生物活性装配体的制备方法及其用途.pdf

本发明涉及制备与使用组成确定的生物活性装配体的方法和组合物，该生物活性装配体可具有多种功能和/或结合特异性。在特定实施方案中，使用停靠-和-锁定(DNL)方法形成生物活性装配体，该方法利用二聚化和停靠域(DDD)与锚定域(AD)间的特异性结合相互作用而形成装配体。在各种实施方案中，一种或多种效应器可连接于DDD或AD序列。互补的AD或DDD序列可连接于形成生物活性装配体核心的衔接组件，使得能够通过特异性DDD/AD结合相互作用形成装配体。这种装配体可连接于广泛的、各式各样的效应器部分用于治疗、检测和/或诊断疾病、病原体感染或其他医学或兽医学病症。

1.  一种生物活性装配体，包含：
a)一种或多种衔接组件；
b)连接于一种或多种衔接组件的一种或多种锚定域(AD)和/或二聚化停靠域(DDD)，其中每个锚定域结合两个二聚化和停靠域。

2.  权利要求1的装配体，其中衔接组件为类型-a(Ma)、类型-b(Mb)、类型-c(Mc)或类型-d(Md)衔接组件。

3.  权利要求2的装配体，进一步包含一种或多种连接于装配体的效应器部分。

4.  权利要求1的装配体，其中锚定域选自AD2(SEQ ID NO：2)或AD3(SEQ ID NO：5)。

5.  权利要求1的装配体，其中二聚化和停靠域选自DDD2(SEQID NO：1)、DDD3(SEQ ID NO：3)和DDD3C(SEQ ID NO：4)。

6.  权利要求3的装配体，其中该生物活性装配体的组成为X₂-AD2-(Ma)-AD3-Y₂，其中X代表连接于DDD2的一种或多种效应器部分，Y代表连接于DDD3C的一种或多种效应器部分。

7.  权利要求3的装配体，其中该生物活性装配体的组成为X-(DDD2-Mb-DDD3C)₂-Y，其中X代表连接于AD2的一种或多种效应器部分，Y代表连接于AD3的一种或多种效应器部分。

8.  权利要求3的装配体，其中该生物活性装配体的组成为X₂-(AD2-Mc-DDD3)₂-X₂，其中X代表连接于DDD2的一种或多种效应器部分。

9.  权利要求3的装配体，其中该生物活性装配体的组成为X₄-(AD2-Md-DDD3C)-Y，其中X代表连接于DDD2的一种或多种效应器部分，Y代表连接于AD3的一种或多种效应器部分。

10.  权利要求1的装配体，其中该生物活性装配体包含DDD3C-CH2-CH3-AD2，其中CH2具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，CH3具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

11.  权利要求2的装配体，其中衔接组件选自HSP70、α₂-巨球蛋白、HAS、Fc和hP1。

12.  权利要求2的装配体，其中衔接组件为热休克蛋白、人鱼精蛋白或人抗体的Fc片段。

13.  权利要求3的装配体，其中效应器部分选自适体、avimers、抗体、抗体片段、单克隆抗体、单克隆抗体片段、嵌合抗体、嵌合抗体片段、人源化抗体、人源化抗体片段、Fd片段、Fab片段、F(ab)₂片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv、scFv、dsFv、sFv、双链抗体和三链抗体。

14.  权利要求1的装配体，其中该装配体各组分的连接方式为共价连接或非共价连接。

15.  权利要求14的装配体，其中该装配体的至少两种组分通过二硫键共价连接。

16.  权利要求3的装配体，其中效应器包含蛋白质、肽、肽模拟物、多核苷酸、RNAi、低聚糖、天然或合成的多聚物质、纳米微粒、量子点、有机化合物或无机化合物。

17.  权利要求13的装配体，其中Fab片段选自hMN-14、L19、hA20、hLL2、L243、hCC49、7E3、hLL1、hPAM4、hRS7、rH1、L49、抗-CD14、抗-CD111、Humira、REMICADE、Xolair、Synagis和hMN-15的Fab片段。

18.  权利要求16的装配体，其中效应器包含选自以下的蛋白质：细菌毒素、植物毒素、篦麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、细胞因子、生长因子、可溶性受体组分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF₁₂₁、TPO、EPO、凝块溶解剂、酶、荧光蛋白质、sTNFα-R和纳米抗体。

19.  权利要求13的装配体，其中效应器具有至少一个结合以下物质的结合位点：碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba733、BrE3-抗原、CA125、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、结肠特异性抗原P(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、HLA-DR、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF-1)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A-抗原、血管发生标记、癌基因标记或癌基因产物。

20.  权利要求3的装配体，其中效应器为诊断剂、治疗剂、化学治疗剂、放射性同位素、显像剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、药物、前体药物、酶、结合分子、适体、细胞表面受体配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核苷酸、干扰RNA、激素、光检测标记、染料、肽、毒素、造影剂、顺磁性标记、超声标记、促细胞凋亡剂、脂质体、纳米微粒或其组合。

21.  权利要求20的装配体，其中抗血管生成剂为血管他丁、baculostatin、canstatin、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗-Flk-1抗体、抗-Flt-1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖素相关蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、促血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、金雀异黄素、TNP-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、血管他丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子IV或米诺环素。

22.  权利要求20的装配体，其中治疗剂为相思豆毒素、金刚烷胺、阿莫西林、两性霉素B、氨苄西林、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮胞苷、氨曲南、阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明、Batrafen、联苯苄唑、博来霉素、bortezomib、苔藓抑素1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、羧苄青霉素、卡泊芬净、卡莫司汀、头孢克洛、头孢唑林、先锋霉素族抗菌素、头孢吡肟、头孢三嗪、头孢噻肟、西乐葆、苯丁酸氮芥、氯霉素、Cipro、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西紫杉醇、放线菌素D、道诺霉素葡糖苷酸、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、白喉毒素、DNA酶I、多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星(2P-DOX)、多西环素、氰基-吗啉代多柔比星、多柔比星葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、乙炔基雌二醇、雌莫司汀、雌激素受体结合剂、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、erythrocycline、红霉素、甲硝唑、法呢基蛋白转移酶抑制剂、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、更昔洛韦、庆大霉素、白树毒蛋白、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、乙酸美屈孕酮、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、米拉霉素、丝裂霉素、米托坦、米诺环素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、诺维本、亚硝基脲、制霉菌素、onconase、苯唑西林、巴龙霉素、青霉素、喷他脒、哌拉西林-三唑巴坦、丁酸苯基酯、强的松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、商陆抗病毒蛋白、PSI-341、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、雷洛昔芬、rapLR1、核糖核酸酶、篦麻毒素、司莫司汀、利福布汀、利福平、金刚乙胺、链霉素、磺胺甲基异噁唑、柳氮磺吡啶、葡萄球菌肠毒素A、链唑霉素、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾丸素、四环素、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、反铂、甲氧苄氨嘧啶磺胺甲噁唑、尿嘧啶氮芥、伐昔洛韦、万古霉素、velcade、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、扎那米韦、阿齐霉素、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合。

23.  权利要求20的装配体，其中诊断剂或治疗剂选自²²⁵Ac、²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、¹⁴C、⁵¹Cr、³⁶Cl、⁴⁵Ti、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁶⁶Dy、¹⁵²Eu、¹⁸F、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^195mHg、¹⁶⁶Ho、³H、¹¹¹In、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、⁵²Fe、⁵⁹Fe¹⁷⁷Lu、¹⁹¹Os、²¹²Pb、³²P、³³P、¹⁴²Pr、^195mPt、²²³Ra、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、⁴⁷Sc、⁷⁵Se¹¹¹Ag、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr、³⁵S、¹⁶¹Tb、^94mTc、^99mTc、⁸⁶Y、⁹⁰Y和⁸⁹Zr。

24.  权利要求20的装配体，其中显像剂选自铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、镧(III)、金(III)、铅(II)和铋(III)。

25.  权利要求20的装配体，其中光检测标记选自Alexa 350、Alexa430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5，6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、酞酸、对苯二甲酸、异酞酸、甲酚紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、藻红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三-联吡啶二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝色染料、别藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、藻红青素、藻红蛋白R、REG、若丹明绿、若丹明异硫氰酸盐、若丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、四甲基若丹明及德克萨斯红。

26.  权利要求13的装配体，其中至少一种效应器部分具有结合载体或半抗原的结合位点。

27.  权利要求26的装配体，其中载体或半抗原包含至少一种诊断剂或治疗剂。

28.  权利要求3的装配体，其中一种或多种效应器部分选自N-A1-B1、A3-B3、抗-CD2 Fab、抗-CD3 Fab、抗-CD16 Fab、抗-CD19 Fab、抗-CD20 Fab、抗-CD22 Fab、抗-CD64 Fab、抗-CD74 Fab、抗-CD89 Fab、抗-CD205 Fab、抗-CD209 Fab、抗-hTfR Fab、抗-HER2 Fab、抗-HER3 Fab、抗-EGFR Fab、抗-IGF-1R Fab、抗-VEGF Fab、抗-VEGFR1 Fab、抗-VEGFR2 Fab、抗-VEGFR3 Fab、抗-P1GF Fab、抗-MUC1 Fab、抗-hIR Fab、BDNF、神经肽、基于鱼精蛋白/DNA的疫苗、鱼精蛋白/siRNA、可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)和Aβ12-28P。

29.  权利要求3的装配体，其中第一种效应器具有对与疾病或病症有关的任何细胞表面抗原的亲和力，第二种效应器选自细胞因子、生长因子、羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原酶、β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)或其各种工程类似物、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、链霉抗生物素蛋白、核糖核酸酶、细菌毒素、植物毒素及表面活性蛋白D(Sp-D)。

30.  一种方法，包括：
a)获得权利要求3的生物活性装配体；及
b)给予患病受试者生物活性装配体；
其中该生物活性装配体对于疾病具有治疗效果。

31.  权利要求30的方法，其中疾病为癌、增生、淀粉样变性病、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、糖尿病性视网膜病、青少年糖尿病、迟发性糖尿病、黄斑变性、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、肉状瘤病、哮喘、水肿、肺动脉高血压、银屑病、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、Osler-Webber综合征、心肌血管发生、蚀斑新生血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、与慢性炎症有关的纤维变性、肺纤维化、器官移植排斥、深部静脉血栓形成或伤口肉芽发生。

32.  权利要求31的方法，其中疾病为癌且至少一种效应器具有对肿瘤相关抗原的结合亲和力，所述抗原选自碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、A33抗体特异性抗原、Ba 733、BrE3-抗原、CA125、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、结肠特异性抗原P(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、HLA-DR、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF-1)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗体特异性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、S100、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、ED-B纤连蛋白、17-1A-抗原、血管发生标记、癌基因标记及癌基因产物。

33.  权利要求32的方法，其中癌为急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾细胞癌、胆囊癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头和颈部癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、髓质甲状腺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、睾丸癌、胰腺癌、神经胶质瘤及其他脑和脊髓肿瘤、肉瘤、肝癌、前列腺癌、黑素瘤或膀胱癌。

34.  权利要求33的方法，进一步包括与装配体联合使用一种或多种抗癌治疗方法。

35.  权利要求34的方法，其中治疗方法包括给予化学治疗剂、细胞因子、放射治疗、免疫治疗、放射免疫疗法、局部高温、激光辐射、抗血管生成剂或外科切除。

36.  权利要求30的方法，其中生物活性装配体包含具有与疾病或其他病症相关抗原的结合亲和力的第一种效应器，和具有与载体或半抗原的结合亲和力的第二种效应器。

37.  权利要求36的方法，进一步包括：
c)任选给予清除剂从而清除循环的生物活性装配体；及
d)将载体或半抗原给予受试者，其中载体或半抗原缀合于一种或多种治疗剂和/或诊断剂。

38.  权利要求37的方法，其中载体或半抗原结合连接于选自以下的物质：抗血管生成剂、化学治疗剂、细胞因子、药物、前体药物、毒素、干扰RNA、适体、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫调节剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫药物、激素、结合分子、脂质、聚合物、胶粒、脂质体、纳米微粒或其组合。

39.  权利要求30的方法，其中疾病由于真菌引起。

40.  权利要求39的方法，其中真菌为小孢子菌属(Microsporum)、发癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、申氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球类芽生菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)或白色念珠菌(Candida albican)。

41.  权利要求30的方法，其中疾病由于病毒引起。

42.  权利要求41的方法，其中病毒为人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、细胞巨化病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼吸道肠孤儿病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清微小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞体病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃巴病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病病毒。

43.  权利要求30的方法，其中疾病由于细菌引起。

44.  权利要求43的方法，其中细菌为炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、无乳链球菌(Streptococcusag alactiae)、嗜肺性军团病菌(Legionellapneumophilia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus spp.)、流感嗜血杆菌B(Hemophilis influenzae B)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆氏病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或支原体属(Mycoplasma)。

45.  权利要求30的方法，其中疾病由于单细胞寄生虫引起。

46.  权利要求45的方法，其中寄生虫为肠兰伯鞭毛虫(Giardialamblia)、贾第虫(Giardia spp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptospordium spp.)、棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)、纳氏虫(Naegleria spp.)、利什曼原虫(Leishmaniaspp.)、结肠小袋虫(Balantidium coli)、伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)、锥体虫(Trypanosoma spp.)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、毛滴虫(Trichmonas spp.)、内阿米巴(Entamoeba spp.)、双核阿米巴(Dientamoeba spp.)、巴贝虫(Babesia spp.)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、等孢子球虫(Isospora spp.)、弓形体(Toxoplasma spp.)、肠胞虫(Enterocytozoon spp.)、肺囊虫(Pneumocystisspp.)和肠袋虫(Balantidium spp.)。

47.  权利要求30的方法，其中疾病为自身免疫性疾病。

48.  权利要求47的方法，其中自身免疫性疾病为急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、亨诺-许兰二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症(格雷夫斯病)、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、银屑病或纤维化肺泡炎。

49.  权利要求30的方法，其中疾病为心肌梗塞、缺血性心脏病、动脉粥样硬化斑块、移植排斥、阿尔茨海默病、由活化的粒细胞、单核细胞、淋巴样细胞或巨噬细胞的添加性生长引起的特应性组织或炎症。

50.  一种诊断疾病的方法，包括：
a)获得权利要求3的生物活性装配体，其中第一种效应器部分结合于与疾病有关的靶向分子、组合体、聚集体、细胞、抗原或组织上，第二种效应器部分结合于诊断性半抗原上；
b)将装配体给予怀疑患病的受试者；
c)给予同一受试者结合第二种效应器的诊断性半抗原；及
d)检测结合于第二种效应器的半抗原的存在；
其中半抗原定位到与疾病有关的组织是受试者患病的诊断依据。

51.  权利要求50的方法，其中半抗原缀合于磁共振影像(MRI)造影剂并通过MRI检测定位的半抗原。

52.  权利要求51的方法，其中MRI造影剂为铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。

53.  权利要求50的方法，其中半抗原缀合于超声成像增强剂且通过超声成像检测定位的半抗原。

54.  权利要求30或50的方法，进一步包括为所述治疗或所述检测进行内窥镜操作。

55.  权利要求30的方法，其中生物活性装配体包含选自以下的抗体或抗体片段的组合：抗-CD74X抗-CD20、抗-CD74X抗-CD22、抗-CD22X抗-CD20、抗-CD20X抗-HLA-DR、抗-CD19X抗-CD20、抗-CD20X抗-CD80、抗-CD2X抗-CD25、抗-CD8X抗-CD25和抗-CD2X抗-CD147。

56.  制备生物活性装配体的方法，包括：
a)获得缀合于至少两种AD和/或DDD序列的衔接组件；
b)获得至少一种缀合于DDD和/或AD序列的效应器，所述DDD和/或AD序列与缀合于衔接组件的AD和/或DDD序列互补。
c)在允许形成生物活性装配体的条件下暴露互补的AD和DDD序列。

57.  权利要求56的方法，其中互补的DDD/AD序列为DDD2/AD2或DDD3C/AD3。

58.  权利要求16的装配体，其中效应器为能够结合于肿瘤相关抗原、癌基因蛋白、生长因子或细胞表面受体的肽。

59.  权利要求58的装配体，其中肽能够结合于EGFR、VEGFR、P1GF或Flt-1。

60.  权利要求59的装配体，其中肽为BP1SHRYRLAIQLHASDSSSCV(SEQ ID NO：16)、BP2 QDDHLTTGR(SEQID NO：17)或BP4 RMPYSEHSAPLG(SEQ ID NO：18)。

61.  权利要求20的装配体，其中细胞因子选自人生长激素、N-蛋氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体发生激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳激素、胎盘催乳激素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、米勒管抑制物、小鼠促性腺素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)、NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素(IL)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit-配体、FLT-3、血管他丁、血小板反应蛋白、内皮他丁、肿瘤坏死因子和LT。

62.  权利要求20的装配体，其中趋化因子选自RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、IP-10。

63.  权利要求20的装配体，其中效应器部分选自促肾上腺皮质激素、依比拉肽、血管紧张素、血管紧张素II、天冬酰胺酶、心钠肽、心钠利尿肽、杆菌肽、β-内啡肽、凝血因子VII、VIII和IX、血液胸腺因子、骨形态发生因子、骨形态形成性蛋白质、缓激肽、雨蛙肽、降钙素基因相关多肽、降钙素、CCK-8、细胞生长因子、EGF、酸性FGF、碱性FGF、趋化因子、胆囊收缩素、胆囊收缩素-8、胆囊收缩素-促胰酶素、多粘菌素、集落刺激因子、促肾上腺皮质激素释放因子、去氨加压素、二肽、超氧化剂物歧化酶、强啡肽、章鱼素、内啡肽、内皮素、内皮素拮抗肽、endotherins、脑啡肽、表皮生长因子、促红细胞生成素、促卵胞激素、gallanin、胃抑制性多肽、胃泌素释放多肽、胃泌素、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、促性腺素、短杆菌肽、短杆菌肽、生长因子、生长激素释放因子、生长激素、h-ANP、激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素β链、人胎盘催乳激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、IGF-I、IGF-II、干扰素、白介素、肠多肽、激肽释放酶、京都啡肽、促黄体激素释放激素、促黄体发生激素、促黄体激素-释放激素、氯化溶菌酶制剂、MSH促黑激素、MSH黑素细胞刺激素、mellitin、胃动素、胞壁酰、胞壁酰二肽、神经生长因子、神经营养因子、NT-3、NT-4、CNTF、GDNF、BDNF、神经肽Y、神经降压素、催产素、胰抑素、胰多肽、促胰酶素、甲状旁腺激素、五肽胃泌素、多肽YY、垂体腺苷酸环化酶-激活多肽、血小板衍生的生长因子、polymixinB、催乳素、蛋白质合成刺激多肽、PTH-关联蛋白、松弛肽、肾素、肠促胰液素、血清胸腺因子、促生长因子、生长激素抑制素、P物质、过氧化物、超氧化物歧化酶、taftsin、四肽胃泌素、胸腺体液因子、胸腺肽、噻莫母林、甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素TRH、胰蛋白酶、吞噬刺激肽、肿瘤生长因子、肿瘤坏死因子、短杆菌酪肽、尿抑胃激素、尿激酶、肠血管活性多肽、抗利尿激素及功能等价物。

生物活性装配体的制备方法及其用途
相关申请
[0001]本申请为2006年3月24日申请的PCT申请PCT/US2006/010762，2006年3月29日申请的PCT/US2006/012084的部分继续申请，及2006年3月24日申请的美国专利申请11/389,358和2006年3月28号申请的11/391,584的部分继续申请；并且按照35 U.S.C.§119(e)的规定，要求保护2005年10月19号申请的美国临时专利申请60/728,292、2005年12月16号申请的60/751,196、2006年3月14号申请的60/782,332的利益，每个引证的申请其全部内容通过引用并入本文中。
发明领域
[0002]本发明的各种实施方案涉及用于制造和使用多价的、多特异性的和/或多功能性的复合体的方法及组合物。这种复合体能够广泛用于各种应用中，特别用于感染、疾病和其他与健康有关情况的治疗、检测和/或诊断，包括但不限于癌、自身免疫性疾病、心血管疾病、新陈代谢疾病、退行性疾病，包括例如阿尔茨海默病的神经系统疾病和器官移植排斥。
发明背景
[0003]人造药物由于能够将多拷贝的靶向部分和效应器部分合并起来，从而使结合更紧密、药效更强，因此非常需要该类药物。虽然重组技术普遍用于制造具有靶向域和效应器域的融合蛋白质，但是只有正确应用缀合化学才可获得包含相同或不同单体组分以得到多价性或多功能性的多聚体结构。
[0004]通过重组技术制备的药物，存在的问题可包括较高的制备费用、较低的表达产率、在血清中不稳定、在溶液中不稳定而造成聚集物产生或各亚基分离、由于存在多种产物形式而使批组成不明确、污染性副产物、由于位阻因素或构象改变使功能性活性或结合亲和力/亲和性降低等。至于通过各种化学交联方法制备的药物，较高制备费用和纯化产物的不均一性是两个主要局限。
[0005]因此本领域仍然需要一种制备多特异性或功能性的多价结构的通用方法，该结构有确定的组成、均质纯净、亲和力不变，且可以较高产率制备，不需要额外纯化步骤。而且，这种结构也必须在血清中足够稳定以适于体内应用。还需要稳定的、多特异性或功能性的多价结构，该结构应易于构建和/或以相对纯化的形式得到。

概述
[0006]本发明公开了用于制造既适于体外应用又适于体内应用的复杂度提高的生物活性装配体(assembly)的平台技术。通过至少两种不同的蛋白质或非蛋白质的位点特异性结合构建此装配体，使用的策略基于2005年10月19号申请的美国临时专利申请60/728,292、2005年12月16号申请的60/751,196、2006年3月14号申请的60/782,332，及2006年3月24号申请的美国专利申请11/389,358和2006年3月28号申请的11/391,584(其各自全部内容通过引用并入本文中)，以及最近的报道(Rossi等，Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：6841-6846)所讨论的停靠和锁定(Dock and Lock)(DNL)方法。
[0007]生物活性装配体的使用方法可包括疾病或其他病症的检测、诊断和/或治疗。这些病症可包括但不限于癌、增生、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎、糖尿病、肉状瘤病、哮喘、水肿、肺动脉高血压、银屑病、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、Osler-Webber综合征、心肌血管发生、蚀斑新生血管形成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、与慢性炎症有关的纤维变性、肺纤维化、淀粉样变性病、阿尔茨海默病、器官移植排斥、深部静脉血栓形成或伤口肉芽发生。
[0008]在特定的实施方案中，公开的方法和组合物可用于治疗自身免疫性疾病，例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、亨诺-许兰二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑(erythemanodosurn)、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻综合征、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiterans)、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症(即格雷夫斯病)、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、银屑病或纤维化肺泡炎。
[0009]在某些实施方案中，生物活性装配体可用于治疗癌。预计其可靶向作用于任何类型肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。可靶向的示例性肿瘤类型包括急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、胆囊癌(biliarycancer)、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头和颈部癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、髓质甲状腺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、黑素瘤、肝癌、前列腺癌、神经胶质及其他脑和脊髓肿瘤、及膀胱癌。
[0010]可靶向的肿瘤相关抗原包括但不限于碳酸酐酶IX、A3、A33抗体特异性抗原、BrE3-抗原、CD1、CD1a、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亚基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Ba733、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、PAM-4-抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰岛素生长因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、胎盘生长因子(PlGF)、17-1A-抗原、血管发生标记(例如ED-B纤连蛋白)、癌基因标记(例如bcl-2)、癌基因产物，及其他肿瘤相关抗原。近来关于肿瘤相关抗原的报道包括Mizukami等(2005，Nature Med.11：992-97)；Hatfield等(2005，Curr.CancerDrug Targets 5：229-48)；Vallbohmer等(2005，J.Clin.Oncol.23：3536-44)；和Ren等(2005，Ann.Surg.242：55-63)，各自通过引用并入本文中。
[0011]在其他实施方案中，此生物活性装配体可用于治疗病原微生物的感染，例如细菌、病毒、真菌或单细胞寄生物。可治疗的示例性真菌包括小孢子菌属(Microsporum)、发癣菌属(Trichophyton)、表皮癣菌属(Epidermophyton)、申氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、粗球类芽生菌(Coccidioides immitis)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)或白色念珠菌(Candida albican)。示例性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、细胞巨化病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼吸道肠孤儿病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清微小样病毒(human serumparvo-like virus)、猿猴病毒40、呼吸道合胞体病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃巴病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病病毒。示例性细菌包括炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、嗜肺性军团病菌(Legionella pneumophilia)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus spp.)、流感嗜血杆菌B(Hemophilis influenzae B)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、莱姆氏病螺旋体(Lyme diseasespirochetes)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或支原体属(Mycoplasma)。示例性寄生物包括肠兰伯鞭毛虫(Giardia lamblia)、贾第虫(Giardia spp.)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptospordium spp.)、棘阿米巴(Acanthamoeba spp.)、纳氏虫(Naegleriaspp.)、利什曼原虫(Leishmania spp.)、结肠小袋虫(Balantidium coli)、伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)、锥体虫(Trypanosoma spp.)、脆弱双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、毛滴虫(Trichmonas spp.)、内阿米巴(Entamoeba spp.)、双核阿米巴(Dientamoeba spp.)、巴贝虫(Babesia spp.)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、等孢子球虫(Isospora spp.)、弓形体(Toxoplasma spp.)、肠胞虫(Enterocytozoon spp.)、肺囊虫(Pneumocystis spp.)和肠袋虫(Balantidium spp.)。
[0012]虽然并非限制性的，但是在各种实施方案中，一种或多种蛋白质或肽治疗剂或诊断剂可连接于或掺入生物活性装配体内，例如细菌毒素、植物毒素、篦麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、细胞因子、生长因子、可溶性受体组分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF₁₂₁、TPO、EPO、凝块溶解剂(clot-dissolving agent)、酶、荧光蛋白质、sTNFα-R、avimer、scFv、dsFv或纳米抗体(nanobody)。
[0013]在另一些实施方案中，抗血管生成剂可形成生物活性装配体的一部分或连接于生物活性装配体。使用的示例性抗血管生成剂包括血管他丁、baculostatin、canstatin、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体或肽、抗胎盘生长因子抗体或肽、抗-Flk-1抗体、抗-Flt-1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖素相关蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、促血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、金雀异黄素、TNP-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、血管他丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子IV或米诺环素。
[0014]在又一些其它实施方案中，一种或多种治疗剂例如aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮杂胞苷、博来霉素、bortezomib、苔藓抑素1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西紫杉醇、放线菌素D(dactinomycin)、道诺霉素葡糖苷酸、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、2-吡咯啉基多柔比星(2P-DOX)、氰基-吗啉代多柔比星、多柔比星葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、乙炔基雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、氟尿嘧啶、氟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、乙酸美屈孕酮(medroprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮、美法仑、巯嘌呤、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、米拉霉素、丝裂霉素、米托坦、丁酸苯基酯、强的松、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、司莫司汀链脲霉素(semustine streptozocin)、他莫昔芬、紫杉烷类、泰素、丙酸睾丸素、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶氮芥、velcade、长春碱、长春瑞滨、长春新碱、蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶、onconase、rapLR1、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、商陆抗病毒蛋白、白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素、假单胞菌内毒素、反义寡核苷酸、干扰RNA或其组合可缀合于或掺入生物活性装配体。
[0015]在各种实施方案中，一种或多种效应剂例如诊断剂、治疗剂、化学治疗剂、放射性同位素、显像剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、药物、前体药物、酶、结合分子、细胞表面受体配体、螯合剂、免疫调节剂、寡核苷酸、干扰RNA、适体、激素、光检测标记(photodetectable label)、染料、肽、毒素、造影剂、顺磁性标记、超声标记、促细胞凋亡剂(pro-apoptotic agent)、脂质体、纳米微粒或其组合，可连接于生物活性装配体。
[0016]与生物活性装配体及其使用方法有关的各种实施方案可用于诱导病态细胞的细胞凋亡。进一步的详细资料可见于美国专利申请公开第20050079184号，其全部内容通过引用并入本文中。这种结构可包含对抗原有亲和力的抗体或抗体片段等第一和/或第二结合部分，所述抗原选自CD2、CD3、CD8、CD10、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR、CEA、CSAp、CA-125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纤连蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。在更特别的实施方案中，用于诱导细胞凋亡的生物活性装配体可包含单克隆抗体、Fab片段、嵌合抗体、人源化或人抗体或片段。在优选的实施方案中，生物活性装配体可包含抗-CD74X抗-CD20、抗-CD74X抗-CD22、抗-CD22X抗-CD20、抗-CD20X抗-HLA-DR、抗-CD19X抗-CD20、抗-CD19x抗-CD22、抗-CD20X抗-CD80、抗-CD2X抗-CD25、抗-CD8X抗-CD25和抗-CD2X抗-CD147的组合。在更优选的实施方案中，嵌合抗体、人源化或人抗体或抗体片段可得自LL2(抗-CD22)、LL1(抗-CD74)和A20(抗-CD20)的可变域。
[0017]在某些实施方案中，本领域中已知的任何治疗性蛋白质或肽可连接于AD或ADD序列，并用作要求保护的方法和组合物中的效应器。已知许多这样的治疗性蛋白质或肽，并在例如2005年11月2号申请的美国专利申请公开第20060084794号，“Albumin fusion proteins，”(白蛋白融合蛋白)中做了描述，其全部内容通过引用并入本文中。20060084794的表1列举了使用的各种已知的示例性治疗性蛋白质或肽，包括示例性标识符(identifiers)、专利参考号及优选的适应症，其全部内容通过引用明确地并入本文。例如在美国专利第6,309,633号中公开了使用的其他治疗性蛋白质或肽，其全部内容通过引用并入本文，可包括但不限于促肾上腺皮质激素、依比拉肽、血管紧张素、血管紧张素II、天冬酰胺酶、心钠肽、心钠利尿肽、杆菌肽、β-内啡肽、凝血因子VII、VIII和IX、血液胸腺因子、骨形态发生因子、骨形态形成性蛋白质、缓激肽、雨蛙肽、降钙素基因相关多肽、降钙素、CCK-8、细胞生长因子、EGF、TGF-α、TGF-β、酸性FGF、碱性FGF、趋化因子、胆囊收缩素、胆囊收缩素-8、胆囊收缩素-促胰酶素、多粘菌素、集落刺激因子、GMCSF、MCSF、促肾上腺皮质激素释放因子、细胞因子、去氨加压素、二肽、超氧化剂物歧化酶、强啡肽、章鱼素、内啡肽、内皮素、内皮素拮抗肽(endothelin-antagonistic peptides)、endotherins、脑啡肽、表皮生长因子、促红细胞生成素、促卵胞激素、gallanin、胃抑制性多肽、胃泌素释放多肽、胃泌素、G-CSF、高血糖素、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathio-peroxidase)、促性腺素、短杆菌肽、短杆菌肽(gramicidines)、生长因子、生长激素释放因子、生长激素、h-ANP、激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素β链、人胎盘催乳激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、IGF-I、IGF-II、干扰素、白介素、肠多肽、激肽释放酶、京都啡肽、促黄体激素释放激素、促黄体发生激素、促黄体激素-释放激素、氯化溶菌酶制剂、MSH促黑激素、MSH黑素细胞刺激素、mellitin、胃动素、胞壁酰、胞壁酰二肽、神经生长因子、神经营养因子、NT-3、NT-4、CNTF、GDNF、BDNF、神经肽Y、神经降压素、催产素、胰抑素、胰多肽、促胰酶素、甲状旁腺激素、五肽胃泌素、多肽YY、垂体腺苷酸环化酶-激活多肽、血小板衍生的生长因子、polymixin B、催乳素、蛋白质合成刺激多肽、PTH-关联蛋白、松弛肽、肾素、肠促胰液素、血清胸腺因子、促生长因子、生长激素抑制素、P物质、过氧化物、超氧化物歧化酶、taftsin、四肽胃泌素、血小板生成素、胸腺体液因子、胸腺生成素、胸腺肽、噻莫母林、甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放激素TRH、胰蛋白酶、吞噬刺激肽、肿瘤生长因子、肿瘤坏死因子、短杆菌酪肽(tyrocidin)、尿抑胃激素、尿激酶、肠血管活性多肽、抗利尿激素及功能等价物(functionalequivalents)。

附图简述
[0018]图1显示在形成生物活性装配体中使用的示例性肽序列，包括DDD2(SEQ ID NO：1)、AD2(SEQ ID NO：2)、DDD3(SEQ ID NO：3)、DDD3C(SEQ ID NO：4)和AD3(SEQ ID NO：5)。以下讨论了使用这种序列形成生物活性装配体的组合物和方法。
[0019]图2显示基于类型a衔接分子(Ma)的X₂(Ma)Y₂生物活性装配体的示意图，类型a衔接分子(Ma)上例如连接有AD2和AD3每种各一分子。例如AD2和AD3用作DDD2和DDD3C的结合位点。那些二聚化和停靠域可再连接于各种效应器或结合分子(X和Y)上。结果是异四聚体包含两种不同的同二聚体。
[0020]图3显示基于类型b衔接分子(Mb)的X(Mb)₂Y生物活性装配体的示意图，类型b衔接分子(Mb)上例如连接有DDD2和DDD3每种各一分子。添加适当的锚定域例如AD2和AD3，所述锚定域连接于两个不同效应器部分，导致二聚作用并形成X(Mb)₂Y装配体。
[0021]图4显示基于类型c衔接分子(Mc)的X₂(Mc)₂X₂生物活性装配体的示意图，类型c衔接分子(Mc)上例如连接有DDD3和AD2每种各一分子。连接于不同Mc分子的DDD3序列二聚作用提供两个结合同二聚体的锚定位点(AD2)，每个包含例如连接于效应器X的DDD2。所得生物活性装配体为包含效应器X的4个拷贝的同四聚体。
[0022]图5显示基于类型d衔接分子(Md)的X₂(Md)_2YX₂生物活性装配体的示意图。与图4中所示装配体的差异为使用DDD3C二聚化和停靠域，使AD3锚定域结合于效应器Y。
[0023]图6显示示例性DDD3C-CH2-CH3-AD2构建体的完整氨基酸序列(参见实施例7)，包含DDD3C(SEQ ID NO：4)、第一接头(SEQ IDNO：6)、CH2(SEQ ID NO：7)、CH3(SEQ ID NO：8)、第二接头(SEQ ID NO：9)和AD2(SEQ ID NO：2)。
举例说明性实施方案的描述
[0024]本申请引用的所有文献或文献选段包括但不限于专利、专利申请书、文章、书籍和论文，其全部内容通过引用清楚地并入本文中。
定义
[0025]本文所用的“一”可指一个或多个。
[0026]本文所用术语“和”与“或”可用来指“与”形式连接词或“或”形式连接词。即除非另有说明二者应理解为等同于“和/或”。
[0027]本文所述的抗体是指全长(即天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组方法制成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分或类似物，例如抗体片段。
[0028]抗体片段为抗体的一部分例如F(ab)₂、F(ab’)₂、Fab、Fv、sFv等。无论其结构如何，抗体片段结合被完整抗体识别的相同抗原。术语“抗体片段”也包括作用方式类似于抗体，即通过结合特异性抗原而形成复合体的任何合成的或遗传工程改造的蛋白质。例如抗体片段包括由可变区组成的分离片段，例如包括重链和轻链可变区的“Fv”片段，其中轻链和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子，和模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(CDR)。
[0029]效应器为产生所选结果的原子、分子或化合物。效应器可包括治疗剂和/或诊断剂。
[0030]治疗剂为适用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、适体、螯合剂、硼化合物、光活化剂、染料和放射性同位素。在美国专利公开第20050002945号、第20040018557号、第20030148409号和第20050014207号中公开了使用的其他示例性治疗剂和方法，各自通过引用并入本文中。
[0031]诊断剂为适用于通过体外或体内实验诊断疾病的原子、分子或化合物。适用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如与生物素-链亲和素复合体)、造影剂、荧光化合物或分子及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)。
[0032]免疫缀合物为结合分子(例如抗体成分)与原子、分子或高级结构(例如与载体、治疗剂或诊断剂)的缀合物。
[0033]裸抗体(naked antibody)为未缀合任何其他药物的抗体。
[0034]载体为能够连接治疗剂或诊断剂从而促进递送这种药物至靶细胞的原子、分子或高级结构。载体可包括蛋白质、肽、脂质(例如能形成高级结构的两亲性脂质)、多糖(例如右旋糖酐)或其他高级结构，例如微粒、脂质体或纳米微粒。
[0035]本文所用术语抗体融合蛋白指重组产生的抗原结合分子，其中两种或多种具有相同或不同特异性的相同或不同scFv或抗体片段被连接在一起。融合蛋白的价(Valency)指该融合蛋白有多少结合单抗原或抗原表位的结合臂或位点，即单价、二价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价指其可利用多种相互作用与抗原结合，由此提高与抗原结合的亲和力。特异性指抗体融合蛋白能够结合多少抗原或抗原表位，即单特异性、二特异性、三特异性、多特异性。根据这些定义，天然抗体例如IgG，由于其具有两个结合臂因而为二价，但是由于其结合一个抗原表位因而为单特异性的。单特异性的多价融合蛋白具有多于一个结合抗原表位的结合位点，但是仅结合一个这种抗原表位，例如，双链抗体具有与同一抗原反应的两个结合位点，就属于这种单特异性的多价融合蛋白。这种融合蛋白可包含单抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合，或相同抗体组分的多个拷贝。这种融合蛋白可另外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适于这种融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素毒素融合蛋白”)。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNase)，优选重组的RNase。
[0036]如果给药量为生理上有效的，则本文所述抗体或免疫缀合物制剂或组合物是指以“治疗上有效量”给予。如果其存在导致接受药物的哺乳动物生理学上可检测的变化，则该药物为生理学上有效的。尤其是，如果它的存在激发抗肿瘤反应或减轻自身免疫疾病状态的体征和症状，则该抗体制剂为生理上有效的。生理上显著效应也可指诱发接受药物的哺乳动物体液和/或细胞免疫反应从而导致靶细胞的调节(modulaton)、生长抑制或死亡。
基于生物活性装配体的DNL
[0037]本发明的某些实施方案可涉及通过基于停靠和锁定(DNL)方法的位点特异性缀合策略制备的生物活性装配体。DNL方法利用自然界中发现的相互之间特异性结合的α-螺旋状肽。该α-螺旋状肽为cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调节性(R)亚基中二聚化和停靠域(DDD)，和多种A-激酶锚定蛋白(AKAPs)中的锚定域(AD)。每个肽通过基因重组融合或化学性结合于感兴趣实体，这些螺旋为两种修饰后实体“停靠”形成半稳定结构提供了极好的接头组件，其进一步经由引入这些螺旋的半胱氨酸残基形成的二硫键“锁定”成为稳定复合体。PKA中已鉴定出两种类型的R亚基(RI和RII)且每种均具有α和β亚型。因为R亚基只能分离为稳定的二聚体而AKAPs仅结合二聚的R亚基，DNL方法的独特性质是得自DDD的肽衍生的实体总是形成同二聚体，导致在最终复合体中产生两个拷贝的所述实体。
[0038]两对相互作用的DDD和AD肽特别适于作为接头组件。第一对包括得自人RIIα的44个氨基末端残基的DDD2(图1A，SEQ ID NO：1)，和AD2(图1B，SEQ ID NO：2)，得自最适于RIIα-选择性结合的合成肽即AK AP-IS(Alto等，Proc Natl Acad Sci美国，2003，100：4445-4450)。第二对包括DDD3(图1C，SEQ ID NO：3)或DDD3C(图1D，SEQ ID NO：4)，得自人RIα的肽片段(残基12-61)(Leon等，J Biol Chem，1997，272：28431-28437)，和AD3(图1E，SEQ ID NO：5)，得自特异性结合RIα的D-AKAP2的突变体肽的PV-38(Burns-Hamuro等，Proc Natl Acad Sci美国，2003，100：4072-4077)。
[0039]在一个实施方案中，下文称为类型-a衔接组件(Ma)的生物学实体包括两种特殊的AD肽，一种优先与RIIα的DDD反应(例如AD2与DDD2)，而另一种优先与RIα的DDD反应(例如AD3与DDD3C)，制备这种实体并用来与两种其它下文中称为周边组件的生物活性实体复合，得到如图2所示的含有5个独立组分的X₂(Ma)Y₂的装配体，其中一种外周组件包含每个单体亚基连接于RIIα的DDD的同二聚体(指定为X₂)而另一种包含每个单体亚基连接于RIα的DDD的不同的同二聚体(指定为Y₂)。
[0040]在另一个实施方案中，下文中称为类型-b衔接组件(Mb)的生物学实体含有两种特殊的DDD肽，一种优先与AD2反应(例如DDD2)，而另一种优先与AD3反应(例如DDD3C)。将该生物学实体制备为下文称为(Mb)₂的同二聚体并用来与两种外周组件复合得到如图3所示的含有4个独立组分的X(Mb)₂Y的装配体，其中一种外周组件包含连接于AD2(指定为X)的单体亚基而另一种包含连接于AD3(指定为Y)的不同单体亚基。
[0041]在又一个实施方案中，下文中称为类型-c衔接组件(Mc)的生物学实体既含有AD2也含有DDD3。将其制备为下文称为(Mc)₂的同二聚体并用来与两种相同的外周组件复合，得到如图4所示的含有6个独立组分的X₂(Mc)₂X₂的装配体，每个外周组件包含连接DDD2的独立单体亚基的同二聚体(指定为X₂)。
[0042]在进一步的实施方案中，下文中称为类型-d衔接组件(Md)的生物学实体含有AD2和DDD3C(取代类型-c中DDD3)。将该生物学实体制备为下文称为(Md)₂的同二聚体并用来与三种外周组件复合，得到如图5所示的含有7个独立组分的X₂(Md)₂YX₂的装配体，外周组件中两种为带有连接于DDD2的独立单体亚基的相同同二聚体(指定为X₂)而第三种包括连接于AD3的单体亚基(指定为Y)。
[0043]在另一个实施方案中，本发明制备的生物活性装配体可进一步缀合于效应器和载体从而得到由这种修饰赋予的其它功能。另外可构建含有能够与DNA或RNA或含有免疫刺激CpG基序的合成的寡聚脱氧核苷酸(ODN)形成复合体的组分的生物活性装配体(Klinman，Nat RevImmunol，2004，4：1-10；Krieg，Nat Rev Drug Discov，2006，5：471-484)。
[0044]可通过公开的方法和组合物设计并制备大量的生物活性装配体，其广泛应用依赖于选定的衔接组件类型和连接于衔接组件的外周组件。特别适合作为衔接组件的生物活性实体包括人IgG1的Fc、人血清白蛋白(HSA)、各种热休克蛋白(HSPs)、生物发光蛋白、人转铁蛋白(hTf)和人鱼精蛋白。可衍生为外周组件使用的生物活性实体包括细胞因子、趋化因子、生长因子、可溶性受体、抗体片段、荧光蛋白、l-肽、d-肽、含有非天然氨基酸的肽、拟肽、肽模拟物、DNA序列、合成CpG ODN、小干扰RNAs、人鱼精蛋白1、得自鱼精蛋白的DNA-结合肽、蛋白质转导域、核定位信号、促进透皮递药或膜渗透的肽、DNA或RNA适体、肽适体、霍乱毒素亚基B单体、酶、聚乙二醇、纳米微粒、含有药物聚合物、螯合物、量子点(quantum dots)，和各种基于支架的结合蛋白例如纳米抗体、Evibody、锚蛋白重复蛋白、Trans-body、Anticalin、微体、AdNectin、域抗体、Affibody、Maxibody、四连蛋白、Affilin分子、iMabs和Monobody(Hey等，Trends Biotechnol，2005，23：514-522；Binz等，NatBiotechnol，2005，23：1257-1268)。表1、表2、表3和表4中分别列出了基于类型-a、类型-b、类型-c和类型-d衔接组件的选定的装配体的具体组成。
[0045]基于HSPs的衔接组件由于亚单位疫苗具有良好的安全性并易于制备，所以非常需要经明确鉴定的分子所组成的亚单位疫苗，但是由于其免疫原性差和稳定性不佳阻碍了其应用，这一点可通过开发改良的递送载体与更有效但无毒的佐剂补救。可采用本发明组合物和方法制备亚单位疫苗，该疫苗(1)含有确定的抗原分子，(2)具有嵌入型佐剂从而增强免疫反应，(3)能够诱发抗原特异性T细胞免疫。
[0046]一种方法为产生基于HSPs的类型-a衔接组件，用以连接得自靶抗原的外周组件和蛋白质或肽类免疫增强剂，得到用于直接免疫接种或体外敏化树状突细胞产生MHC-I和MHC-II呈递的基于蛋白质或肽的疫苗(Srivastava，Nat Rev Immunol，2002，2：185-194)。或者，基于HSP的衔接组件连接得自DNA-结合蛋白质的外周组件，例如人鱼精蛋白(Song等，Nat Biotechnol，2005，23：709-717)，或含有簇集的精氨酸残基的DNA-结合肽，例如RRRRRRGGRRRRRR(SEQ ID NO：10)(Brewer等，J BiolChem，2003，278：42403-42406)，以及靶分子例如抗体片段，经与编码靶抗原或靶抗原和免疫增强剂的基因的质粒复合后，产生用作靶向特异性的DNA疫苗的多功能性装配体。由于HSPs能够与各种抗原肽非共价结合，因此也可通过这种疫苗进一步扩大较宽的保护谱(美国专利第5,935,576号；美国专利第5,750,119号)。实施里1描述了基于HSPs的类型-a衔接组件的产生和用途。
[0047]基于人鱼精蛋白的衔接组件使用基于人鱼精蛋白的衔接组件的生物活性装配体特别适于递送DNA疫苗、siRNAs或治疗性基因至特定细胞。包括抗gp120Fab和人鱼精蛋白1(hP1)的融合蛋白(F105-P)已经显示出能够有效地将编码假单胞菌外毒素A的质粒(Chen等，Gene Ther，1995，2：116-123)或siRNAs递送至HIV-感染的细胞或HIV包膜表达(envelope-expressing)肿瘤细胞(Song等，Nat Biotechnol，2005，23：709-717)。可制备基于hP1的类型-b衔接组件用于连接得自不同生物实体例如靶特异性结合蛋白的外周组件，并且使用所得装配体作为载体用于靶向特异性的递送通过复合而结合hP1的质粒或siRNAs。或者可制备基于hP1的类型-c衔接组件用于连接得自相同生物实体例如靶特异性结合蛋白的外周组件，并且使用所得包括靶特异性结合蛋白的四个拷贝的装配体作为载体用于靶向特异性的递送通过复合而结合hP1的质粒或siRNAs。另一个实施方案是制备基于hP1的类型-d衔接组件用于连接得自两种不同生物实体的外周组件，并且使用所得包括一种实体的四个拷贝和另一实体的一个拷贝的装配体作为载体用于递送通过复合而结合hP1的质粒或siRNAs。实施例2和实施例3分别描述了基于hP1的类型-b和类型-c的衔接组件的制备和用途。
[0048]基于人免疫球蛋白Fc的衔接组件含有人IgG的Fc的融合蛋白具有Fc的固有性质赋予的许多优点。例如，Fc结合于肺和肠上皮细胞表达的新生儿受体(FcRn)促进Fc-融合蛋白通过粘膜屏障的转运(Spiekermann等，J Exp Med，2002，196：303-310)，这样使肺或口腔递送可以进行(Dumont等，J Aerosol Med，2005，18：294-303；Bitonti等，ProcNatl Acad Sci USA，2004，101：9763-9768；Low等，Hum Reprod，2005，20：1805-1813)。Fc与连续毛细血管内皮中表达的FcRn的pH-依赖性结合也延长了IgG抗体或含有Fc-的融合蛋白的血清半寿期。具有对FcRn高亲和力的IgG或Fc突变体经证明能显著提高这种工程构建体的血清半寿期(Hinton等，J Immunol，2006，176：346-356；Hinton等，J Biol Chem，2004，279：6213-6216)。另一方面，具有对FcRn较低亲和力的IgG或Fc突变体显示出与相应野生型相比更短的半寿期(Kenanova等，Cancer Res，2005，65：622-631)。最适调节(tailor)含有Fc的生物学实体的药代动力学的能力对于药物设计是非常具吸引力的。实施例4、实施例5和实施例6分别概括了基于Fc的类型-b、类型-c和类型-d的衔接组件的产生和用途。在实施例7中描述了构建DDD3-CH2-CH3-AD2和DDD3C-CH2-CH3-AD2的表达载体的详细方法。
生物活性装配体的缀合物
[0049]其它部分可缀合于上述的生物活性装配体中。例如药物、毒素、放射性化合物、酶、激素、细胞毒蛋白、螯合物、细胞因子和其它功能剂可缀合于生物活性装配体上。可经例如共价键连接于侧链含有氨基、羧基、巯基或羟基的氨基酸残基而缀合。为此目的可使用各种常用接头，例如二异氰酸酯、二异硫代硫酸酯、二(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳化二亚胺、马来酰亚胺-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛等。药物缀合于生物活性装配体优选不显著影响未修饰结构中包括的每个亚基的活性。可分开进行不同外周组件的缀合并使用所得缀合物制备生物活性装配体。另外细胞毒性剂可首先偶联到聚合物载体，然后缀合于生物活性装配体。关于这种方法参见Ryser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：3867-3870，1978；美国4,699,784和美国4,046,722，其内容通过引用并入本文中。如下面所讨论的，一种或多种效应器也可缀合于载体部分，然后通过掺入装配体的例如特异性结合载体部分的单克隆抗体或片段，可定向到生物活性装配体。在下述预先靶向一节描述了使用用于递送效应器分子至定位于靶细胞、组织或病原微生物的生物活性装配体的载体部分的实例。
[0050]可通过本领域中已知的各种方法制备本文所述的缀合物。例如生物活性装配体可用¹³¹I放射标记并缀合于脂质，这样所得缀合物可形成脂质体。脂质体可结合一种或多种治疗剂(例如药物FUdR-dO)或诊断剂。或者除载体外，生物活性装配体可缀合于¹³¹I(例如酪氨酸残基)和药物(例如赖氨酸残基的ε氨基)，且载体可结合其它治疗剂或诊断剂。治疗剂和诊断剂可共价结合生物活性装配体的一个或多个亚基。
[0051]本领域已知脂质体或微粒的构造。参见例如Wrobel和Collins，Biochimica et Biophysica Acta(1995)，1235：296-304、Lundberg等，J.Pharm.Pharmacol.(1999)，51：1099-1105；Lundberg等，Int.J.Pharm.(2000)，205：101-108；Lundberg，J.Pharm.Sci.(1994)，83：72-75；Xu等，Molec.Cancer Ther.(2002)，1：337-346；Torchilin等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.，美国(2003)，100：6039-6044；美国5,565,215、美国6,379,698和美国2003/0082154。
[0052]也已经描述了自聚合物、二氧化硅或金属制备的适于药物递送或成像的纳米微粒或纳米胶囊。参见例如West等，Applications ofNanotechnology to Biotechnology(2000)，11：215-217；美国5,620,708、美国5,702,727和美国6,530,944。已经描述了抗体或结合分子缀合于脂质体从而形成治疗剂或诊断剂的靶向载体。参见例如Bendas，Biodrugs(2001)，15：215-224；Xu等，Mol.Cancer Ther(2002)，1：337-346；Torchilin等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.美国(2003)，100：6039-6044；Bally等，J.LiposomeRes.(1998)，8：299-335；Lundberg，Int.J.Pharm.(1994)，109：73-81；Lundberg，J.Pharm.Pharmacol.(1997)，49：16-21；Lundberg，Anti-cancer Drug Design(1998)，13：453-461。也参见美国6,306,393、美国系列号10/350,096、美国系列号09/590,284和1999年5月9号申请的美国系列号60/138,284。所有文献通过引用并入本文中。
[0053]广泛的、各式各样的诊断剂或治疗剂可方便的用于形成生物活性装配体的缀合物，或者可连接到结合生物活性装配体识别位点的半抗原上。诊断剂可包括放射性同位素、MRI中使用的增强剂或用于超声成像的造影剂，和荧光化合物。本领域已知许多适当的显像剂以及它们附着到蛋白质或肽的方法(参见美国专利第5,021,236号和第4,472,509号，二者均通过引用并入本文中)。特定的连接方法涉及采用金属螯形络合物例如有机螯合剂比如DTPA连接于蛋白质或肽(美国专利第4,472,509号)。
[0054]为了用放射性金属或顺磁性离子装载生物活性装配体，可需要将其与其中已经连接用于结合放射性金属或顺磁性离子的螯合基的多个拷贝的载体反应。这种载体可为聚赖氨酸、多糖，或具有可结合螯合基的衍生的或可衍生的多聚物质例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、二-缩氨基硫脲、聚肟(polyoximes)等已知的适用于此目的的物质。含有螯合物的载体可用最小聚集和丧失免疫反应性最少的标准化学方法偶联到生物活性装配体。
[0055]在美国第4,824,659号中公开了可用来制备这些缀合物的其他方法和反应剂，其全部内容通过引用并入本文中。特别有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其一甲基和环己基类似物，可与总能量范围为60-4,000keV的诊断性同位素联用。一些有用的诊断性核素可包括¹²⁴I、¹⁸F、⁵²Fe、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁹⁴Tc、^94mTc、^99mTc或¹¹¹In。如果与本文所述生物活性装配体和载体联用，与非放射性金属例如锰、铁和钆络合的相同螯合物适用于MRI。大环螯合物例如NOTA、DOTA和TETA适于和多种金属和射电金属，最特别分别与镓、钇和铜的放射性核素联用。可通过设计环大小使之适合感兴趣金属，从而非常稳定地制备这种金属-螯形络合物。可使用其他环型螯合物例如大环聚醚用于络合²²³Ra。
[0056]治疗剂包括例如化学治疗药物例如长春花生物碱、蒽环类抗生素、表叶毒素、紫杉烷类、抗代谢物、烷化剂、抗生素、Cox-2抑制剂、抗有丝分裂物质、抗血管生成剂和促凋亡剂，尤其是多柔比星、氨甲喋呤、紫杉酚、CPT-11、SN-38、喜树碱(camptothecans)，及其它这类或其他种类的抗癌剂等。其他癌化学治疗药物包括氮芥、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、铂配位络合物、激素等。在REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第19版(Mack Publishing Co.1995)及在GOODMAN AND GILMAN′S THEPHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，第7版(MacMillanPublishing Co.1985)以及这些出版物的修订版中描述了适当的化学治疗剂。其他适当的化学治疗剂例如实验性药物为本领域技术人员已知，并可使用本领域已知的方法缀合于本文所述生物活性装配体。
[0057]其他类别的治疗剂包括发射α-粒子(例如²¹²Pb、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹¹At、²²³Ra、²²⁵Ac)，发射β-粒子(例如³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、⁸⁹Sr、⁹⁰Y、¹¹¹Ag、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴²Pr、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁶Dy、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re)，或发射俄歇电子(例如¹¹¹In、¹²⁵I、⁶⁷Ga、¹⁹¹Os、¹⁹³mPt、¹⁹⁵mPt、¹⁹⁵mHg)的放射性核素。可用一种或多种上述放射性核素使用诊断剂中描述的方法标记生物活性装配体。
[0058]在美国专利系列号6,309,633中公开了适于作为效应器的示例性治疗肽或蛋白质(通过引用并入本文中)，且其可包括例如：促肾上腺皮质激素(ACTH)、促肾上腺皮质激素衍生物(例如依比拉肽)、血管紧张素、血管紧张素II、天冬酰胺酶、心钠肽、心钠利尿肽、杆菌肽、β-内啡肽、凝血因子VII、VIII和IX、血液胸腺因子(FTS)、血液胸腺素衍生物(参见美国专利第4,229,438号)、铃蟾肽、骨形态发生因子(BMP)、骨形态形成性蛋白质、缓激肽、雨蛙肽、降钙素基因相关多肽(CGRP)、降钙素、CCK-8、细胞生长因子(例如EGF、TGF-α、TGF-β、PDGF、酸性FGF、碱性FGF)，浅蓝菌素(cerulein)、趋化因子、胆囊收缩素、胆囊收缩素-8、胆囊收缩素-促胰酶素(CCK-PZ)、多粘菌素、集落刺激因子(例如CSF、GCSF、GMCSF、MCSF)，促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、细胞因子、去氨加压素、dinorphin、二肽、超氧化剂物歧化酶、强啡肽、章鱼素、内啡肽、内皮素、内皮素拮抗肽(endothelin-antagonistic peptides)(参见欧洲专利公开号436189、457195和496452，日本专利未检验公开号94692/1991和130299/1991)、endotherins、脑啡肽、脑啡肽衍生物(参见美国专利第4,277,394号及欧洲专利公开号31567)，表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、促卵胞激素(FSH)、gallanin、胃抑制性多肽、胃泌素释放多肽(GRP)、胃泌素、G-CSF、高血糖素、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathio-peroxidase)、促性腺素(例如人绒毛膜促性腺激素及其α、β亚基)，短杆菌肽、短杆菌肽(gramicidines)、生长因子(EGF)、生长激素释放因子(GRF)、生长激素、激素释放激素(LHRH)、人心尿钠排泄多肽(h-ANP)、人胎盘催乳激素、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)、干扰素、干扰素类(例如α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素)，白介素(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)、肠多肽(VIP)、激肽释放酶、京都啡肽、促黄体激素释放激素、促黄体发生激素(LH)、促黄体激素-释放激素(LH-RH)、氯化溶菌酶制剂、MSH促黑激素(MSH)、MSH黑素细胞刺激素、mellitin、胃动素、胞壁酰、胞壁酰二肽、神经生长因子(NGF)、神经营养因子(例如NT-3、NT-4、CNTF、GDNF、BDNF)，神经肽Y、神经降压素、催产素、胰抑素、胰多肽、促胰酶素、甲状旁腺激素(PTH)、五肽胃泌素、多肽YY、垂体腺苷酸环化酶-激活多肽(PACAPs)、血小板衍生的生长因子、polymixin B、催乳素、蛋白质合成刺激多肽、PTH-关联蛋白、松弛肽、肾素、肠促胰液素、血清胸腺因子、促生长因子、生长激素抑制素、生长激素抑制素衍生物(善得定，参见美国专利第4,087,390号、第4,093,574号、第4,100,117号和第4,253,998号)，P物质、过氧化物、超氧化物歧化酶、taftsin、四肽胃泌素、血小板生成素(TPO)、胸腺体液因子(THF)、胸腺生成素、胸腺肽、噻莫母林、甲状腺激素释放激素、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、胰蛋白酶、吞噬刺激肽、肿瘤生长因子(TGF-α)、肿瘤坏死因子(TNF)、短杆菌酪肽(tyrocidin)、尿抑胃激素、尿激酶、肠血管活性多肽、抗利尿激素及这些多肽的功能等价物。
[0059]含有可检测标记(例如荧光分子)或细胞毒剂(例如放射性碘)的适当的肽可与生物活性装配体共价、非共价或其他方式连接。例如可通过光敏剂或染料结合于生物活性装配体得到治疗上有利的缀合物。荧光组合物例如荧光染料及其他色原体或染料例如对可见光敏感的卟啉已经通过相配光直接照射损伤用于检测和治疗损伤。在治疗上术语称为光辐射、光线疗法或光动力学治疗。参见Jori等(eds.)，PHOTODYNAMICTH ERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto1985)；van den Bergh，Chem.Britain(1986)，22：430。而且为光线疗法单克隆抗体与光敏化染料偶联。参见Mew等，J.Immunol.(1983)，130：1473；idem.，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；idem.，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等，Cancer(1991)，67：2529。也考虑内窥镜检查应用。Endoscopic methods of detection and therapy are described in U.S.在美国4,932,412、美国5,525,338、美国5,716,595、美国5,736,119、美国5,922,302、美国6,096,289和美国6,387,350中公开了内窥镜检查的检测和治疗方法，其全部内容通过引用并入本文中。
[0060]在某些实施方案中，本文公开的新型构建体和方法适于靶向递送RNAi用于治疗性干涉。递送载体可为具融合于人鱼精蛋白(小于等于50个氨基酸残基的肽)的内化(internalizing)抗体结合域的生物活性装配体。一个实例为生物活性装配体，包含人鱼精蛋白1(hP1)和/或人鱼精蛋白2(hP2)，二者均能够形成稳定的DNA或RNA复合体，例如体内应用的RNAi(Nat Biotechnol.23：709-717，2005；Gene Therapy.13：194-195，2006)。这种多价复合体促进结合于靶细胞或受体介导的内化入靶细胞，其中在含内体中非共价结合的RNAi解离并释放到细胞质中。除了RNAi的递送外，这些构建体也可适用于治疗性基因或DNA疫苗的靶向递送。另一有利的方面是应用这种技术制备细胞内抗体，从功能上说其是RNAi的蛋白质类似物。
肽给药法
[0061]要求保护的方法和/或组合物的各种实施方案可涉及给予受试者一种或多种基于生物活性装配体的肽。可通过本领域已知的各种途径给予，包括但不限于口服、经鼻、口腔给予、吸入、直肠、阴道、局部给予、正位给药、皮内、皮下、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内或静脉注射给予。
[0062]口服给予受试者的未修饰肽可在消化道内降解，且根据序列和结构可显示穿过肠内层的吸收不佳。但是已熟知用化学方法修饰肽从而降低其对内源性蛋白酶降解的敏感性或增加其通过消化道的吸收(参见例如Blondelle等，1995，Biophys.J.69：604-11；Ecker和Crooke，1995，Biotechnology 13：351-69；Goodman和Ro，1995，BURGER’S MEDICINALCHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY，VOL.I，ed.Wollf，John Wiley &Sons；Goodman和Shao，1996，Pure & Appl.Chem.68：1303-08)。也已经描述了制备肽类似物，例如含有D-氨基酸的肽的文库；包括模拟肽结构的有机分子的肽模拟物；或拟肽例如插烯(vinylogou)拟肽的方法，且可用于构建基于适合受试者口服的生物活性装配体的肽。
[0063]在某些实施方案中，标准的肽键连接可被一种或多种其它连接基团取代，例如CH₂-NH、CH₂-S、CH₂-CH₂、CH＝CH、CO-CH₂、CHOH-CH₂等。已熟知用于制备肽模拟物的方法(例如Hruby，1982，Life Sci31：189-99；Holladay等，1983，Tetrahedron Lett.24：4401-04；Jennings-White等，1982，Tetrahedron Lett.23：2533；Almquiest等，1980，J.Med.Chem.23：1392-98；Hudson等，1979，Int.J.Pept.Res.14：177-185；Spatola等，1986，Life Sci 38：1243-49；美国专利第5,169,862号、第5,539,085号、第5,576,423、第5,051,448号、第5,559,103号，各自通过引用并入本文中)。与其肽类似物相比，肽模拟物可显示出提高的体内的稳定性和/或吸收。
[0064]或者，可通过使用N-末端和/或C-末端加帽以防止肽链端解酶活性，从而口服给予肽。例如C-末端可使用酰胺肽加帽而N-末端可通过肽乙酰化加帽。也可将肽环化来阻断肽链端解酶，例如通过形成环状酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。
[0065]也可通过用D-氨基酸替换天然存在的L-氨基酸稳定肽，特别是在已知的肽链内切酶作用部位替换。本领域已知肽链内切酶结合和切割的序列，且已经描述了制备和使用掺入D-氨基酸的肽的方法(例如McBride等2004年6月14号申请的美国专利申请号20050025709，通过引用并入本文中)。在某些实施方案中，肽和/或蛋白质可通过与蛋白水解酶抑制剂和/或肽酶抑制剂共制备，口服给予。
[0066]在Mehta(“Oral delivery and recombinant production of peptidehormones，”(肽激素的口服给药和重组制备)2004年6月，BioPharmInternational)中公开了治疗性肽的口服给药的其他方法。给予包有肠溶衣的固体剂型形式的肽和赋形剂，其中赋形剂调节肠蛋白水解活性并提高肽的跨肠壁转运。使用这种技术完整肽的相对生物利用度在给药剂量的1％-10％范围内。使用包有肠溶衣的微胶囊已经成功的给予狗胰岛素和牛胆酸钠与蛋白酶抑制剂(Ziv等，1994，J.Bone Miner.Res.18(Suppl.2)：792-94)。已经使用酰基肉毒碱作为渗透促进剂及肠溶衣完成肽口服给药(Eudragit L30D-55，Rohm Pharma Polymers，参见Mehta，2004)。用于口服给予肽的赋形剂可通常包括一种或多种肠蛋白酶/肽酶的抑制剂、去污剂或其他药物从而提高肽的溶解度或吸收，其可包装于包有肠溶衣的胶囊或片剂中(Mehta，2004)。胶囊中可包括有机酸，当胶囊在肠中溶解时酸化肠且抑制肠蛋白酶活性(Mehta，2004)。用于口服递送肽的的另一种选择包括缀合于基于聚乙二醇(PEG)的两性分子低聚物，增加吸收并抑制酶的降解(Soltero和Ekwuribe，2001，Pharm.Technol.6：110)。
[0067]在其它又一些实施方案中，可通过缀合于特定蛋白质例如IgG1的Fc区而修饰肽，用于口服或吸入给予(参见实施例3-7)。例如在Low等.(2005，Hum.Reprod.20：1805-13)和Dumont等(2005，J.Aerosol.Med.18：294-303)中公开了肽-Fc缀合物的制备和使用方法，各自通过引用并入本文中。Low等(2005)公开了FSH的α和β亚基以单链或异源二聚体形式缀合于IgG1的Fc区，使用重组技术在CHO细胞中表达。通过新生儿Fc受体介导的转运系统经肺或肠上皮细胞吸收缀合Fc的肽。与天然肽相比，缀合Fc的肽显示出提高的稳定性和体内吸收。也观察到异源二聚体缀合物比单链形式更具活性。
蛋白质和肽
[0068]可使用在要求保护的方法和组合物内的许多种多肽或蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质可包含包括抗原结合位点的抗体或抗体片段的蛋白质。本文所用的蛋白质、多肽或肽通常是指但不限于最多全长序列均自基因翻译的超过约200个氨基酸的蛋白质，超过约100个氨基酸的蛋白质，和/或约3-约100个氨基酸的肽。为了方便起见，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”文中可互换使用。相应的术语“蛋白质或肽”包括包含天然存在蛋白质中发现的20种普通氨基酸中至少一种的氨基酸序列，或至少一种修饰后或不常见氨基酸。
[0069]本文所用“氨基酸残基”指本领域已知的任何天然存在的氨基酸，任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质或肽的残基为连续的，没有任何中断氨基酸序列的非氨基酸。在另一些实施方案中，序列可包含一种或多种非氨基酸部分。在特定的实施方案中，蛋白质或肽的残基序列可被一种或多种非氨基酸部分中断。
[0070]相应的，术语“蛋白质或肽”指氨基酸序列，该序列包含至少一种在天然存在的蛋白质中发现的20种普通氨基酸，或至少一种包括但不限于下列所示的修饰的或不常见氨基酸。


[0071]可通过本领域已知的任何技术制备蛋白质或肽，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源分离蛋白质或肽或化学合成蛋白质或肽。以前已经公开了与各种基因相对应的核苷酸、蛋白质、多肽和肽序列，且本领域普通技术人员可在计算机化数据库中找到。一种这样的数据库为National Center for Biotechnology Information’sGenbank and GenPept databases(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。可使用本文公开的技术或为本领域技术人员已知的技术扩增和/或表达已知基因的编码区。或者本领域技术人员知道各种商品化的蛋白质、多肽和肽制品。
肽模拟物
[0072]制备多肽的另一种实施方案为使用肽模拟物。模拟物为模拟蛋白质二级结构元件的含有肽的分子。参见例如Johnson等，“Peptide TurnMimetics”in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY，Pezzuto等，Eds.，Chapman和Hall，New York(1993)，通过引用并入本文。肽模拟物的使用基本原理是，蛋白质的肽主链的存在主要用来定向氨基酸侧链以便于分子间相互作用，例如抗体和抗原见的相互作用。预期肽模拟物能使分子间相互作用类似于天然分子。
融合蛋白
[0073]各种实施方案可涉及融合蛋白。这些分子通常具有肽的全部或大部分，在其N-末端或C-末端连接于第二种肽或蛋白质的全部或部分。本领域技术人员已熟知产生融合蛋白的方法。例如可使用双功能交联剂通过化学结合，通过完整融合蛋白的从头合成，或者通过将编码第一种蛋白质或肽的DNA序列连接于编码第二种肽或蛋白质的DNA序列，然后表达这种完整融合蛋白制成这种蛋白质。
合成肽
[0074]可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成完整或部分蛋白质或肽。根据已知资料可商业购得并可使用各种自动合成仪。参见例如Stewart和Young，(1984，Solid Phase Peptide Synthesis，2d.ed.，PierceChemical Co.)；Tam等，(1983，J.Am.Chem.Soc.，105：6442)；Merrifield，(1986，Science，232：341-347)；Barany和Merrifield(1979，The Peptides，Gross and Meienhofer，eds.，Academic Press，New York，第1-284页)。通过这种方法可容易的合成通常约6至约35-50个氨基酸的短肽序列。或者，可采用重组DNA技术，其中编码感兴趣肽的核苷酸序列插入到表达载体中，转化或转染适当的宿主细胞，并培养在适当条件下进行表达。
抗体
[0075]各种实施方案可涉及用于靶向的抗体。本文所用术语“抗体”是指具有抗原结合区，且包括抗体片段例如Fab’、Fab、F(ab’)₂、单域抗体(DABs)、Fv，scFv(单链抗体Fv)等的任何抗体样分子。本领域已熟知多种基于抗体的构建体和片段的制备技术和用途。本领域也已经熟知抗体的制备和鉴定方法(参见例如Harlowe和Lane，1988，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory)。也可自广泛的各种已知途径商业购得所用的抗体。例如自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，Manassas，VA)可得到许多种分泌型抗体杂交瘤系。包括但不限于肿瘤相关抗原的大量抗各种疾病靶标的抗体已经保藏于ATCC并可用于要求保护的方法和组合物中。(参见例如美国专利号7,060,802、7,056,509、7,049,060、7,045,132、7,041,803、7,041,802、7,041,293、7,038,018、7,037,498、7,012,133、7,001,598、6,998,468、6,994,976、6,994,852、6,989,241、6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、6,949,244、6,946,129、6,943,020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、8,783,758、6,770,450、6,767,711、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,15、6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,652,852、6,635,482、6,630,144、6,610,833、6,610,294、6,605,441、6,605,279、6,596,852、6,592,868、6,576,745、6,572；856、6,566,076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206、6,441,143、6,432,404、6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,274、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、6,340,459，对于分泌型抗体杂交瘤细胞系的ATCC保藏号及抗体或抗体片段的相关靶标抗原，各自内容均通过引用并入本文中)。这些仅为示例性的而本领域中已知广泛的、各式各样的其他分泌型抗体杂交瘤。技术人员将认识到抗几乎所有疾病相关抗原的分泌型抗体杂交瘤可通过简单检索ATCC、PubMed和/或USPTO数据库中抗选定的感兴趣的疾病相关靶的抗体即可获得。
抗体片段的产生
[0076]要求保护的方法和/或组合物的一些实施方案可涉及抗体片段。可通过常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体获得这种抗体片段。例如可通过用胃蛋白酶酶切抗体产生抗体片段而提供F(ab′)₂片段。该片段可进一步用巯基还原剂切割，然后任选用保护基保护二硫键断裂产生的巯基，从而产生Fab′单价片段。或者使用番木瓜蛋白酶酶切产生两种单价Fab片段和Fc片段。在美国专利第4,036,945号、美国专利第4,331,647号，Nisonoff等，1960，Arch.Biochem.Biophys.，89：230；Porter，1959，Biochem.J.，73：119；Edelman等，1967，METHODS INENZYMOLOGY，第422页(Academic Press)和Coligan等，(eds.),1991，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，(John Wiley & Sons)中公开了产生抗体片段的示例性方法。
[0077]也可使用切割抗体的其它方法，例如分离重链形成单价轻链-重链片段，进一步切割片段，或使用其它酶切、化学或遗传学技术，使片段结合于完整抗体识别的抗原。例如Fv片段包含V_H链和V_L链的缔合。这种缔合可为非共价的，如Inbar等，1972，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，69：2659所述。或者，可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学物质例如戊二醛交联。参见Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。
[0078]优选的Fv片段包含通过肽接头结合的V_H和V_L链。通过构建包含编码由寡核苷酸接头序列连接的V_H和V_L域的DNA序列的结构基因，制备单链抗原结合蛋白(sFv)。将结构基因插入到表达载体，然后引入到宿主细胞例如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成带有桥接这两个V域的接头肽的单多肽链。本领域中熟知产生sFv’s的方法。参见Whitlow等，1991，Methods：A Companion to Methods in Enzymology(酶学方法手册)2：97；Bird等，1988，Science，242：423；美国专利第4,946,778号；Pack等，1993，Bio/Technology，11：1271，和Sandhu，1992，Crit.Rev.Biotech.，12：437。
[0079]另一种形式的抗体片段为编码单个互补性决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可通过构建编码感兴趣抗体CDR的基因获得。例如通过使用聚合酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区来制备这种基因。参见Larrick等，1991，Methods：A Companion to Methods inEnzymology 2：106；Ritter等(eds.)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，第166-179页(Cambridge University Press)；Birch等，(eds.)，1995，MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，第137-185页(Wiley-Liss，Inc.)。如果分泌抗体的杂交瘤细胞系是公众可以得到的，则可将编码抗原结合特异性的CDR序列直接拿来，掺入嵌合抗体或人源化抗体并使用。
嵌合抗体和人源化抗体
[0080]嵌合抗体为重组蛋白质，其中人抗体的可变区被例如包括小鼠抗体的互补性决定区(CDRs)的小鼠抗体的可变区取代。当给予受试者时，嵌合抗体显示出免疫原性降低而稳定性增加。本领域已熟知构建嵌合抗体的方法(例如Leung等，1994，Hybridoma 13：469)。
[0081]可通过将小鼠CDRs自小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链转移入相应人抗体的可变域来人源化嵌合单克隆抗体。小鼠嵌合单克隆抗体中的框架区(FR)也用人FR序列取代。为保护人源化单克隆的稳定性和抗原特异性，可用小鼠对应残基取代一种或多种人FR残基。人源化单克隆抗体可用于治疗受试者。也可通过选择性修饰CDR序列提高人源化抗体对靶标的亲和力(WO0029584A1)。本领域已熟知产生人源化单克隆抗体的技术。(参见例如Jones等，1986，Nature，321：522；Riechmann等，Nature，1988，332：323；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534；Carter等，1992，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA，89：4285；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.，1992，12：437；Tempest等，1991，Biotechnology9：266；Singer等，J.Immunol.，1993，150：2844)。
[0082]其它实施方案可涉及非人类的灵长类抗体。例如在Goldenberg等，WO91/11465(1991)和Losman等，Int.J.Cancer 46：310(1990)中描述了用于产生治疗上有效的狒狒抗体的通用技术。
人抗体
[0083]本领域已知使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化转基因动物产生全人抗体的方法(例如Mancini等，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50；各自通过引用并入本文)。这种全人抗体预期比嵌合或人源化抗体显示出更少的副作用，并且在体内的功能基本与内源性人抗体相同。在某些实施方案中，要求保护的方法和步骤可利用通过这种技术制成的人抗体。
[0084]在一个备选方案中，可使用噬菌体展示技术产生人抗体(例如Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40，通过引用并入本文)。可自正常人或自显示特定疾病状态的人例如癌患者(Dantas-Barbosa等，2005)产生人抗体。自患病个体构建人抗体的优势在于，循环抗体库可偏向(biased towards)抗疾病相关抗原的抗体。
[0085]在这种方法论的非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)自骨肉瘤患者构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，总RNA得自循环血淋巴细胞(Id.)。重组Fab克隆自μ、γ和κ链抗体库并插入到噬菌体展示文库(Id.)中。使用抗免疫球蛋白重链和轻链序列的特异性引物将RNAs转化为cDNAs，并用来制造Fab cDNA文库(Marks等，1991，J.Mol.Biol.222：581-97，通过引用并入本文)。按照Andris-Widhopf等(2000，In：Phage Display Laboratory Manual，Barbas等(eds)，第一版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY第9.1-9.22页，通过引用并入本文)进行文库构建。用限制性内切酶消化最终的Fab片段并插入到噬菌体基因组中来制造噬菌体展示文库。可通过本领域已知的标准噬菌体展示方法筛选这种文库。技术人员将认识到，这种技术仅为示例性的并且可利用噬菌体展示制造与筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
[0086]在另一个备选方案中，使用标准免疫方案，经基因工程改造产生人抗体的转基因动物可用于生产抗基本上所有致免疫性靶标的抗体。这种系统的非限制性实例为得自Abgenix(Fremont，CA)的XenoMouse(例如Green等，1999，J.Immunol.Methods 231：11-23，通过引用并入本文)。在XenoMouse和类似动物中，小鼠抗体基因已经灭活并被功能性人抗体基因取代，同时其余的小鼠免疫系统保留完整。
[0087]用种系配置的(germline-configured)YACs(酵母人工染色体)转化XenoMouse，YACs含有部分人IgH和Igκ基因座，其中包括大多数可变区序列，以及附加基因和调节序列。人可变区库可用来产生产抗体B细胞，可通过已有技术将该B细胞加工为杂交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse通过正常免疫反应产生人抗体，其可通过上面讨论的标准技术收获和/或产生。可得到各种品系的XenoMouse，每种能产生不同种类的抗体。这种人抗体可通过化学交联或其他已知方法偶联到其他分子。转基因方法产生的人抗体经证明具有治疗潜力，同时保留正常人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。技术人员将认识到要求保护的组合物和方法不限于使用XenoMouse系统，而是可利用任何转基因动物通过基因工程产生人抗体。
预先靶向(Pre-Targeting)
[0088]一种双特异性生物活性装配体的使用策略包括预先靶向方法，其中在给予受试者双特异性装配体后给予效应器部分。包括效应器、半抗原或载体和患病组织的结合位点的双特异性装配体定位在患病组织并提高效应器对患病组织的定位特异性(美国专利申请第20050002945号)。因为效应器分子自循环清除的速率可比双特异性装配体的快的多，所以如果采用预先靶向策略，相比于效应器分子直接连接于患病靶抗体，正常组织可减少接触效应器分子。
[0089]已经发展了预先靶向方法来提高检测或治疗剂的靶标：本底(target：background)比率。在例如Goodwin等，美国专利第4,863,713号；Goodwin等，J.Nucl.Med.29：226，1988；Hnatowich等，J.Nucl.Med.28：1294，1987；Oehr等，J.Nucl.Med.29：728，1988；Klibanov等，J.Nucl.Med.29：1951，1988；Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30：66，1989；Kalofonos等，J.Nucl.Med.31：1791，1990；Schechter等，Int.J.Cancer 48：167，1991；Paganelli等，Cancer Res.51：5960，1991；Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12：211，1991；美国专利第5,256,395号；Stickney等，Cancer Res.51：6650，1991；Yuan等，Cancer Res.51：3119，1991；美国专利第6,077,499号；美国系列号09/597,580；美国系列号10/361,026；美国系列号09/337,756；美国系列号09/823,746；美国系列号10/116,116；美国系列号09/382,186；美国系列号10/150,654；美国专利第6,090,381号；美国专利第6,472,511号；美国系列号10/114,315；美国临时申请号60/386,411；美国临时申请号60/345,641；美国临时申请号60/3328,835；美国临时申请号60/426,379；美国系列号09/823,746；美国系列号09/337,756；美国临时申请号60/342,103中描述了预先靶向的实例和生物素/卵白素方法的实例，所有其内容通过引用并入本文中。
[0090]在某些实施方案中，双特异性装配体和可靶向构建体可有利于治疗和/或成像正常或患病组织或器官，例如使用在美国专利第6,126,916号、第6,077,499号、第6,010,680号、第5,776,095号、第5,776,094号、第5,776,093号、第5,772,981号、第5,753,206号、第5,746,996号、第5,697,902号、第5,328,679号、第5,128,119号、第5,101,827号和第4,735,210号中所述方法，各自通过引用并入本文中。在1999年6月22号申请的美国专利申请系列号09/337,756和2001年4月3号申请的美国专利申请系列号09/823,746中描述了其它方法。
适体
[0091]在某些实施方案中，用于生物活性装配体形成的前体可包含适体。构建及确定适体结合性质的方法为本领域所熟知。例如在美国专利第5,582,981号、第5,595,877号和第5,637,459号中描述了这种技术，各自通过引用并入本文中。
[0092]可通过任何已知方法包括合成、重组和提纯方法制备适体，并可单独使用或与相同靶向特异性的其他配体组合使用。通常至少大约3个核苷酸，优选至少5个核苷酸为影响特异性结合所必需的。虽然可优选10、20、30或40个核苷酸的适体，但是小于10个碱基的适体序列可能是适宜的。
[0093]适体需要含有赋予结合特异性的序列，但是可使用侧翼区进行扩展和其它方式衍生化。在优选的实施方案中，适体的结合序列侧面相接的可为引物结合序列，促进适体经PCR或其它扩增技术扩增。在另一个实施方案中，侧翼序列可包含优先识别或结合某一组成成分以增强适体与底物的固定作用的特异性序列。
[0094]适体可作为常规DNA或RNA分子进行分离、测序和/或扩增或合成。或者，感兴趣的适体可包含修饰后的低聚物。适体中通常存在的任何羟基可被膦酸基团、磷酸基取代，用标准保护基团保护，或被活化以产生与其它核苷酸的额外连接键，或可缀合于固体载体上。一种或多种磷酸二酯键可由可选择的连接基团取代，例如P(O)S、P(O)NR₂、P(O)R、P(O)OR′、CO或CNR₂取代P(O)O，其中R为H或烷基(1-20C)，R′为烷基(1-20C)，另外，这种基团可经O或S连接于邻近核苷酸。并非低聚物中所有键均需要相同。
[0095]已经熟知制备和筛选结合于特定的感兴趣靶点的适体的方法，例如美国专利第5,475,096号和美国专利第5,270,163号的方法，各自通过引用并入本文中。这种技术通常涉及从候选适体混合物中选择及分步重复结合、自未结合适体分离出结合的适体并扩增。因为在混合物中仅有少量相应于最高亲和力适体的序列(可能仅有一分子的适体)，通常需要设定分配标准使分离期间混合物中保留显著量的适体(约5％-50％)。每个循环导致对靶标具高亲和力的适体的富集。可重复进行3-6个选择和扩增循环，以产生高亲和力及特异性结合于靶标的适体。
Avimers
[0096]在某些实施方案中，本文所述外周组件和/或装配体可包含一种或多种avimer序列。Avimers为一类对多种靶分子的亲和力和特异性多少类似于抗体的结合蛋白。通过体外外显子改组和噬菌体展示自人细胞外受体开发(Silverman等，2005，Nat.Biotechnol.23：1493-94；Silverman等，2006，Nat.Biotechnol.24：220.)。所得多域(multidomain)蛋白可包含亲和力(一些情况下亚纳摩尔(subnanomolar))和特异性比单-表位结合蛋白提高的多个独立结合域。(Id.)在各种实施方案中，avimers可连接于例如在要求保护的方法和组合物中使用的DDD和/或AD序列。例如在美国专利申请公开号20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384中公开了关于avimers构建和使用的详细方法，每个文献的实施例部分通过引用并入本文。
疾病组织检测、诊断和成像的方法
基于蛋白质的体外诊断
[0097]本发明考虑使用生物活性装配体体外和/或体内筛选存在疾病相关抗原的生物样品。在示例性免疫测定中，如下所述可利用液相中或结合于固相载体中的包含抗体、融合蛋白或其片段的生物活性装配体。在优选的实施方案中，尤其是涉及体内给药时抗体或其片段为人源化的。也优选完整人抗体或抗体片段。仍更优选的，融合蛋白包含人源化的或完整人抗体。技术人员将认识到，许多用于测定特定基因表达水平的技术是已知的，可使用任何这种已知的方法，例如免疫测定、RT-PCR、mRNA纯化和/或cDNA制备，然后与基因表达测定芯片杂交，来测定个体受试者和/或组织中表达水平。适用的示例性体外测定包括RIA、ELISA、夹心酶联免疫分析、蛋白质印迹、槽印迹、点印迹法等。虽然使用完整抗体发展了这种技术，但是可使用掺有抗体、抗体片段或其它结合部分的生物活性装配体。
[0098]掺有抗体、融合蛋白、抗体片段和/或其它结合部分的生物活性装配体也可用来检测从组织学样本制备的组织切片中的靶抗原。这种原位检测可用来确定抗原的存在并确定在检验组织中抗原的分布。可通过应用可检测标记的装配体至冰冻的或石蜡包埋的组织切片进行原位检测。原位检测的通用技术为普通技术人员所熟知。参见例如Ponder，＂CellMarking Techniques and Their Application，＂(细胞标记技术及应用)inMAMMALIAN DEVELOPMENT：A PRACTICAL APPROACH 113-38Monk(ed.)(IRL出版1987)，and Coligan在第5.8.1-5.8.8页。
[0099]可用任何适当的标记部分，例如放射性同位素、酶、荧光标记、染料、色原体、化学发光标记(chemiluminescent label)、生物发光标记或顺磁性标记可检测性标记生物活性装配体。
[0100]标记部分可为放射性同位素，通过使用γ计数器或β-闪烁计数器或通过放射自显影法检测。在优选的实施方案中，诊断性缀合物为γ辐射同位素、β辐射同位素、或正电子-辐射同位素。标记部分是指在预定条件下产生信号的分子。标记部分的实例包括放射性同位素、酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光Kennedy等，Clin.Chim.Acta 70：1(1976)，Schurs等，Clin.Chim.Acta 81：1(1977)，Shih等，Int′l J.Cancer 46：1101(1990)中描述了这方面的典型方法论。
体内诊断
[0101]已熟知用标记性肽或MAbs的诊断性成像的方法。例如在免疫闪烁成像技术中，用γ辐射放射性同位素标记配体或抗体并引入患者体内。使用γ射线照相机检测γ辐射放射性同位素的定位和分布。参见例如Srivastava(ed.)，RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIESFOR IMAGING AND THERAPY(Plenum出版1988)，Chase，＂MedicalApplications of Radioisotopes，＂(放射性同位素的医学应用)inREMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Gennaro等(eds.)，第624-652页(Mack Publishing Co.，1990)，和Brown，＂Clinical Useof Monoclonal Antibodies，＂(单克隆抗体的临床应用)inBIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49，Pezzuto等(eds.)(Chapman & Hall 1993)。也优选使用发射正电子的放射性核素(PET同位素)，例如具有511keV的能量，例如¹⁸F、⁶⁸Ga、⁶⁴Cu和¹²⁴I。可通过直接标记生物活性装配体，或通过如在Goldenberg等，“Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection andRadioimmunotherapy，”(预先靶向抗体放射免疫检测和放射免疫治疗晚期癌症)(J Clin Oncol 2006；24：823-834)中所述的预先靶向(pretargeted)成像方法介导这种成像，也参见美国专利公开第20050002945号、第20040018557号、第20030148409号和第20050014207号，各自通过引用并入本文中。
[0102]通过选择能够使半衰期最短、体内存留最少及允许检测和精确测量的同位素的量最少这三者达到最佳组合的同位素，将递送到患者体内的放射剂量维持在尽可能低的水平。适于诊断性成像的放射性同位素的实例包括^99mTc和¹¹¹In。
[0103]为体内诊断的目的，生物活性装配体或结合于它们的半抗原或载体也可用顺磁性离子及各种放射性造影剂标记。特别适于核磁共振成像的造影剂包含钆、锰、镝、镧或铁离子。其它药物包括铬、铜、钴、镍、铼、铕、铽、钬或钕。配体、抗体及其片段也可缀合于超声造影剂/增强剂。例如一种超声造影剂为包含人源化IgG或其片段的脂质体。也优选这种超声造影剂为充填气体的脂质体。
显像剂和放射性同位素
[0104]本领域已知许多适当的显像剂及将其连接于蛋白质或肽的方法(参见例如美国专利第5,021,236号和第4,472,509号，二者内容通过引用并入本文)。某些连接方法涉及使用例如采用有机螯合剂比如连接于蛋白质或肽的DTPA金属螯形络合物(美国专利第4,472,509号)。在偶联剂例如戊二醛或高碘酸盐存在下，蛋白质或肽也可与酶反应。在偶联剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备用荧光素标记的缀合物。
[0105]潜在的用作显像剂的顺磁性离子的非限制性实例包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)，特别优选钆。用于文中其它部分例如X线显像使用的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，及特别的铋(III)。
[0106]用于成像的潜在的放射性同位素或治疗剂包括砹²¹¹、碳¹⁴、Cr⁵¹、氯³⁶、钴⁵⁷、钴⁵⁸、铜⁶²、铜⁶⁴、铜⁶⁷、Eu¹⁵²、氟¹⁸、镓⁶⁷、镓⁶⁸、氢³、碘¹²³、碘¹²⁴、碘¹²⁵、碘¹³¹、铟¹¹¹、铁⁵²、铁⁵⁹、镥¹⁷⁷、磷³²、磷³³、铼¹⁸⁶、铼¹⁸⁸、Sc⁴⁷、硒⁷⁵、银¹¹¹、硫³⁵、锝^94m、锝^99m、钇⁸⁶和钇⁹⁰、锆⁸⁹。由于其能量低且适于大范围测量，I¹²⁵经常优选用在某些实施方案中，锝^99m和铟¹¹¹也经常优选使用。
[0107]可根据本领域中熟知技术制备放射性标记蛋白质或肽。例如它们可通过与碘化钠或碘化钾及化学氧化剂例如次氯酸钠或酶氧化剂例如乳酸过氧化物酶接触而碘化。可用锝^99m通过配体交换方法标记蛋白质或肽，例如通过用二价锡溶液还原性高锝酸盐(pertechnate)，将还原的锝螯合到葡聚糖凝胶柱上并将肽上柱，或者通过直接标记技术，例如通过孵育高锝酸盐、还原剂例如SNCl₂、缓冲液例如酞酸钠-钾溶液和肽进行标记。经常用于将以金属离子形式存在的放射性同位素与肽结合的中间功能团包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、卟啉螯合剂和乙二胺四乙酸(EDTA)。也考虑使用荧光素标记，包括若丹明、异硫氰酸荧光素和肾造影剂。
[0108]在某些实施方案中，蛋白质或肽可连接于第二种结合配体或酶(一种酶标签)产生一种与显色底物有关的显色产物。适当的酶的实例包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。优选的第二种结合配体为生物素和卵白素或抗生蛋白链菌素化合物。使用的这些标记为本领域技术人员所熟知且在例如美国专利第3,817,837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275,149号和第4,366,241号中得到描述，各自通过引用并入本文中。这些荧光标记优选用于体外，但是也可于体内应用，特别是内窥镜检查或血管内检测步骤。
[0109]在可选择的实施方案中，配体、抗体或其它蛋白质或肽可用荧光标记做标记。光检测标记的非限制性实例包括Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5，6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Pacific Blue、酞酸、对苯二甲酸、异酞酸、甲酚紫(cresyl fast violet)、甲酚蓝紫(cresyl blue violet)、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、藻红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三-联吡啶二胺铕(europium trisbipyridine diamine)、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝色染料、别藻蓝蛋白(allopycocyanin)、别藻蓝蛋白B(allococyanin B)、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺素、藻红青素、藻红蛋白R、REG、若丹明绿、若丹明异硫氰酸盐、若丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基若丹明异硫醇)、四甲基若丹明、Edans及德克萨斯红。这些或其它发光标记可自商业来源例如Molecular Probes(Eugene，OR)和EMD Biosciences(San Diego，CA)获得。
[0110]有用的化学发光标记包括氨基苯二酰肼、异氨基苯二酰肼、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶鎓(acridinium)盐和草酸酯，或生物发光化合物例如荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。可在例如手术中、内窥镜检查或血管内肿瘤或疾病诊断中使用诊断性缀合物。
[0111]在各种实施方案中，有用的标记包含金属纳米微粒。已经知道制备纳米微粒的方法。(参见例如美国专利第6,054,495号、第6,127,120号、第6,149,868号；Lee和Meisel，J.Phys.Chem.86：3391-3395，1982.)也可自商业来源购得纳米微粒(例如Nanoprobes Inc.，Yaphank，NY；Polysciences，Inc.，Warrington，PA)。修饰后纳米微粒可自商业购得，例如得自Nanoprobes，Inc.(Yaphank，NY)的Nanogold纳米微粒。可商业购得用于缀合于蛋白质或肽的有用的功能性纳米微粒。
治疗剂
药用组合物
[0112]在一些实施方案中，生物活性装配体和/或一种或多种其他治疗剂可给予受试者，例如癌症患者。这些药物可以药用组合物形式给药。通常要求制备的组合物基本没有可对人或动物有害的杂质。本领域技术人员将知道可通过多种途径包括例如口服或非胃肠道比如静脉注射给予受试者。
[0113]在某些实施方案中，必须给予受试者有效量的治疗药物。“有效量”是产生所需效应的药物的量。有效量依赖于例如药物的效力和期望效应。与为减少或消除实体瘤或为防止或减少其转移的治疗癌症所需的量相比，可需要例如较少量的抗血管生成剂用于治疗增生性疾病，例如黄斑变性或子宫内膜异位。可使用本领域技术人员熟知的方法确定用于特定目的的特定药物有效量。
化学治疗剂
[0114]在某些实施方案中，可给予化学治疗剂。有用的抗癌化学治疗剂包括但不限于5-氟尿嘧啶、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、法呢基蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、甲氨蝶呤、丝裂霉素、诺维本、亚硝基脲(nitrosurea)、plicomycin、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、紫杉酚、temazolomide(DTIC的水溶液形式)、反铂(transplatinum)、长春碱和甲氨蝶呤、长春新碱，或前述物质的任何类似物或衍生变异体。有利于抗感染有机体的化学治疗剂包括但不限于阿昔洛维、阿苯达唑、金刚烷胺、阿米卡星、阿莫西林、两性霉素B、氨苄西林、氨曲南、阿奇霉素、杆菌肽、复方新诺明、巴特联苯苄唑、羧苄西林、卡泊芬净、头孢克洛、头孢唑林、头孢菌素类、头孢吡肟、头孢曲松、头孢噻肟、氯霉素、西多福韦、克拉霉素、克拉维酸、克霉唑、氯唑西林、多西环素、益康唑、erythrocycline、红霉素、甲硝唑、氟康唑、氟胞嘧啶、膦甲酸、呋喃唑酮、更昔洛韦、庆大霉素、亚胺培南、异烟肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美罗培南、咪康唑、米诺环素、萘替芳、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奥塞米韦、苯唑西林、巴龙霉素、青霉素、喷他脒、哌拉西林-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金刚乙胺、链霉素、磺胺甲噁唑、柳氮磺吡啶、四环素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、甲氧苄啶磺胺甲噁唑、伐昔洛韦、万古霉素、扎那米韦和阿齐霉素(zithromycin)。
[0115]本领域技术人员已熟知化学治疗剂及给药方法、剂量等(参见例如the“Physicians Desk Reference”，Goodman & Gilman’s“ThePharmacological Basis of Therapeutics”和in“Remington’s PharmaceuticalSciences”，相关部分内容通过引用并入本文中)。剂量的部分变化依赖于需治疗受试者的病况。无论如何负责给药的人员确定各个受试者的适当剂量。
激素
[0116]皮质类固醇激素可提高其它化学治疗剂的效力，因而其时常联用治疗。强的松和地塞米松为皮质类固醇激素的实例。黄体酮例如己酸羟孕酮、乙酸甲羟孕酮、乙酸甲地孕酮已经用于子宫内膜和乳腺癌的治疗。雌激素例如己烯雌酚和乙炔雌二醇已经用于治疗癌症例如前列腺癌。抗雌激素药例如他莫昔芬已经用于治疗癌症例如乳腺癌。雄激素例如丙酸睾丸素和氟甲睾酮已经用于治疗乳腺癌。
血管生成抑制剂
[0117]在某些实施方案中，可使用抗血管生成剂为血管他丁、baculostatin、canstatin、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗-Flk-1抗体、抗-Flt-1抗体或肽、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖素相关蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸酯、促血管生成素2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、金雀异黄素、TNP-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、血管他丁、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子IV或米诺环素。
免疫调节剂
[0118]本文所用术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素和血细胞生成因子例如白介素、集落刺激因子、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ)及指定为“S1因子”的干细胞生长因子。适当的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-γ、TNF-α等。
[0119]术语“细胞因子”为一种作为细胞间调节剂作用于另一细胞的细胞群释放的蛋白质或肽的总称。如本文广泛使用的细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子和常用的多肽激素。细胞因子包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素例如促卵胞生成激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体发生激素(LH)；肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳激素、胎盘催乳激素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、米勒管抑制物、小鼠促性腺素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)例如NGF-β、血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-α、TGF-β；胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配体或FLT-3、血管他丁、血小板反应蛋白、内皮他丁、肿瘤坏死因子和LT。如文中所用的，术语细胞因子包括得自天然来源或得自重组体细胞培养的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
[0120]趋化因子通常用作化学引诱物以募集免疫效应细胞到趋化因子表达位点。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β、IP-10。技术人员将认识到某些细胞因子也具有化学引诱物效应并也可归类到术语趋化因子下。类似的，术语免疫调节剂和细胞因子在其各自成员间互有交叉。
放射性同位素疗法和放射免疫疗法
[0121]在一些实施方案中，肽和/或蛋白质可适用于放射性核素治疗或放射免疫疗法(参见Govindan等，2005，Technology in Cancer Research &Treatment，4：375-91；Sharkey和Goldenberg，2005，J.Nucl.Med.46：115S-127S；Goldenberg等(J Clin Oncol 2006；24：823-834)，“Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection andRadioimmunotherapy，”(预先靶向抗体的晚期癌放射免疫检测和放射免疫疗法)，各自通过引用并入本文)。在特定实施方案中，生物活性装配体可直接用放射性同位素标记并给予受试者。在可选择的实施方案中，可用上面所述的预先靶向方法给予放射性同位素，给予双特异性生物活性装配体定位在患病组织内增加表达的位点后，放射标记并注射使用的半抗原肽或配体。
[0122]适于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹¹At、⁶²Cu、⁶⁷Cu、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³³P、⁴⁷Sc、¹¹¹Ag、⁶⁷Ga、¹⁴²Pr、¹⁵³Sm、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁸⁹Re、²¹²Pb、²²³Ra、²²⁵Ac、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、⁷⁷As、⁸⁹Sr、⁹⁹Mo、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹⁴³Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁶⁹Er、¹⁹⁴Ir、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au和²¹¹Pb。这种治疗性放射性核素优选具有在20-6,000keV范围内的衰变能量，对于俄歇发射体优选范围为60-200keV，对于β-发射体优选100-2,500keV，对于α发射体优选4,000-6,000keV。适当的β-粒子发射核素的最大衰变能量优选20-5,000keV，更优选100-4,000keV，最优选500-2,500keV。也优选基本用俄歇粒子衰变的放射性核素。例如Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。适当的β-粒子发射核素的衰变能量优选<1,000keV，更优选<100keV，最优选<70keV。也优选基本用α粒子发射衰变的放射性核素。这种放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。适当的α粒子发射放射性核素的衰变能量优选2,000-10,000keV，更优选3,000-8,000keV，最优选4,000-7,000keV。
[0123]例如由于其61.5小时半寿期和丰富提供的β-粒子及γ射线，所以被认为是更有望用于放射免疫疗法的放射性同位素之一的⁶⁷Cu可使用螯合剂、对溴乙酰胺基苄基四乙基氨基四乙酸(TETA)缀合于蛋白质或肽。或者使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)可将发射活性β-粒子的⁹⁰Y偶联到肽、抗体、融合蛋白或其片段。
[0124]其他可能的放射性同位素包括¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁵Br、¹⁹⁸Au、²²⁴Ac、¹²⁶I、¹³³I、⁷⁷Br、¹¹³mIn、⁹⁵Ru、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Ru、¹⁰⁷Hg、²⁰³Hg、^121mTe、^122mTe、^125mTe、¹⁶⁵Tm、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁸Tm、¹⁹⁷Pt、¹⁰⁹Pd、¹⁰⁵Rh、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁹⁹Au、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵¹Cr、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、²⁰¹Tl、²²⁵Ac、⁷⁶Br、¹⁶⁹Yb等。
[0125]在另一个实施方案中，可使用放射增敏剂。添加放射增敏剂可提高效力。在D.M.Goldenberg(ed.)，CANCER THERAPY WITHRADIOLABELED ANTIBODIES，CRC出版(1995)中描述了放射增敏剂，其全部内容通过引用并入本文中。
[0126]具有载硼附加物(boron addend-loaded)的载体的肽、抗体、抗体片段或融合蛋白用于热中子激活治疗(thermal neutron activation therapy)正常的将以类似方式起作用。可是，在进行中子辐射前清除非定向的免疫缀合物是有利的。使用结合于配体的抗体可加速清除率。参见美国专利第4,624,846号中关于这种一般原则的叙述。例如硼附加物比如碳硼烷可与抗体连接。如同本领域所熟知的可在侧链上用羧基制备碳硼烷。可通过激活碳硼的羧基并与载体上的氨基缩合而制得连接于载体例如氨基右旋糖酐的碳硼烷。这种过渡性的缀合物然后缀合于抗体上。给予这种缀合物后，热中子辐射激活硼附加物并转化为α发射衰变的放射性原子从而产生高度毒性、短期的效应。
试剂盒
[0127]各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种生物活性装配体。如果含有给药组分的组合物并非制备为经消化道例如通过口服使用，可包括能够通过其他途径递送试剂盒组分的装置。一类用于非胃肠道给药的装置是注射器，用来将组合物注射进受试者体内。也可使用吸入装置。
[0128]试剂盒部分可共同包装或分开包装于两个或多个独立的容器内。在一些实施方案中，容器可为容纳适于重建的组合物的无菌、低压冻干制剂的小瓶。试剂盒也可含有适于重建和/或其他反应剂稀释的一种或多种缓冲液。其他容器可包括但不限于小药袋、托盘、盒子、试管等。试剂盒部分可包装或无菌维护于容器中。另一部分可包括介绍给使用者使用试剂盒的产品说明书。
实施例
10129]提供下列实施例用来举例说明，并非限制本发明的权利要求。
实施例1.包含热休克蛋白、AD2和AD3(类型-a衔接组件)的融合蛋白的产生与用途
[0130]融合蛋白中AD2和AD3分别连接于热休克蛋白例如HSP70或gp96的氨基末端和羧基末端，该融合蛋白可进一步用一种包括DDD2-连接的同二聚体(X₂)而另一种包括DDD3C-连接的同二聚体(Y₂)的两种周边组件停靠并锁定从而形成组成为X₂(Ma)Y₂的复合体。两种周边组件的一种选择为人CD22的Ig-样域1和2与人CD20的胞外区，经与基于HSP的衔接组件缀合后作为治疗性疫苗用于B细胞淋巴瘤。此两种周边组件的另一种选择为CEACAM5的N-A1和A3-B3域，经与基于HSP的衔接组件缀合后作为治疗性疫苗用于CEA-表达癌。这两种外周组件也可为hLL1Fab和HER2的胞外区，经与基于HSP的衔接组件后作为治疗性疫苗用于治疗过表达HER2的癌。
[0131]如上所述在盐溶液或其他生理相容性溶液中制备包含稳定连接于CEACAM5的N-A1和A3-B3域的AD2-HSP70-AD3的疫苗，并将疫苗给予结肠直肠癌手术切除后的患者。每周一次，至少持续4周给予治疗性疫苗，剂量范围为100μg-5000μg，优选剂量约为500μg。注射途径为皮下注射，但是注射位点每次可以不同，相同部位的重复注射要间隔一次或多次。例如，第一次注射部位为左大腿，第二次注射在右大腿，第三次注射在左臂，第四次注射在右臂，第五次注射在左大腿，第六次注射在右臂等。四次每周注射一次的第一次循环后，每两周一次再注射两次，然后每月注射一次。通过测量(1)评价细胞免疫的迟发型超敏反应，(2)体外溶细胞性T淋巴细胞的活性，(3)循环性CEA的水平，(4)使用各种显像技术例如CT扫描测量的肿瘤大小变化，及(5)与CEA-表达癌相关的其它生物标记，评价此疫苗引发抗癌免疫反应的作用。
实施例2.使用包含稳定连接于CEACAM5的N-A1和A3-B3域的AD2-HSP70-AD3的疫苗治疗结肠直肠癌
[0132]患者DN为62岁的男性，切除了直径4cm的左结肠癌，诊断患有T2N1M0疾病，拒绝手术后化疗，给予实验性疫苗治疗。患者每周注射一次共注射了4次每剂量500μg的溶于盐溶液中的包含稳定连接于CEACAM5的N-A1和A3-B3域的AD2-HSP70-AD3的疫苗，接着每两周注射一次共注射两次相同剂量，然后每月注射一次共注射一次相同剂量。第一次注射部位为左臂，第二次注射在右臂，第三次注射在右大腿，第四次注射在左大腿。然后重复注射部位。事先给予患者扑热息痛和抗组织胺类药物以减轻任何副作用。
[0133]注射期间，在注射部位仅见1级或2级局部红斑或搔痒，第4次注射后其范围少许扩大(shortness of breadth)，在4小时内均消退。在接下来的3、6和12个月，包括诊断性影像检验(CT及在12个月一次FDG-PET研究)以及血清CEA测定均未检测出异常。在接下来的2年，认为患者的疾病已痊愈，从而用实验性疫苗避免了攻击性化疗(aggressivechemotherapy)。
实施例3.包含DDD2-hP1-DDD3C(类型-b衔接组件)的多肽的产生和用途
[0134]多肽中DDD2和DDD3C分别融合于hP1的氨基末端和羧基末端，该多肽将自缔合形成经二硫键连接的hP1所组成的同二聚体的结构，接着用含巯基剂还原，进一步与两种外周组件停靠和锁定，从而形成其组成为X(hP1)₂Y的复合体，其中两种外周组件中的一种为AD2(X)衍生的实体，另一种为AD3(Y)衍生的实体。X和Y的适当选择包括受体靶向的配体、抗体片段及免疫刺激分子。例如，可使用X(hP1)₂Y的构建体携带治疗性siRNAs或基因穿过血脑屏障(BBB)并进一步进入神经胶质瘤细胞而治疗脑癌，其中两种外周组件的一种基于抗-hTfR(人运铁蛋白受体)Fab而另一种基于抗-hIR(人胰岛素受体)Fab。(Zhang等，Clin CancerRes，2004，10：3667-3677)。
实施例4.包含DDD3-hP1-AD2(类型-c衔接组件)的多肽的产生和用途[0135]多肽中DDD3和AD2分别融合于hP1的氨基末端和羧基末端，该多肽将自缔合形成hP1的同二聚体，其可与两种相同的DDD2-连接的外周组件(X₂)停靠和锁定从而形成组成为X₂(hP1)₂X₂的复合体。X₂(hP1)₂X₂的构建体特别有希望的一个用途为递送非病毒载体穿过血脑屏障用于脑癌的基因治疗。例如，可使用X₂(hP1)₂X₂的构建体携带编码酪氨酸羟化酶的基因的DNA载体穿过BBB用于治疗帕金森氏病，其中外周组件(X)基于抗-hTfR Fab(Pardridge，NeuroRx，2005，2：129-138)。
实施例5.包含DDD2-CH2-CH3-DDD3C(类型-b衔接组件)的多肽的产生和用途
[0136]多肽中的DDD2和DDD3C分别融合于人IgG1的CH2和CH3域的氨基末端和羧基末端，该多肽将自缔合形成经二硫键连接的两个Fc亚基所组成的结构，其可用含硫醇剂还原转化为单个Fc亚基，并进一步与两种外周组件停靠和锁定，从而形成组成为X(Fc)Y的复合体，其中两种外周组件中的一种为AD2(X)衍生的实体，另一种为AD3(Y)衍生的实体。如果这两种含有AD的实体分别得自不同特异性的Fab，则所得装配体为带有完整Fc的IgG-样双特异性抗体。
实施例6.包含DDD3-CH2-CH3-AD2(类型-c衔接组件)的多肽的产生和用途
[0137]多肽中DDD3和AD2分别融合于人IgG1的CH2和CH3域的氨基末端和羧基末端，该多肽将自缔合形成含有Fc的结构，其可与两种相同DDD2-连接的外周组件(X₂)停靠和锁定从而形成组成为X₂(Fc)X₂的复合体。
实施例7.包含DDD3C-CH2-CH3-AD2(类型-d衔接组件)的多肽的产生和用途
[0138]多肽中DDD3C和AD2分别融合于人IgG1的CH2和CH3域的氨基末端和羧基末端，该多肽将自缔合形成经二硫键连接的两个Fc亚基所组成的结构，其可用含硫醇剂还原转化为单个Fc亚基，并进一步与三种外周组件停靠和锁定，两种为相同的DDD2-连接的同二聚体(X₂)而第三种为AD3-连接的实体(Y)，从而进一步形成组成为X₂(Fc)YX₂的复合体。
实施例8.DDD3-CH2-CH3-AD2和DDD3C-CH2-CH3-AD2的分子工程
[0139]使用人RIαcDNA克隆(Invitrogen IMAGE clone #5531156)作模板进行两轮PCR反应从而产生DDD3和DDD3C序列。两个反应均使用寡核苷酸RI BglII右(right)作为3’PCR PCR引物。寡核苷酸RI BspHI左(Left)和RI-C BspHI左(Left)分别用作DDD3和DDD3C的5’引物。
RI BglII右
[0140]5’-AGATCTGCCTTTTGCCTCCTCCTTCTC-3’(SEQ ID NO：11)
RI BspHI左
[0141]5’-TCATGAGCCTTCGAGAATGTGAGCTC-3’(SEQ ID NO：12)
RI-C BspHI左
[0142]5’-TCATGAGTTGTGGCGGAAGCCTTCGAGAATGTGAGC-3’(SEQ ID NO：13)
[0143]pdHL2载体作为模板及寡核苷酸Fc BglII左和Fc Bam-EcoRI右作为引物扩增Fc(CH2和CH3域)
Fc BglII左
[0144]5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO：14)
Fc Bam-EcoRI右
[0145]5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQIDNO：15)
[0146]将每个扩增引物克隆进pGemT PCR克隆载体中。用BglII和EcoRI限制性内切酶自pGemT切下Fc插入片段并克隆进SV3穿梭载体内相同位点从而产生中间体克隆Fc-SV3。
[0147]然后用BspHI和BglII自pGemT载体切下DDD3和DDD3C插入片段并与用NcoI(BspHI相容性末端)和BglII消化的Fc-SV3载体连接从而分别产生穿梭载体DDD3-Fc-SV3和DDD3C-Fc-SV3。最终用XbaI和BamHI自SV3穿梭载体切下表达盒并与用XbaI和BamHI消化h679-AD2-pdHL2制备的AD2-pdHL2载体连接。最终的表达构建体为DDD3-Fc-AD2-pDH L2和DDD3C-Fc-AD2-pdHL2。
[0148]图6显示了DDD3C-Fc-AD2的氨基酸序列。除了DDD3C-Fc-AD2的5氨基末端残基即MSCGG用MS取代外，DDD3-Fc-AD2的氨基酸序列是相同的。
[0149]两种表达载体均转染入Sp/EEE细胞。通过ELISA法使用A蛋白包被板捕获并用HRP-缀合抗体检测来筛选阳性克隆。使用A蛋白亲和色谱进行纯化。
实施例9.用连接于脑源性神经营养因子(BDNF)和人转铁蛋白受体(hTfR)的单克隆抗体的组成为DDD3C-CH2-CH3-AD2的药物治疗病灶性、暂时性脑缺血
[0150]中风症状起始一小时内，患者TF静脉注射给予10mg的在盐溶液中的包含4个BDNF-DDD2组件和一个稳定连接于DDD3C-Fc-AD2组件的抗-hTfRFab-AD3组件的复合体。如MRI所示，及时介入减少了总半球梗死体积(total hemisphere infarct volume)，存在的局部肢体麻痹、语言障碍、意识错乱的体征和症状在48小时内显著改善，同时患者也接受其它支持性的和抗凝治疗。
表1.所选的X₂(Ma)Y₂装配体的组成