抗微生物蛋白质 本发明涉及可从甜菜分离的抗微生物蛋白质。
根据本发明，提供了一种抗微生物蛋白质，包含一种具有序列-Gln／Cys-AA2-Pro／Ile-Asn／Thr／Leu-AA5-AA6-Cys-Cys-Ala／Asn-Gly／Lys-AA11-AA12-AA13-AA14-AA15-的肽，其条件是AA2和AA14不是半胖氨酸，且当AA1是Cys时AA4是Leu。技术人员将认识到缩写AAx指20个常见氨基酸之一。
抗微生物蛋白质包括在任何环境中对包括细菌(尤其是革兰氏阳性细菌)、病毒且特别是真菌的任意微生物有毒性或生长抑制力的蛋白质(单独或与另一物质组合)。该抗微生物蛋白质包括在与微生物接触时表现出抗微生物活性的那些蛋白质和作为其同化作用或呼吸作用的后果而抗微生物的那些蛋白质。
根据本发明，提供了一种具有在SEQ ID Nos．3，5或6中任一项所述之序列的抗微生物蛋白质。
还包括具有SEQ ID No．3的抗微生物蛋白质的同工型，其中80位的Val是Ala。
本发明还进一步包括基本上相似于上述任一蛋白质的纯蛋白质。
“基本上相似于”是指包含与上面给定的肽序列有至少95％的相似性的氨基酸序列的纯蛋白质(也如权利要求1所限定)和／或具有至少65％相似，优选75％相似，更优选85％相似，特别优选95％相似于下面SEQID Nos 3，5或6所述蛋白质之序列的氨基酸序列地纯蛋白质。在本发明说明书中，互相间具有给定百分数相似性的两个氨基酸序列当任选引入高达2个缺口且对于每个缺口而言总共影响不超过2个氨基酸残基来进行序列比较时在相似位置具有至少该百分数的相同或保守取代的氨基酸残基。
为达到本发明的目的，保守取代可在下列各组内的氨基酸之间作出：
(ⅰ)丝氨酸和苏氨酸；
(ⅱ)谷氨酸和天冬氨酸；
(ⅲ)精氨酸和赖氨酸；
(ⅳ)天冬酰胺和谷氨酰胺；
(ⅴ)异亮氨酸，亮氨酸，缬氨酸和甲硫氨酸；
(ⅵ)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸
(ⅶ)丙氨酸和甘氨酸。
本发明还进一步包括与根据本发明的抗微生物蛋白质具有至少90％相同的纯蛋白质，以及具有其至少90％的比活的纯蛋白质。为达到本申请的目的，比活是由限定量的蛋白质对限定量的特定微生物产生生长或复制抑制的量的测量值。
本发明还进一步包括所说的纯蛋白质与选自SEQ ID Nos．7至12和14中所述的至少一种蛋白质组合。该组合的蛋白质可进一步与一种或多种已知的“致病相关性蛋白质”组合。用真菌或病毒病原体感染植物可在营养组织中诱导系统合成大约10个家系的同源致病相关性蛋白质(PR蛋白质)。该PR蛋白质被分成5组。PR-2，PR-3和PR-5蛋白质分别是β-1，3-葡聚糖酶，几丁质酶和奇异果甜蛋白类蛋白质。对于PR-1和PR-4组的蛋白质尚未确定其具体功能。PR-4蛋白质相似于橡胶蛋白原的C-末端区域和推断的土豆伤口诱导性WIN蛋白质，因此缺乏N-末端橡胶蛋白区。特别优选的是根据本发明的蛋白质与一种或多种作为PR-4组蛋白质的基本相对部分的蛋白质组合，该相对部分指相似于橡胶蛋白原的C-末端区域和推断的土豆伤口诱导性WIN蛋白质的蛋白质基本相对部分。特别优选的是，所说的致病相关性蛋白质的基本相对部分是几丁质结合WIN蛋白质，特别是由大麦粒或应激的大麦叶所产生的该蛋白质。
本发明还进一步包括含有编码具有上文所公开的抗微生物蛋白质的氨基酸序列的蛋白质之序列的重组DNA。特别是该DNA可编码至少一种其序列在SEQ-ID Nos．3，5和6中描述的蛋白质，另外任选编码至少一种其序列在SEQ ID Nos．7至12和14中描述的蛋白质。优选的是，编码具有在SEQ ID No．3，5或6中所述之氨基酸序列的蛋白质的序列具有SEQ ID No．1(编码具有SEQ ID No．6的蛋白质，相应于IWF5)，SEQID No．2(编码具有SEQ ID No．3的蛋白质，相应于IWF6)或SEQ IDNo．4(编码具有SEQ ID No．5的蛋白质，相应于IWF7)中所述的cDNA序列。该重组DNA可进一步编码具有除草剂抗性，植物生长促进，抗真菌，抗细菌，抗病毒和／或抗线虫特性的蛋白质。如果该DNA将被导入异源生物中，可对它进行修饰以去掉已知的mRNA不稳定性基序(如富含AT的区域)和多聚腺苷酸化信号(如果存在的话)，和／或使用将要插入重组DNA的生物所优选的密码子以使由此修饰的DNA在所说的生物中的表达产生基本上相似于未修饰的重组DNA在根据本发明的抗微生物蛋白质是内源性的生物中表达所获得的蛋白质。
本发明还进一步包括与上面所述“相似”的重组DNA。“相似DNA”指互补于能与本发明的重组序列杂交的试验序列的序列。当试验和发明序列是双链时，组成试验序列的核酸优选TM在发明序列TM的20℃内。如果试验和发明序列混合起来且同时变性，这些序列的TM值优选彼此在10℃内。更优选的是，杂交在严格条件下进行，优选试验或发明DNA在支持物上。因此，优选变性的试验或发明序列首先结合到支持物上，在50至70℃之间的温度下在含0．1％SDS的双倍浓度柠檬酸盐缓冲溶液(SSC)中在限定的一段时间内实现杂交，随后在相同温度下但用SSC浓度减少的缓冲液漂洗支持物。根据所需的严格程度，且由此得到序列的相似程度，在某一具体温度(如60℃)下，浓度减小的缓冲液典型地是含0．1％SDS的单强度SSC，含0．1％SDS的半强度SSC和含0．1％SDS的1／10强度SSC。具有最大相似程度的序列是其杂交受浓度减小的缓冲液洗涤的影响最小的那些序列。最优选的是试验和发明序列非常相似，以致于它们之间的杂交基本上不受在含0．1％SDS的1／10强度柠檬酸钠缓冲液中洗涤或培养的影响。
本发明还进一步包括互补于在严格条件下与根据本发明的重组DNA杂交的序列的DNA序列。
本发明还包括：含有能在植物中表达的并与植物可操纵的启动子和终止子连接的上面公开的DNA的载体；用该DNA转化的植物；含有稳定插入并能以孟德尔方式遗传的DNA的该植物的后代，和／或该植物和该后代的种子。转化的植物可用已知方法制备且包括用本发明的DNA根据各种已知方法(土壤杆菌Ti和Ri质粒，电穿孔，显微注射，微粒枪等)转化的植物细胞或原生质体的再生。转化的细胞可在适当情况下再生成完整植物，其中核物质稳定地掺入基因组。以这种方式可获得单子叶和双子叶植物。根据本发明的转化植物的例子包括：水果，其中包括西红柿，芒果，桃，苹果，梨，草莓，香蕉和甜瓜；野外庄稼，如canola，向日葵，烟草，甜菜，小粒谷类，如小麦，大麦和水稻，玉米和棉花，以及蔬菜，如土豆，胡萝卜，莴苣，甘蓝和洋葱。优选的植物是甜菜和玉米。
本发明还进一步包括由所说的DNA表达产生的蛋白质，和由重组DNA在用其转化的植物内表达产生的抗微生物蛋白质。
本发明还进一步包括含有一种或多种根据本发明的蛋白质的抗微生物组合物；包括将它们与该蛋白质接触的抵抗真菌的方法，以及从含有抗微生物蛋白质的生物材料中获得抗微生物蛋白质的提取方法，包含对该材料(优选以微生物的形式)进行离析并用溶剂提取。可预料到的是该抗微生物蛋白质对作为上面所称之生物材料的来源的微生物表现出很小(如果有的话)的抗微生物效应。
从下面的描述和有关附图及序列表将使本发明更显而易见。
图1显示了从CM琼脂柱的胞间洗涤液的典型洗脱图谱；
图2显示了图1所示的0．3M NaCl馏份从Mono S FPLC柱的典型洗脱图谱；
图3显示了图2中峰4所代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；
图4显示了图3中峰4．4所代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；
图5显示了图3中峰4．3所代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；
图6显示了图2中峰5代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；
图7显示了图6中峰5．4代表的蛋白质从RP-HPLC柱的典型洗脱图谱；
图8和9显示了不同量的图4中峰4．4所代表的蛋白质(SEQ ID No．6)的抗真菌活性；
图10显示了图5中峰4．3(SEQ ID No．3，其中80位的Val是Ala)所代表的蛋白质的抗真菌活性；
图11显示了图7中峰5．4(SEQ ID No．5)所代表的蛋白质的抗真菌活性。
SEQ ID No．6显示了图4中峰4．4所代表的蛋白质的氨基酸序列；其中80位Val是Ala的SEQ ID No．3显示了图5中峰4．3所代表的蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID No．5显示了图7中峰5．4所代表的蛋白质的氨基酸序列；SEQ ID No．7至12和14显示了已知抗真菌蛋白质的氨基酸序列。抗性诱导：
用25ppm 2，6-二氯异烟酸(INA)以2天的间隔处理6周龄甜菜(betavulgaris Lcv，=．Monova，Danisco Seed)4次。经过喷洒近轴叶表面至饱和点施用悬浮于0．05％Tween 20中的INA。最后一次处理2天后，按下面所述分离胞间洗涤液(IWF)。从未接触INA的叶中分离的胞间洗涤液也含有根根据本发明的蛋白质。胞间洗涤液的分离：
经过浸入20mM HAC(pH4．5)中从500-700克甜菜叶中分离出IWF。然后将由此浸入的叶放入脱水器中并以4乇(最大值)真空浸润5分钟。空气干燥叶表面后，在500ml离心管中以500g离心15分钟收集IWF。阳离子交换色谱
经过在起始缓冲液(20mM HAC(pH4．5))中预先平衡的10ml CM琼脂糖柱(Pharmacia LKB)上进行阳离子交换色谱分离由此获得的IWF。在4℃下以25ml／h的流速进行分离。收集每份3ml馏份。经过用起始缓冲液充分洗柱去掉未结合于柱上的蛋白质。经过对柱使用含逐步增加盐浓度：即，0．1M NaCl，0．3M NaCl和0．5M NaCl的另一起始缓冲液洗脱结合的蛋白质。测量洗脱液在280mm处的吸光率，使用以前描述的微量滴定平板生物测定(PCT专利申请号PCT／DK 92／00108，公开号WO 92／17591，现在属于Sandoz LTD)测定被判断为包含蛋白质的馏份对C．beticola(甜菜生尾孢)的抗真菌活性。
典型的洗脱图谱在图1中显示。对柱使用含0．3M NaCl的起始缓冲液所得的洗脱液进一步按下面所述纯化。纯化从CM-琼脂糖FPLC色谱的0．3M NaCl洗脱物中的抗真菌蛋白质
经过在4℃对20mM HAC(pH4．5)过夜透析(分子量截留值：1KDa)脱盐0．3M NaCl蛋白质馏份。以5％(重量／体积)的浓度向由此透析的蛋白质馏份中加入甜菜碱。然后向经过阳离子交换快速蛋白质液相色谱(FPLC)使用在含5％(重量／体积)甜菜碱的20mM HAc(pH4．5)(A-缓冲液)中平衡的Mono S HR 5／5柱(Pharmacia LKB)分级分离4ml所得的溶液。经过用在30mlA缓冲液中的0至0．3M NaCl的线型盐梯度，随后用在相同缓冲液中的1．0M NaCl的洗脱步骤洗脱结合的蛋白质。流速为1ml／分。
图2显示了0．3M NaCl馏份含许多不同的蛋白质，其中数量最大的命名为峰1-5。强抗真菌活性与峰4和5所代表的蛋白质相关。当使用Phast系统(Pharmacia LKB)以SDS-PAGE分离时，银染色的10-15％梯度Phast凝胶或高密度凝胶(Pharmacia LKB)揭示了峰4和5各含大约10种不同的蛋白质。反相HPLC
在Vydac C4硅胶柱(The Separations Group，CA，美国)上经反相(RP)HPLC进一步纯化来自Mono S柱的蛋白质峰4和5(图2中描述)。溶剂系统是A：在水中的0．1％TFA和B：在乙腈中的0．1％TFA。上样后用5至45％的B缓冲液的线型梯度洗脱蛋白质，随后用60％B-缓冲液在2分钟内洗脱。流速为0．7ml／分。经过监测在214和280nm下洗脱液的吸光率检测蛋白质。收集并冻干分离的蛋白质峰。在进行纯度和抗真菌活性分析前，用水洗涤由此冻干的蛋白质2次，再冻干并随后溶于10mM Tris-HCl(pH8．0)。由峰4代表的物质在RP-HPLC柱上分成9-10个不同的蛋白质峰(图3)。峰4．3和4．4包含强抗真菌活性且随后在RP-C4柱上再次色谱(图4和5)。以SDS-PAGE随后进行的分析(银染色)证实这两种蛋白质已被纯化成匀质(资料未显示)。而且，N-末端氨基酸测序证实在每个峰中只存在一种蛋白质。峰4．3和4．4分别命名为IWF6和IWF5。RP-HPLC纯化后图2中峰5代表的物质被分离成8-10种不同的蛋白质峰(图6)。其中，峰5．4包含强抗真菌活性。第二轮RP-HPLC(图7)后，以SDS-PAGE和氨基酸测序证实该蛋白质为匀质。该蛋白质命名为IWF7。抗真菌活性
这些蛋白质单独或与WIN N(按Hejgaard等(FEBS Letters，307，389-392(1992)所述以大麦粒或应激的大麦叶中纯化)，和／或具有相应于SEQ ID No．s7-12和14中给出的至少一个序列的蛋白质组合与C．beticola的孢子培养。测定混合物(240μl)含100μl土豆葡萄糖培养基(Difco)，40μl在100mM Tris和20mM NaCl(pH8．0)中的蛋白质样品(或缓冲液对照)以及在100μl水中的大约400个孢子。用胶带密封微量滴定平板以避免蒸发和污染，随后在室温下在以200rpm运行的搅拌器中培养。在8天内每天测量在620nm下的吸光率并以蛋白质浓度对时间作布点图。命名为IWF5的蛋白质对C．beticola显示出强烈生长抑制效应。在10μg／孔(40μg／ml)时检测不到真菌生长(图8)，在4μg／孔时显著延缓生长并强烈抑制(图9)。命名为IWF6的蛋白质对C．beticola也显示出强烈生长抑制效应。该活性水平比得上IWF5，在～5μg／孔时产生几乎完全的生长抑制(图10)。而且，命名为IWF7的蛋白质对C．beticola也显示出强烈生长抑制效应。在10μg／孔时，检测不到真菌生长(图11)。而且，显微镜分析表明：该蛋白质抑制分生孢子的萌发。因此，IWF7可影响孢子萌发及菌丝生长。氨基酸测序：
将来自CM琼脂糖柱的0．3M NaCl洗脱物(图1)两相应于图4中峰4．4，图5中峰4．3和图7中峰4．4的纯化的抗真菌蛋白质羧甲基化并在Vydac C4柱上进行RP-HPLC。溶剂系统是A：在水中的0．1％TFA和B：在乙腈中的0．1％TFA。具有略微不同滞留时间的蛋白质作为单一峰洗脱。用内切-R-蛋白酶对其裂解并随后在Vydac C18柱上以RP-HPLC进行纯化获得该蛋白质的C-末端序列。IWF5，IWF6和IWF／cDNA的克隆：
使用下列引物按以前所述(Nielsen等，1996；植物分子生物学，31：539-552)经3′和5′RACE获得IWF5，IWF6和IWF7的cDNA序列。
A、3′RACE引物QT：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T)17-3′QO：5′-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3′ Q：GAGGACTCGAGCTCAAGC-3′
B、5′RACE引物5′-ANKER：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3′5′-UNI：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACG
IWF 5 3′RACE
IWF5蛋白质的氨基酸序列用于构建2个简并的寡核苷酸引物，该引物用于以3′RACE分离部分cDNA克隆。按照Collinge等1987(植物分子生物学8：405-414)用C．beticola接种6天后从甜菜(cv．MonoVa)叶纯化总RNA。用来自Perkin Elmer的RT-PCR试剂盒并按照其方案进行逆转录及随后的PCR。简单地说，1μg总RNA和2．5pmol QT-引物与逆转录酶在42℃保温45分钟，接着在99℃保温5分钟及在5℃保温5分钟。在第一次PCR中，40pmol的引物QO用作下游引物，上游引物是150pmol的简并引物(5′-GC(ACGT)TG(CT)(AC)G(ACGT)TG(CT)ATGAA：在IWF5 cDNA序列的位置315-331)。在第二轮嵌套式PCR中，50pmol的引物Q1用作下游引物，上游引物是50pmol简并引物(5′-GG(ACGT)AT(ACT)AA(CT)CA(CT)AA(GA)TA：在IWF5 cDNA序列中位置354-370)。PRC条件是：94℃1分钟，42℃2分钟，50℃1分钟及72℃5分钟进行一个循环，接着是94℃1分钟，42℃2分钟，72℃3分钟进行35个循环，接着是72℃10分钟。第二轮PCR后，获得390bp的单链DNA产物。将DNA产物克隆进pT7Blue载体(Novagen)并使用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测序。IWF5 5′RACE
使用来自Gibco BRL的5′RACE系统以通过3′RACE获得的部分cDNA序列构建的3个基因特异性引物经5′RACE获得IWF5 cDNA 5′末端的序列。简单地说，1μg与3′RACE所用相同的总RNA和2．5pmol基因特异性引物GSP5-1(5′-TGGAATTGG-AGATTATGTAAG：在IWF5 cDNA序列的位置619-643)在70℃保温10分钟，接着加入逆转录酶并在42℃培养30分钟，70℃培养15分钟，加入RNase H并在55℃再培养10分钟。按照Gibco BRL的方案给cDNA加上dC-尾。对加尾的cDNA进行2轮PCR。在第一轮PCR中，20pmol的5′-ANKER引物用作上游引物，下游引物为20pmol的基因特异性引物GSP5-2(5′-TCACTTTAGATGTAAGAAGCACA-CATG：在IWF5 cDNA序列中的位置596-622)。在第二轮PCR中，50pmol的5′-UNI引物用作上游引物，下游引物是50pmol的基因特异性引物GSP5-3(5′-TAAGCAGAAAGTTCCAGAAAGCA-TG：在IWF5 cDNA序列中的位置548-572)。第一轮PCR的条件是：94℃1分钟，51℃1分钟，72℃2分钟进行35个循环，接着是72℃10分钟。第二轮PCR的条件是：94℃1分钟，55℃1分钟及72℃2分钟进行35轮循环，接着是72℃10分钟。单链600bp DNA产物克隆进pT7Blue载体(Novagen)中并使用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪Pharmacia)测序。IWF6 3′RACE
IWF6蛋白质的氨酸酸序列用于构建2个简并的寡核苷酸引物，该引物用于经3′RACE分离部分cDNA。按照Collinge等，1987(植物分子生物学8：405-414)用C．beticola接种6天后从甜菜(cv．Monova)纯化总RNA。用来自Perkin Elmer的RT-PCR试剂盒并按照其方案进行逆转录及随后的PCR。简单地说，1μg总RNA和2．5pmol QT-引物与逆转录酶在42℃保温45分钟。接着在99℃保温5分钟并在5℃保温5分钟。在第一轮PCR中，将40pmol引物QO用作下游引物，上游引物是150pmol简并的引物(5′-GG(AGCT)TA(CT)TG(CT)AA(CT)AT(ACT)(TC)T：在IWF6 cDNA序列的位置297-313)。在第二轮嵌套式PCR中，将50pmol的引物Q1用作下游引物，上游引物是50pmol的简并引物(5＇-AA(CT)GT(ACGT)TG(CT)TG)(CT)GC(ACGT)GG：在IWF6 cDNA序列的位置314-332)。PCR条件是，94℃1分钟，42℃2分钟，50℃1分钟及72℃3分钟进行一个循环，接着是94℃1分钟，42℃2分钟及72℃3分钟进行35个循环，随后是72℃10分钟。第二轮PCR后，获得了320bp的单链DNA产物。将DNA产物克隆进pT7Blue载体(Novagen)并使用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测序。IWF6 5′RACE
使用Gibco BRL的5′RACE系统以通过3′RACE获得的部分cDNA序列构建的3个基团特异性引物经5′RACE获得IWF6 cDNA的5′末端序列。简单地说，1μg与3′RACE所用相同的总RNA和2．5pmol基因特异性引物GSP6-1(5′-CATCAAGA-AGTCCA TAATTG TCTAG：在IWF6 cDNA序列的位置508-532)在70℃保温10分钟，随后加入逆转录酶并在42℃培养30分钟，70℃培养15分钟，并加入RNaseH并在55℃再培养10分钟。按照Gibco BRL的方案给cDNA加dC尾。对加尾的cDNA进行2轮PCR。在第一轮PCR中，将20pmol 5′-ANKER引物用作上游引物，下游引物是20pmol的基因特异性引物GSP6-2(5′-TGATCTTTATTGAC-AAACAGACGC：在IWF6 cDNA序列的位置473-498)。在第二轮PCR中，50pmol的5′-UNI引物用作上游引物，下游引物是50pmol的基因特异性引物GSP6-3(5′-ACAGACACGCTAGTT-AGATGACTAAGL：在IWF6 cDNA序列的位置456-482)。第一轮PCR的条件是：94℃1分钟，51℃1分钟，72℃2分钟进行35个循环，随后是72℃10分钟。第二轮PCR的条件是：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟进行35个循环，接着是72℃10分钟。将单链510bp DNA产物克隆进pT7Blue载体(Novagen)并使用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amercham)及ALF DNA测序仪(Pharmacia)测序。IWF7 3′-RACE
IWF7蛋白质的氨基酸序列用于构建2个简并的寡核苷酸引物，该引物用于经3′RACE分离部分cDNA克隆。按照Collinge等l987(植物分子生物学8：405-414)用C．beticola接种6天后从甜菜(cv．Monova)叶纯化总RNA。用来自Perkin Elmer的RT-PCR试剂盒并按照其方案进行逆转录及随后的PCR。简单地说，将1μg总RNA和2．5pmolQT-引物与逆转录酶在42℃保温45分钟，随后在99℃保温5分钟并在5℃保温5分钟。在第一轮PCR中，40pmol引物QO用作下游引物，上游引物是150pmol的简并引物(5′-GA(AG)CA(AG)AA(AG)CC(ACGT)TGA(CT)(CT)T：在IWF7 cDNA序列的位置247-263)。在第二轮嵌套式PCR中，50pmol引物Q1用作下游引物，上游引物是50pmol简并引物(5′-TG(CT)GG(ACGT)TA(CT)TA(CT)AA(AG)AA：在IWF7 cDNA序列的位置265-286)。PCR条件是：94℃1分钟，42℃2分钟，50℃1分钟，72℃3分钟循环一次，随后94℃1分钟，42℃2分钟，72℃3分钟进行35个循环，随后是72℃10分钟。第二轮PCR后，获得270bp的单链DNA产物。将DNA产物克隆进pT7Blue载体(Novagen)并使用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测序。IWF7 5′RACE
使用Gibco BRL的5′RACE系统以通过3′RACE获得的部分cDNA序列构建的3个基因特异性引物经5′RACE获得IWF7 cDNA 5′末端的序列。简单地说，将1μg与3′RACE所用相同的总RNA与2．5pmol基因特异性引物GSP7-1(5′-CCTAATTTC-CCTCAAATCACG：在IWF7cDNA序列的位置443-463)在70℃保温10分钟，随后加入逆转录酶并在42℃保温30分钟，70℃15分钟，并加入RNaseH在55℃再保温10分钟。按照Gibco BRL的方案将cDNA加上dc尾。对加尾的cDNA进行2轮PCR。在第一轮PCR中，将20pmol的5′-ANKER引物用作上游引物，下游引物是20pmol的基因特异性引物GSP7-2(5′-AATTTCCCTCAAATCACGAATTGAG：在IWF7 cDNA序列的位置436-460)。在第二轮PCR中，将50pmol的5＇-UNI引物用作上游引物，下游引物是50pmol的基因特异性引物GSP7-3(5′-TCGTCAGTTTTGGCTCATTTTGGG：在IWF7 cDNA序列的位置400-423)。第一轮PCR的条件是94℃1分钟，51℃1分钟和72℃2分进行35个循环，随后在72℃进行10分钟。第二轮PCR的条件是：94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟进行35轮循环，接着在72℃10分钟。将单链450bp DNA产物克隆进pTBlue载体(Novagen)并使用Termo测序酶荧光循环测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)测序。转化植物的生产：
将编码根据本发明的蛋白质的基因导入植物。以基因特异性引物为基础，使用PCR从相应的mRNA合成编码该蛋白质的基因的编码区。加入启动子和终止子序列后，将编码所说蛋白质的基因引入植物转化载体。该载体可任选包括编码WIN蛋白质的基因(如从应激的大麦叶或大麦粒获得的WIN蛋白质)和／或编码一个或多个在SEQ ID Nos．4至9中所述的蛋白质的基因和／或编码几丁质酶和／或葡聚糖酶的基因。一个可能的几丁质酶是在PCT专利申请号PCT／DK92／00108(公开号WO92／17591)中所述的几丁质酶4。例如，可用这些载体转化根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。然后用该转化的土壤杆菌处理植物细胞，由此转化的植物细胞再生成完整植物，其中新的核物质稳定地插入了基因组中。但是可预料到的是，编码根据本发明的蛋白质(或该蛋白质的组合)，任选还编码其它蛋白质的DNA可用其它已知方法导入植物细胞中，包括使用微粒枪，由电穿孔，电转化，和显微注射等，且根据技术人员已知的方法进行转化植物细胞的再生，包括用细胞因子处理细胞，其中为了提高再生频率该细胞因子是必需的或需要的。
另外，可用包含编码该蛋白的基因(或多个基因)的载体转化合适的微生物(即，其中本发明的蛋白质的生产基本上是无毒的微生物)以便转化的微生物产生该蛋白质。该微生物可进一步包括编码其它蛋白质，如WIN蛋白质和／或其序列在一个或多个SEQ ID No．4-9中描述的蛋白质的基因。而且，所述其它蛋白质可进一步包括各种几丁质酶和／或葡聚糖酶。一种可能的所述其它蛋白质是在PCT专利申请号PCT／DK92／00108(公开号WO 92／17591)中描述的几丁质酶4。
然后这些微生物可用于抵抗植物病原体。例如，可干燥转化的微生物并喷洒到感染的植物或有感染危险的植物上。
序列表(1)一般信息： (ⅰ)：申请人：
(A)名称：Sandoz Ltd．
(B)街道：Lichtstrasse 35
(C)城市：Basel
(D)州：BS
(E)国家：瑞士
(F)邮编：CH-4002
(G)电话：+41-61-3246428
(H)电传：+41-61-3227532
(A)名称：Sandoz Patent GmbH
(B)街道：Humboldtstrasse 59
(C)城市：Loerrach
(E)国家：德国
(F)邮编：(ZIP)：D-7850
(A)名称：Sandoz Erfindungen Verwaltungsgesellschaft MBH
(B)街道：Brunnerstrasse 59
(C)城市：维也纳
(E)国家：澳大利亚
(F)邮编(ZIP)：A-1230 (ⅱ)发明题目：抗微生物蛋白质 (ⅲ)序列数：34 (ⅳ)计算机可读形式：
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS／MS-DOS
(D)软件：PatentIN Release #1．0，Version #1．25(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：722个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅱ)分子类型：cDNA (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulgaris(甜菜) (ⅹⅰ)SEQ ID NO：1的序列描述ACCATCTAGT ACCAATTAAT TACAACTATC TCTCTCTCTC TTTCTCTCTA GGCCTCTTTC 60TTAAAGTTTG TGATAGGATT AGCAGCAATC CCAACATGGC TAGGGCAGCT AATCTAAAGC 120TGTTATGCGC ATTTATTCTG AGCATAGTGG TGTTCACACC ACATGCAGAG GCCGCCATTA 180ACTGTGGTCT GGTCTCTCAG AGCCTTGCAG CATGCCTTGG ATTCCTAGAG AATGGTCAGG 240GACCAAATGC AGCTTGCTGC AACGGTGTTA AGACACTCCG AAACTTGACT CCCACAACCC 300AGGACAAAAG AACGGCTTGT AGGTGCATGA AATCAGCCGC TTCAGCCATT CCCGGCATCA 360ACCATAAGTA CTCAGCTGCA CTTCCCGGCA AATGTGGGGT CAGCATTCCA GGGCCTGTTG 420GCCCCCAGGC AGACTGCTCT CAGATCCACT AGACCTGAAG TTTCCAGGAG GGGAACACTA 480GCAAAACAAA GAATAGTTGG GTTCTGACTT CATACAAGCA AAATCTATAG TAAATTCCCA 540TGAAGTGCAT GCTTTCTGGA ACTTTCTGCT TATCAAGTTA TTATTACATA TATACCATGT 600GTGCTTCTTA CATCTAAAGT GACTTACATA ATCTCCAATT CCATGTAAGA GATAGCAAGG 660AAGATTAAAT ATTGAAATAA AATCYCTTAT TGGTTAAAHC CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA 720AA 722(2)SEQ ID NO：2的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：587个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅱ)分子类型：cDNA (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulagaris (ⅸ)FETURE：
(A)名称／关键词：CDS
(B)位置：129．．374 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：2的序列描述ATAAGTGGCA AGCAAAAAGA AATCATTTCA CTAAAAACTG CAAAAAGAAA ATGGAGAAGT 60CATCATGCTT TAAGCTGGTT TTCTTAGTCT TTCTGTTGCT CAACATTTCA GCTTCAACAC 120TTGCAAGA ATG CAA CCA ACT ATA ATG GAA GAA CTT ACA AAG GAA CAA GTT 170 Met Gln Pro Thr Ile Met Glu Glu Leu Thr Lys Glu Gln Val 1 5 10CTT GAA GAA CTT GGT GCT TAC AAG CAG ATA ATA GCA TCA GCA GCA ACA 218Leu Glu Glu Leu Gly Ala Tyr Lys Gln Ile Ile Ala Ser Ala Ala Thr 15 20 25 30AGA GAC CGC GGC GAG TTA TTA AGA ACG GTG ATA GAA GCG GTT GCG CGA 266Arg Asp Arg Gly Glu Leu Leu Arg Thr Val Ile Glu Ala Val Ala Arg 35 40 45CCG CGA CCG CGA CCG TGC ATA AGG GCT GGC GGC TAC TGT AAC ATT TTG 314Pro Arg Pro Arg Pro Cys Ile Arg Ala Gly Gly Tyr Cys Asn Ile Leu
50 55 60AAC GTA TGT TGT GCT GGG TTG ACT TGT GAG GAA CAT GAT ATA CAA GAC 362Asn Val Cys Cys Ala Gly Leu Thr Cys Glu Glu His Asp Ile Gln Asp
65 70 75GCC GTC TGC GTC TAAATCTTGG ACTTGCTTAA AAAAATGTGT TATTATAAGT 414Ala Val Cys Val
80GTATTTGGCC TTTTAGGCTT GATCTTCAAT TTCGTCTTTA AGCTTAGTCA TCTAACTAGC 474GTGTCTGTTT GTCAATAAAG ATCATTGTCT TCTCTAGACA ATTATGGACT TCTTGATGCT 534TTTATTTTAA TAATATAAAA TATTTCCTCG CTTTCAAAAA AAAAAAAAAA AAA 587(2)SEQ ID NO：3的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：82个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：3的序列描述：Met Gln Pro Thr Ile Met Glu Glu Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Glu 1 5 10 15Glu Leu Gly Ala Tyr Lys Gln Ile Ile Ala Ser Ala Ala Thr Arg Asp
20 25 30Arg Gly Glu Leu Leu Arg Thr Val Ile Glu Ala Val Ala Arg Pro Arg
35 40 45Pro Arg Pro Cys Ile Arg Ala Gly Gly Tyr Cys Asn Ile Leu Asn Val
50 55 60Cys Cys Ala Gly Leu Thr Cys Glu Glu His Asp Ile Gln Asp Ala Val 65 70 75 80Cys Val(2)SEQ ID NO：4的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：510个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：cDNA (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源：
(A)生物：Beta vulgaris (ⅸ)特征：
(A)名称／关键词：CDS
(B)位置：76．．357 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：4的序列描述：TTATAATAAC TCCCTCTCTT ACACAAACAC ATAACATAAA TCTCCTCTAT ACATTTTTCT 60CTTCTAAGCA TCATT ATG GCC AAG GTG GCT ACT CTT ACC CTA CTT GCC GTG 111
Met Ala Lys Val Ala Thr Leu Thr Leu Leu Ala Val
1 5 10GTT GTC GTG GCG GTG CTA CTA TTC GAG ACA CCA ACG ACC GAG GCG GTT 159Val Val Val Ala Val Leu Leu Phe Glu Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val
15 20 25ACC TGC AGT GCA GTG CAG CTG AGC CCT TGC GCA CCA GCA ATT ATG TCC 207Thr Cys Ser Ala Val Gln Leu Ser Pro Cys Ala Pro Ala Ile Met Ser
30 35 40AAC CAA ACA CCA ACA AGC GCA TGT TGT GCA AAA TTG AGG GAG CAA AAA 255Asn Gln Thr Pro Thr Ser Ala Cys Cys Ala Lys Leu Arg Glu Gln Lys 45 50 55 60CCT TGC CTT TGT GGA TAC TAC AAG AAC CCT ACT CTT AGG CCT TAC ATT 303Pro Cys Leu Cys Gly Tyr Tyr Lys Asn Pro Thr Leu Arg Pro Tyr Ile
65 70 75AAT TCC CCT GGT GCT AAA CGT GTG GCT TCT ACT TGT AAA GTC AGC GTT 351Asn Ser Pro Gly Ala Lys Arg Val Ala Ser Thr Cys Lys Val Ser Val
80 85 90AGC TGC TAAACATATG TACCAGTGTT ACCTAATTTG TTATCTAATT CGCCCAAAAT 407Ser CysGAGCCAAAAC TGACGATAAT TAGCTTTTCT CAATTCGTGA TTTGAGGGAA ATTAGGTAAC 467TACTGATATA TATACCTTCC ACAAAACAAA AAAAAAAAAA AAA 510(2)SEQ ID NO：5的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：94个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：线型 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：5的序列描述：Met Ala Lys Val Ala Thr Leu Thr Leu Leu Ala Val Val Val Val Ala 1 5 10 15Val Leu Leu Phe Glu Thr Pro Thr Thr Glu Ala Val Thr Cys Ser Ala
20 25 30Val Gln Leu Ser Pro Cys Ala Pro Ala Ile Met Ser Asn Gln Thr Pro
35 40 45Thr Ser Ala Cys Cys Ala Lys Leu Arg Glu Gln Lys Pro Cys Leu Cys
50 55 60Gly Tyr Tyr Lys Asn Pro Thr Leu Arg Pro Tyr Ile Asn Ser Pro Gly 65 70 75 80Ala Lys Arg Val Ala Ser Thr Cys Lys Val Ser Val Ser Cys
85 90(2)SEQ ID NO：6的信息： (ⅰ)序列特征
(A)长度：92个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅲ)假设：无 (ⅵ)原始来源：
(A)生物：Beta vulgaris (ⅹⅰ)SEQ ID NO：6的序列描述：Ala Ile Asn Cys Gly Leu Val Ser Gln Ser Leu Ala Ala Cys Leu Gly1 5 10 15Phe Leu Glu Asn Gly Gln Gly Pro Asn Ala Ala Cys Cys Asn Gly Val
20 25 30Lys Thr Leu Arg Asn Leu Thr Pro Thr Thr Gln Asp Lys Arg Thr Ala
35 40 45Cys Arg Cys Met Lys Ser Ala Ala Ser Ala Ile Pro Gly Ile Asn His
50 55 60Lys Tyr Ser Ala Ala Leu Pro Gly Lys Cys Gly Val Ser Ile Pro Gly65 70 75 80Pro Val Gly Pro Gln Ala Asp Cys Ser Gln Ile His
85 90(2)SEQ ID NO：7的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：91个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulgaris (ⅹⅰ)SEQ ID NO：7的序列描述Ile Thr Cys Gly Leu Val Ala Ser Lys Leu Ala Pro Cys Ile Gly Tyr1 5 10 15Leu Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ile Lys
20 25 30Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ala Asp Arg Lys Thr Ala Cys
35 40 45Thr Cys Leu Lys Ser Ala Ala Thr Ser Met Lys Gly Ile Asn Tyr Gly
50 55 60Lys Ala Ala Ser Leu Pro Arg Gln Cys Gly Val Ser Ile Pro Tyr Ala65 70 75 80Ile Ser Pro Asn Thr Asn Cys Asn Ala Ile His
85 90(2)SEQ ID NO：8的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：91个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulgaris (ⅹⅰ)SEQ ID NO：8的序列描述Ile Thr Cys Gly Leu Val Ala Ser Lys Leu Ala Pro Cys Ile Gly Tyr1 5 10 15Leu Gln Gly Ala Pro Gly Pro Ser Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ile Lys
20 25 30Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ala Ser Pro Ala Asp Arg Lys Thr Ala Cys
35 40 45Thr Cys Leu Lys Ser Ala Ala Thr Ser Met Lys Gly Ile Asn Tyr Gly
50 55 60Lys Ala Ala Ser Leu Pro Arg Gln Cys Gly Val Ser Ile Pro Tyr Ala65 70 75 80Ile Ser Pro Asn Thr Asn Cys Asn Ala Ile His
85 90(2)SEQ ID NO：9的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：30个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源：
(A)生物：Beta vulgaris (ⅹⅰ)SEQ ID NO：9的序列描述Ser Gly Glu Cys Asn Met Tyr Gly Arg Cys Pro Pro Gly Tyr Cys Cys1 5 10 15Ser Lys Phe Gly Tyr Cys Gly Val Gly Arg Ala Tyr Cys Gly
20 25 30(2)SEQ ID NO：10的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：46个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulgaris (ⅹⅰ)SEQ ID NO：10的序列描述Ala Ile Cys Lys Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Ala Cys Gly Arg1 5 10 15Asp Ala Asp Cys Glu Lys Ala Cys Asp Gln Glu Asn Trp Pro Gly Gly
20 25 30Val Cys Val Pro Phe Leu Arg Cys Glu Cys Gln Arg Ser Cys
35 40 45(2)SEQ ID NO：11的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：46个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulgaris (ⅹⅰ)SEQ ID NO：11的序列描述：Ala Thr Cys Arg Lys Pro Ser Met Tyr Phe Ser Gly Ala Cys Phe Ser1 5 10 15Asp Thr Asn Cys Gln Lys Ala Cys Asn Arg Glu Asp Trp Pro Asn Gly
20 25 30Lys Cys Leu Val Gly Phe Lys Cys Glu Cys Gln Arg Pro Cys
35 40 45(2)SEQ ID NO：12的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：32个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulgaris (ⅹⅰ)SEQ ID NO：12的序列描述Arg Cys Ile Pro Cys Gly Gln Asp Cys Ile Ser Ser Arg Asn Cys Cys1 5 10 15Ser Pro Cys Lys Cys Asn Phe Gly Pro Pro Val Pro Arg Cys Thr Asn
20 25 30(2)SEQ ID NO：13的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：549个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅱ)分子类型：cDNA (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：Beta vulgaris (ⅸ)特征：
(A)名称／关键词：CDS
(B)位置66．．293 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：13的序列描述ACTCAACAAA TTCAGAAAAA AACAGAAGCA AAAAAAGTTT ATTGAAAGAG TAAGTTGAGG 60TGAAA ATG ATG AAA AGC TTT GTG ATA GTT ATG TTG GTC ATG TCC ATG 107
Met Met Lys Ser Phe Val Ile Val Met Leu Val Met Ser Met
1 5 10ATG GTG GCT ACA TCT ATG GCA AGT GGT GAA TGC AAT ATG TAT GGT CGA 155Met Val Ala Thr Ser Met Ala Ser Gly Glu Cys Asn Met Tyr Gly Arg 15 20 25 30TGC CCC CCA GGG TAT TGT TGT AGC AAG TTT GGC TAC TGT GGT GTC GGA 203Cys Pro Pro Gly Tyr Cys Cys Ser Lys Phe Gly Tyr Cys Gly Val Gly
35 40 45CGC GCC TAT TGT GGC GAT GCT GAG CAG AAG GTT GAA GAT CAT CCA TCT 251Arg Ala Tyr Cys Gly Asp Ala Glu Gln Lys Val Glu Asp His Pro Ser
50 55 60AAT GAT GCT GAT GTT CCT GAG TTT GTT GGA GCT GGT GCC CCA 293Asn Asp Ala Asp Val Pro Glu Phe Val Gly Ala Gly Ala Pro
65 70 75TGATGCTCGA AGCCAGGTAA TCGTAATGGC ATGGGTTACC TAATAAGTAA ACTCATTGTG 353CCTAGCTTGC TACATGCTTA TCCACTATAA ATAAGCTCCT ACAGGAGTTG TGTTTTTCTT 413TTAATTTTGT AATCAAGGGT TTGACTTTAA TTAATGAGAC CAATGTATAC TTGCATGTCG 473GATAAATATT AACTAAGCCA CTCGTATTGG TTTATTATAA AACTACTATA AAAAAAAAAA 533AAAAAAAAAA AAAAAA 549(2)SEQ ID NO：14的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：76个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线型 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：14的序列描述：Met Met Lys Ser Phe Val Ile Val Met Leu Val Met Ser Met Met Val 1 5 10 15Ala Thr Ser Met Ala Ser Gly Glu Cys Asn Met Tyr Gly Arg Cys Pro
20 25 30Pro Gly Tyr Cys Cys Ser Lys Phe Gly Tyr Cys Gly Val Gly Arg Ala
35 40 45Tyr Cys Gly Asp Ala Glu Gln Lys Val Glu Asp His Pro Ser Asn Asp
50 55 60Ala Asp Val Pro Glu Phe Val Gly Ala Gly Ala Pro 65 70 75(2)SEQ ID NO：15的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：52个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：15的序列描述：CCAGTGAGCA GAGTGACGAG GACTCGAGCT CAAGCTTTTT TTTTTTTTTT TT 52(2)SEQ ID NO：16的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：16的序列描述：CCAGTGAGCA GAGTGACG 18(2)SEQ ID NO：17的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：18个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：17的序列描述：GAGGACTCGA GCTCAAGC l8(2)SEQ ID NO：18的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：18的序列描述：GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGGGGGGGG 30(2)SEQ ID NO：19的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：19的序列描述：GGCCACGCGT CGACTAGTAC G 21(2)SEQ ID NO：20的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：20的序列描述：GCACGTTGCT ACGACGTTGC TATGAA 26(2)SEQ ID NO：21的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：21的序列描述：GGACGTATAC TAACTCACTA AGATA 25(2)SEQ ID NO：22的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：22的序列描述： 21TGGAATTGGA GATTATGTAA G(2)SEQ ID NO：23的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：23的序列描述：TCACTTTAGA TGTAAGAAGC ACACATG 27(2)SEQ ID NO：24的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：24的序列描述：TAAGCAGAAA GTTCCAGAAA GCATG 25(2)SEQ ID NO：25的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：25的序列描述：GGAGCTTACT TGCTAACTAT ACTTCT 26(2)SEQ ID NO：26的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：26的序列描述：AACTGTACGT TGCTTGCTGC ACGTGG 26(2)SEQ ID NO：27的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：27的序列描述：CATCAAGAAG TCCATAATTG TCTAG 25(2)SEQ ID NO：28的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：28的序列描述：TGATCTTTAT TGACAAACAG ACGC 24(2)SEQ ID NO：29的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：27个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：29的序列描述：ACAGACACGC TAGTTAGATG ACTAAGC 27(2)SEQ ID NO：30的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：26个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：30的序列描述：GAAGCAAGAA AGCCACGTTG ACTCTT 26(2)SEQ ID NO：31的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：31的序列描述：TGCTGGACGT TACTTACTAA AGAA 24(2)SEQ ID NO：32的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：32的序列描述：CCTAATTTCC CTCAAATCAC G 2l(2)SEQ ID NO：33的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：33的序列描述：AATTTCCCTC AAATCACGAA TTGAG 25(2)SEQ ID NO：34的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：24个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：未知 (ⅲ)假设：无 (ⅲ)反义：无 (ⅵ)原始来源
(A)生物体：引物 (ⅹⅰ)SEQ ID NO：34的序列描述：TCGTCAGTTT TGGCTCATTT TGGG 24