导入了细胞死亡抑制基因的逆境抗性植物及其生产方法本发明涉及逆境抗性(stress resistant)植物及生产该逆境抗性植
物的方法。更具体地说，本发明涉及经过将细胞死亡抑制基因导入
植物来培育逆境抗性植物。
目前，对多细胞生物的程序化细胞死亡(下文简称为“PCD”)
的研究变得较热门。PCD预期对生物体的个体发生，内环境稳定，
对逆境的抗性等是必需的。对PCD的研究主要在Caenorhabditis
elegans(下文简称为“C.elegans”)，果蝇属和哺乳动物上进行
(例如，Miura等，细胞技术，Vol.14.no.2：145-153，1995)。例
如，对C.elegans的研究揭示了一些细胞死亡基因(例如，ced-3和
ced-4)和一些细胞死亡抑制基因(例如，ced-9)。据认为细胞死
亡抑制基因对细胞死亡基因具有负调节活性，从而抑制了随机细胞
死亡。
在哺乳动物中发现的由bcl-2基因编码的蛋白质(即，Bcl-2蛋
白质)在各种系统的细胞(即，淋巴系统，神经系统，生殖系统和
上皮系统的细胞)中表现出细胞死亡抑制活性。迄今，已知能以各
种方法诱导的细胞死亡受Bcl-2过度表达的抑制(例如，Eguchi等，
实验医学，Vol.13，no.16，24-31，1995)。
最近，报道了许多编码Bcl-2相关蛋白和Bcl-2结合蛋白的基
因。这些基因被分类成Bcl-2家族。属于Bcl-2家族的基因的例子包
括来自哺乳动物的bcl-2，bax，bcl-xL，bcl-xS，bad，bak，Al和Mcl-1基
因，来自C.elegans的ced-9基因，BHRF1基因(来自EpsteinBarr
病毒)和LMW5-HL基因(来自非州猪瘟病毒)(Takayama，实验医
学，Vol.13.No.16.24-31，1995)。一般来说，本领域已知属于Bcl-2
家族的基因间在核酸序列水平及在氨基酸序列水平上的相同性和相
似性极低。例如，Baxα和Bcl-2之间在氨基酸序列水平上的相同性
大约为21％，其相似性大约为43％(Yamamoto，“胞间信号转导”，
实验医学，增刊，Adduce Co.，Ltd.)。
最近刚开始对高等植物的PCD进行研究(见Fukuda等，Kagaku
To Seibutsu，34：586-594，1996)。植物总是接触严重的逆境。例如，
植物可被病毒或细菌感染，可被紫外光辐射，或可受到除草剂引起
的超氧化物的影响。为了抵抗这些逆境，例如，在病毒感染的情况
下，超敏反应(HR)诱导PCD。HR的特征在于在感染部位迅速
出现坏死病灶。尽管HR涉及一些组织损伤，但其结果是为了经过
限制感染的传播而保护植物。另外，据认为植物中的这种PCD涉及
细胞死亡基因和细胞死亡抑制基因。
由于细胞死亡抑制基因很可能负调节由逆境或类似情况引起的
细胞死亡(即，能防止细胞死亡)，所以据认为细胞死亡抑制基因
具有对逆境的抗性。因此，在培育植物时，经过表达细胞死亡抑制
基因可赋予对逆境的抗性。提供赋予了对逆境的抗性的植物在农业
领域是一个重要的主题，目前，由于臭氧层的破坏等因素，我们实
际接受的紫外(UV-B)光的量每10年增加大约6.8％。很明显，植
物也面临这一环境问题。
然而，目前，就发明人所知，在本申请要求优先权的日本专利
申请号9-56743和10-8056的申请日之前，对于使用细胞死亡抑制基
因获得对诸如紫外光，产生超氧化物的除草剂和盐逆境的逆境的抗
性尚未进行研究。
本发明涉及导入了细胞死亡抑制基因的逆境抗性植物。用已知
的基因重组技术将细胞死亡抑制基因导入植物细胞的DNA。植物细
胞的DNA不仅指染色体DNA，也指植物细胞中的各种细胞器(例
如，线粒体，叶绿体等)的DNA。
根据本发明的一个方面，提供了一种逆境抗性植物，其中导入
了细胞死亡抑制基因。
在本发明的一个实施方案中，细胞死亡抑制基因属于Bcl-2家族
且编码具有细胞死亡抑制活性的肽。
在本发明的一个实施方案中，细胞死亡抑制基因是
Caenorhabditis elegans ced-9基因。
在本发明的一个实施方案中，细胞死亡抑制基因是人bcl-xL基
因。
在本发明的一个实施方案中，逆境是由紫外辐射引起的逆境。
在本发明的一个实施方案中，逆境是由产生超氧化物的除草剂
引起的氧化逆境。
在本发明的一个实施方案中，逆境是由盐引起的逆境。
根据本发明的另一方面，生产逆境抗性植物的方法包括下列步
骤：将细胞死亡抑制基因导入植物细胞；及将导入了细胞死亡抑制
基因的植物细胞再生成植物体。
在本发明的一个实施方案中，细胞死亡抑制基因是掺入植物表
达载体。
因此，本文描述的本发明具有如下优点(1)经过将PCD相关
基因导入植物而提供了获得了对各种逆境的抗性的植物；和(2)
提供了培育获得了对各种逆境的抗性的植物的方法，其中PCD相关
基因被导入植物中。
经过参考附图阅读和理解下面的详细描述，本发明的这些和其
它优势对本领域的技术人员来说将是显而易见的。
图1是显示起始载体pBE2113的结构的示意图。
图2是显示含人bcl-xL基因的质粒(pM65)和含C.elegans ced-9
基因的质粒(pM66)的示意图。
图3是显示为证实导入的基因在转基因植物(M66)中的表达
而进行的RT-PCR的结果的电泳照片，其中C指对照植物，各数字
代表转基因植物的个体号码。
图4显示了为证实人bcl-xL基因产物在转基因植物(M65)中
的表达而使用抗Bcl-xL抗体进行Western印迹分析的结果，其中在
该植物中导入了来自动物的细胞死亡抑制基因，图中C代表对照植
物且各数字代表转基因植物的个体号。
图5是显示为证实C.elegans ced-9基因在转基因植物(M66)
中的表达而进行的Northern印迹分析的放射自显影照片，其中C代
表对照植物，各数字代表转基因植物的个体号，还显示了pM66表
达载体的示意图。
图6A是显示紫外照射处理后4周龄叶片及紫外照射处理后从
12周龄叶片获得的叶圆片的照片。
图6B是显示UV-B照射处理10天后获得的小植物的照片。
图7是显示导入了动物细胞死亡抑制基因的植物的叶绿素含量
即使在UV照射处理后也仅略有减少的图示。
图8是显示导入了动物细胞死亡抑制基因的植物获得百草枯抗
性的图示。
图9是显示导入了动物细胞死亡抑制基因的植物(M65-21和
M66-30植物)及野生型烟草植物在盐逆境中重量改变的图示。
图10是显示导入了动物细胞死亡抑制基因的植物(M65-21和
M66-30植物)籽苗及35S-GUS植物籽苗的照片。这些植物在各种盐
浓度下放置3天。
图11是显示导入了动物细胞死亡抑制基因的植物(M65-21和
M66-30植物)及35S-GUS植物(对照)的破裂叶片面积的图示。
图12是显示导入了动物细胞死亡抑制基因的植物(M65-21和
M66-30植物)及35S-GUS植物盐(O.2M NaCl)抗性的照片，且
作为对照，显示了相同类型的植物吸收水代替盐的照片。导入了细
胞死亡抑制基因的植物获得了盐抗性。
图13显示了野生型植物(对照)和导入了动物细胞死亡抑制基
因的植物(M65-21和M66-30植物)在O.2M NaCl条件下放置9天
后的照片。植物在茎部切下并放入O.2M NaCl溶液中。导入了细胞
死亡抑制基因的植物获得了盐抗性。
图14是显示为证实Bcl-xL蛋白在转基因植物细胞中的定位而
进行Western印迹分析的结果的电泳照片。它显示了Bcl-xL蛋白质
位于线粒体组分中。
在下文中，将对本发明进行更详细的描述。
本文的术语“细胞死亡抑制基因”指针对对PCD以抑制方式发
挥作用的基因，而不管其来源(植物或动物)，只要该基因来自多
细胞生物。细胞死亡抑制基因优选来自动物，例如，细胞死亡抑制
基因可来自线虫(例如，C.elegans)或包括人类的哺乳动物。细胞
死亡抑制基因的例子包括来自C.elegans的ced-9基因，来自哺乳动
物例如人，小鼠或鸡的bcl-2基因，来自人的bcl-xL基因(Miura等，
细胞技术，Vol.14，no.2：145-153，1995)。
根据本发明，可使用已知的细胞死亡抑制基因。优选的细胞死
亡抑制基因包括属于Bcl-2家族的那些基因(例如，ced-9基因和
bcl-xL基因)。
使用已知的细胞死亡抑制基因或其片段作探针可获得的，并与
已知细胞死亡抑制基因同源的来自各种类型的生物的基因组或
cDNA文库的基因也可用作细胞死亡抑制基因。为达到该目的，例
如，可使用植物DNA文库，C.elegans DNA文库和人DNA文库。
本领域的技术人员可适当选择用于筛选文库的严格条件。本文的“具
有同源性的基因”指当在氨基酸水平上与细胞死亡抑制基因相比较
时，在特定区域高度保守的基因。本文使用的术语“高度保守”指，
例如，在氨基酸水平上具有大约40％或更多的同源性，优选大约70％
或更多，更优选大约80％或更多，还更优选大约90％或更多的同源
性。在此概念下，同源性测定表示为所比较的两个氨基酸序列间不
变的氨基酸和保守性取代的氨基酸占总氨基酸的比率。
属于Bcl-2家族的基因具有在氨基酸水平上高度保守的区域。已
知BH1和BH2区域高度保守，还已知在N端有一个也是高度保守
的区域(即，BH3区域)。这些区域在异源性Bcl-2家族(人，小
鼠，大鼠和鸡)间在进化上保守(Takayama，实验医学，Vol.13，No.
16，24-31，1995；和Ohta等，实验医学，Vol.13.No.16，32-37，
1995)。特别是已知包括所有BH1，BH2和BH3区域的蛋白质以
其本身抑制细胞程序性死亡(Takayama，实验医学，Vol.13.no.16，
24-31，1995)。
因此，术语“属于Bcl-2家族的基因”指属于Bcl-2家族的已知
细胞死亡抑制基因或与其同源的基因。与属于Bcl-2家族的已知细胞
死亡抑制基因同源的基因意在指编码包括至少一个选自BH1，BH2
和BH3区域的区域的蛋白质的基因，优选编码包括选自BH1，BH2
和BH3区域的至少两个区域的蛋白质的基因，更优选编码包括BH1
和BH2区域的蛋白质的基因，最优选编码包括BH1，BH2和BH3
所有区域的蛋白质的基因。
使用商业上可获得的计算机分析软件(Gene Works，
IntelliGenetics Inc.)将感兴趣的基因所编码的氨基酸序列与已知
Bcl-2家族蛋白质的氨基酸序列进行序列对比可较容易地寻找和鉴
定高度保守的区域。
根据Miura等，细胞技术，Vol.14，No 2：145-153，1995所述的
方法可测定所获得的基因的细胞死亡抑制活性。具体地说，将该感
兴趣的基因导入Rat1细胞，已知从培养基中去掉血清可诱导该细胞
死亡(Kumar，S.等，基因发展，8：1613-1626，1994)，然后从培养
基中去掉血清。4天后，观察重组Rat1细胞的细胞死亡率。如果重
组Rat1细胞中的细胞死亡明显受到抑制，则认为感兴趣的基因具有
细胞死亡抑制活性。
根据Eguchi等，实验医学，Vol.13.No.16，24-31，1995所述的
方法也可测定所获得的基因的细胞死亡抑制活性。具体地说，将感
兴趣的基因导入来自大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PCl2的细胞，将大约
105个细胞接种在6cm平皿上并放入箱中适应低氧浓度。然后，通过
使用例如BBL Gas Pac Plus(Becton Dickinson)可减小箱中的氧浓
度。使用台盼兰在一段时间内定量存活细胞的数目，其中氧浓度减
少到100ppm时的时间点定为0。由于已知在100ppm或更低的低
氧浓度条件下(即，在诱导细胞程序死亡的条件)培养48小时时大
约一半的细胞被杀死，所以当观察到细胞死亡率明显受抑制时，认
为感兴趣的基因具有细胞死亡抑制活性。
因此本文使用的术语“具有细胞死亡抑制活性的基因”指根据
至少一种上述方法或其相当方法证实为具有细胞死亡抑制活性的基
因。
生产用于筛选与已知细胞死亡抑制基因同源的基因的DNA文
库的方法，与探针杂交的严格条件及克隆基因的方法对本领域的技
术人员来说是熟知的。例如，见Maniatis等，分子克隆实验手册，
第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989。
经过，首先从C.elegans分离总RNA，然后用总RNA作模板经
RT-PCR获得ced-9的全长cDNA来筛选ced-9基因。优选的是，可
将5′-TTGAATTCGAGATGACACGCTGCACGGCGG-3′(SEQ
ID NO：1)用作引物。具体地说，从mRNA合成第一链cDNA，然
后使用SEQ ID NO：1的引物和5′-GGGAATTCGTTACTTCAAGC
TGAACATCAT-3′(SEQ ID NO：2)进行PCR，从而获得感兴趣
的cDNA。
经过使用合适的引物以相似方式可分离bcl-xL基因。
按照商业上可获得的试剂盒或仪器的厂家说明书或以本领域的
技术人员熟知的方法进行PCR。
由此获得的来自动物或其它来源的细胞死亡抑制基因可经与合
适的植物表达载体相连而导入植物中。另外，通过使用直接将核酸
导入植物的转化方法(例如，电穿孔方法，粒子枪方法，磷酸钙方
法或聚乙二醇(PEG)方法)可将细胞死亡抑制基因导入植物中。
本文使用的术语“植物”包括单子叶和双子叶植物，特别优选
的植物的例子包括烟草，青椒，茄子，甜瓜，西红柿，甜薯，卷心
菜，大葱，硬花球花椰菜，胡萝卜，黄瓜，柑橘水果，大白菜，莴
苣，桃子，水稻，土豆，大麦，小麦，和苹果。除非另有说明，本
文所用的“植物”包括任意一种植物体，植物器官，植物组织，植
物细胞和种子。植物器官的例子包括根，叶，茎，花等。植物细胞
的例子包括愈伤组织和悬浮培养细胞。
本文使用的术语“植物表达载体”指一种核酸序列，在该序列
中诸如调节细胞死亡抑制基因表达的启动子的各种调节元件以在宿
主植物细胞中可操作的方式互相连接。优选的植物表达载体可包括
植物启动子，终止子，药师抗性基因和增强子。本领域的技术人员
熟知：植物表达载体的类型和调节元件的类型可根据宿主细胞而变
化。本发明使用的植物表达载体可进一步含有T-DNA区域。T
-DNA区域能使基因经土壤杆菌介导的转化导入植物基因组。
本文使用的术语“植物启动子”指在植物中表达的启动子。植
物启动子的例子包括但不限于其表达受某类逆境诱导的启动子，例
如，编码烟草感染特异性蛋白质PR-1a的基因的启动子(下文称为
“烟草PR-1a启动子”)，或以组成型表达的启动子，例如，花椰
菜花叶病毒35S启动子(下文称为“CaMV 35S启动子”)和胭脂氨
酸合酶启动子(Pnos)。
本文使用的术语“终止子”指位于编码蛋白质的基因区下游的
序列，它参与mRNA转录的终止并添加聚腺苷酸序列。已知终止子
负责mRNA的稳定性，从而影响基因的表达水平。终止子的例子包
括但不限于CaMV 35S终止子，胭脂氨酸合酶基因(Tnos)终止子，烟
草PR-1a基因的终止子。
药物抗性基因需要使转基因植物易于选择。作为药物抗性基
因，优选使用赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(NPT II)基因，
赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因等。
用于表达药物抗性基因的启动子的例子包括但不限于E12 Ω启
动子，烟草PR-1a启动子，CaMV 35S启动子，和胭脂氨酸合酶
启动子。优选的是使用E12Ω启动子，它以高水平组成型表达感兴
趣的基因。E12Ω启动子包括串联相连的CaMV 35S启动子的2个
增强子区域(En 35S：-417到-90)，CaMV 35S核心启动子和烟
草花叶病毒的Ω区域(基因217：217，1987)，CaMV 35S启动子
和Ω区定位在串联增强子区的下游(见在日本公开公报号7-250685
中公开的质粒pST10)。E12Ω启动子具有比CaMV 35S启动子高10
到20倍的活性。
可使用增强子增强感兴趣的基因的表达。作为增强子，优选含
上述CaMV 35S启动子上游序列的增强子区。每个感兴趣的基因可
使用多个增强子。
用于本发明构建植物表达载体的载体可优选是pBI型载体，
pUC型载体或pTRA型载体。
pBI型和pTRA型载体可经土壤杆菌将感兴趣的基因导入植物
中。可优选使用pBI型双向载体或pTRA型中间载体。pBI型载体
的例子包括pBI121，pBI101，pBI101.2和pBI101.3。这些载体含
来自一个区域(T-DNA区域)的基因，其经过土壤杆菌介导的转化
导入植物中。这些载体还含有NPTII基因(用于提供卡那霉素抗性)，
它在植物启动子的控制下表达，用作标记基因。
pUC型载体的应用能将基因直接导入植物中。pUC型载体的例
子包括pUC18，pUC19和pUC9。
本发明的植物表达载体可使用本领域技术人员熟知的重组DNA
技术来生产。优选的是，将来自动物的细胞死亡抑制基因导入上述
载体启动子的下游。
使用本领域技术人员熟知的方法可将植物表达载体导入植物细
胞。例如，经土壤杆菌导入植物表达载体的方法或将植物表达载体
直接导入细胞的方法是已知的。可例如，如在Nanel等，微生物学
通讯，67，325，1990中所述进行使用土壤杆菌的方法。根据该
方法，首先用例如植物表达载体经电穿孔转化土壤杆菌，然后以
S.B.Gelvin等，植物分子生物学手册，学术出版社所述的方法将由此转
化的土壤杆菌感染进植物细胞。直接将植物表达载体导入细胞的方
法的例子包括电穿孔方法和基因枪方法。这些方法是本领域中熟知
的且适合于待转化的植物的方法可由本领域的技术人员适当选择。
已导入了植物表达载体的细胞的选择以其药物抗性如卡那霉素
抗性为基础。此后，可使用常规方法将细胞再生为植物组织，植物
器官或植物体。可从植物体获得种子。
使用引物对经PCR分析，可确定细胞死亡抑制基因是否已导入
了转基因植物。例如，当感兴趣的基因经含胭脂氨酸合酶终止子的
植物表达载体导入转基因植物时，可使用5′-
AGACCGGCAACAGGATTCAA-3′(SEQ ID NO：5)，(相对于胭
脂氨酸合酶终止子的序列)作为3′引物进行PCR。如果感兴趣的基因
是C.elegans ced-9基因，5′引物可以是5′-
CCTCTTCGTTTACACATCGC-3′(SEQ ID NO：3)。如果感兴趣的
基因是人bcl-xL基因，5′引物可以是5′-ACAAGGAGATGCAGG
-3′(SEQ ID NO：4)。将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，当扩
增出与阳性对照具有相同迁移率的DNA时，证实在转基因植物中存
在感兴趣的基因。
以本领域技术人员熟知的方法可证实导入的细胞死亡抑制基因
的表达。例如，使用相应于所导入基因的DNA，即，例如，ced-9
或bcl-xL的cDNA或其部分序列作探针对植物叶所提取的总RNA进
行Northern印迹分析可证实表达。
为了证实来自动物或其它来源的细胞死亡抑制基因产物在植物
中的表达，可使用本领域技术人员熟知的方法(例如，Western印
迹)。例如，可按如下方法证实表达：按Leammli等，自然227：680
-685，1970所述经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(下文简称为“SDS
-PAGE”)分离从转基因植物提取的蛋白质样品并转移到合适的膜
上。用抗感兴趣蛋白质的抗体温育膜，经免疫化学检测感兴趣的带，
以而证实感兴趣的基因产物的表达。为了检测人bcl-xL基因产物的
表达，经SDS-PAGE分离从叶中提取的蛋白质样品并转移到膜上，
用抗人bcl-xL蛋白质的多克隆抗体温育膜，然后，例如，用碱性磷
酸酶缀合的抗兔IgG抗体温育膜。以作为底物的BCIP(5-溴-4-
氯-3-吲哚-磷酸)及NBT(氮蓝四唑)的水解观察反应，从而检测
基因产物的表达。
转基因植物的逆境抗性可根据对紫外辐射处理的抗性，对产生
超氧化物的除草剂(例如，1，1-二甲基-4，4-联吡啶二氯；
以商标“百草枯”出售)处理的抗性和/或对盐逆境的抗性来检测。
典型地是，可使用UV-B光进行UV辐射处理。可使用东芝
UV-B灯(东芝FK-208E)进行UV-B辐射处理。准备2组各2
个紫外灯，各紫外灯的水平距离为20cm。以UV-B灯辐射出的紫
外光的波长主要是UV-B(290-320nm)，剩下的是UV-C(260
-280nm)和UV-A(340-360nm)。低于290nm的波长可被二乙酸纤
维素膜阻断。可调节UV-B灯与植物顶端间的距离使UV-B辐
射的量合适。对UV-B辐射补充强度为100μmol-2S-1的白光(每
天辐射16小时)。因此总是在白光存在下进行UV-B光强度的测
量。可用Spectroline数字辐射计(Spectronic Corporation，Westbury，NY)
测量辐射强度且根据NIST标准品来校正。
产生超氧化物的除草剂的例子包括百草枯(商标)。在连续光照条
件下将叶片浸入除草剂溶液中进行除草剂处理。
在UV-B处理的情况下，如果与非转基因植物相比，转基因
植物中的指示表型受抑制则表明转基因植物获得了UV-B抗性。
这类表型包括用UV辐射的叶片表面的光泽异常，用UV辐射的叶萎
蔫和枯萎。另外，与非转基因植物相比，如果UV-B辐射处理或
除草剂处理后转基因植物叶片的脱色受抑制则发现转基因植物获得
了UV-B抗性或除草剂抗性。
另外，为检查UV-B辐射处理或除草剂处理的影响，可测量
叶绿素含量。具体地说，在预定期间的上述处理后，使用N，N-
二甲基甲酰胺立即从叶中提取叶绿素，然后经分光光度计测量提取
物。测量转基因植物和非转基因植物的叶绿素含量，如果转基因植
物叶绿素含量高于非转基因植物，则表明转基因植物获得了抗性。
本文所述的高盐浓度指对照植物的生长受抑制的盐浓度。术语
“盐逆境”指植物在这种高盐浓度的环境中生长的情况。高盐浓度
的范围是本领域技术人员所熟知的。例如，对0.1M或0.2MNaCl浓
度的溶液的抗性可以是盐逆境抗性的指标。
可按如下方法检测对盐逆境的抗性。转基因植物和对照植物暴
露于高盐浓度环境中，例如，将植物浸入盐水并使其吸收盐水。生
长到30到40cm高度的幼苗或植物可用作植物样品。比较转基因植
物和对照植物间重量的改变及形态的改变(例如，褐色或黄化的程
度，离层形成的程度)。如果与对照植物相比接触盐环境后转基因植
物的重量改变(典型地是重量减少)及可观察到的形态改变受抑制，则
表明转基因植物获得了对盐逆境的抗性。
本领域技术人员可预料到，可选择在不同于上述条件但在与其
相当的条件下检测转基因植物的逆境抗性。
根据本发明，术语“逆境抗性植物”指被赋予了至少一种：对
紫外辐射处理的抗性；对产生超氧化物的除草剂处理的抗性；和对
盐逆境处理的抗性的转基因植物。
下面将以说明性的实施例的方式描述本发明。用于下列实施例
的限制性酶，质粒等可从商业来源获得。
实施例1：植物表达载体的制备
图1所示的双向载体pBE2113用作植物表达载体的起始材料。
如在日本公开公报号7-250685中所述，使用含药物抗性基因区
(Pnos，NPTII和Tnos)且其中导入了E12Ω启动子区序列的双向载体
pBI121(由Clontech生产)作为起始材料生产植物表达载体。
实施例2：来自动物的细胞死亡抑制基因的分离及植物表达载
体的构建
使用TRIsol(生命技术公司)从C.elegans分离总RNA，从mRNA
合成第一链cDNA。然后，使用5′-TTGAATTCGAGATGACACG
CTGCACGGCGG-3′(SEQ ID NO：1)作引物经RT-PCR合成
ced-9全长cDNA。然后，使用Pfu聚合酶(由Stratagene生产)，同时
使用SEQ ID NO：1作5′引物且5′-GGGAATTCGTTACTTCAAGC
TGAACATCAT-3′(SEQ ID NO：2)作3′引物进行PCR。在94摄氏度
变性DNA1.5分钟，在55摄氏度退火2.5分钟并在72摄氏度进行延
伸反应2分钟，重复该循环25次。将PCR产物克隆进pBluescript
的EcoRI位点，从而获得质粒pM61。
另一方面，使用5′-ATGTCTCAGAGCAACCGGGAGCTGGT
GGTT-3′(SEQ ID.NO：6)作5′引物，5′-TCATTTCCGACTGAAG
AGTGAGCCCAGCAG-3′(SEQ ID NO：7)作3′引物经PCR从人
cDNA文库(由Clontech生产)分离人bcl-xL基因，PCR的条件与上
面所述相同。将分离的全长人bcl-xL cDNA克隆进pBluescript的
EcoRI位点，从而获得质粒pM21。使用合成接头将pM21的SalI位
点或pM61的Hind III位点改变成Bgll II。所得的质粒分别命名为
pM21-Bgl和pM61-Bgl。分离pM21-Bgl的Bgl II-Sac I
片段或pM61-Bgl的Bgl II-Sac I片段并克隆进pBE2113的E12
Ω下游。具有人bcl-xL基因的载体命名为pM65，具有C.elegans ced-9
基因的载体命名为pM66。表达载体pM65和pM66在图2中以示意
图表示。
实施例3：将表达载体导入烟草植物
根癌土壤杆菌的转化
在含250μg/ml链霉素和50μg/ml利福平的培养基中于28摄
氏度培养根癌土壤杆菌。制备细胞悬浮培养物，根据Navel等，微
生物学通讯，67，325，1990，所述的方法经电穿孔将表达载体
(pM65或pM66)导入上述细菌中。
在一个例子中，使用含连接到CaMV-35S启动子上的GUS(葡糖
醛酸酶)基因的质粒(pBI121：35S-GUS)，且在另一个例子中，
使用含与CaMV 35S启动子融合的POX(来自水稻的超氧化物酶)基
因(Ito等，植物细胞报道，13：361-366，1994)的质粒(35S-POX)以
相同的方式进行转化以比较转化效力。
烟草的转化
获得根据上述方法用质粒pM65或pM66转化的土壤杆菌并在
YEB培养基中进行悬浮培养(DNA克隆，Vol.2.p.78)。然后用无菌水
将培养基稀释20倍，随后与烟草(Nicotiana tabacum cv.Samsun NN)
叶圆片共同培养。几天后，将细菌移至含抗生素的培养基中。每隔
两周将叶圆片在选择培养基上进行传代培养。以常规方法选择并再
生转基因烟草细胞。结果，获得了20个独立的导入了人bcl-xL基因
(pM65)的卡那霉素抗性转化子，以及29个独立的导入了C.elegance
ced9基因(pM66)的卡那霉素抗性转化子。而且，在质粒35S-GUS
的例子中获得了20个独立的卡那霉素抗性转化子，在质粒35S-
POX的例子中获得了47个独立的卡那霉素抗性转化子。结果在表1
中显示。
表1
独立的卡那霉素抗独立的具有感兴趣的百分率(％)
性转化子的数目 基因的转化子的数目
M65转化子
(E12Ω-bcl-xL) 20 20 100
M66转化子
(E12Ω-ced-9) 29 28 97
对照转化子
(35S-GUS) 20 14 70
对照转化子
(35S-POX) 47 34 73
导入的基因在括号中显示
导入了细胞死亡抑制基因的转化子具有极高百分率(97％或更高)
的感兴趣的基因(bcl-xL或ced-9)。从以下描述的PCR也证实了这些
结果。另一方面，未导入细胞死亡抑制基因的转化子仅大约70％具
有感光趣的基因(GUS或POX)。这些事实表明，导入了细胞死亡抑
制基因的细胞在存活中具有优势。
实施例4：以PCR方法证实转化
用常现方法从导入了C.elegance ced-9基因(pM66)的转基因烟草
提取总RNA并合成cDNA然后，使用5′-CCTCTTCGTTT
ACACATCGC-3′CSEQ ID ND NO：3)作5′引物，以针对胭脂氨酸合
酶终止子的序列5′-AGACCGGCAACAGGATTCAA-3′(SEQ ID
NO：5)作3′引物进行RT-PCR，PCR条件与实施例2相同。将所得
的PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳以确定是否扩增了与对照具有
相同迁移率的DNA片段。结果在图3中显示，证实了在转化子中存
在导入的基因。
实施例5：在转基因植物中检测细胞死亡抑制基因产物的表达
以Western印迹证实人bcl-xL基因产物的表达。从导入了人
bcl-xL基因(pM65)的转基因烟草Samsun NN和野生型Samsun NN中
各获得的直径大约为7mm的4个叶圆片在20μl125mM Tris-HCl，
pH6.8(含0.1％SDS，20％甘油，28mM2-巯基乙醇，10μg/ml
溴酚兰)中研磨，以16,000rpm离心10分钟，并煮沸5分钟，收
集由此获得的上清作为蛋白质部分。对蛋白质部分进行12.5％SDS-
PAGE，并转移到Immobilion-P膜(由Milipore生产)上。此后，用抗
人bcl-xL蛋白质的兔多克隆抗体(由MBL生产)温育膜，洗涤膜并与
碱性磷酸酶缀合后抗兔IgG抗体(1∶1000稀释，由KPL实验室生
产)温育。以作为底物的BCIP及NBT的水解观察感兴趣的带。结果
在图4中显示，证实了在转基因植物中表达人Bcl-xL蛋白质。
实施例6：以Northerb印迹检测转基因植物中的RNA
以Northern印迹证实了ced-9基因在转基因植物中的表达。按照
常规方法，将从再生的烟草叶中提取的总RNA在琼脂糖甲醛凝胶上
进行电泳并印迹到Hybond-N膜(由Amersham生产)上。使用相应于
导入基因，例如，ced-9或bcl-xL的cDNA的DNA作探针检测感兴
趣的mRNA。结果在图5中显示，证实了导入的基因在转基因植物
中的表达。
实施例7：在转基因植物中获得紫外抗性
根据实施例6所述的方法，在证实表达细胞死亡抑制基因的转
基因烟草植物中选择出导入了人bcl-xL基因的M65-21植物及导入
了C.elegans ced-9基因的M66-30植物。检查这些植物的UV抗性。
使用东芝UV-B灯在上述条件下进行UV辐射处理。
首先，用通过滤片光片的UV-B及无滤光片的UV-B辐射野生
型烟草植物，发现直接用UV光(260-360nm)辐射的烟草比经滤光片
辐射的烟草具有对UV光更高的敏感性。因此，认为UV-C增强了
UV-B的有害影响。
将每种M65-21(bcl-xL)，M66-30(ced-9)和野生型烟草植物的第
二代自花传粉植物的4周龄叶，12周龄叶圆片和小植株分别用无滤
光片的UV-B辐射。转基因烟草和野生型烟草(对照)植物与UV-
B(25kJ/m2)接触10天，在处理后4和5天时观察不到可见的变化。
在处理后第7或8天时野生型萎蔫，最终枯萎。转基因M65-21(bcl-
xL)和M66-30(ced-9)植物不显示出变化或有轻微的形态学上的破
坏。结果在图6中显示，图6A是显示用UV-B辐射处理10天的4
周龄叶和12周龄叶的叶圆片的照片，图6B是显示用UV-B光辐射
10天的小植株的照片。这些结果表明转基因植物获得了对UV-B光
的抗性，从而可推断在天然环境中表现出对UV辐射的抗性。
实施例8：在转基因植物中对叶绿素降解的抑制效应
按与实施例7中相同的方式，经过使用无滤光片的UV-B，使
M65-21(bcl-xL)植物，M66-30(ced-9)植物和野生型烟草植物的12周
龄叶的叶圆片暴露于UV-B灯(32kJ/m2)下10天，UV-B辐射处理
后，使用N，N-二甲基甲酰胺从处理的叶圆片中提取叶绿素，并
根据Borra等，Biochemica et Biophysica Acta，975：384-394，1989的方
法进行测量。具体地说，使用公式：13.43×(在663.8nm波长处的
吸收值)-3.47×(在646.8nm波长处的吸收值)测量叶绿素a，用
公式：22.9×(在646.8nm波长处的吸收值)-5.38×(在663.8nm
波长处的吸收值)测量叶绿素b，从而获得叶绿素含量a+b。另外，
在126kJ/m2UV-B辐射的条件下也进行了处理。在这一情况下，由于
叶片在第3天开始黄化，所以处理只进行了2天。结果在图7中显
示。在所有处理中，转基因M65-21(bcl-xL)和M66-30(ced-9)植物的
叶绿素保持不降解。
实施例9：在转基因植物中对百草枯(商标)的抗性
百草枯是在叶绿体中产生超氧化物和自由基的除草剂。由于转
基因M65-21(bcl-xL)和M66-30(ced-9)植物表现出对叶绿素降解的抗
性，因此认为它们也具有对百草枯的抗性。在连续光照条件下将烟
草叶圆片浸入0到100μM的百草枯溶液中，按实施例8相同的方
式，提取叶绿素并测量叶绿素的浓度。结果在图8中显示，转基因
M65-21(bcl-xL)和M66-30(ced-9)烟草植物均表现出对百草枯的抗
性。
实施例10：在转基因植物中获得盐抗性
在证实表达细胞死亡抑制基因的转基因植物中选择导入了人
bcl-xL基因的M65-21植物和导入了C.elegans ced-9基因的M66-30
植物来评价盐抗性。
(A)M65-21的第二代自花传粉植物的种子(下文称为“M65-21-
2”)，M66-30的第二代自花传粉植物的种子(下文称为“M66-30-
3”)和作为对照的35S-GUS的种子分别种植在含50μg/ml卡那霉
素的琼脂培养基上，2个月后，从琼脂培养基上小心取出幼苗并经
洗涤除去根上的琼脂。然后，将各幼苗放入含2.2ml水，0.1MNaCl
溶液或0.20M NaCl溶液的2mlEppendorf管(其中盖被切除)中，使其
根浸入溶液中。将管放在试管架上并放入透明丙烯酸盒中。然后在
光照射为3000lux(16小时/天)和温度为25℃的条件下评价植物对盐
的抗性。
另外，作为对照植物，将非转基因烟草(野生型烟草)植物种植在
不含卡那霉素的琼脂培养基中。
(1)在一段时间内测量各幼苗的重量，定量评价各植物对盐的
抗性。结果在图9中显示，图中显示的值为各植物5株幼苗的平均
值。
对于浸入水(即，OM NaCl)中的幼苗，移植1天后其重量减少。
认为这是由于幼苗不得不在空气中从密封的培养器中取出并放入试
管培养基中。此后，浸入水中的幼苗重量逐渐增加。
对于野生型烟草植物，用0.1M NaCl处理的幼苗重量明显减少，
用0.2M NaCl处理的幼苗重量减少更大。
在另一方面，对于转基因植物65-21-2(bcl-xL)植物和M66-30-
3(ced-9)植物，用0.1M NaCl处理的幼苗基本上检测不到重量的减
少。即使用0.2M NaCl处理的幼苗，与野生型烟草植物相比其重量
的减小也受到抑制。
(2)对于在与上面完全相同的条件下处理的35S-GUS植物(对
照)，获得了与野生型烟草植物所获得的相同的结果。处理后3天拍
照(图10)，在高浓度盐的条件下35S-GUS植物完全被破坏，其中叶
萎蔫且根的生长受到抑制。而与对照植物相比，转基因烟草植物破
坏较小。
(3)用立体显微镜观察经上述处理破坏的叶面积。图11是显
示叶破坏的面积的百分数，该结果表示上述转基因植物比对照植物
获得了对盐更高的抗性，M65-21植物几乎不受0.1M NaCl的影响。
(4)新制备与上述实验(1)至(3)中所用的相同类型的幼苗(即，在播
种2个月后获得的幼苗)。将这些幼苗移到不含卡那霉素的两个琼脂
培养基中。移植3天后，向一个培养基中加入NaCl水溶液使培养基
的最终NaCl浓度为0.2M(NaCl处理的培养基)，向另一培养基(对照
培养基)中加入相同量的水。
观察植物在两种培养基上的生长，移植20天后，在对照培养基
中的35-GUS植物和转基因植物顺利生长且产生绿叶(图12，右侧)
另一方面，在NaCl处理的培养基中植物的生长总体上受抑制(图
12，左侧)。
然而，在NaCl处理的培养基中，与对照35S-GUS植物相比转
基因烟草植物被盐的破坏较小。所有对照植物的叶片均黄化且具有
萎黄病的症状。另一方面，转基因植物对20天的盐处理具有抗性且
它们的许多叶片保持绿色。
(B)经过切下生长于蛭石中的30至40cm烟草植物的茎并浸入
NaCl溶液中使其吸收的方法来进一步评价盐抗性。另外，定量植物
下位叶片的Na+和Cl-浓度以分析植物对盐逆境的抗性机制。
在植物体下方(根以上大约7cm)切下罐栽野生型烟草植物和转
基因M65-21-2及M66-30-3烟草植物的茎。将各植物放入含300ml
0.2M NaCl溶液或300ml水(对照)的500ml锥形瓶中使切下的茎浸入
溶液中，此后在25℃和3000lux(16小时/天)的条件下维持9天。9
天后，野生型烟草植物出现黄化。野生型植物的下部叶被浸软且因
此很可能形成了导致落叶的离层。另一方面，转基因M65-21-2和
M66-30-3植物明显地有更健康的外观且不出现下位叶离层的形成
(图13)。
收获上述植物的下位叶，将包括叶柄的总叶片与蒸馏水一起研
磨，在10,000xg下离心15分钟。测量所得上清的离子导电性和
Na+及Cl-含量。
使用导电性检测仪(Shimatsu CDD-6A)测量导电性。将100μl
上清注射进检测仪中。显示的测量值μs/cm除以细胞常数(25)即得
导电率S(西门子)。
使用DIONEX离子色谱DX-100经CS12A柱定量Na+浓度，使
用DIONEX离子色谱2000i经DIONEX AS4A柱定量Cl-浓度。
离子导电率的分析结果在表2中显示，所有吸收0.2M NaCl的
植物下位叶片比吸收水而非NaCL的植物(对照)包含更高浓度的电解
质。具体地说，两个野生型烟草植物SNNa和SNNb的电解质含量
比吸收水而非NaCl的对照植物SNN的电解质含量分别增加146％和
113％。
在转基因烟草植下位叶片中包含的电解质含量比野生型SNN
烟草明显较少，且与原始植物相比最多增加37％到78％因此，认
为转基因烟草植物一旦吸收了NaCl就以某种机制从某些叶组织中
排泄掉或吸收较少量的NaCl。
另外，测量了Na+和Cl-的浓度。结果，在对照烟草SNN下位叶
片中积累的Na+浓度的增加比吸收水的植物大6到8倍。另一方面，
在转基因烟草植物中，Na+浓度的增加极大地受到抑制。特别是在
M66植物中，Na+浓度的增加比吸收水的植物仅大2到3倍(表2)
对于Cl-浓度获得了相似的结果(数据未显示)。
表2
植物
蛋白质
(mg/gFW)
Na(ppm)
导电率(uS)
总量
与对照相比增加的量
总量
与对照相比增加的量
SNN(-NaCl)
7.6
0.76
-
926
-
SNNa(+NaCl)
13.4
6.55
5.79(×7.6)
2,274
1,348(146％)
SNNb(+NaCl)
16.2
5.48
4.72(×6.2)
1,974
1,048(113％)
M65-21a(+NaCl)
15.8
4.33
3.57(×4.7)
1,266
340(37％)
M65-21b(+NaCl)
13.4
4.34
3.58(×4.7)
1,545
619(67％)
M66-30a(+NaCl)
10.4
2.39
1.63(×2.1)
1,373
447(48％)
M66-30b(+NaCl)
14.6
3.38
2.62(×3.4)
1,648
722(78％)
这些结果表明：过量表达来自动物的细胞死亡抑制基因产物的
这些植物经过防止Na+和Cl-的过多积累而表现出对盐的抗性。
(6)为了进一步分析盐抗性机制，以差速离心分离M65-21植物
叶的细胞器，并检查Bcl-xL蛋白质的定位。以Western印迹分析获
得的结果在图14中显示。
从这些结果发现在蛋白质水平上大多数Bcl-xL蛋白质位于线
粒体组分中。
在动物中，据认为这些细胞死亡抑制基因产物存在于线粒体膜
上，从而防止线粒体的功能障碍以抑制细胞死亡。从本发明的上述
实施例获得的结果显示，来自动物的细胞死亡抑制蛋白同样在植物
中发挥功能，且不仅可提供UV抗性及百草枯抗性，也提供盐抗性，
据认为对由逆境引起的胞内细胞器(例如，线粒体)的功能障碍的保护
负责该机制。
导入了细胞死亡抑制基因的植物表现出对UV辐射的抗性，对
产生超氧化物的除草剂的抗性及对盐逆境的抗性。根据本发明，提
供了被赋予对各种逆境的抗性的植物，该植物在农业和植物育种中
具有优势。而且，根据本发明，提供了提供被赋予对逆境抗性的植
物的方法。
在不偏离本发明的范围和实质的前提下，各种其它的改进对本
领域技术人员而言是显而易见的且可由他们很容易地做出。因此，
无意使本文所附权利要求书的范围受本文所提供的说明的限制，而
应在广义上理解权利要求书。
序列表
(1)一般信息
(i)申请人：农林水产省农业生物资源研究所
(ii)发明名称：导入了细胞死亡抑制基因的逆境抗性植物及其生
产方法
(iii)序列数：7
(iv)联系地址：
(A)联系人：农林水产省农业生物资源研究所
(B)街道：2-1-2，Kannondai
(C)城市：Tsukuba-shi
(D)州：茨城县
(E)国家：日本
(F)邮编：305-8602
(v)计算机可读形式：
(1)媒体类型：3.50英寸软盘，1.4MB format
(2)计算机：EPSON
(3)操作系统：MS-DOS 2.11版
(4)软件：Word Perfect(ASCII file)
(vii)在先申请数据：
(A)申请号：(1)JP 9-56743
(2)JP 10-8056
(B)申请日：(1)1997年3月11日
(2)1998年1月12日
(2)SEQ ID NO.1信息
(i)序列特征：
(A)长度：30
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：其它核酸，引物
(xi)序列描述：SEQ ID NO.1：
TTGAATTCGA GATGACACGC TGCACGGCGG
(2)SEQ ID NO.2信息
(i)序列特征：
(A)长度：30
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：其它核酸，引物
(xi)序列描述：SEQ ID NO.2：
GGGAATTCGT TACTTCAAGC TGAACATCAT
(2)SEQ ID NO.3信息
(i)序列特征：
(A)长度：20
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：其它核酸，引物
(xi)序列描述：SEQ ID NO.3：
CCTCTTCGTT TACACATCGC
(2)SEQ ID NO.4信息
(i)序列特征：
(A)长度：15
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：其它核酸，引物
(xi)序列描述：SEQ ID NO.4：
ACAAGGAGAT GCAGG
(2)SEQ ID NO.5信息
(i)序列特征：
(A)长度：20
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：其它核酸，引物
(xi)序列描述：SEQ ID NO.5：
AGACCGGCAA CAGGATTCAA
(2)SEQ ID NO.6信息
(i)序列特征：
(A)长度：30
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：其它核酸，引物
(xi)序列描述：SEQ ID NO.6：
ATGTCTCAGA GCAACCGGGA GCTGGTGGTT
(2)SEQ ID NO.7信息
(i)序列特征：
(A)长度：30
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型
(ii)分子类型：其它核酸，引物
(xi)序列描述：SEQ ID NO.7：
TCATTTCCGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAG