病毒唑对免疫反应的调节作用 【发明领域】
本发明领域为免疫学。
【发明背景】
除了通常使用的生理和表型诊断指标外，疾病有时可与分子标志比如Polioly、特定基因的突变、出现不同的细胞表面标志等相关。许多此类标志是疾病特异性的预测因子或指标，因此可作为诊断工具来明确诊断生理状况。
近年来，对相对复杂的疾病如自身免疫病，哮喘、癌症等与特定分子标志的关系作了许多尝试性的工作。一些研究已发现共刺激分子B7-1和B7-2直接或间接参与疾病中免疫系统的调节。然而，尽管这些研究对疾病中B7-1和B7-2的多种表达水平作了深入探讨，尚未得到与之相关的全面、统一的认识。(肝脏学(Hepatology)25，第5期，1997，1108-1114页：共刺激分子B7-1和B7-2的表达与人肝细胞肝癌；J.Cancer Res.Clin.Oncol.124，第7期，1998，383-388页：共刺激分子B7-1和B7-2在人胃癌上的表达；神经免疫学杂志(J.Neuro immunol)，84，第2期，1998，179-187页：多发性硬化中脑脊液细胞上的共刺激性CD80(B7-1)和CD86(B7-2)；神经免疫学杂志，91，第1-2期，1998，198-203页：137-1(CD80)、B7-2(CD86)、白细胞介素-12和转化生长因子-βmRNA在多发性硬化病人之CSF和周围血单核细胞中的表达。)
许多情况下，发现B7-1、B7-2和特定疾病之间的关系明显地不一致。见图1。例如，在一些类型的癌症中，B7-1地数量相对较高，B7-2的数量相对较低。另一些类型的癌症中，B7-1和B7-2之间的关系恰恰相反。(J.Cancer Res.Clin.Oncol.124，第7期1998 383-388页：共刺激分子B7-1和B7-2在人胃癌上的表达；英国血液学杂志(Br.J.Haematol)102，第5期，1998，1257-1262页：共刺激性分子的表达及其与人类急性髓细胞性白血病预后的关系：B7-2阳性的白血病预后很差；国际分子医学杂志(Int.J.Mol.Med.)2，第2期，1998 167-171页：B7-1和B7-2在头颈癌细胞上的缺失及基因治疗的可能意义)。
B7-1和B7-2的表达与已知的细胞因子模式间的关系也是不一致的。见图2。例如，B7-1表达开高与1型反应的上调和下调有关，B7-2也与1型反应的上调和下调有关。B7-1和B7-2与2型反应的关系也是如此。(见图1)(美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Reopin.Cell.Mol.Biol.)17，第2期，1997 235-242页：B-7同源物CD80和CD86对人类抗原特异性1型和2型反应的不同调节作用；免疫学杂志(J.Immunol.)156，第8期，1996 2387-2391页：小鼠B7-1和B7-2分子对1L-4产生的共刺激作用。)。
另外，不清楚何药甚至何种药可有效调节B7-1或B7-2活性，即使发现此类药物，仍不知如何有效利用这些共刺激分子来调节免疫系统。综合这些未知因素，仍需要提供调节一种或多种B7标志的方法和组分，以一种特别的方式来影响免疫系统针对特定攻击的反应。
附图简述
图1中的表格表示特定疾病与B7-1和B7-2表达的关系。
图2中的表格表示多种疾病与1型反应、2型反应、B7-1和B7-2表达的关系。
发明概述
本发明提供调节免疫系统对攻击的反应的方法和组合物。总的来说，通过提供给系统一种选定浓度的核苷来调节该反应，该所选浓度的核苷对B7标志物的影响与攻击的效应相反。
在优选实施方案的一个方面中，该攻击选自过敏原、肿瘤、病毒、细菌、感染和自身免疫反应组成的组别。特定的兴趣分子标志是B7-1和B7-2。优选实施方案的另一方面中，该核苷是病毒唑类似物，在尤其优选的实施方案中，该核苷为病毒唑。优选实施方案的另一方面提供足够的核苷使之在含有表达B7标志的细胞液中达到约0.2μM至约5μM的浓度范围。
优选实施方案的还有一个方面中，该攻击与2型反应增强有关，加入该核苷与2型反应减弱有关。
具体实施方案的详述
本发明者已发现特定核苷，尤其是病毒唑和其类似物，与一种或多种B7标志的表达之间具有令人惊讶的联系。更多的发现表明另一种未料及的联系-此类核苷可用来改善疾病或其它攻击的效应。具体地，已发现调节免疫系统针对攻击之反应的方法包括：(a)使该攻击与对B7标志物的影响联系一起；(b)在一浓度范围内应用核苷，并将其与B7标志的调节联系起来以逆转其效应；和(c)提供给该免疫系统以该浓度范围内的该核苷。
此处所用的术语“核苷”是指包括连到杂环的一特异位点或嘌呤(9-位)或嘧啶(1位)的天然位点或类似物，尤其包括D-和L-型含氮二元杂环或单元杂环的相同位点的任何戊糖或修饰过的戊糖基团的化合物。术语“D-核苷”指具有D-核糖部分的核苷化合物(如腺苷酸)。术语“L-核苷”是指具有L-核糖部分的核苷化合物。术语“核苷酸”指5’位点由磷酸酯取代的核苷。
术语“药学上可接受的盐”指缘自任何无机和有机酸或碱的盐。
术语“肿瘤”泛指任何类型的组织自发生长，其可为恶性或非恶性，包括所有的肿瘤和癌症。
术语疾病的“治疗”或“治疗过程”指实施一方案来缓解此疾病的症候或症状，该方案可包括给病人服用一种或多种药物。这样，“治疗”或“治疗过程”勿需完全缓解症候或症状，勿需治愈，且特意包括对病人仅具有空白效应“如安慰效应”的方案。
此处所用术语“免疫系统”指任何有免疫能力的细胞的集合，其共同识别和攻击外源物，并对新病原或其它入侵物产生动态反应。免疫系统的例子是，人类或其它哺乳类免疫系统，包括脾脏、胸腺B-淋巴细胞、T淋巴细胞和抗体。此处定义的免疫系统必须具有细胞成分，但体液成分可有可无。免疫系统含有体液成分的话，该体液成分可包括自有免疫能力的细胞分泌的可溶性分子，包括抗体或白细胞介素。可溶分子的例子为IgG、IgM、IgE或IL2、IL4、IL10。
在此定义下，全血以及无纤维蛋白原、血小板和红细胞的血液可视为包括免疫系统，因为其含有能够对新病原产生动态反应的免疫能细胞。其它的免疫系统是含有免疫能细胞的细胞培养基。相反，抗体缓冲液不是免疫系统，因为其不含免疫能细胞群。在还有其它的实施方案中，人类或其它的物都含有此处定义的免疫系统。
此处所用术语“攻击”指引发免疫反应的任何成分或事件。攻击可分为三类：自身、异体或改变的自身攻击。自身型攻击包括细胞或分子，其中该免疫系统和该攻击来自同一有机体、自身蛋白质或自体蛋白质或其片段，示例包括人血液细胞、未分化细胞、抗体或同一人体的凝集因子。非自身型攻击包括细胞、病毒或分子，其中该免疫系统和该攻击来自不同的有机体，或该攻击是异种的。示例包括来自不同供体的器官或细胞、细菌、病毒或任何类型的其它种系特有的分子，包括内毒素、酶或结构蛋白质。改变的自身型攻击包括细胞或分子，其中该免疫系统和攻击来自同一有机体，但其中该攻击发生改变、降解或肿瘤变化。此类改变的例子包括抗原呈递细胞上B7标志物细胞的改变。降解变化的例子包括凋亡细胞或坏死组织。肿瘤变化的例子包括癌症的诱导。
此处所用的术语“免疫系统反应”和“免疫反应”指针对攻击的任何免疫系统反应。本申请中尤其注重包括B7标志改变的免疫反应。此改变可包括任何B7-1和B7-2表达的联合增强或减弱。这样，图1和2中表格所列出的所有反应为预期的免疫系统反应的示例。
其它所认为的免疫系统反应包括在细胞特异性的作用中细胞成分的参与或遗传特性的变化。细胞特异性的作用可以是细胞-细胞作用或细胞-攻击作用。细胞-细胞作用的例子是T细胞与T辅助细胞接触或T辅助细胞与巨噬细胞接触。细胞-攻击作用的例子是抗原呈递细胞吞入攻击、加工攻击并在细胞表面呈递加工后的攻击，或B细胞表面出现攻击特异性抗体并通过抗体与攻击结合。遗传特性的变化可以是基因组DNA的重排或基因的选择性活化。基因组DNA重排的例子是使抗攻击抗体产生成熟的亲和力的剪切行为或导致不同类型抗体之间发生类别转换的剪切行为。基因选择性活化的例子是编码白细胞介素或B7-1或B7-2之基因转录或翻译水平的升高或降低。
此处所用的产生与攻击有关的模式相反的B7效应指，单独由核苷产生的B7效应；与仅和攻击相关的效应至少是相反的。这样，若攻击与B7-1被表达相关，B7反效应是B7-1(的表达)至少提高的效应。同样，若攻击与B7-2高表达相关，B7反效应是B7-2(的表达)至少降低的效应。
此处所用的术语“提供给免疫系统核苷”指该核苷充分接触免疫系统的某些成分以产生免疫系统反应。在优选实施方案中其指将该核苷加到体内。其它实施方案中其指将该核苷加到免疫系统的器皿或容器中。
应理解术语“提供给免疫系统核苷”的定义涵盖内容非常广泛，包括任何体内、体外或离体接触的联合形式。体内可包括注射、口服、透皮运送或吸入。多种注射的例子是肌内、静脉内或皮下注射。多种口服形式的例子是片剂、糖浆或粉剂。包含体外壳(occlusivedressings)、软膏、或电穿孔法可完成透皮运送。吸入可包括汽化法或喷雾法。
体外接触可通过将含有核苷的溶液分配到置于恰当的容器中的免疫系统，或通过将该核苷溶于是或非免疫系统的一部分的溶液中来完成。分配示例包括自动或人工移液、滴加、倾倒或注射含有核苷的溶液至免疫系统中。或者可通过搅拌、混合或将病毒唑倒入液体使核苷溶于该液体。该液体可包括免疫系统或可作为载体溶液包括缓冲液、等渗液、血液。然后可将此载体分配到免疫系统中。
离体接触可通过以下步骤完成，包括(1)自来源收集部分免疫系统，(2)将核苷加到免疫系统中和(3)至少使部分免疫系统返回到来源中。可通过自体内或体外来源中保留部分免疫系统来完成对部分免疫系统的收集。体内来源示例是脊椎动物，包括人和无脊椎动物。可通过静脉穿刺、自眼部取血或针刺完成收集。体外来源的例子是含有免疫系统的细胞培养物、处理过的或贮存的血液。可通过任何转移液体的方式收集，如自动或人工移液、抽吸、滴加等等。可通过任何转移液体的方式使免疫系统返回到来源中。体外来源的情况下此方式为自动或人工移液、抽吸、滴加或体内来源的情况下(进行)静脉注射。
预想的核苷是病毒唑(1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)，及其类似物。为清楚说明物质，病毒唑类似物指病毒唑的任何衍生物其中(1)一个或多个羟基由含有少于25个原子的非羟基基团替代，包括H、低级烷基、低级芳基、低级芳烷基、低级烷基烯基、卤素等，而且独立地，一个或多个氢由含有少于25个原子的非氢基团取代，包括OH、低级烷基、低级芳基、低级芳烷基、低级烷烯基、卤素等。
优选在缓冲水溶液中配制病毒唑、病毒唑类似物或其它核苷。但在另一实施方案中，可以在其它许多液体或固体形式中配制该核苷。液体形式可以是包含纯溶剂的溶液包括水、DMSO或乙醇。液体形式也可以包含溶液与其它溶剂或已溶固体的混合液包括水-乙醇混合液、水-DMSO混合液、缓冲液。另外，液体形式的核苷可以与例如具有协同改变效应的物质混合一起制成胶体、乳液或软膏。示例是两亲分子、蜡或明胶。固体形式可包含活性成分固体或非活性成分固体。活性成分示例是缓冲剂、离子交换树脂包括MOPS、磷酸盐或柠檬酸盐。非活性成分示例包括淀粉、纤维素或硅胶。另外，固体形式可以是多种制品，包括片剂、胶囊、粉剂等。
在优选实施方案中，提供充足的核苷，使之在含有表达B7标志的细胞液中分别达到约0.2μM至5μM间的浓度范围。次优选方案中考虑0.1μM至约10μM之间的浓度范围。
在优选实施方案的另一方面，攻击使2型反应增加，应用核苷可减少2型反应。可如下理解2型反应。
哺乳类免疫系统含有两类主要的淋巴细胞：B淋巴细胞(B细胞)，源自骨髓；和T淋巴细胞(T细胞)，源自胸腺。B细胞主要负责体液免疫(即抗体生成)而T细胞主要负责细胞介导的免疫。一般将T细胞分成两个亚类：辅助T细胞和细胞素T细胞。通过释放参与细胞介导之免疫的称作细胞因子的可溶性蛋白质介质，T辅助细胞活化其它淋巴细胞，包括B细胞和细胞素T细胞，及巨噬细胞。此处所用的淋巴因子是细胞因子亚类。
T辅助细胞一般也分成两个亚类：1型和2型。1型细胞(也称作Th1细胞)产生白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNFA)和r干扰素(IFNr)，主要负责细胞介导的免疫如迟发性过敏反应和抗病毒免疫。相反，2型细胞(也称作Th2细胞)产生白细胞介素4、5、6、9、10和13，主要参与辅助性体液免疫如针对过敏原的反应，如IgE和IgG4抗体同种型转换(Mosmann，1989，免疫学年度评论(AnnuRev Immunol)，7：145-173)。
此处所用的术语1型和2型“反应”包括分别诱导1型和2型淋巴细胞所致的全部效应。其余情况中，此类反应包括通过转录、翻译、分泌和其它可能的机制相应细胞因子发生产量上的变化、相应淋巴细胞增殖力增强及其它与细胞因子水平增加有关的效应，包括移动效应。
如在此引入供参的美国Tam第5767097号专利内容所述，可选择性地抑制1型和2型反应中的一种而诱导另一种或使其相对不受影响，并且可选择性地诱导1型或2型反应中的一种而掏另一种或使其相对不受影响。同样，如在此援引供参考的共同未决的PCT第PCT/US98/00 634号中的内容所述，特定核苷如病毒唑可有效地选择性调节1型和2型反应，其反应与另一种是相对的。通过实验容易确定何者核苷酸有效降低2型反应。
考虑此处所述之方法可用于治疗许多疾病，如实际上对此类治疗有良好反应的任何疾病。其它情况中尤其考虑该联合(方法)可用于治疗过敏原(过敏)、肿瘤(癌症)、病毒(病毒感染)、细菌(细菌感染)、感染或自身免疫性疾病。
考虑可用本发明之核苷治疗的感染包括呼吸性合胞病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、1型和2型单纯疱疹病毒、生殖器疱疹、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎、带状疱疹、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒A、汉坦病毒(出血热)、人乳头瘤病毒(HPV)、麻疹和真菌病。尤其考虑此处所述的联合(治疗)可用于治疗慢性病毒和细菌性感染，包括HIV、结核、麻风等等。
考虑可用本发明之核苷治疗的感染包括胞内原生动物感染，以及蠕虫和其它寄生虫感染。同样，尤其考虑此处所述的联合(治疗)可用于治疗慢性感染。
考虑可以治疗的肿瘤包括由病毒引起的肿瘤，该效应可包括抑制经病毒感染的细胞转化成肿瘤状态、抑制病毒从已转化的细胞扩散到其它正常细胞和/或抑制病毒转化细胞的生长。
考虑可治疗的过敏病包括所有IgE和IgG过敏病、高IgE综合征和皮炎病如遗传过敏性皮炎。也考虑此处所述方法可用于治疗移植物排斥(移植物抗宿主疾病)和植入反应。
自身免疫性疾病可分为器官非特异性或器官特异性。器官非特异性自身免疫病包括类风湿性关节炎、痛风和痛风性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)，Sjogren综合症、硬皮病、多发性肌炎和皮肌炎、关节强硬性脊椎炎和风湿热。器官特异性自身免疫病已知实际上每个器官都可发生，包括胰岛素依赖的糖尿病、甲状腺疾病(Graves病和Hashimoto甲状腺炎)、Addison病，以及一些肾脏和肺脏疾病包括过敏和哮喘、多发性硬化、重症肌无力、葡萄膜炎、银屑病、肝炎和肝硬化、腹腔疾病、炎性肠病、及某些类型的雄性和雌性不育症。自身免疫病也可由病毒感染包括HIV病毒刺激引发，可由移植排斥引发并可伴随某些肿瘤或通过接触某些化学物质而突然发生。
合成
病毒唑的合成是广为人知的，考虑根据PCT申请PCT/USP7/18387和PCT/USP7/00600中的方法合成病毒唑类似物，二者的内容在此援引供参。
给药
考虑根据本发明的核苷可以在任何药物制剂中并在任何恰当的方案下给药。考虑最好通过在特定的病人中进行实验来确定优选剂量与方案。此类实验勿需过多耗费，考虑核苷在人类中的给药剂量介于约100毫克/天到约5,000毫克/天。在人类和其它系统中，尤其考虑提供可在含有表达B7的细胞液中分别达到约0.2μM和约5μM之间的核苷浓度的病毒唑或其它核苷。
当然，治疗一种疾病时，本领域普通技术人员会意识到有效治疗剂量会视待治疗感染或疾病(类型)、其严重性、所用治疗方案、所用药物的药代动力学以及所治疗的病人(动物或人类)。这样，有效剂量范围可自1毫克/公斤体重或少至25毫克/公斤体重或更多。一般地，根据所用核苷、所治疗的疾病或感染(类型)及给药途径、考虑“第二种”药物的有效治疗剂量范围为自稍低于约1毫克/公斤至约25毫克/公斤病人。该剂量范围一般产生活性核苷的有效血液浓度水平，即在病人体内达到约0.04微克/毫升至约100微克/毫升血液的浓度范围。然而，通过给予小剂量药物，再提高给药量直至副反应过大或出现意料效应为止来考虑制定合适的病人特异的方案。
本发明之核苷的给药(方式)可以是口服、非肠道给药(包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸内注射或灌注技术)、吸入喷雾或直肠(给药)、局部(给药)等，其剂量单位制剂含有一般的无毒药用载体、佐剂和溶媒。
考虑本发明的核苷可与药用载体制成混合剂。例如，本发明的核苷可作为药用盐口服。由于本发明的核苷多为水溶性，可将其在生理盐水(缓冲pH值约7.2至7.5)中静脉内给药。一般的缓冲液如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐可用作此途。当然，在本说明范围内本领域普通技术人员可改变制剂形式，针对特定给药方式提供多种制剂而仍保持本发明组分的稳定性和治疗活性。具体地，例如通过进行本领域普通技术范围内的小的修饰(盐制剂、酯化等)可轻易提高本核苷在水或其它溶媒中的稳定性。针对一特定核苷而更改给药途径和剂量方案以便控制所考虑核苷的药代动力学，在病人体内达到最好的治疗效应，也属于本领域普通技术范围。
一些药物剂量形式中，优选所给予的核苷的前药形式，尤其包括酰化(乙酰化或其它)衍生物、吡啶酯和本核苷的多种盐形式。本领域普通技术人员会意识到如何简便地将本核苷修饰成前药形式以便将活性核苷运送到宿主机体或病人体内的靶点。在将所考虑的核苷运送到宿主机体或病人体内的靶类的过程中，本领域普通技术人员也会利用前药形式的有利的药代动力学参数(如果可得的话)，使该核苷的意料效应达到最大。
另外，所考虑的核苷可以分别或一起给药，分别给药时顺序可任意。选择活性成分和药用活性剂的数量及相对的给药时间，以便达到意想的联合治疗效应。
所考虑核苷的给药途径可自连续性(静脉内滴注)到每天口服数次(例如Q.I.D)之间变化，可包括口服、体表、非肠道、肌肉内、静脉内、皮下、透皮(可包括一增强渗透性的物质)、经口和栓剂给药，以及其它的给药途径。
在本发明的治疗过程中，优选使有效治疗剂量的核苷与药用载体根据一般的药物混合技术密切混合一起而产生一种剂量。依据给药如口服或非肠道给药方式所需的制剂形式，载体可采取多种形式。制备口服剂量形式的药物组分时，可使用任何常规的药物媒介。这样，就液体口服制品如悬浮液、配剂和溶液而言，可应用恰当的载体和添加剂包括水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、染料及类似物。就固体口服制品如粉剂、片剂、胶囊及固体制品如栓剂而言，可使用恰当的载体和添加剂包括淀粉、糖载体葡萄糖、甘露醇、乳糖及有关载体、稀释剂、颗粒剂、润滑剂、结合剂、分散剂及类似物。需要的话，片剂或胶囊可以是肠衣(形式)或通过标准技术得以持续释放。
就非肠道制剂而言，载体一般包含无菌的水或氯化钠水溶液，但其它成分包括促分散剂也包括在内。当然，以无菌状态使用和保持无菌水时，组分和载体也要无菌。也可制备可注射悬浮液，这种情况下可使用合适的液体载体、悬浮剂和类似物。
也应理解一般而言，本发明最优选的用途是其中活性核苷对非靶类宿主细胞的细胞毒性相对较低而对靶点的活性相对较高的用途。在这一方面，L-核苷能具有比D-核苷更高的稳定性也是有利的，这可产生更好的药代动力学效应。之所以如此是因为L-核苷不易被酶识别，因而可具有更长的半衰期。
这样，发现了用病毒唑或其它核苷来对B7分子标志进行有利调节的方法。尽管此处所述为具体实施方案，除非经附加的权利要求解释，本发明的范围不受限制。
按照条约第19条的修改
1.一种调节免疫系统针对攻击之反应的方法，包括：
使该攻击与对B7标志物的影响联系起来；
在一浓度范围内应用核苷，并将其与逆转该效应的B7分子标志的调节联系起来；和
提供给免疫系统该浓度范围内的该核苷。
2.权利要求1的方法，其中该攻击包括过敏原。
3.权利要求1的方法，其中该攻击包括肿瘤。
4.权利要求1的方法，其中该攻击包括病毒。
5.权利要求1的方法，其中该攻击包括细菌。
6.权利要求1的方法，其中该攻击包括感染。
7.权利要求1的方法，其中该攻击包括自身免疫反应。
8.权利要求1-8任一项方法，其中该分子标志是B7-1。
9.权利要求1-8任一项方法，其中该分子标志是B7-2。
10.权利要求1-8任一项方法，其中该核苷是病毒唑。
11.权利要求1-8任一项方法，其中该核苷是病毒唑类似物。
12.权利要求1的方法，其中该攻击选自过敏原、微生物、肿瘤、感染和自身免疫反应，该分子标志是B7-1，该核苷是病毒唑。
13.权利要求1的方法，其中该攻击选自过敏原、微生物、肿瘤、感染和自身免疫反应，该分子标志是B7-2，该核苷是病毒唑。
14.权利要求1的方法，其中该攻击选自过敏原、微生物、肿瘤、感染和自身免疫，该分子标志是B7-1，该核苷不是病毒唑。
15.权利要求12-14任一项方法，其中在含有表达B7标志的细胞液中的该浓度范围分别在约0.2μM到约5μM之间。
16.权利要求1-8的任一项方法，还包括使该攻击与2型反应增强联系起来，以及使该核苷的应用与2型反应减弱联系起来。