具有抗HIV活性的d4T的磷酸芳基酯衍生物 发明领域
本发明涉及磷酸芳基酯核苷衍生物，特别是2＇,3＇-二氢-2＇,3＇-二脱氧胸腺嘧啶核苷(此后称“d4T”)的磷酸芳基酯衍生物，该物质对人类免疫缺损病毒(HIV)具有有效的活性，例如作为HIV逆转录酶的抑制剂。
发明背景
AIDS的传播及控制该病毒的不断努力是最好的证明。一种控制HIV的方法就是抑制它地逆转录酶的活性(RT)。因此，需要新的、有效的及选择性的HIV RT抑制剂作为有用的治疗药物。已知有效的HIVRT抑制剂包括2＇,3＇-二脱氧核苷的5＇-三磷酸酯(“ddN”)的类似物。这些活性RT抑制剂是通过核苷激酶和核苷酸激酶的作用在细胞内产生。因此，认为在抗HIV试剂的研究中ddN化合物如AZT和d4T是非常有希望的。
3＇-叠氮基-3＇-脱氧胸腺嘧啶核苷(叠氮胸腺嘧啶核苷，AZT)转化为它的生物活性代谢物AZT三磷酸酯的限速步骤是其单磷酸酯衍生物转化为二磷酸酯衍生物，而据报告，在细胞内产生生物活性的2＇,3＇-二脱氢-2＇,3＇-二脱氢胸腺嘧啶核苷(d4T)的代谢物d4T-三磷酸酯的限速步骤是该核苷转化为其单磷酸酯衍生物(Balzarini等，1989,J.Biol.Chem.264:6127；McGuigan等，1996,J.Med.Chem.39:1748)。在先有技术中提出的该机制见图1。
为了克服ddN类似物对细胞内核苷激酶激活的依赖，McGuigan等制备了AZT(McGuigan等，1993,J.Med. Chem.36:1048；McGuigan等，1992,Antiviral Res.,17:311)和d4T(McGuigan等，1996,J.Med.Chem.39:1748；McGuigan等，1996,Bioorg.Med.Chem.Lett.6:1183)的磷酸芳基甲氧基丙氨酸基酯衍生物。结果显示这类化合物经过细胞内水解产生单磷酸酯衍生物，所述衍生物在不依赖胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的模式下通过胸苷酸激酶的作用进一步磷酸化得到生物活性的三磷酸酯衍生物。可是，到目前为止所有通过各种芳基部分的取代进一步提高d4T的磷酸芳基酯衍生物效力而不伴随增加它们的细胞毒性的尝试全部失败(McGuigan等，1996,J.Med.Chem.39:1748)。
本发明发现，核苷的磷酸芳基酯衍生物的芳基部分上具有吸电子部分的取代基，如对位溴取代基时，由于该取代基的吸电子性质可提高d4T的核苷衍生物的承受水解能力。取代的磷酸苯基酯核苷衍生物呈现出有效的和特殊的抗病毒活性。
发明概述
本发明涉及磷酸芳基酯核苷衍生物，特别是2＇,3＇-二脱氢-2＇,3＇-二脱氧胸腺嘧啶核苷(此后称“d4T”)的磷酸芳基酯衍生物，该衍生物对HIV具有有效的活性，例如作为HIV逆转录酶的抑制剂。出呼意料地发现d4T的磷酸芳基酯衍生物，例如具有一个吸电子取代如在芳基上有一个对-溴基取代的衍生物，作为一种抗HIV药物其效力明显增强，而没有不良水平的细胞毒性。详细地说，这些衍生物是HIV逆转录酶的有效抑制剂。在本发明的一个优选方面，可以用氨基酸残基进一步取代磷酸芳基酯基团中的磷，所述的氨基酸残基可以酯化或取代，如甲氧基丙氨酸基。
例如，对-溴基取代的d4T的磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物作为一种有效抗HIV剂有效地抑制HIV在外周血单核细胞(PBMNC)以及TK-缺陷型CEM T-细胞中的复制而没有可检测到的细胞毒性。另外，这种新的d4T衍生物d4T-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)对RTMDR-1即一种对AZT和NNI-耐受的HIV-1菌株，具有有效的抗病毒活性，而对HIV-2具有中等活性。同样，相应的对溴取代的磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯AZT衍生物在PBMNC及TK缺陷型CEM T-细胞中显示有效的抗-HIV活性，但是对AZT-和NNI-抗性RTMDR-1或HIV-2无效。与这些d4T和AZT衍生物对比，相应的3dT衍生物-3dT-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)呈现出超过3dT的改良活性，但在PBMNC或TK-缺陷型CEM T-细胞中不象d4T和AZT衍生物一样有效。据我们所知，这是第一次报告以前未受注意的结构活性关系，该关系决定了d4T和AZT的磷酸苯基酯衍生物的药效。
先导化合物d4T-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)和AZT-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)为有效的HIV治疗策略设计提供基础，该策略能够抑制HIV的复制，特别是抑制其在TK-缺陷型细胞中的复制。
附图简述
图1是现有技术提出的d4T磷酸芳基酯衍生物新陈代谢途径示意图。
图2A和2B图示可提高取代苯环水解的吸电子假说。
图2C为洗脱分布图，图示每一个受试化合物水解产生A-d4T：化合物2，其中X=H(空心方形)；化合物3，其中X=OCH3(实心方形)；和化合物4，其中X=Br(实心圆形)。
图2D为洗脱分布图，图示受试化合物对猪的肝脏酯酶引起的酶促水解的敏感性。
图3为洗脱分布图，说明化合物2-4在TK-缺陷型CEM细胞中的细胞内水解。在与化合物4孵育的CEM细胞的溶胞产物等份试样中只可检测到对应于A-d4T-MP的680pmol的代谢产物峰。
图4A-4F图示化合物6c(图4A)和化合物7c(图4B)的化学结构；在PBMNC或TK-缺陷型CEM T-细胞中化合物6c(图4C)和化合物7c(图4D)对HTL ⅧB的抗-HIV活性；及化合物6c(图4E)和化合物7c(图4F)对HIV-1(HTLVⅧB)、HIV-2和RTMDR-1的抗病毒活性。用抑制HIV复制的％表示抗病毒活性，根据感染细胞中RT的活性进行测量。
图5A和5B是示意图，图示在苯环上的共振效应(电子非定域作用)，因此预料苯环上的对位取代基和邻位取代基具有相同的电子效应。
发明详述
我们出乎预料地发现，核苷的某些取代的磷酸芳基酯衍生物具有增加的抗HIV活性而同时保持低水平的细胞毒性。因此，这些衍生物特别适用于作为抗病毒组合物的活性剂以及作为治疗病毒感染如HIV感染的方法的活性剂。本发明的化合物
正如在以下实施例中更充分地讨论的一样，本发明化合物为具有有效的抗病毒活性的核苷磷酸芳基酯衍生物，详细地说是d4T和AZT的衍生物。适宜用于本发明组合物和本发明方法的核苷衍生物为下式化合物或其药学上可接受的盐：其中Y为氧或硫，优选氧；R1为未取代的芳基或吸电子基团取代的芳基；R2为式Ⅱ或Ⅲ的核苷：其中R6为嘌呤或嘧啶，优选嘧啶；而R7、R8、R9、R10、R11和R12独立为氢、羟基、卤基、叠氮基、-NO2、-NR13R14或-N(OR15)R16，其中R13、R14、R15和R16独立为氢、酰基、烷基或环烷基；R3为氢、酰基、烷基或环烷基；R4为氨基酸的侧链；或R3和R4可以结合形成脯氨酸或羟基脯氨酸的侧链；而R5为氢、烷基、环烷基或芳基。
术语“芳基”包括芳香烃基如苯基，包括稠合的芳香环如萘基。这类基团在芳香环上可以不被取代或被一个吸电子基团取代，如卤基(溴、氯、氟、碘基)、NO2或酰基。一个吸电子基团取代的芳基优选为溴苯基，更优选4-溴苯基。
术语“酰基”包括式R17C(O)-的取代基，其中R17为氢、烷基或环烷基。
术语“烷基”包括含有1到6个碳原子的直链或支链饱和脂肪族烃链，如甲基、乙基、丙基、异丙基(1-甲基乙基)、丁基、叔丁基(1,1-二甲基乙基)等等。这类基团可以不被取代或被羟基、卤基、叠氮基、-NO2、-NR13R14或-N(OR15)R16取代，其中R13、R14、R15和R16如前定义。
术语“环烷基”包括含有3到7个碳原子的饱和脂肪族烃环，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。这类基团可以不被取代或被羟基、卤基、叠氮基、-NO2、-NR13R14或-N(OR15)R16取代，其中R13、R14、R15和R16如前定义。
术语“嘌呤”包括腺嘌呤和鸟嘌呤。
术语“嘧啶”包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。所述嘧啶优选为胸腺嘧啶。
术语“氨基酸的侧链”指变化的氨基酸基团，包括例如甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、羟赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等的侧链。所述氨基酸侧链优选为丙氨酸或色氨酸侧链。
通常，含有吸电子取代基的化合物，例如在图5A和5B中所示的邻位或对位被卤素或NO2取代，可以更有效地水解提供活性抑制剂化合物。优选卤素取代，而最优选对-溴基取代。
为了全面阐述本发明的组合物和方法，描述d4T衍生物。d4T衍生物含有磷酸芳基酯取代，其中的芳基含有一个吸电子取代，如邻位或对位卤素(Br、Cl、F、I)取代基或NO2取代基。下面显示了一个实例，其中R18为一个可以酯化或取代的氨基酸残基如-NHCH(CH3)COOCH3或其药学上可接受的盐或酯。d4T衍生物的合成：
为了阐述本发明化合物的合成，描述了d4T衍生物的合成。可按照如下方法制备d4T衍生物。用在Mansuri等，1989,J.Med.Chem.32,461中讨论的方法由胸腺嘧啶核苷制备d4T，该文献公开内容通过引用结合到本文中。通过在McGuigan等，1992,Antiviral Res.17:311中讨论的方法可以制备适当取代的氯代磷酸(phosphorochloridate)取代芳基酯，该文献公开内容通过引用结合到本文中。将氯代磷酸酯加入到d4T的含有N-甲基咪唑的无水四氢呋喃溶液中以便形成需要的产物。
采用适宜的组合物形式将d4T衍生物给予患者，该组合物含有作为活性剂的d4T或AZT的衍生物以及药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂。如果需要可以使用缓释剂型。将该组合物按照适宜的抗病毒剂量给予需要抗病毒的患者，例如，所述剂量有效地抑制HIV逆转录酶和/或抑制HIV在宿主细胞的复制。按照适宜的剂量方案给药。
实施例
用下列实施例进一步解释本发明，不应该认为这些实施例限定本发明。
实施例1
d4T衍生物的合成及鉴定
按照Mansuri，等，1989,J.Med.Chem.32,461的方法，用胸腺嘧啶核苷制备d4T 1。按照McGuigan等，1992,Antiviral Res.,17:311报道的方法制备适当取代的氯代磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯。按照在下面方案1中概述合成化合物2-4。方案1．将氯代磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯加入到d4T和1-甲基咪唑的无水四氢呋喃(THF)溶液中并在室温下搅拌该混合物5-6小时。处理反应混合物以良好产率提供所需要的衍生物。采用柱色谱法得到纯净的化合物。
通过HPLC测量合成化合物的物理数据，HPLC的进行条件为C184×250mm LiChrospher柱，用70∶30水/乙腈作为洗脱剂，流速为1ml/分钟。通过HPLC下列化合物的纯度超过96％。由于非对映异构体用星号标记的13C NMR峰是分裂的。
化合物2：产率81％；IR(Neat):3222,2985,2954,1743,1693,1593,1491,1456,1213,1153,1039,931,769 cm-1；1H NMR(CDCl3)δ9.30(brs,1H),7.30-7.10(m,6H),6.85-6.82(m,1H),6.36-6.26(m,1H),5.91-5.85(m,1H),5.00(br m,1H),4.19-3.68(m,4H),3.72,3.71(s,3H),1.83,1.80(d,3H),1.38-1.25(m,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.9,163.7,150.7,149.7,135.7*,133.2*,129.6*,127.3*,125.0*,120.0,111.1,89.6*,84.5*,66.9*,52.5*,50.0*,20.9和12.3；31P NMR(CDCl3)δ 2.66,3.20；MALDI-TOF质谱m/e 487.9(M+Na)；HPLC保留时间：5.54及5.85分钟。
化合物3：产率92％；IR(Neat)：3223,3072,2999,2953,2837,1743,1693,1506,1443,1207,1153,1111,1034,937,837和756 cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.40(br s,1H),7.30-7.00(m,5H),6.83-6.81(m,1H),6.37-6.27(m,1H),5.91-5.86(m,1H),5.00(br m,1H),4.40-4.30(m,2H),4.20-4.10(m,2H),3.95-3.93(s,3H),3.82-3.80(s,3H),1.85-1.81(s,3H)，和1.39-1.29(m,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 174.0,163.9,156.6,150.8,143.5,135.8*,133.3*,127.4*,121.2*,114.5,111.2,89.7*,84.5,66.9*,55.5,52.5,50.6*,20.9和12.3；31P NMR(CDCl3)δ 3.82,3.20,；MALDI-TOF质谱m/e 518.2(M+Na)；HPLC保留时间：5.83及6.26分钟。
化合物4：产率83％；IR(Neat)：3203,3070,2954,2887,2248,1743,1693,1485,1221,1153,1038,912,835,733 cm-1；1H NMR(CDCl3)δ9.60-9.58(br s,1H),7.45-7.42(m,2H),7.30-7.09(m,4H),6.37-6.27(m,1H),5.93-5.88(m,1H),5.04-5.01(br m,1H),4.35-4.33(m,2H),4.27-3.98(m,2H),3.71-3.70(s,3H),1.85-1.81(s,3H),1.37-1.31(m,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.7,163.8,150.8,149.7*,135.6*,133.1*,127.4*,121.9*,11 8.0,111.2*,89.7*,84.4*,67.8*,52.5,50.0*,20.7和12.3；31P NMR(CDCl3)δ 3.41,2.78，；MALDI-TOF质谱m/e 567.1(M+Na)；HPLC保留时间：12.04及12.72分钟。
实施例2
化合物2-4对水解的敏感性
图2A和2B图示在代谢产物前体B(见图1)的苯环上的对位取代基的电子效应。为了评估化合物对水解的敏感性，将化合物2-4溶解于甲醇中，然后用0.002N NaOH处理。保持浓度恒定并且用HPLC监测水解产物A-d4T-MP的产生。用Lichrospher柱进行HPLC层析。在等度条件下用70∶30水/乙腈的混合溶剂对柱进行洗脱并且洗脱分布图见图2C。
在猪的肝脏酯酶系统下试验化合物的水解。数据在图2C中显示。在37℃下，将化合物2和4(在Tris-HCl中1mM)与100U的猪肝脏酯酶(Sigma)的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)孵育2小时。通过加入丙酮并冷却该反应混合物使反应停止。在15,000xg下离心后，用一种可以检测到50pmol代谢产物的定量分析HPLC方法检测0.1ml等份反应混合物中存在的活性代谢产物。0.1ml等份的化合物4的反应产物含有1.4nmol的A-d4T-MP，而在化合物2的反应产物中未检测到该代谢产物。
正如图2A和2B所示，在苯基部分的对位上的吸电子取代基的存在很可能增加了代谢产物前体B中苯氧基团的水解速率(图2A和2B)，前体B是在d4T的磷酸苯基酯衍生物的代谢路径的第一步(图1，A至B)依赖于羧酸酯酶产生。苯环对位上的单一溴取代基不会影响羧酸酯酶对该化合物的识别和水解(图1中的A至B步骤)。由吸电子的对位溴取代基引起的电子效应会增加苯氧基团C的水解产生D并随后产生E即关键代谢产物A-d4T-MP的前体。为了试验所述水解，通过测量丙氨酸基-d4T-单磷酸酯(A-d4T-MP)的产生，我们比较了未取代的化合物2、对-甲氧基(OCH3)取代的化合物3及对-溴基取代的化合物4(=d4T-5＇-[磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯]或d4T-pBPMAP)在用0.002N NaOH处理后化学水解的速率。
正如图2C所示，具有对-溴取代基的化合物4比未取代的化合物2呈现出更快的水解速率，而在对位具有供电子取代基-OCH3的化合物3较这两种化合物中的任何一种具有较慢的水解比率。类似地，先导化合物4对由猪的肝脏酯酶引起的酶促水解较化合物2更敏感(图2D)。
实施例3
化合物2-4在T-缺陷型CEM细胞中的细胞内代谢
为了分析化合物2-4在T-缺陷型CEM细胞中的细胞内代谢，将1×106CEM细胞与化合物2-4(100uM)孵育3小时，随后用HPLC检查部分水解的磷酸二酯代谢产物、丙氨酸基d4T单磷酸酯。值得注意的是，在用化合物4处理的CEM细胞内所述代谢产物的量是明显高于用化合物2或3处理的CEM细胞内的所述代谢产物的量(680pmol/106细胞与＜50pmol/106细胞；图3)。
在RPMI、10％胎牛血清及1％青霉素/链霉素组成的培养基中培养CEM细胞。在37℃下，按照106细胞/ml的密度将1×106细胞与100uM的这些化合物孵育3小时。孵育后，用冰冷却的PBS洗涤细胞两次并加入0.5ml 60％甲醇提取。将细胞的溶胞产物在-20℃下保存过夜，然后在15,000xg下离心溶胞产物10分钟以去除细胞碎屑。将每份100μL的这些溶胞产物直接注射入HPLC。该HPLC系统由一个具有四级泵的Hewlett Packard(HP)1100系列、一个自动进样器、一个电子脱气器、一个二极管阵列检测器及一台具有用于数据分析的chemstation软件程序的计算机组成。将所述样品在250×4.6mm Sulpelco LC-DB C18柱上洗脱。利用溶剂梯度解析代谢产物与母体化合物，它含有甲醇和10mM磷酸铵的混合物(pH3.7)。以1ml/分钟的流速进行梯度洗脱，前10分钟用5到35％的甲醇洗脱，继续用35％的甲醇洗脱5分钟，最后用35到100％的甲醇线性梯度再洗脱20分钟。检测波长为270nm。仅仅在与化合物4孵育的CEM细胞溶胞产物的等份中检测到一个保留时间为8.7分钟的代谢产物峰，该峰对应于680pmol的A-d4T-MP。
因为其提高的水解敏感性，假设化合物4与其它化合物相比是一个更有效的抗HIV试剂。在外周血单核细胞和TK-缺陷型CEM T-细胞中，用前述的方法(Zarling等，1990 Nature 347:92；Erice等，1993Antimicrob.Agents Chemother.37∶835；Uckun等，1998 Antimicrob.Agents Chemother.42:383)测试化合物2-4以及母体化合物d4T(1)抑制HIV复制的能力。通过比较受试物质处理的感染细胞的p24及RT活性值和未处理感染细胞的p24及RT活性值计算抑制病毒复制的百分率。同时，用细胞增殖的微量培养四唑鉴定法(MTA)，正如在以上Zarling、Enrice和Uckum的文章中描述的一样，检测所述化合物的细胞毒性。
表1显示抑制HIV-1复制的相似的IC50值，提供了当在受HIV-1感染的外周血单核细胞中试验时，d4T磷酸芳基酯衍生物并不比该母体化合物d4T更加有效的证据。与以前的报道一致，实际上在TK-缺陷型CEM细胞中d4T抑制HIV-1复制的能力降低。反之，d4T抑制产生p24的IC50值在外周血单核细胞中为18nM，在TK-缺陷型CEM细胞中为556nM。类似地，抑制RT活性的IC50值从40nM增加到2355nM(表1)。尽管所有的3种磷酸芳基酯衍生物在TK-缺陷型CEM细胞中皆比d4T有效，在芳基部分有一个对-溴取代基的化合物4(d4T-5＇-[磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯])在抑制p24产生上比d4T强12.6倍(IC50值：44nM对556nM)并且在抑制RT活性上比d4T强41.3倍(IC50值：57nM对2355nM)(表1)。
表1 PBMNC CEM化合物X IC50[p24]IC50[RT]IC50[MTA]IC50[p24]IC50[RT]IC50[MTA] 1(=d4T) 0.018 0.040＞10 0.556 2.355＞10 2 H ND ND＞10 0.145 0.133＞10 3 -OCH3 0.033 0.033＞10 0.106 0.320＞10 4 Br 0.022 0.042＞10 0.044 0.057＞10
通过MTA测定，所有的受试化合物在浓度高达10,000nM时对外周血单核细胞或CEM细胞没有任何一个呈现可检测到的细胞毒性。有趣的是，在芳基部分具有对-甲氧基取代基的化合物3在抑制HIV感染的TK-缺陷型CEM细胞的RT活性方面较化合物4低5.6倍(IC50值：320nM对57nM)，虽然这两个化合物在外周血单核细胞中呈现相似的活性(IC50值：33nM对42nM)。因此，对位-取代基一致表现出影响d4T的磷酸芳基酯衍生物在TK-缺陷型细胞中的抗HIV活性。据我们所知，这是第一次论证通过在芳基部分引入单一对-溴取代基实际上可以提高d4T的磷酸芳基酯衍生物的药效以及选择性指数。从前未知的由d4T的磷酸酯衍生物的芳基部分决定的结构-活性关系为可能更有效的d4T类似物的设计提供了基础。
实施例4
化合物4和AZT在MDR细胞中的活性
将化合物4(d4T-5＇-[磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯])抗HIV-MDR细胞的活性与AZT-5＇-[磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯](P-AZT)及AZT进行比较。使用实施例4所述的孵育和分析方法。
正如表2所示，P-AZT和AZT具有相似的活性，IC50值分别为1.5和2.0nM。化合物4的活性(0.02nM)比AZT(2.0nM)更有效100倍。
表2
HIV-2 HIV-MDR 化合物 IC50[RT] IC50 [RT] 4 0.4 0.02 P-AZT 3.9 1.5 AZT 2.4 2.0
实施例5
3dT磷酸芳基酯衍生物的合成
通过进一步比较，研究在3＇-脱氧胸腺嘧啶核苷(3dT)的磷酸芳基酯衍生物的芳基部分的各种取代基对抗HIV活性的影响。正如方案2所示，由d4T 1制备3dT 5，用文献方法(Mansuri等，1989 J.Med.Chem.32:461-466)从胸腺嘧啶核苷制备d4T 1。在乙醇中，在H2及催化量的5％Pd/C的存在下进行1的氢化作用得到3dT 5，收率为85％。还按照McGuigan等，1992 Antiviral Res 17:311-321报道的方法制备适当取代的氯代磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯，并按照在方案2中描述的方法合成化合物6-11。方案2．将适当取代的氯代磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯加入到3dT和1-甲基咪唑的无水四氢呋喃(THF)的混合物中。在室温下搅拌该反应混合物12小时并且除去溶剂。将产生的树胶状物重新溶解于氯仿中并用1M HCl、饱和的碳酸氢钠溶液(NO2衍生物情况例外)及水洗涤。有机相用MgSO4干燥并且在真空下除去溶剂。用以5％甲醇的氯仿溶液洗脱的硅胶快速柱层析纯化该粗产物，以好的收率得到纯净的化合物6-11。
测定了所述合成化合物的物理数据。HPLC的进行条件为C184×250mm LiChrospher柱，用70∶30水/乙腈作为洗脱剂，流速为1ml/分钟。由于HPLC，下列化合物的纯度超过96％。由于非对映异构体用星号标记13C NMR峰是分裂的。
化合物5：产率85％；1H NMR(CDCl3)δ11.1(br s,1H),7.82(s,1H),5.97-5.94(m,1H),5.10(br s,1H),4.05-3.95(m,1H),3.72-3.52(m,2H),2.30-1.86(m,4H),1.77(s,3H),；13C NMR(CDCl3)δ 163.9,150.4,136.4,108.7,84.8,81.4,62.2,31.8,25.1和12.5。
化合物6：产率96％；IR(neat)：3211,2955,2821,1689,1491,1265,1211,1153,1043,和933 cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 10.1(br s,1H),7.47(s,1H),7.32-7.12(m,5H),6.14-6.08(m,1H),4.41-4.21(m,4H),4.05-4.00(m,1H),3.70,3.69(s,3H),2.37-2.32(m,1H),2.05-1.89(m,7H),1.38-1.35(dd,3H)；13C NMR(CDCl3)δ173.6*,163.8,150.3,150.1*,135.2,129.4*,124.7,119.8*,110.5*,85.7*,78.3*,67.2*,52.3,50.1*,31.6*,25.4*,20.7*和12.4*；31p NMR(CDCl3)δ 2.82&3.11,；MS(MALDI-TOF)：490.4(M+Na)；HPLC保留时间=6.86,7.35分钟。
化合物7：产率96％；IR(neat)：3217,2954,2821,1743,1689,1489,1265,1217,1153,1092,1012,926和837cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.40(br s,1H),7.43-7.41(m,1H),7.30-7.14(m,4H),6.13-6.07(m,1H),4.39-4.00(m,5H),3.71,3.70(s,3H),2.38-2.36(m,2H),2.09-1.89(m,5H),1.39-1.36(dd,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.6*,163.7,150.2,148.8*,135.3,129.5-129.0,121.5-121.3,116.3,110.6,86.0*,78.4*,67.7*,52.6*,50.2*,31.8*,25.4*,20.9*和12.5；31P NMR(CDCl3)δ2.87& 3.09；MS(MALDI-TOF)：524.9(M+Na)；HPLC保留时间=14.05,14.89分钟。
化合物8：粘稠的油状物，产率96％；λmax:223(ε3338)和269(ε4695)nm；IR(neat):3211,2955,1743,1693,1500,1569,1265,1197,1153,1045,923和843cm-1；1H NMR(CDCl3)δ9.40(br s,1H),7.45-7.43(d,1H),7.19-7.01(m,4H),6.14-6.06(m,1H),4.39-3.97(nm,5H),3.71,3.70(s,3H),2.38-1.89(m,7H),1.39-1.35(t,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.6*,163.7,150.2,150.1*,135.3,121.5*,116.3*,110.6*,85.9*,78.4*,67.7*,52.6,50.2*,31.8*,25.6*,20.9*和12.5；31P NMR(CDCl3)δ 3.13和3.37；MS(MALDI-TOF)：508.2(M+Na)；HPLC保留时间=8.38,8.80分钟。
化合物9：产率83％；IR(neat):3211,2954,1743,1689,1485,1265,1217,1153,1010,923和833cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.82(br s,1H),7.45-7.41(m,3H),7.15-7.11(m,2H),6.14-6.06(m,1H),4.39-4.00(m,5H),3.71,3.70(s,3H),2.38-1.89(m,7H),1.39-1.35(dd,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.6*,163.8,150.3,148.5*,135.2,132.6*,121.8*,117.7,110.6*,85.9*,78.3*,67.2*,52.5,50.2*,31.6*,25.6*,20.8*和12.5；31PNMR(CDCl3)δ 2.83和3.05；MS(MALDI-TOF)：570.0 (M+2+Na)；HPLC保留时间=15.50,16.57分钟。
化合物10：产率87％；IR(neat):3203,2955,1743,1684,1593,1522,1348,1265,1153,1101,920和860cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.51(br s,1H),8.24-8.21(m,2H),7.42-7.37(m,3H),6.13-6.08(m,1H),4.39-4.03(nm,5H),3.72,3.71(s,3H),2.38-1.89(m,7H),1.41-1.38(dd,3H)；13CNMR(CDCl3)δ 173.4*,163.7,155.2*,150.2*,144.4,135.3,125.9-125.4,120.6*,115.4,110.6*,86.1*,78.4*,68.1*,52.7,50.2*,31.7*,25.8*,20.9*和12.5；31P NMR(CDCl3)δ 2.60和2.81；MS(MALDI-TOF)：535.0(M+Na)；HPLC保留时间=8.12,10.14分钟。
化合物11：产率100％；IR(neat)：3209,2954,1743,1506,1468,1265,1207,1153,1036,937和835 cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.89(br s,1H),7.49-7.47(m,1H),7.16-7.11(m,2H),6.84-6.80(m,2H),6.15-6.09(m,1H),4.39-4.02(m,5H),3.77,3.76(s,3H),3.74,3.73(s,3H),2.38-1.89(m,7H),1.38-1.33(t,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.7*,163.9,156.3,150.3,143.7*,135.2,120.7*,114.3*,110.5,85.7*,78.4*,67.3*,55.4,52.4,50.1*,31.8*,25.4*,20.8*和12.4*；31P NMR(CDCl3)δ 3.27和3.52；MS(MALDI-TOF)：521.3(M+1+Na)；HPLC保留时间=7.15,7.66分钟。
实施例6
3dT化合物6-11的抗病毒活性
用以前描述的方法(Zarling等，1990；Erice等，1993；Uckun等，1998，同上)以与d4T并行比较的方式测试化合物6-11以及母体化合物3dT在外周血单核细胞及TK-缺陷型CEM T-细胞中抑制HIV-1复制的能力。
在外周血单核细胞及TK-缺陷型CEM T-细胞中3dT以及它的衍生物的活性较d4T低(表3)。值得注意的是，在外周血单核细胞中化合物6-11的IC50[RT]值高于3dT的IC50[RT]值(1.2-3.1对0.7，表3)，暗示这些前体药物是足够稳定的，在它们的新陈代谢中不依赖TK的步骤，或许它们的酶促水解，可能是产生活性物的限速步骤。相比之下，报道d4T的磷酸芳基酯衍生物较d4T更有效，暗示依赖TK产生d4T单磷酸酯是其代谢激活的限速步骤(McGuigan等，1996a)。按照关于d4T和AZT的磷酸芳基酯衍生物的生物活性的文献报道结果(McGuigan等，1993,1996a),3dT的磷酸芳基酯衍生物在TK-缺陷型细胞中抑制HIV-1复制较其母体化合物3dT更有效，虽然仍具有高微摩尔IC50[RT]值(表3)。
因为化合物6-11的活性在TK-缺陷型CEM T-细胞中较在外周血单核细胞(PBMNC)中低，所以推测在缺少TK时这些前体药物产生的3dT单磷酸酯转化为其活性的三磷酸酯是以较低的速率进行。比较起来，在正常细胞和TK-缺陷型细胞中d4T的磷酸芳基酯衍生物呈现出相似的活性(McGuigan等，1996 Bioorg.Med.Chem.Lett.6:1183-1186)。3＇-脱氧胸腺嘧啶核苷的磷酸芳基酯衍生物(6-11)在正常外周血单核细胞(PBMNC)和TK-缺陷型CEM T-细胞中的抗HIV活性。所有的数据用uM表示并且代表抑制病毒复制的浓度，通过RT活性分析测量，用50％(IC50[RT])9或50％细胞毒性浓度表示，通过MTA(IC50[MTA])测量(Mansuri等，1989 J.Med.Chem.32:461)。
表3 PBMNC CEM化合物 X IC50 [RT] IC50 [MTA] IC50 [RT] IC50 [MTA] 6 H 2.1 ＞100 7.5 ＞100 7 Cl 2.1 ＞100 21.9 ＞100 8 F 3.1 ＞100 32.7 ＞100 9 Br 1.2 ＞100 22.8 ＞100 10 NO 2.0 ＞100 22.6 ＞100 11 OMe 1.3 ＞100 19.7 ＞100 3dT - 0.7 ＞100 91.2 ＞100 d4T - 0.004 ＞100 2.335 ＞100
正如图5A和5B所示，苯环上对位取代基的电子效应可能会影响在图1描述的3dT的磷酸芳基酯衍生物的新陈代谢途径中B水解转化为D。预期在化合物7-10(图2A和2B)中苯基部分的对位吸电子取代基的存在将增加取代的苯氧基团水解的速率。可是，这些化合物并不比没有对位取代的化合物6或具有供电子对位取代基的化合物11更有效，因此提示假设在它们的新陈代(在图1中A到B)中依赖于羧酸酯酶的第一步水解对于活性3dT代谢产物的产生起到一个关键的及限速的作用。因此，按照对于核苷类似物的磷酸芳基甲氧基丙氨酸基酯衍生物提出的新陈代谢途径，化合物7-10可用作推测引起其水解的羧酸酯酶相对较少的底物(McIntee等，1997 J.Med.Chem.40:3323-3331)。
实施例7
d4T、AZT和3dT衍生物的抗HIV活性
正如方案1所示，用文献方法(Mansuri等，1989，同上)从胸腺嘧啶核苷制备d4T 1。在H2及催化量的5％Pd/C的存在下在乙醇中进行1的氢化作用，以85％的收率得到3dT 3(方案1)。
用文献方法(Chu等，美国专利第4,841,039号)从胸腺嘧啶核苷制备AZT 2。用商业渠道可获得的苯酚通过两步程序(方案2)制备在其苯氧基部分具有不同取代基的ddN磷酸化剂5a、5b和5c(McGuigan等1992，同上)，从前报道过化合物4a、4b、5a、5b、7a和7b。化合物4c和5c为新化合物并且在下面报道它们的合成方法及特征数据。
正如方案3所示，按照下列文献条件进行d4T 1、AZT 2和3dT 3的磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物的合成(McGuigan等，1992)。常规的合成方法如下：将适当取代的氯代磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯5加入到需要的ddN(1、2或3)和1-甲基咪唑的无水四氢呋喃(THF)混合物中。在室温下搅拌该反应混合物12小时，然后除去溶剂。将得到的树胶状物重新溶解于氯仿中并用1M HCl、饱和的碳酸氢钠溶液及水洗涤。有机相用MgSO4干燥并且在真空下除去溶剂。用甲醇和氯仿的混合溶剂作为洗脱剂的硅胶快速柱层析纯化该粗产物，以好的收率得到需要的纯净化合物。
方案1．d4T和3dT的合成。
方案2．氯代磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯的合成。
方案3．ddN的磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物的合成。磷酸二氯对-溴苯基酯4c.按照McGuigan等，1993，同上，描述的方法，在0℃、氮气氛下，在3小时内将对-溴苯酚(13.20g；76.30mmol)和蒸馏的三乙胺(10.65ml)的无水Et2O(165ml)溶液滴加到剧烈搅拌的的磷酰氯(8.5ml；91.2mmol)的无水Et2O(83ml)溶液中。随后将产生的混合物逐渐加温到室温，在室温下搅拌过夜，然后加热至回流两小时。将反应混合物冷却至室温并在吸气器压力下过滤。用无水Et2O(2×50ml)洗涤沉淀。将合并的Et2O层在旋转蒸发器中蒸发至干得到粗产品4c，一种浅黄色的油状物，然后将该油状物进行真空蒸馏得到纯净的4c(14.05g；63.5％的产率)，一种无色的粘稠油状物(bp.110-115℃/2mmHg)。IR(Neat):3095,1481,1303,1187,948,829cm-1；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.50(2H,d,J=9.0Hz),7.15(2H,d,J=9.0Hz)。GC/MS(m/e)290(M+),254(M+-Cl),173(M+-POCl2,81Br),171(M+-POCl2,79Br),156(M+-PO2Cl2,81Br),154(M+-PO2Cl2,79Br)。氯代磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯5c。按照McGuigan等，同上，描述的方法，在-70℃、氮环境下，在3小时内中将蒸馏三乙胺(8.80ml；63.14mmol)的无水CH2Cl2(180ml)溶液经过一个附加漏斗滴加到剧烈搅拌的磷酸二氯对-溴苯基酯4c(8.69g；29.97mmol)和L-丙氨酸甲酯盐酸盐(4.19g；30.02mmol)的无水CH2Cl2(250ml)溶液中。随后将产生的混合物逐渐加温到室温并在室温下搅拌过夜。在旋转蒸发器中除去溶剂。加入无水Et2O(300ml)溶解该残余物并在吸气器压力下过滤以便移去白色固体。用无水Et2O(2×60ml)冲洗白色固体。合并Et2O层并蒸发至干，得到定量收率的5c(10.7g)，一种浅粉黄色的粘稠油状物。不用进一步纯化可将该产品直接用于下一步反应。IR(Neat):3212,2989,2952,1747,1483,1270,1209,1147,927,831,757cm-1；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.70(1H,br,Ala-NH),7.48(2H,d,J=9.0Hz，芳基H),7.16(2H,d,J=9.0Hz，芳基H),3.79和3.77(3H,s&s,-OCH3),1.51和1.40(3H,d&d,Ala-CH3)。MS(CI,m/e)357.9(M+,81Br),355.9(M+,79Br),322.0(M+-Cl,81Br),320.0(M+-Cl,79Br),297.9(M+-COOCH3,81Br),295.9(M+-COOCH3,79Br),184.0(M+-BrC6H4O)。AZT 1、d4T 2和3dT 3的磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物的特征数据：HPLC的进行条件为C18 4×250mm LiChrospher柱，用70∶30水/乙腈作为洗脱剂，流速为1ml/分钟。由于HPLC，下列化合物的纯度超过96％。由于磷的立构中心引起的非对映异构体，用星型符号标记的13C NMR峰是分裂的。化合物6a：产率81％；IR(Neat):3222,2985,2954,1743,1693,1593,1491,1456,1213,1153,1039,931,769cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.30(brs,1H),7.30-7.10(m,6H),6.85-6.82(m,1H),6.36-6.26(m,1H),5.91-5.85(m,1H),5.00(br m,1H),4.19-3.68(m,4H),3.72,3.71(s,3H),1.83,1.80(d,3H),1.38-1.25(m,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.9,163.7,150.7,149.7,135.7*,133.2*,129.6*,127.3*,125.0*,120.0,111.1,89.6*,84.5*,66.9*,52.5*,50.0*,20.9和12.3；31P NMR(CDCl3)δ 2.66,3.20,；MALDI-TOF质谱m/e：487.9(M+Na)；HPLC保留时间：5.54和5.85分钟。化合物6b：产率92％；IR(Neat):3223,3072,2999,2953,2837,1743,1693,1506,1443,1207,1153,1111,1034,937,837和756cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.40(br s,1H),7.30-7.00(m,5H),6.83-6.81(m,1H),6.37-6.27(m,1H),5.91-5.86(m,1H),5.00(br m,1H),4.40-4.30(m,2H),4.20-4.10(m,2H),3.95-3.93(s,3H),3.82-3.80(s,3H),1.85-1.81(s,3H)和1.39-1.29(ml,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 174.0,163.9,156.6,150.8,143.5,135.8*,133.3*,127.4*,121.2*,114.5,111.2,89.7*,84.5,66.9*,55.5,52.5,50.6*,20.9和12.3；31P NMR(CDCl3)δ 3.82,3.20,；MALDI-TOF质谱m/e:518.2(M+Na)；HPLC保留时间：5.83和6.26分钟。化合物6c：产率83％；IR(Neat):3203,3070,2954,2887,2248,1743,1693,1485,1221,1153,1038,912,835,733cm-1；1H NMR(CDCl3)δ9.60-9.58(br s,1H),7.45-7.42(m,2H),7.30-7.09(m,4H),6.37-6.27(m,1H),5.93-5.88(m,1H),5.04-5.01(br m,1H),4.35-4.33(m,2H),4.27-3.98(m,2H),3.71-3.70(s,3H),1.85-1.81(s,3H),1.37-1.31(m,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.7,163.8,150.8,149.7*,135.6*,133.1*,127.4*,121.9*,118.0,111.2*,89.7*,84.4*,67.8*,52.5,50.0*,20.7和12.3；31P NMR(CDCl3)δ 3.41,2.78；MALDI-TOF质谱m/e:567.1(M+Na)；HPLC保留时间：12.04和12.72分钟。化合物7c：产率95％；IR(Neat):3205.7,3066.3,2954.5,2109.8,1745.3,1691.3,1484.9,1270.9,1153.2,1010.5和926.1cm-1；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ 8.69(1H,br,3-NH),7.45(2H,d,J=9.0Hz,芳基H)，7.34和7.32(1H,s&s，乙烯基H)，7.11(2H,d,J=9.0Hz，芳基H),6.18&6.13(1H,t&t,J=6.6&6.6Hz,C-1＇位H),4.44-3.77(6H,m,C-3＇、4＇和5＇H,Ala-NH和Ala-CH),3.73&3.72(3H,s&s,-COOCH3),2.51-2.20(2H,m,C-2＇位H)，2.18(3H,s,C-5位-CH3),1.39&1.36(3H,d&d,Ala-CH3)；13C NMR(75MHZ,CDCl3)δ 173.6,163.6,150.1,149.2,149.1,135.2,132.4,121.6,117.8,111.1,85.0,84.7,81.9,81.8,65.5,60.1,59.9,52.4,50.0,49.9,36.9,20.6,20.5,12.2。MS(CI,m/e):589.1(M+,81Br)和587.1(M+,79Br)。化合物8a：产率96％；IR(Neat)：3211,2955,2821,1689,1491,1265,1211,1153,1043和933cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 10.1(br s,1H),7.47(s,1H),7.32-7.12(m,5H),6.14-6.08(m,1H),4.41-4.21(m,4H),4.05-4.00(m,1H),3.70,3.69(s,3H),2.37-2.32(m,1H),2.05-1.89(m,7H),1.38-1.35(dd,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.6*,163.8,150.3,150.1*,135.2,129.4*,124.7,119.8*,110.5*,85.7*,78.3*,67.2*,52.3,50.1*,31.6*,25.4*,20.7*和12.4*；31P NMR(CDCl3)δ 2.82&3.11；MS(MALDI-TOF):490.4(M+Na)；HPLC保留时间=6.86,7.35分钟。化合物8b：产率100％；IR(Neat):3209,2954,1743,1506,1468,1265,1207,1153,1036,937和835cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.89(br s,1H),7.49-7.47(m,1H),7.16-7.11(m,2H),6.84-6.80(m,2H),6.15-6.09(m,1H),4.39-4.02(m,5H),3.77,3.76(s,3H),3.74,3.73(s,3H),2.38-1.89(m,7H),1.38-1.33(t,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.7*,163.9,156.3,150.3,143.7*,135.2,120.7*,114.3*,110.5,85.7*,78.4*,67.3*,55.4,52.4,50.1*,31.8*,25.4*,20.8*和12.4*；31P NMR(CDCl3)δ 3.27,3.52；MS(MALDI-TOF):521.3(M+1+Na)；HPLC保留时间=7.15,7.66分钟。化合物8c：产率83％；IR(Neat):3211,2954,1743,1689,1485,1265,1217,1153,1010,923和833cm-1；1H NMR(CDCl3)δ 9.82(br s,1H),7.45-7.41(m,3H),7.15-7.11(m,2H),6.14-6.06(m,1H),4.39-4.00(m,5H),3.71,3.70(s,3H),2.38-1.89(m,7H),1.39-1.35(dd,3H)；13C NMR(CDCl3)δ 173.6*,163.8,150.3,148.5*,135.2,132.6*,121.8*,117.7,110.6*,85.9*,78.3*,67.2*,52.5,50.2*,31.6*,25.6*,20.8*和12.5；31P NMR(CDCl3)δ 2.83,3.05；MS(MALDI-TOF)：570.0(M+2+Na)；HPLC保留时间=15.50,16.57分钟。抗HIV活性和细胞毒性的细胞分析用AZT-敏感的HIV-1(病毒株：HTL ⅧB)、AZT-和NNI-抗性HIV-1(病毒株：RTMDR-1)(由Dr.Brendan Larder惠赠，NIH AIDS Research and Reference Reagent Program,DIV.AIDS,NIAID,NIH；cat.#2529)或HIV-2(病毒株：CBL-20)感染的外周血单核细胞(PBMNC)以及HTL ⅧB感染的TK-缺陷型CEM T-细胞，通过测定抑制病毒复制达50％所需要的化合物浓度评估抗HIV活性，该测定是以逆转录酶的活性分析为基础(IC50[RT])。通过比较受试物质处理的感染细胞的RT活性值和未处理的感染细胞(即病毒对照)的RT活性值计算抑制病毒复制的百分率。通过微量培养四唑鉴定法(MTA)，采用2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-硫苯基)-5-[苯氨基-羰基]-2H-四唑氢氧化物(XTT)，检测所述化合物的50％细胞毒性(CC50[MTA])(Zarling等，1990；Erice等，1993,Uckun等，1998，同上)。d4T-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)和AZT-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)作为有效的抗HIV剂的鉴定
当在HIV-1感染的PBMNC中试验时，d4T磷酸苯基酯衍生物并不比其母体化合物d4T更有效。在TK-缺陷型CEM细胞中D4T抑制HIV-1复制的能力明显下降。d4T抑制RT活性的IC50值在PBNMC中为40nM，而在TK-缺陷型CEM细胞中为2400nM(表4及图4A-4F)。尽管在TK-缺陷型CEM细胞中所有三种磷酸苯基酯衍生物比d4T更有效，但是在苯基部分具有对-溴取代基的化合物6c(d4T-5＇-[磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯])在抑制RT活性方面比d4T强60倍(IC50值：60nM对2400nM)(表4)。
通过MTA测定，所有的化合物在浓度高达10,000nM时对PBMNC或CEM细胞没有任何一个呈现可检测到的细胞毒性。有趣的是，在苯基部分具有对-甲氧基取代基的化合物6b在抑制HIV感染的TK-缺陷型CEM细胞的RT活性方面较化合物6c低5倍(IC50值：300nM对60nM)，然这两个化合物在外周血单核细胞中呈现相似的活性(IC50值：30nM对40nM)(表4)。
测试化合物7a、7b、7c和它们的母体化合物AZT 2在PBMNC和TK-缺陷型CEM T-细胞中抑制HIV复制的能力(表4)。通过比较受试物质处理的感染细胞的RT活性值和未处理的感染细胞的RT活性值计算抑制病毒复制的百分率。同时，用细胞增生的微量培养四唑分析法(MTA)检测所述化合物的细胞毒性。在TK-缺陷型CEM细胞中AZT2抑制HIV-1复制的能力显著下降。AZT抑制RT活性的IC50值在PBNMC中为3nM，在TK-缺陷型CEM细胞中为200nM。不同于对应的d4T衍生物，当在HIV-1感染的TK-缺陷型CEM T-细胞中试验时，AZT的未取代的和对位取代的磷酸苯基酯衍生物并不比母体化合物AZT更有效。可是，AZT的磷酸对-溴取代的苯基酯衍生物即AZT-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)7c，在抑制TK-缺陷型CEM细胞的HIV复制的有效性是AZT的5倍(IC50[RT]值：0.04uM对0.2uM)。通过MTA测定，在浓度高达10,000nM时对PBMNC或CEM细胞没有任何一个化合物呈现可检测到的细胞毒性。
与4TT 1并行比较，测试化合物8a-c及其母体化合物3dT 3在PBMNC和TK-缺陷型CEMT-细胞中抑制HIV-1复制的能力。在外周血单核细胞及TK-缺陷型CEM T-细胞中3dT及其衍生物的活性较d4T低(表4)。值得注意的是，在外周血单核细胞中，化合物8a-c的IC50[RT]值高于3dT的IC50[RT]值(1.2-3.1对0.7，表4)，提示这些前体药物是足够稳定的并且在它们的代谢、或许其酶促水解中不依赖TK的步骤可能是产生活性物的限速步骤。按照关于d4T和AZT的磷酸苯基酯衍生物的生物活性的文献报道结果，3dT的磷酸苯基酯衍生物在TK-缺陷型细胞中抑制HIV-1复制较其母体化合物3dT更有效，虽然仍具有高微摩尔IC50[RT]值(表4及图4A-4F)。因为化合物8a-c的活性在TK-缺陷型CEM T-细胞中较在PBMNC中低，所以我们推测在缺少TK时这些前体药物产生的3dT单磷酸酯转化为其具有活性的三磷酸酯以非常低的速率进行。
表4d4T、AZT和3dT的磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物在正常的外周血单核细胞(PBMNC)和TK-缺陷型CEM T-细胞中的抗HIV活性 PBMNC CEM化合物 X IC50 [RT] IC50 [MTA] IC50 [RT]IC50[MTA] 6a H N.D N.D 0.1 ＞10 6b OCH3 0.03 ＞10 0.3 ＞10 6c Br 0.04 ＞10 0.06 ＞10 7a H N.D N.D 1.7 ＞10 7b OMe 0.1 ＞10 4.1 ＞10 7c Br 0.004 ＞10 0.04 ＞10 8a H 2.1 ＞10 7.5 ＞10 8b OMe 1.3 ＞10 19.7 ＞10 8c Br 1.2 ＞10 22.8 ＞10 1(d4T) - 0.04 ＞10 2.4 ＞10 2(AZT) - 0.003 ＞10 0.2 ＞10 3(3dT) - 0.7 ＞10 91.2 ＞10
先导化合物d4T-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)和AZT-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)抗HIV-2和RTMDR-1的活性
与AZT 2平行比较，测试化合物6c和7c对在PBMNC中的RTMDR-1(一种AZT和NNI抗性HIV-1株)和HIV-2的HIV复制的抑制能力(表5)。新的d4T衍生物6c即d4T-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)，对RTMDR-1具有有效的抗病毒活性并对HIV-2具有中度活性。可是，对应的AZT的磷酸对-溴取代苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物7c和其母体化合物AZT 2并不能有效地抗AZT抗性RTMDR-1或抗HIV-2。
表5先导化合物6c和7c在HIV-2和RTMDR-1细胞中的抗HIV活性 HIV-2 RTMDR-1 化合物 IC50 [RT] IC50 [RT] 6c 0.4 0.02 7c 3.9 1.5 2(AZT) 2.4 2.0
所有的数据用uM表示并且代表抑制病毒复制50％需要的浓度(IC50[RT])，通过RT活性分析进行测量。
在TK-缺陷型CEM细胞中化合物6a、6b和6c都比它们的母体化合物d4T 1更有效，而在HIV-1感染的PBMNC中这些d4T磷酸苯基酯衍生物(6a、6b和6c)并不比它们的母体化合物d4T 1更有效(表4)。比较所有的d4T磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物，在TK-缺陷型CEM细胞中d4T-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)6c是最有效的抗HIV剂。所述观察结果可能归因于6c的苯基部分上的对-溴取代基，由于溴取代基的吸电子性质(图2)使该取代基增加6c的磷进行水解的能力并且导致在TK-缺陷型CEM T-细胞中产生明显更高量的关键代谢产物d4T单磷酸酯(McIntee等，1997,J.Med.Chem.40:3233-3331)。
在TK-缺陷型CEM细胞中AZT的磷酸苯基酯、磷酸甲氧基苯基酯和磷酸溴苯基酯衍生物的药效也具有与d4T衍生物的同样药效趋势，也就是7c(溴苯基酯)＞7a(苯基酯)＞7b(甲氧基苯基酯)。可是，在这三种AZT磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物(7a、7b和7c)中，在TK-缺陷型CEM细胞中只有7c具有比AZT高的药效(IC50值：40nM对200nM)。对于3dT磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物，预料在苯基部分的对位吸电子取代基的存在将增加化合物8c的取代的苯氧基团水解的速率(例如图2中的B到C)。可是，8c并不比没有对位取代的8a化合物或具有供电子对位取代基的8b化合物更有效，因此提出这样的假设：在它们的新陈代谢中依赖于羧酸酯酶的第一水解步骤(例如图2中的A到B)对于活性3dT代谢产物的产生起到一个关键的及限速的作用。对于核苷类似物的磷酸苯基甲氧基丙氨酸基酯衍生物(图2)，我们推测按照所提出的新陈代谢途径，化合物8a、8b和8c可能起作推定引起水解的羧酸酯的较差的底物。3dT磷酸芳基酯衍生物的作用并不象关于前体药物型的非常相似的核苷类似物d4T的代谢和活性的公开著作所预期的那样。令我们非常惊奇的是，在HIV-1感染的正常外周血单核细胞或TK-缺陷型CEM T-细胞系中3dT磷酸芳基酯衍生物并没有引起有希望的抗HIV活性。
总之，认为d4T-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)6c和AZT-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)7c是抗HIV的活性剂，在TK-缺陷型CEM T-细胞中可有效地抑制HIV复制而没有任何可检测到的细胞毒性。另外，所述新的d4T衍生物6c对RTMDR-1即一种AZT及NNI抗性HIV-1株具有有效的抗病毒活性而对HIV-2具有中度活性。与这些d4T和AZT衍生物相比，相应的3dT衍生物即3dT-5＇-(磷酸对-溴苯基甲氧基丙氨酸基酯)在PBMNC或TK-缺陷型CEM T-细胞中并没有显著的抗HIV活性。据我们所知，这是首次综合报道从前未曾认识到的结构活性关系，该关系决定d4T和AZT的磷酸苯基酯衍生物的效力。先导化合物6c和7c的进一步开发可以为设计有效的HIV治疗策略提供根据，该策略能够在TK-缺陷型细胞中抑制HIV复制。
尽管以上提供了本发明的详细说明，但是本发明并不局限于此。可以修改在此描述的本发明，包括变通的实施方案，这对于本领域的技术人员而言是显而易见的。接下面的权利要求，应该认为所有这类变通均在本发明的实质和范围内。