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本发明涉及使用多核苷酸、初级转录物和mmRNA分子的组合物、方法和试剂盒。本发明还涉及使用多核苷酸、初级转录物和mmRNA分子改变胆固醇水平的组合物和方法。

1.一种组合物，其包含在可接受的稀释剂或载体中的：
(a)编码PCSK9阴性LDLR的合成多核苷酸，和
(b)编码CYP7A1的合成多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合物，其还包含：
(c)他汀，所述他汀选自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他
汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀及其组合。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的组合物，其中所述合成多核苷酸包
含：
(a)连接的核苷的第一区域，所述第一区域编码至少一种调节胆固醇的
多肽；
(b)位于所述第一区域5’末端处的第一侧翼区，其包含：
(i)连接的核苷的序列，所述序列选自天然5’非翻译区(UTR)、
SEQIDNO:1及其功能性变体；
(c)位于所述第一区域3’末端处的第二侧翼区，其包含：
(i’)连接的核苷的序列，所述序列选自天然3’UTR、任意前述
包含一个或多个微RNA或微RNA结合位点或微RNA种子的序列
及其功能性变体或组合；和
(ii’)连接的核苷的3’加尾序列；
其中所述连接的核苷的第一区域包含至少第一修饰核苷。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中第二侧翼区编码至少一个miR
结合位点。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述miR结合位点选自miR-122a
和miR-422a。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述合成多核苷酸包
含至少一个化学修饰。
7.方法，其包括使受试者中的肝细胞与根据权利要求1-6中任一项所述
的组合物接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其还包括测量所述受试者的血浆中的胆
固醇水平。
9.根据权利要求7所述的方法，其还包括使所述肝脏细胞与他汀接触。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述受试者是人。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述人在CYP7A1中具有多态性。
12.治疗有需求的受试者中疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施
用根据权利要求1-6中任一项所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病或病症选自脂肪肝病、
肝细胞癌、NASH、脂肪变性、家族性高胆固醇血症(FH)、高胆固醇血症和
异常脂蛋白谱。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述疾病或病症是家族性高胆固
醇血症(FH)。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含可
药用赋形剂。
16.根据权利要求7-14中任一项所述的方法，其中所述组合物包含脂质，
并且其中所述脂质选自DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-KC2-DMA、
98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、reLNP、PLGA、PEG、PEG-DMA和
聚乙二醇化脂质及其混合物。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述合成多核苷酸以1μg至150
μg之间的每日总剂量施用。
18.调节受试者血浆中胆固醇水平的方法，其包括使所述受试者与根据
权利要求1-6中任一项所述的组合物接触。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述调节是降低的水平。

改变胆固醇水平的组合物和方法

相关申请的引用

本申请要求2013年3月15日提交的名为“改变胆固醇水平的组合物和方
法”的美国临时专利申请号61/786,737；2013年5月29日提交的名为“改变胆
固醇水平的组合物和方法”的美国临时专利申请号61/828,214；2013年6月
26日提交的名为“改变胆固醇水平的组合物和方法”的美国临时专利申请号
61/839,488；2013年11月13日提交的名为“改变胆固醇水平的组合物和方法”
的美国临时专利申请号61/903,474；和2013年12月20日提交的名为“改变
胆固醇水平的组合物和方法”的美国申请号14/135,887的优先权，所述文献每
一篇的内容通过引用方式完整并入本文。

序列表的引用

本申请随电子格式的序列表一起提交。序列表作为2014年3月13日创
建、大小175,503比特、名为M044PCTSQLST.txt的文件提供。电子格式的
序列表中的信息通过引用的方式完整并入本文。

技术领域

本发明涉及用于调节和/或改变生物中胆固醇水平在的或改变生物中胆
固醇运输的组合物和方法。在一个方面，本发明涉及治疗中的RNA如修饰
的RNA。本发明的RNA或修饰的RNA可以编码肽、多肽或多种蛋白质。
本发明的RNA或修饰的RNA也可以用来产生目的多肽。本发明的修饰RNA
分子可以是mRNA并且因此称作修饰的mRNA。目的多肽可以用于治疗中
和/或临床环境和研究环境下。

背景技术

高胆固醇是心脏病发作和卒中的众多风险因素之一。尽管饮食不良和缺
少锻炼是高胆固醇的常见原因，但是遗传改变，如由LDLR缺乏引起的家族
性高胆固醇血症(FH)，可能是高胆固醇的原因。目前市场上有众多降胆固醇
药物，但是它们并非没有风险或在某些情况或其他药物情况下并非没有禁忌。
这类药物包括他汀类、贝特类、烟酸、胆汁酸螯合剂(树脂)、植物甾醇或阻
止脂肪吸收、减少胆固醇吸收或靶向胆固醇运输途径中诸基因的其他化合物。

基于核酸的降胆固醇药物例如包括靶向ApoB-100的反义寡核苷酸抑制
剂，米泊美生(mipomersen)，其在2013年1月获批用于治疗纯合家族性高胆
固醇血症(FH)。在2012年12月，FDA还批准洛美他派(lomitapide)用于相同
病症。

更麻烦之处是与靶向胆固醇的药物相关的肝相关问题，尤其血清氨基转
移酶升高和肝脂肪蓄积(或肝脂肪变性)。例如，因为围绕米泊美生的潜在明
显安全顾虑，该药物将附带关于肝毒性以及需要处方者和药房证明的加框警
告，以及该药物应当随每张新处方恰当使用的文件记录。尽管米泊美生总体
上有效降低LDL胆固醇(临床试验中超过半数的患者具有超过20％的LDL水
平下降并且在纯合FH试验中，它降低LDL24.7％)，但是一般FH患者具有
400-1000mg/dL之间的平均LDL。因此，降低作用在这些患者中可能不充分。
此外，这些试验并不大到足以有把握评估心血管结局，尽管心血管益处当然
是该药物的最终预期作用。另外，心脏病患的严重不良事件在III期试验的米
泊美生组中出现。

通过提供基于核酸的化合物或多核苷酸，本发明解决了LDL胆固醇水平
升高和肝功能失调的问题，其中所述化合物或多核苷酸编码目的多肽(例如，
修饰的mRNA或mmRNA)并且具有避免一个或多个本领域问题的结构特征
和/或化学特征。

为此目的，发明人已经显示某些修饰的mRNA序列具有作为治疗药的潜
力，所述治疗药具有超出仅规避、避免或削弱免疫反应的益处。这类研究详
述于公开的待决申请国际申请PCT/US2011/046861(2011年8月5日提交)和
PCT/US2011/054636(2011年10月3日提交)、国际申请号
PCT/US2011/054617(2011年10月3日提交)中，所述文献的内容通过引用的
方式完整并入本文。

发明概述

本文中描述了在治疗、预防或诊断与胆固醇和/或胆固醇运输相关的疾病
和病症中使用RNA如修饰的RNA的组合物、方法和试剂盒RNA。

根据本发明，通过提供一种或多种改变胆固醇的浓度、其加工或运输的
多肽(包括酶)，调节与胆固醇运输相关的途径。

在一个实施方案中，通过向细胞提供更多受体分子或通过最大限度减少
LDL受体破坏，增加LDL胆固醇从血浆向肝脏细胞的转运。在第一情况下，
提供编码LDL受体的多核苷酸、初级构建体或mmRNA。在第二情况下，突
变体形式的LDL受体由多核苷酸、初级构建体或mmRNA编码。这类突变
LDL受体(LDL-R或LDLR)将以某种方式在其PCSK-9结合作用方面存在缺
陷。因此，PCSK9结合作用缺陷型LDLR将携带胆固醇进入肝细胞中。

本文中提供编码LDLR突变体的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA。
在一个方面，修饰的mRNA可以编码一种LDLR突变体，所述LDLR突变
体可以在包含LDLR氨基酸314-393的区域(如，但不限于SEQIDNO:19)
中包含至少一个氨基酸突变。在一个实施方案中，该氨基酸区域包含SEQID
NO:19的氨基酸316-339。修饰的mRNA可以包含至少一个核苷修饰如，但
不限于1-甲基假尿苷。修饰的mRNA还可以包含核苷修饰5-甲基胞嘧啶。

本文中还提供降低受试者中血清胆固醇的方法，所述方法包括向受试者
施用修饰的mRNA，所述修饰的mRNA可以编码一种LDLR突变体，所述
LDLR突变体可以在包含LDLR氨基酸314-393的区域(如，但不限于SEQID
NO:19)中包含至少一个氨基酸突变。在一个实施方案中，该氨基酸区域包含
SEQIDNO:19的氨基酸316-339。

在一个实施方案中，向肝细胞提供一种或多种编码和/或过量表达
CYP7A1的多核苷酸、初级构建体或mmRNA。CYP7A1是胆汁酸合成的限
速酶，并促进移除进入的胆固醇。有些人具有与血浆低密度脂蛋白(LDL)和
肝脏胆固醇含量高相关的CYP7A1突变以及胆汁酸排泄缺陷。

在一个实施方案中，递送两种多核苷酸、初级构建体或mmRNA，导致
血浆胆固醇较低并同时增强胆固醇处置。

在一个实施方案中，一种或多种多核苷酸、初级构建体或mmRNA在
3’UTR中被修饰以含有微RNA结合位点或种子区。在这个实施方案中，可
以通过miR去稳定化(尤其在肝细胞中的普遍存在性miR122a)，使具有大约
30分钟正常半寿期的CYP7A1多核苷酸依赖转录。根据这个实施方案，可以
将miR122a结合位点并入mmRNA的3’UTR，造成转录物较不稳定。取决于
工程化至构建体中的结合位点的数目，这将允许滴定稳定性并因此允许控制
所编码的CYP7A1酶的表达。编码CYP7A1的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA也可以用于创建可用于概念验证研究和基本研究中的小鼠模型。这
些研究将类似于产生剂量依赖性基因治疗。

在一个实施方案中，治疗方案可以设计用于罕见疾病，其中患者呈现对
他汀类低反应的CYP7A1多态性。在这种情况下，对本发明有效组合物的研
究可以迅速完成并且以基于膳食的难题为基础。就此而言，本发明的组合物
可用于研究和治疗涉及胆固醇相关疾病的(罕见和流行)疾病。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以随其他药物化合物一起施用。
这类其他药物特别包括他汀类。他汀类的例子包括但不限于阿托伐他汀
(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀
(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀
(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及其组合。

根据本发明，包含多核苷酸、初级构建体或mmRNA的组合物可用于治
疗如罕见非酒精性脂肪肝病之类的疾病。在治疗这种病症时，包括驱动肝脏
胆固醇至其天然汇槽(经胆汁离开身体)的任何治疗药将具有优越的治疗结
果。因此，包括施用编码LDLR的多核苷酸、初级构建体或mmRNA将增加
肝细胞中的胆固醇，但是共施用编码CYP7A1的第二多核苷酸、初级构建体
或mmRNA将继续驱动胆固醇经胆汁离开，因而避免目前随已知治疗药所见
的脂肪肝症状。

除随CYP7A1多核苷酸、初级构建体或mmRNA一起递送至少LDLR或
PCSK9LDLR突变体之外，还预期递送额外的药物如他汀将与本文所述的
LDLR-CYP7A1疗法非常协同。因此，将促进胆固醇排泄，将阻止新形成并
且将增加从血浆运输。

在一个实施方案中，mmRNA混合物将随胆固醇稳态途径滴定，以促进
胆固醇动员离开身体。

在另一个实施方案中，可以共施用胆汁酸螯合剂或脂溶性维生素。

将理解，为了清晰起见在独立实施方案背景下描述的本公开的某些特征
也可以在单个实施方案中组合地提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案
情景下描述的本公开的多种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。

在下文描述中叙述本发明的多种实施方案的详细内容。本发明的其他特
征、目的和优点将从本描述及附图并且从权利要求书中显而易见。

附图简述

前述目的和其他目的、特征和优点将从以下对如附图中所示的本发明具
体实施方案的描述显而易见，其中相同参考字符在不同视图间始终指相同的
部分。附图不必然地符合比例，反而重点在于说明本发明各种实施方案的原
理。

图1是本发明的初级构建体的示意图。

图2是本发明的初级构建体的示意图。

图3显示肝脏细胞中胆固醇运输的途径。

图4是低密度脂蛋白受体(LDLR)修饰的mRNA的流式细胞术曲线。

图5是LDLR修饰的mRNA的流式细胞术曲线。

图6是LDLR表达的图。图6A显示细胞的LDL受体表达与添加的LDLR
mRNA的曲线。图6B显示转染后细胞的LDL受体表达。图6C显示
标记的LRL的饱和作用。图6D显示BODIPY-LDL对细胞的结合亲和力。图
6E显示每个级分的总胆固醇含量。

图7是LDLR修饰的mRNA产物的生物分析仪图像。泳道1，以核苷酸
计的尺寸标记；泳道2，LDLR修饰的mRNA。

图8是在HEK293细胞中转染的800ngLDLR修饰的mRNA的流式细
胞术曲线。

图9是在HEK293细胞中转染的LDLR修饰的mRNA的流式细胞术曲
线。

图10显示血清中的胆固醇水平。图10A显示来自合并LDLR敲除小鼠(上
半小图)和野生型小鼠(下半小图)的FPLC级分的吸光度谱。图10B显示每个
级分的总胆固醇含量。

图11是在HEK293细胞中转染的变异LDLR修饰的mRNA的流式细胞
术曲线。

图12是在具有或没有PCSK9的情况下，在HEK293细胞中转染的变异
LDLR修饰的mRNA的流式细胞术曲线。

图13是转染的变异LDLR修饰的mRNA的流式细胞术曲线。图13A显
示BODIPY-LDL与LDLRmRNA转染细胞的结合作用的等值线图。图13B
显示BODIPY-LDL的最大半数细胞结合作用。

图14显示用LDLRmRNA转染后对半寿期的影响。图14A显示野生型
LDLRmRNA。图14B显示编码具有4个氨基酸置换(N316A、E317A、D331A
和Y336A)的变异LDLR的LDLRmRNA。图14C显示编码具有1个氨基酸
置换Y336A的变异LDLR的LDLRmRNA。图14D显示编码具有1个氨基
酸置换E317A的变异LDLR的LDLRmRNA。图14E显示编码具有1个氨
基酸置换N316A的变异LDLR的LDLRmRNA。图14F显示编码具有1个
氨基酸置换L339D的变异LDLR的LDLRmRNA。图14G显示编码具有1
个氨基酸置换D331E的变异LDLR的LDLRmRNA。

图15显示当PCSK的量变动时对细胞表面LDLR的影响。

发明详述

在治疗药、诊断学、试剂领域并且对于生物测定法而言有重大意义的是
能够输送核酸(例如，核糖核酸(RNA))至细胞内部，无论体外、体内、原位或
离体递送，从而引起该核酸的胞内翻译和产生编码的目的多肽。非整合性多
核苷酸的递送和功能特别重要。

本文中描述了用于设计、制备、制造和/或配制编码一种或多种目的多肽
的多核苷酸的组合物(包括药物组合物)和方法。还提供用于选择、设计和/或
利用编码本文所述目的多肽的多核苷酸的系统、方法、装置和试剂盒。

根据本发明，优选地修饰这些多核苷酸从而避免本领域编码多肽的其他
分子的缺陷。因此，这些多核苷酸称作修饰的mRNA或mmRNA。

本文中部分地提供已经设计成改善以下一者或多者的编码目的多肽的多
核苷酸、初级构建体和/或mmRNA：组织中的稳定性和/或清除率、受体摄取
和/或动力学、组合物的细胞接近性、参与翻译机器、mRNA半寿期、翻译效
率、免疫逃避、蛋白质产生能力、分泌效率(当适用时)、循环可及性、蛋白
质半寿期和/或细胞状态、功能和/或活性的调节作用。具体而言，本发明的
多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA用于改变生物、尤其人类患者中的胆固
醇水平或胆固醇运输。

根据本发明，通过提供一种或多种改变胆固醇的浓度、其加工或运输的
多肽(包括酶)，调节与胆固醇运输相关的途径。

在一个实施方案中，通过向细胞提供更多受体分子或通过最大限度减少
LDL受体破坏，增加LDL胆固醇从血浆向肝脏细胞的转运。在第一情况下，
提供编码LDL受体的多核苷酸、初级构建体或mmRNA。在第二情况下，突
变体形式的LDL受体由多核苷酸、初级构建体或mmRNA编码。这类突变
LDL受体(LDL-R或LDLR)将以某种方式在其PCSK-9结合作用方面存在缺
陷。PCSK-9的结合位点已经先前定位至LDLR的EGF-A(或EGF样重复序
列)结构域(参见例如，Kwon等人,MolecularBasisforLDLreceptorrecognition
byPCSK9.PNAS.2008105(6),1820-1825；所述文献的内容通过引用的方式
完整并入本文)。因此，PCSK9结合作用缺陷型LDLR将携带胆固醇进入肝
细胞中。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码在
PCSK-9结合作用方面缺陷的突变体LDLR。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码在
PCSK-9结合位点中包含至少一个氨基酸突变的突变体LDLR。突变体LDLR
可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多于10个突变。

在一个实施方案中，突变体LDLR可以在LDLR的EGF-A结构域(也称
作EGF样重复序列结构域)中包含至少一个氨基酸突变。作为一个非限制性
例子，EGF-A结构域位于LDLR的包含氨基酸314-393的区域内。作为另一
个非限制性例子，EGF-A结构域是SEQIDNO:19的包含氨基酸314-393的
区域。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码在EGF
样1结构域中包含至少一个氨基酸突变的突变体LDLR。EGF样1结构域可
以位于LDLR的包含氨基酸314-353的区域内。作为一个非限制性例子，EGF
样1结构域是SEQIDNO:19的包含氨基酸314-353的区域。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码在EGF
样2结构域中包含至少一个氨基酸突变的突变体LDLR。EGF样2结构域可
以位于LDLR的包含氨基酸353-393的区域内。作为一个非限制性例子，EGF
样2结构域是SEQIDNO:19的包含氨基酸353-393的区域。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码PCSK-9
结合作用缺陷型突变体LDLR。该PCSK-9结合作用缺陷型突变体LDLR可
以在SEQIDNO:19的包含氨基酸314-393区域中包含至少一个氨基酸突变。
作为一个非限制性例子，至少一个突变可以位于氨基酸314-353之间。作为
另一个非限制性例子，至少一个突变可以位于氨基酸315-340之间。作为又
一个非限制性例子，至少一个突变可以位于氨基酸354-393之间。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码在
PCSK-9结合区中包含至少一个突变的PCSK-9结合作用缺陷型突变体
LDLR。该突变可以位于SEQIDNO:19的包含氨基酸314-393的区域内。作
为突变区域的非限制性例子，该突变可以位于314-353、315-340和354-393
的区域内。作为另一个非限制性例子，该突变可以在位置316、317、331、
336或339处。作为又一个非限制性例子，突变体LDLR可以在位置316、
317、331和336包含突变。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码在氨基
酸位置如但不限于316、317、331、336和/或339处包含至少一个突变的
PCSK-9结合作用缺陷型突变体LDLR。作为一个非限制性例子，PCSK-9结
合作用缺陷型突变体LDLR可以包含以下至少一个突变：N316A、E317A、
D331A、D331E、Y336A和/或L339D，其中“N316A”意指在位置316处的天
冬酰胺替换为丙氨酸。作为另一个非限制性例子，PCSK-9结合作用缺陷型
突变体LDLR可以包含突变N316A、E317A、D331A和Y336A。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码在氨基
酸位置如但不限于316、317、331、336和/或339处包含4个突变的PCSK-9
结合作用缺陷型突变体LDLR。作为一个非限制性例子，PCSK-9结合作用缺
陷型突变体LDLR可以包含以下任何四个突变如N316A、E317A、D331A、
D331E、Y336A和/或L339D，其中“N316A”意指在位置316处的天冬酰胺替
换为丙氨酸。作为另一个非限制性例子，PCSK-9结合作用缺陷型突变体
LDLR可以包含突变N316A、E317A、D331A和Y336A。

在一个实施方案中，向肝细胞提供一种或多种编码和/或过量表达
CYP7A1的多核苷酸、初级构建体或mmRNA。CYP7A1是胆汁酸合成的限
速酶，并促进移除进入的胆固醇。有些人具有与血浆低密度脂蛋白(LDL)和
肝脏胆固醇含量高相关的CYP7A1突变以及胆汁酸排泄缺陷。

在一个实施方案中，递送两种多核苷酸、初级构建体或mmRNA，导致
血浆胆固醇较低和同时增强胆固醇处置。

在一个实施方案中，一种或多种多核苷酸、初级构建体或mmRNA在
3’UTR中被修饰以含有微RNA结合位点或种子区。在这个实施方案中，可
以通过miR-去稳定化(尤其在肝细胞中的普遍存在性miR122a)，使具有大约
30分钟正常半寿期的CYP7A1多核苷酸依赖转录。根据这个实施方案，可以
将miR122a结合位点并入mmRNA的3’UTR，造成转录物较不稳定。取决于
工程化至构建体中的结合位点的数目，这将允许滴定稳定性(titrationof
stability)并因此允许控制所编码的CYP7A1酶的表达。编码CYP7A1的多核
苷酸、初级构建体或mmRNA也可以用于创建可用于概念验证研究和基本研
究中的小鼠模型。这些研究将类似于产生剂量依赖性基因治疗。

在一个实施方案中，治疗方案可以设计用于罕见疾病，其中患者呈现对
他汀类低反应的CYP7A1多态性。在这种情况下，对本发明有效组合物的研
究可以迅速完成并且以基于膳食的难题为基础。就此而言，本发明的组合物
可用于研究和治疗涉及胆固醇相关疾病的(罕见和流行)疾病。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以随其他药物化合物一起施用。
这类其他药物特别包括他汀类。他汀类的例子包括但不限于阿托伐他汀
(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀
(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀
(pravastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及其组合。

根据本发明，包含多核苷酸、初级构建体或mmRNA的组合物可用于治
疗如罕见非酒精性脂肪肝病之类的疾病。在治疗这种病症时，包括驱动肝脏
胆固醇至其天然汇槽(经胆汁离开身体)的任何治疗药将具有优越的治疗结
果。因此，包括施用编码LDLR的多核苷酸、初级构建体或mmRNA将增加
肝细胞中的胆固醇，但是共施用编码CYP7A1的第二多核苷酸、初级构建体
或mmRNA将继续驱动胆固醇经胆汁离开，因而避免目前随已知治疗药所见
的脂肪肝症状。

除随CYP7A1多核苷酸、初级构建体或mmRNA一起递送至少LDLR或
PCSK9LDLR突变体之外，还预期递送额外的药物如他汀将与本文所述的
LDLR-CYP7A1疗法非常协同。因此，将促进胆固醇排泄，将阻止新形成并
且将增加从血浆运输。

在一个实施方案中，mmRNA混合物将随胆固醇稳态途径滴定以促进胆
固醇动员离开身体。

在另一个实施方案中，可以共施用胆汁酸螯合剂或脂溶性维生素。

将理解，为了清晰起见在独立实施方案背景下描述的本公开某些特征也
可以在单个实施方案中组合地提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案情
景下描述的本公开多种特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供。

I.本发明的组合物(mmRNA)

本发明提供编码一种或多种目的多肽的核酸分子、尤其多核苷酸、初级
构建体和/或mmRNA。按其最广意义，术语“核酸”包括包含核苷酸聚合物的
任何化合物和/或物质。这些聚合物经常称作多核苷酸。本发明的示例性核酸
或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸
(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA，包括具有β-D-核糖
构型的LNA、具有α-L-核糖构型的α-LNA(LNA的非对映异构体)、具有2’-
氨基官能化的2’-氨基-LNA和具有2’-氨基官能化的2’-氨基-α-LNA)或其杂交
分子。

在优选的实施方案中，核酸分子是信使RNA(mRNA)。如本文所用，术
语“信使RNA”(mRNA)指编码目的多肽并且能够在体外、体内、原位或离体
翻译以产生所编码目的多肽的任何多核苷酸，如合成的多核苷酸。

传统上，mRNA分子的基本组分包含至少一个编码区、一个5’UTR、一
个3’UTR、一个5’帽和一个聚腺苷酸尾。基于这种野生型模块结构，本发明
通过提供多核苷酸或初级RNA构建体，扩展了传统mRNA分子的官能度的
范围，其中所述的多核苷酸或初级RNA构建体维持模块组织化，但是包含
一种或多种向再编程性多核苷酸赋予有用特性的结构性和/或化学性修饰或
改变，所述有用特性在一些实施方案中包括引入了所述多核苷酸的细胞的先
天免疫反应的实质诱导的缺乏。因而，本发明的修饰的mRNA分子，如合成
的修饰的mRNA分子，称作“mmRNA”。如本文所用，“结构性”特征或修饰
是这样一种情况，其中在多核苷酸、初级构建体或mmRNA中插入、缺失、
重复、倒转或随机分配两个或更多个连接的核苷酸，而对核苷酸本身没有进
行明显化学修饰。因为化学键将必然地破裂并重新形成以实现结构性修饰，
所以结构性修饰本质是化学的并且因此是化学修饰。然而，结构性修饰将产
生不同的核苷酸序列。例如，可以将多核苷酸“ATCG”化学修饰成
“AT-5meC-G”。相同的多核苷酸可以在结构上从“ATCG”修饰成“ATCCCG”。
这里，已经插入二核苷酸“CC”，导致对多核苷酸的结构性修饰。

mmRNA构造

本发明的mmRNA与野生型mRNA区分在于其功能性和/或结构性设计
特征，其中如本文佐证，所述特征克服了使用基于核酸的治疗药时有效产生
多肽中的现有问题。

图1显示本发明的代表性多核苷酸初级构建体100。如本文所用，术语
“初级构建体”或“初级mRNA构建体”指多核苷酸转录物，其编码一种或多种
目的多肽并且保留足够的结构性和/或化学特征以允许其中所编码的目的多
肽翻译。初级构建体可以是本发明的多核苷酸。在结构上或化学修饰时，初
级构建体可以称作mmRNA。

返回图1，初级构建体100这里含有连接的核苷酸第一区域102，其旁侧
分布有第一侧翼区104和第二侧翼区106。如本文所用，“第一区域”可以称
作“编码区”或“编码……的区域”或简单称作“第一区域”。这种第一区域可以
包括，但不限于，编码的目的多肽。目的多肽可以在其5’末端处包含一个或
多个由信号序列区域103编码的信号序列。侧翼区104可以包含一个连接的
核苷酸的区域，所述区域包含一个或多个完整或不完整的5’UTR序列。侧翼
区104还可以包5’末端帽108。第二侧翼区106可以包含一个连接的核苷酸
的区域，所述区域包含一个或多个完整或不完整的3’UTR。侧翼区106还可
以包含3’加尾序列110。

桥接第一区域102的5’末端和第一侧翼区104的是第一可操作区域105。
传统上，这个可操作区域包含起始密码子。这个可操作区域可以备选地包含
任何翻译起始序列或信号，包括起始密码子。

桥接第一区域102的3’末端和第二侧翼区106的是第二可操作区域107。
传统上，这个可操作区域包含终止密码子。这个可操作区域可以备选地包含
任何翻译起始序列或信号，包括终止密码子。根据本发明，也可以使用多个
系列终止密码子。

图2显示本发明的代表性多核苷酸初级构建体130。多核苷酸初级构建
体指一种多核苷酸转录物，其编码一种或多种目的多肽并且保留足够结构和/
或化学特征以允许其中所编码的目的多肽翻译。目的多肽和编码目的多肽的
多核苷酸的非限制性例子在以下文献中描述：2012年4月2日提交的名为“用
于产生生物药物的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,862的表6；
2012年8月10日提交的名为“用于产生生物药物的修饰多核苷酸”的美国临
时专利申请号61/681,645；2012年12月14日提交的名为“用于产生生物药物
的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,130；2013年3月9日提交的
名为“用于产生生物药物和与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的国际
申请号PCT/US2013/030062；2012年4月2日提交的名为“用于产生抗体的
修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,866；2012年8月10日提交的
名为“用于产生抗体的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,647；
2012年12月14日提交的名为“用于产生抗体的修饰多核苷酸”的美国临时专
利申请号61/737,134；2013年3月9日提交的名为“修饰的多核苷酸”的国际
申请号PCT/US2013/030063；2012年4月2日提交的名为“用于产生疫苗的
修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,868；2012年8月10日提交的
名为“用于产生疫苗的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,648；
2012年12月14日提交的名为“用于产生疫苗的修饰多核苷酸”的美国临时专
利申请号61/737,135；2012年4月2日提交的名为“用于产生治疗性蛋白和肽
的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,870；2012年8月10日提交
的名为“用于产生治疗性蛋白和肽的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/681,649；2012年12月14日提交的名为“用于产生治疗性蛋白和肽的修饰
多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,139；2012年4月2日提交的名为“用
于产生分泌型蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,873；2012
年8月10日提交的名为“用于产生分泌型蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专
利申请号61/681,650；2012年12月14日提交的名为“用于产生分泌型蛋白的
修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,147；名为“用于产生分泌型蛋
白的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030064；2012年4月2日提
交的名为“用于产生质膜蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,878；2012年8月10日提交的名为“用于产生质膜蛋白的修饰多核苷
酸”的美国临时专利申请号61/681,654；2012年12月14日提交的名为“用于
产生质膜蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,152；2013年3
月9日提交的名为“用于产生膜蛋白的修饰多核苷酸”的国际申请号
PCT/US2013/030059；2012年4月2日提交的名为“用于产生胞质蛋白和细胞
骨架蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,885；2012年8月
10日提交的名为“用于产生胞质蛋白和细胞骨架蛋白的修饰多核苷酸”的美
国临时专利申请号61/681,658；2012年12月14日提交的名为“用于产生胞质
蛋白和细胞骨架蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,155；
2013年3月9日提交的名为“用于产生胞质蛋白和细胞骨架蛋白的修饰多核
苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030066；2012年4月2日提交的名为“用于
产生胞内膜结合型蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,896；2012年7月5日提交的名为“用于产生胞内膜结合型蛋白质的修
饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/668,157；2012年8月10日提交的名
为“用于产生胞内膜结合型蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/681,661；2012年提交12月14日的名为“用于产生胞内膜结合型蛋白质的
修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,160；2012年4月2日提交的名
为“用于产生核蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,911；2012
年8月10日提交的名为“用于产生核蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申
请号61/681,667；2012年12月14日提交的名为“用于产生核蛋白的修饰多核
苷酸”的美国临时专利申请号61/737,168；2013年3月9日提交的名为“用于
产生核蛋白的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030067；2012年4
月2日提交的名为“用于产生蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,922；2012年8月10日提交的名为“用于产生蛋白质的修饰多核苷酸”
的美国临时专利申请号61/681,675；2012年12月14日提交的名为“用于产生
蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,174；2013年3月9
日提交的名为“用于产生蛋白质的修饰多核苷酸”的国际申请号
PCT/US2013/030060；2012年4月2日提交的名为“用于产生与人类疾病相关
的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,935；2012年8月
10日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美
国临时专利申请号61/681,687；2012年12月14日提交的名为“用于产生与人
类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,184；
2013年3月9日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核
苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030061；2012年4月2日提交的名为“用于
产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,945；2012年8月10日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白
质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,696；2012年12月14日提
交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专
利申请号61/737,191；2012年4月2日提交的名为“用于产生与人类疾病相关
的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,953；2012年8月
10日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美
国临时专利申请号61/681,704；2012年12月14日提交的名为“用于产生与人
类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,203；
2013年3月15日提交的名为“蛋白质的体内产生”的国际申请号
PCT/US2013/031821；2012年8月10日提交的名为“用于产生化妆品用蛋白
质和肽的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,720；2012年12月14
日提交的名为“用于产生化妆品用蛋白质和肽的修饰多核苷酸”的美国临时专
利申请号61/737,213；2013年3月9日提交的名为“用于产生化妆品用蛋白质
和肽的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030068；2012年8月10日
提交的名为“用于产生肿瘤学相关蛋白和肽的修饰多核苷酸”的美国临时专利
申请号61/681,742和2013年3月9日提交的名为“用于产生肿瘤学相关蛋白
和肽的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030070，并且，所述文献每
一篇的内容结合通过引用的方式完整并入本文。

返回图2，多核苷酸初级构建体130这里含有连接的核苷酸第一区域132，
其旁侧分布有第一侧翼区134和第二侧翼区136。如本文所用，“第一区域”
可以称作“编码区”或“编码……的区域”或简单称作“第一区域”。这种第一区
域可以包括，但不限于，编码的目的多肽。在一个方面，第一区域132可以
包括，但不限于，编码至少一种目的多肽的可读框。该可读框可以完全或部
分地经密码子优化。侧翼区134可以包含一个连接的核苷酸的区域，所述区
域包含一个或多个完整或不完整的5’UTR序列，所述5’UTR序列可以完全
经密码子优化或部分地经密码子优化。侧翼区134可以包括至少一个核酸序
列，包括但不限于miR序列、TERZAK^TM序列和翻译控制序列。侧翼区134
还可以包5’末端帽138。5’末端帽区138可以包括天然存在的帽、合成帽或
优化帽。优化帽的非限制性例子包括由Rhoads在美国专利号US7074596和
国际专利公开号WO2008157668、WO2009149253和WO2013103659中教授
的帽。第二侧翼区106可以包含一个连接的核苷酸的区域，所述区域包含一
个或多个完整或不完整的3’UTR。第二侧翼区136可以完全经密码子优化或
部分地经密码子优化。侧翼区134可以包括至少一个核酸序列，包括但不限
于miR序列和翻译控制序列。在第二侧翼区136后，多核苷酸初级构建体可
以包含3’加尾序列140。3’加尾序列140可以包括合成加尾区142和/或链终
止性核苷144。合成加尾区的非限制性例子包括聚腺苷酸序列、聚胞苷酸序
列、聚A-G四重体。链终止性核苷的非限制性例子包括2’-O甲基、F和锁核
酸(LNA)。

桥接第一区域132的5’末端和第一侧翼区134的是第一可操作区域144。
传统上，这个可操作区域包含起始密码子。这个可操作区域可以备选地包含
任何翻译起始序列或信号，包括起始密码子。

桥接第一区域132的3’末端和第二侧翼区136的是第二可操作区域146。
传统上，这个可操作区域包含终止密码子。这个可操作区域可以备选地包含
任何翻译起始序列或信号，包括终止密码子。根据本发明，也可以使用多个
系列终止密码子。

通常，本发明初级构建体的第一区域的最短长度可以是足以编码二肽、
三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽的核酸序列的长度。在
另一个实施方案中，该长度可以足以编码2-30个氨基酸例如5-30、10-30、
2-25、5-25、10-25或10-20个氨基酸的肽。该长度可以足以编码至少11、12、
13、14、15、17、20、25或30个氨基酸的肽，或不超过40个氨基酸例如不
超过35、30、25、20、17、15、14、13、12、11或10个氨基酸的肽。多核
苷酸序列可以编码的二肽的例子包括但不限于肌肽(carnosine)和鹅肌肽
(anserine)。

通常，编码本发明目的多肽的第一区域的长度是大于约30个核苷酸长度
(例如，至少或大于约35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、
140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、
1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、
2,500和3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、
30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或至多并包括100,000
个核苷酸)。如本文所用，“第一区域”可以称作“编码区”或“编码……的区域”
或简单称作“第一区域”。

在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA包括约30个至
约100,000个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30
至1,000、30至1,500、30至3,000、30至5,000、30至7,000、30至10,000、
30至25,000、30至50,000、30至70,000、100至250、100至500、100至
1,000、100至1,500、100至3,000、100至5,000、100至7,000、100至10,000、
100至25,000、100至50,000、100至70,000、100至100,000、500至1,000、
500至1,500、500至2,000、500至3,000、500至5,000、500至7,000、500
至10,000、500至25,000、500至50,000、500至70,000、500至100,000、1,000
至1,500、1,000至2,000、1,000至3,000、1,000至5,000、1,000至7,000、1,000
至10,000、1,000至25,000、1,000至50,000、1,000至70,000、1,000至100,000、
1,500至3,000、1,500至5,000、1,500至7,000、1,500至10,000、1,500至25,000、
1,500至50,000、1,500至70,000、1,500至100,000、2,000至3,000、2,000
至5,000、2,000至7,000、2,000至10,000、2,000至25,000、2,000至50,000、
2,000至70,000以及2,000至100,000个核苷酸)。

根据本发明，第一和第二侧翼区可以独立地具有15-1,000个核苷酸长度
(例如，大于30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、
180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800和900个核苷
酸或至少30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、
200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900和1,000个核苷
酸)。

根据本发明，加尾序列可以不存在至长度为500个核苷酸(例如，至少
60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450或
500个核苷酸)。在加尾区是聚腺苷酸尾情况下，该长度可以按聚腺苷酸结合
蛋白结合作用的单位确定或作为聚腺苷酸结合蛋白结合作用的函数确定。在
这个实施方案中，聚腺苷酸尾长到足以结合聚腺苷酸结合蛋白的至少4单体。
聚腺苷酸结合蛋白单体与一段大约38个核苷酸结合。因而，已经观察到约
80个核苷酸和160个核苷酸的聚腺苷酸尾是有功能的。

根据本发明，加帽区可以包含单个帽或一系列形成帽的核苷酸。在这个
实施方案中，加帽区可以是1至10个核苷酸长度，例如2-9、3-8、4-7、1-5、
5-10或至少2个核苷酸长度、或10个核苷酸长度或更小核苷酸长度。在一
些实施方案中，帽不存在。

根据本发明，第一和第二可操作区域可以是3至40个核苷酸长度，例如，
5-30、10-20、15或至少4个核苷酸长度，或30个核苷酸长度或更小核苷酸
长度，并且除起始和/或终止密码子之外，还可以包含一个或多个信号和/或
限制性序列。

环状mmRNA

根据本发明，初级构建体或mmRNA可以是环化或连环化，以产生有翻
译能力的分子从而帮助聚腺苷酸结合蛋白和5’端结合蛋白之间的相互作用。
环化或连环化的机理可以通过至少3种不同途径实现：1)化学、2)酶促和3)
核酶催化。新形成的5’-/3’-键可以是分子内或分子间的。

在第一途径中，核酸的5’-端和3’-端含有当靠近时在分子5’-端和3’-端
之间形成新共价键的化学反应性基团。5’-端可以含有NHS-酯反应基团并且
3’-端可以含有3’-氨基封端的核苷酸，从而在有机溶剂中合成性mRNA分子
3’-端上的3’-氨基封端的核苷酸将对5’-NHS-酯部分发起亲核性攻击，形成新
的5’-/3’-酰胺键。

在第二途径中，T4RNA连接酶可以用来酶促连接5’-磷酸化的核酸分子
至核酸的3’-羟基，形成新磷酸二酯键。在一个示例反应中，根据制造商的操
作方案，将1μg核酸分子在37℃与1-10单位T4RNA连接酶(NewEngland
Biolabs，Ipswich，MA)温育1小时。连接反应可以在能够与附近5’-区域和3’-
区域两者碱基配对以帮助酶促连接反应的分裂寡核苷酸存在下进行。

在第三途径中，cDNA模板的5’-端或3’-端编码连接酶核酶序列，从而
在体外转录期间，所得到的核酸分子可以含有能够使核酸分子5’-端连接至核
酸分子3’-端的活性核酶序列。连接酶核酶可以衍生自组I内含子、组I内含
子、丁型肝炎病毒、发夹核酶或可以通过SELEX(systematicevolutionof
ligandsbyexponentialenrichment，指数富集的配体系统进化)选出。核酶连接
酶反应可以在0℃和37℃之间的温度进行1至24小时。

mmRNA多聚体

根据本发明，可以使用在3’-末端被修饰的核苷酸，将多个不同的多核苷
酸、初级构建体或mmRNA通过3’-端连接在一起。化学缀合可以用来控制
向细胞中递送的化学计量。例如，乙醛酸循环酶，异柠檬酸裂合酶和苹果酸
合成酶可以按1:1比例供应至HepG2细胞中，以改变细胞的脂肪酸代谢。可
以使用在一个多核苷酸、初级构建体或mmRNA种类上的3’-叠氮基封端的
核苷酸和在相对侧的多核苷酸、初级构建体或mmRNA种类上的C5-乙炔基
或含有炔基的核苷酸，通过化学连接的多核苷酸、初级构建体或mmRNA控
制这个比例。根据制造商的操作方案，使用末端转移酶(NewEnglandBiolabs，
Ipswich，MA)转录后添加修饰的核苷酸。在添加3’-修饰的核苷酸后，可以
将两个多核苷酸、初级构建体或mmRNA种类在铜存在或不存在时合并在水
溶液中，以通过如文献中所述的点击化学机制形成新共价键。

在另一个例子中，多于两个多核苷酸可以利用官能化的接头分子连接在
一起。例如，可以化学修饰官能化的糖分子以含有多个化学反应基团(SH-、
NH₂-、N₃、等)，以与3’-官能化mRNA分子上的同族部分(即，3’-马来酰亚
胺酯、3’-NHS-酯、炔基)反应。修饰糖上的反应基团的数目可以按化学计量
方式控制以直接控制缀合的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的化学计量比
率。

mmRNA缀合物和组合

为了进一步增强蛋白质生产，本发明的初级构建体或mmRNA可以是设
计成缀合至其他多核苷酸、染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨
脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、
多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、烷基化剂、
磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂、聚氨基、
烷基、取代的烷基、放射标记的标记、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸
收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成性核糖核酸酶、蛋白质，
例如糖蛋白，或肽，例如，对辅助配体具有特异性亲和力的分子,或抗体，例
如与指定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体、激素和激素受
体,非肽物质，如脂质、凝集素、糖、维生素、辅因子或药物。

缀合可以导致稳定性和/或半寿期增加并且可以特别可用于导引多核苷
酸、初级构建体或mmRNA至细胞、组织或生物中的特定位点。

根据本发明，mmRNA或初级构建体可以随以下一者或多者一起施用或
进一步编码以下一者或多者：RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、miRNA
结合位点、反义RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、
适配体或载体等。

双官能mmRNA

在本发明的一个实施方案中是双官能多核苷酸(例如，双官能初级构建体
或双官能mmRNA)。如名称提示，双官能多核苷酸是具有或能够发挥至少两
个功能的那些。按常规，这些分子还可以称作多官能。

双官能多核苷酸的多个官能团可以由RNA编码(该官能团可以不表现出
现直至编码产物被翻译)或可以是多核苷酸本身的特性。它可以是结构性或化
学性的。双官能的修饰多核苷酸可以包含与多核苷酸共价或静电结合的官能
团。进一步，可以在mmRNA和另一个分子的复合物背景下提供两种功能。

双官能多核苷酸可以编码具有抗增殖性的肽。这些肽可以是线性、环状、
被约束或随机卷曲。它们可以作为适配体，信号传导分子，配体或其模拟物
或拟似物发挥作用。翻译时，抗增殖肽可以具有3至50个氨基酸长度。它们
可以长5-40、10-30个或大约15个氨基酸。它们可以是单链、多链或支链并
且一旦翻译，可以形成复合物、聚集物或任何多单位结构。

非编码性多核苷酸和初级构建体

如本文所述，提供了具有部分或基本上不可翻译的序列(例如，具有非编
码区)的多核苷酸和初级构建体。这种非编码区可以是初级构建体的“第一区
域”。备选地，非编码区可以是除第一区域之外的区域。这类分子通常不翻译，
但是可以通过以下一种或多种方式对蛋白质产生形成影响：结合至并掩蔽一
种或多种翻译装置组分如核糖体蛋白或转运RNA(tRNA)，因而有效减少细胞
中的蛋白质表达或调节细胞中的一个或多个途径或级联，这转而改变蛋白质
水平。多核苷酸或初级构建体可以含有或编码一种或多种长的非编码RNA
(lncRNA或lincRNA)或其部分、小核仁RNA(sno-RNA)、微RNA(miRNA)、
小干扰RNA(siRNA)或Piwi-相互作用RNA(piRNA)。

目的多肽

根据本发明，初级构建体设计成编码一种或多种目的多肽或其片段。目
的多肽可以包括，但不限于，完整多肽、多种多肽或多肽片段，它们可以独
立地由一个或多个核酸、多个核酸、核酸片段或前述任一者的变体编码。如
本文所用，术语“目的多肽”指被选择在本发明初级构建体中编码的任何多肽。
如本文所用，“多肽”意指最经常通过肽键连接在一起的(天然或非天然)氨基
酸残基的聚合物。如本文所用，该术语指任何大小、结构或功能的蛋白质、
多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸并且该多肽则称作
肽。如果多肽是肽，它将长至少约2、3、4个氨基酸残基或至少5个氨基酸
残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直
向同源物、旁系同源物、片段和前述任一者的其他等同物、变体及类似物。
多肽可以是单个分子或可以是多分子复合体如二聚体、三聚体或四聚体。它
们还可以包含单链或多链多肽如抗体或胰岛素并且可以结合或连接。最常见
地，二硫键存在于多链多肽中。术语多肽也可以适用于其中一个或多个氨基
酸残基是相应的天然存在氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物。

术语“多肽变体”指其氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然
或参考序列相比，氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内部的某些位置处拥有
置换、缺失和/或插入。通常，变体将与天然或参考序列拥有至少约50％同一
性(同源性)，并且优选地，它们将与天然或参考序列至少约80％，更优选地
至少约90％相同(同源)。

在一些实施方案中提供“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”
是含有一个或多个模拟激活型序列的氨基酸的物质。例如，谷氨酸盐可以充
当磷酰-苏氨酸和/或磷酰-丝氨酸的模拟物。备选地，变体模拟物可以导致失
活或产生含有该模拟物的失活产物，例如，苯丙氨酸可以充当酪氨酸的失活
置换；或丙氨酸可以充当丝氨酸的失活置换。

“同源性”在其用于氨基酸序列时定义为，在对齐序列并且根据需要引入
空位以实现最大同源性百分数后，候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序
列中残基相同的残基的百分数。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知
的。可以理解，同源性取决于同一性百分数的计算，但是可以因计算中引入
的空位和罚分而在数值上不同。

“同源物”在其用于多肽序列时意指其他物种的相应序列与第二物种的第
二序列具有实质同一性。

“类似物”意在包含因一个或多个氨基酸改变(例如，置换、添加或缺失氨
基酸残基)而不同、但仍然维持一种或多种亲本或起始多肽特性的多肽变体。

本发明涵盖了几个类型基于多肽(包括变体和衍生物)的组合物。这些组
合物包含置换、插入、缺失和共价变体和衍生物。术语“衍生物”按照与术语“变
体”同义的方式使用，但是通常指已经相对参考分子或开始分子以任何方式修
饰和/或改变的分子。

因而，本发明的范围内包括编码相对于参考序列含有置换、插入和/或添
加、缺失和共价修饰的多肽、尤其本文公开的多肽序列的mmRNA。例如，
可以添加序列标签或氨基酸，如一个或多个赖氨酸至本发明的肽序列(例如，
在N末端或C末端添加)。序列标签可以用于肽纯化或定位。赖氨酸可以用
来增加肽溶解度或以允许生物素酰化。备选地，可以任选缺失位于肽或蛋白
质的氨基酸序列的羧基端和氨基端区域的氨基酸残基，从而提供截短的序列。
根据序列的用途(例如，表达该序列作为可溶解或与固相支持物连接的更大序
列的组成部分)，可以备选地缺失某些氨基酸(例如，C末端或N端残基)。

当提到多肽时，“置换变体”是具有在天然或起始序列中移除至少一个氨
基酸残基并且在相同位置处原位插入不同氨基酸的那些变体。置换可以是单
个的，其中已经置换分子中的仅一个氨基酸，或它们可以是多个的，其中已
经在相同分子中置换两个或更多个氨基酸。

如本文所用，术语“保守性氨基酸置换”指将序列中正常存的氨基酸置换
为具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸。保守性置换的例子包括将非极
性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸置换成另一个非极性残基。同
样地，保守性置换的例子包括将一个极性(亲水)残基置换成另一者，如精氨
酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间以及甘氨酸和丝氨酸之间置换。
另外，将碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换成另一者，或将一个酸性
残基如天冬氨酸或谷氨酸置换成另一个酸性残基是保守性置换的额外例子。
非保守性置换的例子包括将非极性(疏水性)氨基酸残基如异亮氨酸、缬氨酸、
亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸置换成极性(亲水性)残基如半胱氨酸、谷氨酰胺、
谷氨酸或赖氨酸和/或将极性残基置换成非极性残基。

当指多肽时，“插入性变体”是紧邻天然或起始序列中特定位置处某个氨
基酸插入一个或多个氨基酸的那些。“紧邻”氨基酸意指与该氨基酸的α-羧基
或α-氨基官能团连接。

当指多肽时，“缺失变体”是移除天然或起始氨基酸序列中一个或多个氨
基酸的那些。通常，缺失变体将缺失在分子特定区域中的一个或多个氨基酸。

当指多肽时，“共价衍生物”包括用有机的蛋白质性或非蛋白质性衍化剂
修饰天然或起始蛋白质，和/或翻译后修饰。通常，通过使蛋白质的靶向氨基
酸残基与能够与选择的侧链或末端残基反应的有机衍化剂反应，或通过利用
在选择的重组宿主细胞中发挥功能的翻译后修饰机制，引入共价修饰。所得
到的共价衍生物可用于以下程序中，所述程序旨在鉴定对生物活性、对免疫
测定或对制备用于免疫亲和纯化重组糖蛋白的抗蛋白质抗体重要的残基。这
类修饰处于本领域技术人员能力范围内并且在无需过多实验的情况下进行。

某些翻译后修饰是重组宿主细胞在已表达多肽上作用的结果。谷氨酰胺
酰和天冬酰胺酰残基经常翻译后脱酰胺成相应的谷氨酰残基和天冬氨酰残
基。备选地，这些残基在微酸性条件下脱酰胺。这些残基的任一种形式均可
以存在于根据本发明产生的多肽中。

其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酰残基或苏氨酰残基
的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.
Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,
SanFrancisco,第79-86页(1983))。

当指多肽时，“特征”定义为分子的基于氨基酸序列的独特组分。由本发
明mmRNA编码的多肽的特征包括表面表现(surfacemanifestation)、局部构
象形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任意组合。

如本文所用，当指多肽时，术语“表面表现”指出现在最外表面上的蛋白
质的基于多肽的组分。

如本文所用，当指多肽时，术语“局部构象形状”意指位于蛋白质的可限
定空间内部的该蛋白质的基于多肽的结构性表现。

如本文所用，当指多肽时，术语“折叠”指氨基酸序列在能量最小化时所
得到的构象。折叠可以在折叠过程的二级或三级水平出现。二级水平折叠的
例子包含β折叠和α螺旋。三级折叠的例子包括因能学力的聚集或分离所形
成的结构域和区域。以这种方式形成的区域包括疏水袋和亲水袋等。

如本文所用，术语“转角”在涉及蛋白质构象时意指改变肽或多肽主链方
向并且可以涉及一个、两个、三个或更多个氨基酸残基的弯曲。

如本文所用，当指多肽时，术语“环”指多肽的结构性特征，所述特征可
以起到逆转肽或多肽主链方向的作用。在环存在于多肽中并仅改变主链方向
的情况下，它可以包含4个或更多个氨基酸残基。Oliva等人已经鉴定到至少
5类蛋白质环(J.MolBiol266(4):814-830；1997)。环可以是开放或封闭的。闭
环或“环状”环可以在桥接部分之间包含2、3、4、5，6、7、8、9、10个或更
多个氨基酸。这类桥接部分可以包含在具有二硫键的多肽中常见的半胱氨酸-
半胱氨酸桥(Cys-Cys)，或备选地桥接部分可以不基于蛋白质，如本文所用的
双溴酰基(dibromozylyl)剂。

如本文所用，当指多肽时，术语“半环”指已鉴定环的一部分，所述部分
具有衍生所述部分的环的至少一半数目的氨基酸残基。可以理解，环可以并
不总是含有均等数目的氨基酸残基。因此，在其中环含有或经鉴定包含奇数
个氨基酸的那些情况下，奇数号的环的半环将包含该环的整数部分或下一个
整数部分(环的氨基酸数目/2+/-0.5个氨基酸)。例如，经鉴定为7氨基酸环的
环可能产生3氨基酸或4氨基酸的半环(7/2＝3.5+/-0.5是3或4)。

如本文所用，当指多肽时，术语“结构域”指多肽的基序，所述基序具有
一个或多个可鉴定的结构性或功能性特征或特性(例如，结合能力、充当蛋白
质-蛋白质相互作用位点)。

如本文所用，当指多肽时，术语“半结构域”指已鉴定结构域的一部分，
所述部分具有衍生所述部分的结构域的至少一半数目的氨基酸残基。可以理
解，结构域可以并不总是含有均等数目的氨基酸残基。因此，在其中结构域
含有或经鉴定包含奇数个氨基酸的那些情况下，奇数号的结构域的半结构域
将包含该结构域的整数部分或下一个整数部分(结构域的氨基酸数目/2+/-0.5
个氨基酸)。例如，经鉴定为7氨基酸结构域的结构域可能产生3氨基酸或4
氨基酸的半结构域(7/2＝3.5+/-0.5是3或4)。还应当理解，可以在结构域或半
结构域内部鉴定出亚结构域，这些亚结构域拥有的结构性或功能特性小于在
衍生这些亚结构域的结构域或半结构中鉴定的全部结构性或功能特性。还应
当理解，包含本文中任何结构域类型的氨基酸不需要沿多肽主链为连续(即，
非相邻的氨基酸可以在结构上折叠以产生结构域、半结构域或亚结构域)。

如本文所用，当指多肽时，术语“位点”在它涉及基于氨基酸的实施方案
时按照与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义的方式使用。位点表示肽或多肽
内部的某个位置，其中可以在基于多肽的本发明分子内部修饰、操作、改变、
衍生化或变动所述位置。

如本文所用，当指多肽时，术语“末端”指肽或多肽的端点。这种端点不
仅限于肽或多肽的第一位点或最终位点，还可以包括在末端区的额外的氨基
酸。基于多肽的本发明分子可以表征为同时具有N末端(以具有游离氨基(NH₂)
的氨基酸终止)和C末端(以具有游离羧基(COOH)的氨基酸终止)。本发明的
蛋白质在一些情况下由通过二硫键或通过非共价力汇聚的多条多肽链组成
(多聚体、寡聚体)。这些类别的蛋白质将具有多个N末端和C末端。备选地，
多肽的末端可以如此修饰，从而它们始于或终于基于非多肽的部分如有机缀
合物，视具体情况而定。

一旦任何所述特征已经鉴定或定义为由本发明初级构建体或mmRNA编
码的多肽的所需组分，则可以通过移除、交换、倒置、缺失、随机化或重复
对这些特征进行任意的数种操作和/或修饰。另外，可以理解，对特征的操作
可以导致与修饰本发明分子相同的结果。例如，涉及缺失结构域的操作将导
致分子长度改变，正如同对核酸修饰以编码小于全长的分子。

修饰和操作可以通过本领域已知的方法如，但不限于，位点定向诱变完
成。随后可以使用体外或体内测定法，如本文所述的那些或本领域已知的任
何其他合适筛选分析法，对所得到的修饰分子测试活性。

根据本发明，多肽可以包含通过多轮实验发现的共有序列。如本文所用，
“共有序列”是单个序列，其代表了允许在一个或多个位点处的可变性的序列
的集合。

如本领域技术人员认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源
蛋白也视为处于本发明目的多肽的范围内。例如，本文提供了参比蛋白的10、
20、30、40、50、60、70、80、90、100个或超过100个氨基酸长度的任何
蛋白质片段(意指比参考多肽序列短至少一个氨基酸残基，但是其他相同的多
肽序列)。在另一个例子中，可以根据本发明使用任何蛋白质，所述蛋白质包
括一段与本文所述的任何序列约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、
约90％、约95％或约100％相同的约20个、约30个、约40个、约50个或
约100个氨基酸。在某些实施方案中，如本文中提供或提到的任何序列中所
示，本发明要使用的多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变。

编码的多肽

本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以设计成编码目的多肽，
如肽和蛋白质。

在一个实施方案中，初级构建体或mmRNA可以编码与参考多肽序列具
有某种同一性的变体多肽。如本文所用，“参考多肽序列”指起始多肽序列。
参考序列可以是野生型序列或在设计另一个序列时所参照的任何序列。“参考
多肽序列”可以是编码LDLR和/或CYP7a1或其变体的任何序列。

如本领域已知，术语“同一性”指如通过比较这些序列所确定的两个或更
多个肽的序列之间的关系。在本领域，同一性还意指肽之间的序列相关性程
度，如通过两个或更多个氨基酸残基链之间的匹配数目所确定。同一性测量
在两个或更多个序列的更小者之间相同匹配的百分数，其空位比对(如果有任
何空位的话)由特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决。可以通过已知
的方法容易地计算相关肽的同一性。这类方法包括但不限于以下文献中描述
的那些：ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.编著,OxfordUniversity
Press,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,
D.W.编著,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequence
Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,HumanaPress,NewJersey,
1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,
1987；SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,MStockton
Press,NewYork,1991及Carillo等人,SIAMJ.AppliedMath.48,1073(1988)。

在一些实施方案中，多肽变体可以具有与参考多肽相同或相似的活性。
备选地，变体可以相对于参考多肽具有改变的活性(例如，增加或减少的活
性)。通常，本发明的特定多核苷酸或多肽的变体将与这种特定参考多核苷酸
或多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于
100％序列同一性，如通过本文所述的和本领域技术人员已知的序列比对程序
和参数所测定。这类用于比对的工具包括BLAST软件包的那些(StephenF.
Altschul,ThomasL.Madden,AlejandroA.JinghuiZhang,Zheng
Zhang,WebbMiller和DavidJ.Lipman(1997),"GappedBLASTand
PSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms",Nucleic
AcidsRes.25:3389-3402)。本文中描述了其他工具，尤其在“同一性”的定义下。

BLAST算法中的默认参数包括例如期望阈值：10；字长：28；匹配/错
配评分：1、-2；空位成本：线性。可以应用任何过滤程序以及针对物种特异
性重复序列(例如，智人(Homosapiens))的选择。

肽

本文公开的初级构建体或mmRNA可以编码一个或多个经验证或“正在
检验”的蛋白质或肽。

根据本发明，一种或多种目前正在销售或处于开发的蛋白质或肽可以由
本发明的多核苷酸、初级构建体或肿瘤学相关mmRNA编码。在不希望受理
论约束的同时，认为向本发明的初级构建体或mmRNA的引入将导致改善的
治疗功效，这至少部分地归因于构建体设计的特异性、纯度和选择性。

多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以改变生物学和/或生理学过程
和/或化合物，如，但不限于改变(例如，延缓)疾病和/或病症进展，减少胆固
醇和/或低密度脂蛋白(LDL)胆固醇，改善Crigler-Najjar综合征，恢复肝杀菌
肽(hepcidin)和/或血色素沉着症2型功能以调节铁摄取,恢复胆汁酸代谢,减少
家族性高胆固醇血症的冠状动脉心脏病风险，和阻止过度角化斑块和角膜浑
浊，这可以治愈手和/或足上的过度角化斑块。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以用来在细
胞或组织中表达多肽，目的在于替换由缺失或突变基因产生的蛋白质。

进一步，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用来治疗与罕
见肝脏病和/或病症相关的代谢紊乱。

侧翼区：非翻译区域(UTR)

基因的非翻译区域(UTR)转录但是不翻译。5’UTR始于转录起点位点并
延续至起始密码子，但是不包括起始密码子；而3’UTR紧邻终止密码子后开
始并延续直至转录终止信号。关于UTR在核酸分子稳定性和翻译的方面发挥
的调节作用，存在日益增长的大量证据。UTR的调节特征可以引入到本发明
的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA中以增强分子的稳定性。也可以并入
特定特征以确保在转录物被错误引入不期望的器官部位时受控地下调该转录
物。

5’UTR和翻译起始

天然5’UTR具有在翻译起始中发挥作用的特征。它们携带标识如Kozak
序列，其中公知所述标识参与核糖体启动许多基因的翻译的过程中。Kozak
序列具有共有的CCR(A/G)CCAUGG，其中R是距起始密码子(AUG)上游三
个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，起始密码子后接另一个“G”。还已经已知
5’UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。

通过工程化在特定靶器官的大量表达的基因中常存在的特征，可以增强
本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的稳定性和蛋白质产生。例如，
引入肝脏表达的mRNA(如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转
铁蛋白、α胎蛋白、促红细胞生成素或因子VII)的5’UTR可以用来增强核酸
分子如mmRNA在肝细胞系或肝中的表达。同样地，可能使用来自其他组织
特异性mRNA的5’UTR以改善在这种组织中的表达，这对于肌肉(MyoD、
肌球蛋白、肌红蛋白、肌形成蛋白、力蛋白)，对于内皮细胞(Tie-1、CD36)，
对于髓样细胞(C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)，
对于白细胞(CD45、CD18)，对于脂肪组织(CD36、GLUT4、ACRP30、脂连
蛋白)并且对于肺上皮细胞(SP-A/B/C/D)都是可能的。

可以将其他非UTR序列并入5’(或3’UTR)UTR中。例如，可以将内含
子或部分内含子序列并入本发明多核苷酸、初级构建体或mmRNA的侧翼区。
并入内含子序列可以增加蛋白质产生以及mRNA水平。

可以选择用于本发明中的5’UTR可以是结构化的UTR如，但不限于，
控制翻译的5’UTR。作为一个非限制性例子，当使用以下文献中描述的任何
末端修饰时，结构化5’UTR可能是有益的：2013年1月31日的名为“利用
RNA构建体差异性靶向”提交的待决美国临时申请号61/758,921；2013年3
月14日的名为“利用RNA构建体差异性靶向”提交的美国临时申请号
61/781,139；2012年11月26日提交的名为“末端优化的RNA”的美国临时申
请号61/729,933；2012年12月14日提交的名为“末端优化的RNA”的美国临
时申请号61/737224和2012年5月31日提交的名为“末端优化的RNA”的美
国临时申请号61/829359；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

3’UTR和AU丰富元件

3’UTR已知具有嵌入其中的多段腺苷和尿苷。这些AU丰富特征标识在
高翻转率的基因中特别占优势。基于它们的序列特征和功能特性，AU丰富
元件(ARE)可以划分成三个类别(Chen等人,1995)：I类ARE在U丰富区内
含有几种分散的AUUUA基序拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类
ARE拥有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚物。含有这种类型
ARE的分子包括GM-CSF和TNF-α。III类ARE的界定较不充分。这些U
丰富区不含有AUUUA基序。c-Jun和肌形成蛋白是这个类别中两个充分研
究的例子。大部分与ARE结合的蛋白质已知使信使去稳定化，而已经记录
ELAV家族的成员，最值得注意地是HuR，增加mRNA的稳定性。HuR与全
部三个类别的ARE结合。HuR特异性结合位点工程化至核酸分子的3’UTR
中将导致与HuR结合，并且因此导致体内信使的稳定化。

引入、移除或修饰3’UTRAU丰富元件(ARE)可以用来调节本发明多核
苷酸、初级构建体或mmRNA的稳定性。当工程化特定多核苷酸、初级构建
体或mmRNA时，可以引入一个或多个拷贝的ARE以使得本发明的多核苷
酸、初级构建体或mmRNA较不稳定并因而阻止翻译并减少所得蛋白质的产
生。同样地，可以鉴定并移除或突变ARE以增加胞内稳定性并且因此增加翻
译和所得蛋白质的产生。转染实验可以在相关细胞系中使用本发明的多核苷
酸、初级构建体或mmRNA实施，并且可以在转染后的多个时间点测定蛋白
质产生。例如，细胞可以用不同的ARE-工程化分子并且通过使用针对相关
蛋白质的ELISA试剂盒和分析转染后6小时、12小时、24小时、48小时和
7日产生的蛋白质来转染。

并入微RNA结合位点

微RNA(或miRNA)是19-25核苷酸长的非编码性RNA，所述非编码性
RNA与核酸分子的3’UTR结合并通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译
下调基因表达。本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以包含一个或
多个微RNA靶序列、微RNA序列、微RNA结合位点或微RNA种子。这类
序列可以对应于任何已知的微RNA，如美国公开US2005/0261218和美国公
开US2005/0059005文献中教授的那些，或在2013年1月31日提交(代理人
案号2030.1039)的待决申请USSN61/758,921的表7中列出的那些，所述文献
的内容通过引用的方式完整并入本文。

微RNA序列包含“种子”区，即，在成熟微RNA的位置2-8的区域中的
序列，所述序列与miRNA靶序列具有完美的Watson-Crick互补性。微RNA
种子区可以包含成熟微RNA的位置2-8或位置2-7。在一些实施方案中，微
RNA种子区可以包含7个核苷酸(例如，成熟微RNA的核苷酸2-8)，其中，
相应miRNA靶中的种子区互补位点旁侧分布有与微RNA位置1相对的腺嘌
呤(A)。在一些实施方案中，微RNA种子区可以包含6个核苷酸(例如，成熟
微RNA的核苷酸2-7)，其中，相应miRNA靶中的种子区互补位点旁侧分布
有与微RNA位置1相对的腺嘌呤(A)。参见例如，GrimsonA,FarhKK,Johnston
WK,Garrett-EngeleP,LimLP,BartelDP；MolCell.2007Jul6；27(1):91-105。微
RNA种子区的碱基与靶序列具有完全互补性。通过工程化微RNA靶序列至
本发明多核苷酸、初级构建体或mmRNA的3’UTR中，可以靶向分子降解或
减少翻译，前提是所讨论的微RNA是可获得的。这个过程将减少递送核酸
分子时脱靶效应的危害。已经报道了微RNA的鉴定、微RNA靶区和它们在
生物学中的表达模式和作用(Bonauer等人,CurrDrugTargets2010
11:943-949；Anand和ChereshCurrOpinHematol201118:171-176；Contreras
和RaoLeukemia201226:404-413(2011Dec20.doi:10.1038/leu.2011.356)；
BartelCell2009136:215-233；Landgraf等人,Cell,2007129:1401-1414)。

例如，如果核酸分子是mRNA并且不意在递送至肝，而是在那里终结，
则如果将miR-122(一种在肝脏中丰富的微RNA)的一个或多个靶位点工程化
至多核苷酸、初级构建体或mmRNA的3’UTR中，那么miR-122可以抑制
目的基因表达。可以工程化用于不同微RNA的一个或多个结合位点以进一
步减少多核苷酸、初级构建体或mmRNA的寿命、稳定性和蛋白质翻译。

如本文所用，术语“微RNA位点”指微RNA靶位点或微RNA识别位点，
或与微RNA结合或缔合的任何核苷酸序列。应当理解“结合”可以遵循传统的
Watson-Crick杂交规则或可以反映微RNA与靶序列在微RNA位点处或其附
近的任何稳定缔合。

相反，为了本发明多核苷酸、初级构建体或mmRNA的目的，可以将微
RNA结合位点从它们天然在其中存在的序列中工程化出去(即移除)以增加特
定组织中的蛋白质表达。例如，可以移除miR-122结合位点以改善肝脏中的
蛋白质表达。可以通过引入或移除一个或几个微RNA结合位点实现调节多
个组织中的表达。

已知微RNA在其中已知调节mRNA并因而调节蛋白质表达的组织的例
子包括但不限于肝(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细
胞(miR-17-92、miR-126)、髓样细胞(miR-142-3p、miR-142-5p、miR-16、miR-21、
miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、
肾(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
微RNA还可以调节复杂的生物学过程如血管生成(miR-132)(Anand和
ChereshCurrOpinHematol201118:171-176)。在本发明的多核苷酸、初级构
建体或mmRNA中，可以移除或引入参与这类过程的微RNA的结合位点，
以便相对于生物相关细胞类型或相对于有关生物学过程的背景下调节多核苷
酸、初级构建体或mmRNA的表达。

最后，通过理解微RNA在不同细胞类型中的表达模式，可以工程化多
核苷酸、初级构建体或mmRNA，用于特定细胞类型中或仅在特定生物学条
件下更有目的的表达。通过引入组织特异性微RNA结合位点，可以设计多
核苷酸、初级构建体或mmRNA，使其最适于某组织中或某生物学条件背景
下的蛋白质表达。

转染实验可以在相关细胞系中使用工程化多核苷酸、初级构建体或
mmRNA实施，并且可以在转染后的多个时间点测定蛋白质产生。例如，细
胞可以用不同微RNA结合位点工程化的多核苷酸、初级构建体或mmRNA
并且通过使用针对相关蛋白质的ELISA试剂盒和分析转染后6小时、12小
时、24小时、48小时、72小时和7日产生的蛋白质来转染。也可以使用微
RNA结合位点工程化的分子实施体内实验，以检验所制备的多核苷酸、初级
构建体或mmRNA的组织特异性表达的变化。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以包含至少
一个miR序列或其变体。用于多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA中的miR
序列的非穷尽列表在待决国际专利申请号PCT/US13/62531(M037.20)的表9
中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以包含至少
一个结合并抑制HMG-CoA还原酶或PCSK9的非翻译区的miR序列。结合
并抑制HMG-CoA还原酶或PCSK9的非翻译区的miR序列的非限制性例子
在国际专利公开号WO2013154766中描述，所述文献的内容通过引用的方式
完整并入本文。作为一个非限制性例子，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA
可以包含含有miR-520d-5p、miR-224或其变体的miR序列(参见例如，国际
专利公开号WO2013154766，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本
文)。作为另一个非限制性例子，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以
包含含有或编码国际专利公开号WO2013154766的SEQIDNO:1、SEQID
NO:2、SEQIDNO:10和/或SEQIDNO:11的miR序列，所述文献的内容
通过引用的方式完整并入本文。作为又一个非限制性例子，多核苷酸、初级
构建体和/或mmRNA可以包含含有miR-224或其变体的miR序列(参见例如，
国际专利公开号WO2013154766，所述文献的内容通过引用的方式完整并入
本文)。作为另一个非限制性例子，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可
以包含含有miR-520d-5p和miR-224或其变体的miR序列(参见例如，国际专
利公开号WO2013154766，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。

5’加帽

mRNA的5’帽结构参与核输出，增加mRNA稳定性并结合mRNA帽结
合蛋白(CBP)，其通过CBP与多聚腺苷酸结合蛋白缔合以形成成熟环状
mRNA物质，从而负责细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。该帽进一步在
mRNA剪接期间帮助移除5’近端内含子。

内源mRNA分子可以是5’-端加帽，从而在mRNA分子的末端鸟苷帽残
基和5’-末端转录的有义核苷酸之间产生5’-ppp-5’-三磷酸键。这种5’-鸟苷酰
帽随后可以甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酰残基。mRNA5’末端的末端核苷酸
和/或反末端转录的核苷酸的核糖可以还任选地2’-O-甲基化。通过水解和切
割鸟苷酰帽结构所致的5’-脱帽作用可以指引核酸分子(如mRNA分子)降解。

修饰本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以产生不可水解的帽
结构，这阻止脱帽并且因此增加mRNA半寿期。因为帽结构水解需要切割
5’-ppp-5’磷酸二酯键，所以可以在加帽反应期间使用修饰的核苷酸。例如，
根据制造商的说明书，来自NewEnglandBiolabs(Ipswich，MA)的痘苗病毒
加帽酶可以随α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5’-ppp-5’帽中产生硫代磷
酸酯键。可以使用额外的修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-磷酸酯和硒-磷酸酯
核苷酸。

额外的修饰包括但不限于，在糖环的2’-羟基上(如上文提到的)mRNA的
5’-末端和/或5’-反末端核苷酸的核糖的2’-O-甲基化。多个不同5’-帽结构可
以用来产生核酸分子(如mRNA分子)的5’-帽。

帽类似物，本文中也称作合成的帽类似物，化学帽、化学帽类似物或结
构性或功能性帽类似物，与天然(即内源、野生型或生理学)5’-帽在化学结构
上不同，但保留帽功能。可以将帽类似物化学(即非酶促)或酶促地合成和/与
核酸分子连接。

例如，抗反转帽类似物(Anti-ReverseCapAnalog，ARCA)帽含有由5’-5’-
三磷酸基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3’-O-甲基
(即，N7,3’-O-二甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷(m⁷G-3’mppp-G；其可以等同地
命名为3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)。另一个未修饰的鸟嘌呤的3’-O原子与加
帽核酸分子(例如mRNA或mmRNA)的5’-末端核苷酸连接。N7-和3’-O-甲基
化的鸟嘌呤提供加帽核酸分子(例如mRNA或mmRNA)的末端部分。

另一个示例性帽是mCAP，其类似于ARCA，但是在鸟苷上具有2’-O-
甲基(即，N7,2’-O-二甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷，m⁷Gm-ppp-G)。

尽管帽类似物允许在体外转录反应中对核酸分子同步加帽，但是至多
20％的转录物保持未加帽。帽类似物与细胞内源转录装置产生的核酸的内源
5’-帽结构的这种差异以及结构性差异可导致减低的翻译能力和降低的细胞
稳定性。

本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA也可以在转录后使用酶加帽，
以产生更真实的5’-帽结构。如本文所用，短语“更真实”指在结构上或功能上
严格反映或模拟内源或野生型特征的特征。即，与现有技术的合成性特征或
类似物等相比，“更真实的”特征更好地代表内源、野生型、天然或生理学细
胞功能和/或结构，或在一个或多个方面优于相应内源、野生型，天然或生理
特征。更真实的本发明5’帽结构的非限制性例子是与本领域已知的合性5’帽
结构(或与野生型，天然或生理学5’帽结构)相比，帽结合蛋白结合作用增强、
半寿期增加、5’核酸内切酶敏感性降低和/或5’脱帽减少的那些，这仅为其中
之一。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2’-O-甲基转移酶酶可以在mRNA
的5’-末端核苷酸和鸟嘌呤帽核苷酸之间产生规范的5-5’-三磷酸键，其中帽
鸟嘌呤含有N7甲基化并且mRNA的5’-末端核苷酸含有2’-O-甲基。这种结
构称为帽1结构。例如与领域已知的其他5’帽类似结构相比，这种帽导致更
高的翻译能力和细胞稳定性以及减少的细胞促炎性细胞因子活化作用。帽结
构包括7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(帽0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(帽1)和
7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp(帽2)。

因为多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以转录后加帽，并且因为这个
过程更高效，所以几乎100％的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以加帽。
这与帽类似物在体外转录反应过程中连接至mRNA时大约80％相反。

根据本发明，5’末端帽可以包括内源帽或帽类似物。根据本发明，5’末
端帽可以包含鸟嘌呤类似物。可用的鸟嘌呤类似物包括肌苷、N1-甲基-鸟苷、
2’氟-鸟苷、7-去氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮
基-鸟苷。

病毒序列

额外的病毒序列如，但不限于，大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)翻译增强序
列，可以工程化并插入本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的3’UTR
中，并且可以刺激构建体体外和体内翻译。转染实验可以在相关细胞系中实
施，并且可以在转染后12小时、24小时、48小时、72小时和7日通过ELISA
分析蛋白质产生。

IRES序列

进一步，提供可以含有内部核糖体进入位点(IRES)的多核苷酸、初级构
建体或mmRNA。最初鉴定为picorna病毒RNA的特征，IRES在不存在5’
帽结构情况下启动蛋白质合成中发挥重要作用。IRES可以充当全核糖体结合
位点，或可以充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个有功能
的核糖体结合位点的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以编码由核糖体独
立翻译的几种肽或多肽(“多顺反子核酸分子”)。向多核苷酸、初级构建体或
mmRNA提供IRES时，进一步任选地提供第二可翻译区域。可以根据本发
明使用的IRES序列的例子包括而不限于来自picorna病毒(例如FMDV)、害
虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒
(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、
猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒((CrPV)的那些。

聚腺苷酸尾

在RNA加工期间，腺嘌呤核苷酸长链(聚腺苷酸尾)可以添加至多核苷酸
如mRNA分子，以增加稳定性。紧跟转录后，转录物3’末端可以被切割以释
放3’羟基。随后聚腺苷酸聚合酶向RNA添加腺嘌呤核苷酸链。称作多聚腺
苷化的过程添加长度可以在100和250个残基之间的聚腺苷酸尾。

已经发现独特聚腺苷酸尾长度向本发明的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA提供了某些优点。

通常，本发明的聚腺苷酸尾的长度是大于30个核苷酸长度。在另一个实
施方案中，聚腺苷酸尾具有大于35个核苷酸长度(例如，至少或大于约35、
40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、
300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、
1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。
在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA包括约30个至约3,000
个核苷酸(例如，30至50、30至100、30至250、30至500、30至750、30
至1,000、30至1,500、30至2,000、30至2,500、50至100、50至250、50
至500、50至750、50至1,000、50至1,500、50至2,000、50至2,500、50
至3,000、100至500、100至750、100至1,000、100至1,500、100至2,000、
100至2,500、100至3,000、500至750、500至1,000、500至1,500、500至
2,000、500至2,500、500至3,000、1,000至1,500、1,000至2,000、1,000至
2,500、1,000至3,000、1,500至2,000、1,500至2,500、1,500至3,000、2,000
至3,000、2,000至2,500和2,500至3,000个核苷酸)。

在一个实施方案中，相对于总体多核苷酸、初级构建体或mmRNA的长
度，设计聚腺苷酸尾。这种设计可以基于编码区长度、特定特征或区域(如第
一或侧翼区)的长度或基于从多核苷酸、初级构建体或mmRNA表达的最终产
物的长度。

在这种情况下，聚腺苷酸尾可以在长度上比多核苷酸、初级构建体或
mmRNA或其特征长10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％
或100％。也可以设计聚腺苷酸尾作为其所属的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA的一部分。在这种情况下，聚腺苷酸尾可以比构建体总长度或构建
体减去聚腺苷酸尾的总长度大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、
80％或90％或更多。进一步，工程化的结合位点和缀合用于聚腺苷酸结合蛋
白的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以增强表达。

此外，可以使用在聚腺苷酸尾的3’末端处修饰的核苷酸，将多个不同多
核苷酸、初级构建体或mmRNA通过3’-端与PABP(聚腺苷酸结合蛋白)连接
在一起。转染实验可以在相关细胞系中实施，并且可以在转染后12小时、24
小时、48小时、72小时和7日通过ELISA分析蛋白质产生。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸初级构建体被设计成包含聚A-G
四重体。G-四重体是一种氢键结合的四个鸟嘌呤核苷酸环状阵列，其可以在
DNA和RNA中由富G序列形成。在这个实施方案中，G-四重体在聚腺苷酸
尾末端并入。在各个时间点，分析所得到的mmRNA构建体的稳定性、蛋白
质产生和其他参数，包括半寿期。已经发现，聚A-G四重体导致的蛋白质产
生等同于仅使用120个核苷酸的聚腺苷酸尾时所见的蛋白质产生的至少
75％。

定量

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以在
来自一种或多种体液的外切体中定量。如本文所用，“体液”包含外周血、血
清、血浆、腹水、尿、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、眼房水、羊水、
耵聍、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper’sfluid)
或预射精液、汗、粪尿、毛发、泪、囊肿液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴
液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、
粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽吸物、囊胚腔
液和脐带血。备选地，外切体可以从选自肺、心脏、胰、胃、肠、膀胱、肾、
卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳腺、前列腺、脑、食道、肝和胎盘的器官提取。

在量化方法中，从受试者获得不多于2mL样品并且通过大小排阻层析、
密度梯度离心、差异性离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲和纯化、微流
体分离或其组合分离外切体。在分析中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA
的水平或浓度可以是所施用构建体的表达水平、存在、不存在、截短或改变。
有利的是，将该水平与一个或多个临床表型或与人类疾病生物标记物的测定
法关联。可以使用构建体特异性探针、细胞测量术、qRT-PCR，实时PCR、
PCR、流式细胞术、电泳、质谱法或其组合进行该测定法，同时可以使用免
疫组织化学方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法分离外切体。也可以通过大
小排阻层析、密度梯度离心、差异性离心、纳米膜超滤、免疫吸附捕获、亲
和纯化、微流体分离或其组合分离外切体。

这些方法向研究者提供实时监测剩余或已递送的多核苷酸、初级构建体
或mmRNA的水平的能力。因为本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA
因结构性或化学性修饰而与内源形成不同，所以这是可能的。

II.mmRNA的设计和合成

根据本发明使用的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以根据任何可获
得的技术制备，所述技术包括但不限于化学合成、通常称作体外转录(IVT)
的酶促合成或酶促或化学切割较长前体等。合成RNA的方法是本领域已知
的(参见，例如，Gait,M.J.(编著)Oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach,
Oxford[Oxfordshire],Washington,DC:IRLPress,1984；和Herdewijn,P.(编著)
Oligonucleotidesynthesis:methodsandapplications,MethodsinMolecular
Biology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:HumanaPress,2005；二者均通过引
用方式并入本文)。

设计和合成本发明初级构建体的过程通常包括步骤：基因构建、产生
mRNA(具有或没有修饰)和纯化。在酶促合成方法中，首选选择编码目的多
肽的靶多核苷酸序列以并入载体中，其中将扩增所述载体以产生cDNA模板。
任选地，靶多核苷酸序列和/或任何侧翼序列可以是经密码子优化。cDNA模
板随后用来通过体外转录(IVT)产生mRNA。在产生后，mRNA可以经过纯
化和净化过程。下文更详细地提供其步骤。

基因构建

基因构建步骤可以包括但不限于基因合成、载体扩增、质粒纯化、质粒
线性化和净化以及cDNA模板合成和净化。

基因合成

一旦选出用于生产的目的多肽或靶，则设计初级构建体。在初级构建体
内部，可以使用所选择的核酸(DNA或RNA)转录物的可读框(ORF)，构建编
码目的多肽的连接核苷的第一区域。该ORF可以包含野生型ORF、其同工
型、变体或片段。如本文所用，“可读框”或“ORF”意指能够编码目的多肽的
核酸序列(DNA或RNA)。ORF经常始于起始密码子ATG并终于无义或终止
密码子或信号。

进一步，第一区域的核苷酸序列可以经密码子优化。密码子优化方法是
本领域已知的并且可以用于实现几种目的中的一个或多个目的。这些目的包
括匹配靶和宿主生物中的密码子频率以确保正确折叠、偏置GC含量以增加
mRNA稳定性或减少二级结构、最大程度减少可能破坏基因构建或表达的串
联重复序列密码子或碱基列、定制转录性和翻译性控制区、插入或移除蛋白
质转运序列、在编码的蛋白质中移除/添加翻译后修饰位点(例如糖基化位点)、
添加、移除或改组蛋白质结构域、插入或删除限制性位点、修饰核糖体结合
位点和mRNA降解位点，调节翻译速率以允许蛋白质的各种结构域正确折
叠，或者减少或消除mRNA内部带来问题的二级结构。密码子优化工具、算
法和服务是本领域已知的，其非限制性例子包括来自GeneArt(Life
Technologies)和/或DNA2.0(MenloParkCA)的服务。在一个实施方案中，使
用优化算法优化ORF序列。表1中给出每种氨基酸的密码子选择。

表1.密码子选择

在一个实施方案中，修饰的mRNA核苷酸序列的至少一部分可以通过本
领域已知和/或本文所述的方法进行密码子优化。在序列已经密码子优化后，
可以对它进一步评价含有限制性位点的区域。可以将限制性位点区域内部的
至少一个核苷酸替换为另一个核苷酸，以从序列移除该限制性位点，但是核
苷酸的替换的确改变了密码子经优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中视为有益的特征可以由初级构建体编码并且
可以作为第一或第二侧翼区在ORF旁侧分布。可以将侧翼区在ORF的优化
之前和/或之后并入初级构建体中。不要求初级构建体含有5’和3’两种侧翼
区。这类特征的例子包括但不限于非翻译区域(UTR)、Kozak序列、寡聚(dT)
序列和可检测标签并且可以包括多个可以具有XbaI识别的克隆位点。

在一些实施方案中，可以提供5’UTR和/或3’UTR作为侧翼区。多个5’
或3’UTR可以纳入侧翼区中并且可以具有相同或不同的序列。侧翼区的任何
部分(包含空无)可以经密码子优化，并且任一个部分可以在密码子优化之前
和/或在之后独立地含有一种或多种不同结构性或化学性修饰。特征组合可以
纳入第一和第二侧翼区中并且可以含于其他特征内部。例如，ORF可以旁侧
分布有可以含有强Kozak翻译起始信号的5’UTR和/或可以包括用于聚腺苷
酸尾的模板添加的寡聚(dT)序列的3’UTR。

2012年12月14日提交的待决美国临时专利申请号61/737,130的表2和
表3提供一系列可以在本发明初级构建体中作为侧翼区利用的示例性UTR。
可以利用5’或3’UTR的变体，其中向末端添加或移除一个或多个核苷酸，包
括A、T、C或G。

应当理解，所列出的这些是例子并且可以将源自任意基因的任意UTR
并入初级构建体的相应第一或第二侧翼区中。另外，可以利用任意已知基因
的多个野生型UTR。提供不是野生型基因的变体的人工UTR也处于本发明
的范围内。这些UTR或其部分可以按照与从中选出它们的转录物中相同的取
向安置或可以在取向或位置上改变。因此，5’或3’UTR可以是倒转、缩短、
加长、与一种或多种其他5’UTR或3’UTR嵌合。如本文所用，术语“改变”
在它指UTR序列时，意指UTR已经相对于参考序列以某种方式改变。例如，
3’或5’UTR可以通过如上文教授的取向或位置变化而相对于野生型或天然
UTR改变，或可以通过纳入额外的核苷酸、核苷酸缺失、核苷酸交换或转位
而改变。产生“改变的”UTR(是否3’或5’)的这些变化中任一变化均包含变体
UTR。

在一个实施方案中，可以使用双重、三重或四重UTR如5’或3’UTR。
如本文所用，“双重”UTR是其中两个拷贝的相同UTR以串联或基本上串联
方式编码的一种UTR。例如，双重β-珠蛋白3’UTR可以如美国专利公开
20100129877中所述那样使用，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本
文。

具有复写型UTR(patternedUTR)也处于本发明的范围内。如本文所用，
“复写型UTR”是反映重复或交替样式的那些UTR，如ABABAB或
AABBAABBAABB或ABCABCABC或其重复1次、2次或超过3次的变体。
在这些样式中，每个字母A、B或C代表一个在核苷酸水平不同的UTR。

在一个实施方案中，侧翼区选自其蛋白质具有共同功能、结构、性能特
征的转录物家族。例如，目的多肽可以属于在特定细胞、组织中或在发育期
间某个时间表达的蛋白家族。用来自这些基因之任一者的UTR可以交换相同
或不同蛋白家族的任何其他UTR，以产生新的嵌合的初级转录物。如本文所
用，“蛋白家族”以最广意义用来指两个或更多个目的多肽的群组，所述多肽
共有至少一种功能、结构、特征、定位、来源或表达模式。

在优化后(如果需要)，将初级构建体组分重构并转化入载体，如但不限
于质粒、病毒、粘粒和人工染色体。例如，优化的构建体可以重构并转化入
其中因本文所述的方法而存在高拷贝质粒样结构或染色体结构的化学感受态
大肠杆菌、酵母、脉孢菌(Neurospora)、玉米、果蝇等。

终止密码子

在一个实施方案中，本发明的初级构建体可以在3’非翻译区(UTR)之前
包含至少两个终止密码子。终止密码子可以选自TGA、TAA和TAG。在一
个实施方案中，本发明的初级构建体包括终止密码子TGA和一个额外的终
止密码子。在又一个实施方案中，额外的终止密码子可以是TAA。

在另一个实施方案中，本发明的初级构建体可以在3’非翻译区(UTR)之
前包含三个终止密码子。

载体扩增

随后扩增含有初级构建体的载体并使用本领域已知的方法分离和纯化质
粒，所述方法例如是但不限于使用InvitrogenPURELINK^TMHiPureMaxiprep
试剂盒(Carlsbad，CA)的大量制备法。

质粒线性化

质粒随后可以使用本领域已知的方法(如，但不限于使用限制性酶和缓冲
液)线性化。线性化反应物可以使用多种方法纯化，所述方法例如包括
Invitrogen’sPURELINK^TMPCRMicro试剂盒(Carlsbad，CA)，和基于HPLC
的纯化方法如，但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相
HPLC(RP-HPLC)，和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)和Invitrogen标准
PURELINK^TMPCR试剂盒(Carlsbad，CA)。纯化方法可以根据所实施的线性
化反应的规格调整。线性化质粒随后用来产生体外转录(IVT)反应用cDNA。

cDNA模板合成

可以通过使线性化质粒经历聚合酶链反应(PCR)，合成cDNA模板。2012
年12月14日提交的美国临时专利申请号61/737,130的表4提供一系列可以
在本发明PCR反应中使用的引物和探针。应当理解该清单并非穷尽并且用于
任何扩增的引物-探针设计均处于本领域那些技术人员的能力范围内。探针还
可以含有化学修饰的碱基以增加与靶分子的碱基配对精确度和碱基配对强
度。

在一个实施方案中，可以在进行转录之前提交cDNA用于测序分析。

mRNA产生

产生mRNA或mmRNA的方法可以包括，但不限于体外转录、cDNA模
板移除和RNA净化，以及mRNA加帽和/或加尾反应。

体外转录

可以使用体外转录(IVT)系统转录在先前步骤中产生的cDNA。该系统一
般包含转录缓冲液、核苷酸三磷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。NTP可
以内部制造，可以选自供应商或可以如本文所述合成。NTP可以选自，但是
不限于本文所述的那些，包括天然和非天然(修饰)的NTP。聚合酶可以选自
但不限于T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶和突变体聚合酶，如，但不限于
能够并入修饰核酸的聚合酶。

RNA聚合酶

任何数目的RNA聚合酶或变体可以用于设计本发明的初级构建体。

可以通过插入或缺失RNA聚合酶序列的氨基酸而修饰RNA聚合酶。作
为一个非限制性例子，可以修饰RNA聚合酶以使其并入2’-修饰核苷酸三磷
酸的能力比未修饰的RNA聚合酶高(参见国际公开WO2008078180和美国专
利8,101,385；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。

可以通过演化RNA聚合酶、优化RNA聚合酶氨基酸和/或核酸序列和/
或通过使用本领域已知的其他方法获得变体。作为一个非限制性例子，可以
使用Esvelt等人(Nature(2011)472(7344):499-503；所述文献通过引用的方式
完整并入本文)所述的连续定向进化系统，演化T7RNA聚合酶变体，其中
T7RNA聚合酶的克隆可以编码至少一个突变如，但不限于，位置93处的赖
氨酸置换为苏氨酸(K93T)、I4M、A7T、E63V、V64D、A65E、D66Y、T76N、
C125R、S128R、A136T、N165S、G175R、H176L、Y178H、F182L、L196F、
G198V、D208Y、E222K、S228A、Q239R、T243N、G259D、M267I、G280C、
H300R、D351A、A354S、E356D、L360P、A383V、Y385C、D388Y、S397R、
M401T、N410S、K450R、P451T、G452V、E484A、H523L、H524N、G542V、
E565K、K577E、K577M、N601S、S684Y、L699I、K713E、N748D、Q754R、
E775K、A827V、D851N或L864F。作为另一个非限制性例子，T7RNA聚
合酶变体可以编码至少如美国公开号20100120024和20070117112中所述的
突变，所述文献通过引用的方式完整并入本文。RNA聚合酶的变体还可以包
括但不限于置换性变体、保守性氨基酸置换、插入性变体、缺失变体和/或共
价衍生物。

在一个实施方案中，初级构建体可以设计成由野生型或变体RNA聚合
酶识别。在这情况下，可以修饰初级构建体以含有来自野生型或亲本初级构
建体的序列变化的位点或区域。

在一个实施方案中，初级构建体可以设计成在RNA聚合酶结合位点或
识别位点上游、在RNA聚合酶结合位点或识别位点下游、在TATA框序列
上游、在初级构建体的TATA框序列下游但是初级构建体的编码区上游、在
5’UTR内部、在5’UTR之前和/或在5’UTR后，包含至少一个置换和/或插入。

在一个实施方案中，可以通过插入具有相同碱基的核苷酸的至少一个区
域和/或一段，替换初级构建体的5’UTR。核苷酸的区域和/或段可以包含但
不限于至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个核
苷酸并且核苷酸可以是天然和/或非天然的。作为一个非限制性例子，核苷酸
群可以包含5-8个腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、一段在本文公开的任何其他
核苷酸和/或其组合。

在一个实施方案中，可以通过插入具有两种不同碱基(如，但不限于腺嘌
呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、本文公开的任何其他核苷酸和/或其组合)的至少两
个区域和/或一段核苷酸，替换初级构建体的5’UTR。例如，可以通过插入
5-8个腺嘌呤碱基随后插入5-8个胞嘧啶碱基，替换5’UTR。在另一个例子中，
可以通过插入5-8个胞嘧啶碱基随后插入5-8个腺嘌呤碱基，替换5’UTR。

在一个实施方案中，初级构建体可以在可以由RNA聚合酶识别的转录
起点位点下游包括至少一个置换和/或插入。作为一个非限制性例子，通过在
紧邻转录起点位点下游(如，但不限于，+1至+6)的区域中置换至少一个核酸，
至少一个置换和/或插入可以在转录起点位点下游出现。紧邻转录起点位点下
游的核苷酸区域的变化可能影响起始速率，增加核苷酸三磷酸(NTP)反应表
观常数值，并增加短转录物从转录复合体解离，从而修复初始转录(Brieba等
人,Biochemistry(2002)41:5144-5149；所述文献通过引用的方式完整并入本
文)。至少一个核酸的修饰、置换和/或插入可以造成核酸序列的沉默突变或
可以造成氨基酸序列中的突变。

在一个实施方案中，初级构建体可以在转录起点位点下游包括至少1、
至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、
至少11、至少12或至少13个鸟嘌呤碱基置换。

在一个实施方案中，初级构建体可以在紧邻转录起点位点下游的区域中
包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个鸟嘌呤碱基置换。
作为一个非限制性例子，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱
基可以由至少1、至少2、至少3或至少4个腺嘌呤核苷酸置换。在另一个非
限制性例子中，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可以由
至少1、至少2、至少3或至少4个胞嘧啶碱基置换。在另一个非限制性例子
中，如果该区域中的核苷酸是GGGAGA，则鸟嘌呤碱基可以由至少1、至少
2、至少3或至少4个胸腺嘧啶和/或本文所述的任何核苷酸置换。

在一个实施方案中，初级构建体可以在起始密码子上游包括至少一个置
换和/或插入。出于清晰目的，本领域技术人员将理解，起始密码子是蛋白质
编码区的第一个密码子，而转录起点位点是转录开始的位点。初级构建体可
以包括，但不限于至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7
或至少8个核苷酸碱基置换和/或插入。可以在起始密码子上游的1、至少1、
至少2、至少3、至少4或至少5个位置插入或置换核苷酸碱基。插入和/或
置换的核苷酸可以是相同的碱基(例如，全部是A或全部是C或全部是T或
全部是G)、两种不同的碱基(例如，A和C、A和T、或C和T)、三种不同
的碱基(例如，A、C和T或A、C和T)或至少四种不同的碱基。作为一个非
限制性例子，初级构建体中编码区上游的鸟嘌呤碱基可以用腺嘌呤、胞嘧啶、
胸腺嘧啶或本文所述的任何核苷酸置换。在另一个非限制性例子中，可以设
计初级构建体中的鸟嘌呤碱基置换，从而在转录起点位点下游的区域中并且
在起始密码子之前留下一个鸟嘌呤碱基(参见Esvelt等人,Nature(2011)
472(7344):499-503；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。作为一个非限
制性例子，可以在转录起点位点下游但是起始密码子上游的1位置处插入至
少5个核苷酸并且所述至少5个核苷酸可以是相同的碱基类型。

cDNA模板移除和净化

可以使用本领域已知的方法如，但不限于脱氧核糖核酸酶I(DNA酶I)
处理，移除cDNA模板。RNA净化还可以包含纯化方法如，但不限于，来自
BeckmanCoulter(Danvers，MA)的系统、基于
HPLC的纯化方法如，但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、
反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。

加帽反应和/或加尾反应

初级构建体或mmRNA还可以发生加帽反应和/或加尾反应。加帽反应可
以通过本领域已知的方法进行以添加5’帽至初级构建体的5’末端。加帽方法
包括但不限于使用痘苗病毒加帽酶(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA)。

可以通过本领域已知的方法(如，但不限于2’O-甲基转移酶)和通过如本
文所述的方法进行聚腺苷酸加尾反应。如果从cDNA生成的初级构建体不包
含聚-T，则可能有益是在净化初级构建体之前进行聚腺苷酸-加尾反应。

mRNA纯化

初级构建体或mmRNA纯化可以包括但不限于mRNA或mmRNA净化、
质量保证和质量控制。可以通过本领域已知的方法进行mRNA或mmRNA
净化，所述方法例如是，但不限于珠(BeckmanCoulter
Genomics,Danvers,MA)、聚-T珠、LNA^TM寡聚物-T捕获探针(Inc,
Vedbaek,丹麦)或基于HPLC的纯化方法，如，但不限于强阴离子交换HPLC、
弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用
HPLC(HIC-HPLC)。当相对于多核苷酸如“纯化的mRNA或mmRNA”使用时，
术语“纯化”指与至少一个污染物分离。如本文所用，“污染物”是使另一者不
适宜、不纯或变次的任何物质。因此，纯化的多核苷酸(例如，DNA和RNA)
的存在形式和环境与它在自然界中的不同，或者存在形式和环境与使其经历
处理或纯化方法之前存在的不同。

可以使用方法如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析性HPLC，实施质
量保证和/或质量控制检查。

在另一个实施方案中，mRNA或mmRNA可以通过包括但不限于逆转-
转录酶-PCR的方法测序。

在一个实施方案中，mRNA或mmRNA可以使用如，但不限于紫外可见
光光谱法(UV/Vis)的方法定量。UV/Vis谱仪的非限制性例子是
谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)。可以分析定量的mRNA或mmRNA以确
定mRNA或mmRNA是否可以具有正确大小，检查mRNA或mmRNA尚未
出现降解。可以通过多种方法检查mRNA和/或mmRNA的降解，所述方法
是如，但不限于琼脂糖凝胶电泳，基于HPLC的纯化方法，如但不限于强阴
离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作
用HPLC(HIC-HPLC)、液相色谱-质谱(LCMS)、毛细管电泳法(CE)和毛细管
凝胶电泳(CGE)。

信号序列

初级构建体或mmRNA还可以编码额外特征，其促进多肽运输至有治疗
意义的部位。辅助蛋白质运输的这样一个特征是信号序列。如本文所用，“信
号序列”或“信号肽”分别是多核苷酸或多肽，其来自长度从约9至200个核苷
酸(3-60个氨基酸)，分别并入在编码区或所编码多肽的5’(或N末端)。添加
这些序列导致编码的多肽通过一个或多个分泌途径运输到内质网。在蛋白质
转运后，一些信号肽由信号肽酶从蛋白质切下。

信号序列可以选自2012年12月14日提交的待决美国临时专利申请号
61/737,130中所列的那些信号序列中的任一个，所述文献的内容通过引用的
方式并入本文。可以通过本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA并入以
便编码的蛋白质信号序列包括来自α-1-抗胰蛋白酶、G-CSF、因子IX、催乳
素、白蛋白、HMMSP38、鸟氨酸氨基甲酰转移酶、细胞色素C氧化酶亚基
8A、III型、细菌的、病毒的、分泌信号、Vrg-6、PhoA、OmpA、STI、STII、
淀粉酶、α因子、葡聚糖内切酶V、分泌信号、真菌的和纤连蛋白的信号序
列。

在该表中，SS是分泌信号，MLS是线粒体前导信号。本发明的初级构
建体或mmRNA可以设计成编码任何信号序列或其片段或变体。这些序列可
以在多肽编码区的起点、在中部或在末端纳入或备选地纳入侧翼区中。

可以在本发明中利用的额外信号序列包括在例如，数据库中教授的那些，
所述数据库例如是http://www.signalpeptide.de/或
http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/处找到的那些。在美国专利8,124,379、
7,413,875和7,385,034中描述的那些信号序列也处于本发明的范围内并且所
述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。

靶选择

根据本发明，初级构建体至少包含编码至少一种目的多肽的连接的核苷
的第一区域。下表2中列出了本发明的目的多肽或“靶”。除编码目的多肽的
基因的名称和描述之外，表2中还显示ENSEMBL转录物ID(ENST)、
ENSEMBL蛋白质ID(ENSP)和当可获得时的优化序列ID(OPTSEQID)。对
于任何特定基因，可能存在一种或多种变体或同工型。在它们存在的情况下，
也在该表中显示它们。本领域技术人员将理解，在该表中公开的是潜在的侧
翼区。，这些侧翼区在每种ENST转录物中编码，或向ORF或编码区的5’(上
游)或3’(下游)。通过教授ENSP序列，明确且具体地公开了编码区。因此，
教授在编码蛋白质的序列旁侧分布的这些序列视为侧翼区。通过利用一个或
多个可获得的数据库或算法，还可能进一步表征5’和3’侧翼区。数据库已经
注释了在ENST转录物的侧翼区中所含的特征并且这些都是本领域可获得
的。

表2.靶

在一个实施方案中，本发明的靶可以是以下文献中描述的任何靶：2012
年4月2日提交的名为“用于产生生物药物的修饰多核苷酸”的美国临时专利
申请号61/618,862；2012年8月10日提交的名为“用于产生生物药物的修饰
多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,645；2012年12月14日提交的名为
“用于产生生物药物的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,130；
2012年4月2日提交的名为“用于产生抗体的修饰多核苷酸”的美国临时专利
申请号61/618,866；2012年8月10日提交的名为“用于产生抗体的修饰多核
苷酸”的美国临时专利申请号61/681,647；2012年12月14日提交的名为“用
于产生抗体的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,134；2012年4
月2日提交的名为“用于产生疫苗的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,868；2012年8月10日提交的名为“用于产生疫苗的修饰多核苷酸”的
美国临时专利申请号61/681,648；2012年12月14日提交的名为“用于产生疫
苗的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,135；2012年4月2日提交
的名为“用于产生治疗性蛋白和肽的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,870；2012年8月10日提交的名为“用于产生治疗性蛋白和肽的修饰
多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,649；2012年12月14日提交的名为
“用于产生治疗性蛋白和肽的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/737,139；2012年4月2日提交的名为“用于产生分泌型蛋白的修饰多核苷
酸”的美国临时专利申请号61/618,873；2012年8月10日提交的名为“用于产
生分泌型蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,650；2012年
12月14日提交的名为“用于产生分泌型蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专
利申请号61/737,147；2012年4月2日提交的名为“用于产生质膜蛋白的修饰
多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,878；2012年8月10日提交的名为
“用于产生质膜蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,654；
2012年12月14日提交的名为“用于产生质膜蛋白的修饰多核苷酸”的美国临
时专利申请号61/737,152；2012年4月2日提交的名为“用于产生胞质和细胞
骨架蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,885；2012年8月
10日提交的名为“用于产生胞质和细胞骨架蛋白的修饰多核苷酸”的美国临
时专利申请号61/681,658；2012年12月14日提交的名为“用于产生胞质和细
胞骨架蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,155；2012年4
月2日提交的名为“用于产生胞内膜结合型蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临
时专利申请号61/618,896；2012年7月5日提交的名为“用于产生胞内膜结合
型蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/668,157；2012年8月
10日提交的名为“用于产生胞内膜结合型蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临
时专利申请号61/681,661；2012年12月14日提交的名为“用于产生胞内膜结
合型蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,160；2012年4
月2日提交的名为“用于产生核蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,911；2012年8月10日提交的名为“用于产生核蛋白的修饰多核苷酸”
的美国临时专利申请号61/681,667；2012年12月14日提交的名为“用于产生
核蛋白的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,168；2012年4月2
日提交的名为“用于产生蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,922；2012年8月10日提交的名为“用于产生蛋白质的修饰多核苷酸”
的美国临时专利申请号61/681,675；2012年12月14日提交的名为“用于产生
蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,174；2012年4月2
日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临
时专利申请号61/618,935；2012年8月10日提交的名为“用于产生与人类疾
病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,687；2012
年12月14日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷
酸”的美国临时专利申请号61/737,184；2012年4月2日提交的名为“用于产
生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号
61/618,945；2012年8月10日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白
质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/681,696；2012年12月14日提
交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专
利申请号61/737,191；2012年4月2日提交的名为“用于产生与人类疾病相关
的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/618,953；2012年8月
10日提交的名为“用于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美
国临时专利申请号61/681,704；2012年12月14日提交的名为“用于产生与人
类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的美国临时专利申请号61/737,203；
2013年3月9日提交的名为“用于产生生物药物和与人类疾病相关的蛋白质
的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030062；2013年3月9日提交
的名为“修饰的多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030063；名为“用于产生
分泌型蛋白的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030064；2013年3
月9日提交的名为“用于产生膜蛋白的修饰多核苷酸”的国际申请号
PCT/US2013/030059；2013年3月9日提交的名为“用于产生胞质和细胞骨架
蛋白的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030066；2013年3月9日
提交的名为“用于产生核蛋白的修饰多核苷酸”的国际申请号
PCT/US2013/030067；2013年3月9日提交的名为“用于产生蛋白质的修饰多
核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030060；2013年3月9日提交的名为“用
于产生与人类疾病相关的蛋白质的修饰多核苷酸”的国际申请号
PCT/US2013/030061；2013年3月9日提交的名为“用于产生化妆用蛋白质和
肽的修饰多核苷酸”的国际申请号PCT/US2013/030068；2013年3月9日提
交的名为“用于产生肿瘤学相关蛋白和肽的修饰多核苷酸”的国际申请号
PCT/US2013/030070；2013年3月15日提交的名为“蛋白质的体内产生”的国
际申请号PCT/US2013/031821；所述每份文献的内容通过引用的方式完整并
入本文。

蛋白质切割信号和位点

在一个实施方案中，本发明的多肽可以包括至少一个蛋白质切割信号，
所述蛋白质切割信号含有至少一个蛋白质切割位点。该蛋白质切割位点可以
位于N末端、C末端、N末端和C末端之间的任何空间，如，但不限于N
末端和C末端之间的半途、N末端和半路点之间、在半路点和C末端之间及
其组合。

本发明的多肽可以包括，但不限于前蛋白转化酶(或激素原转化酶)、凝
血酶或因子Xa蛋白质切割信号。前蛋白转化酶是一个9种蛋白酶的家族，
包含7种与酵母kexin相关的碱性氨基酸特异性枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋
白酶，称作激素原转化酶1/3(PC1/3)、PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5/6，配
对碱性氨基酸切割酶4(PACE4)和PC7，以及两种在非碱性残基处切割的其他
枯草杆菌酶，称作枯草杆菌蛋白酶kexin同工酶1(SKI-1)和前蛋白转化酶枯
草杆菌蛋白酶kexin9(PCSK9)。

在一个实施方案中，本发明的初级构建体和mmRNA可以如此工程化，
从而初级构建体或mmRNA含有至少一个编码的蛋白质切割信号。编码的蛋
白质切割信号可以位于起始密码子之前、起始密码子之后、编码区之前、编
码区内部，如，但不限于编码区中的半途、在起始密码子和半路点之间、在
半路点和终止密码子之间、编码区后后，终止密码子之前、在两个终止密码
子之间、终止密码子之后及其组合。

在一个实施方案中，本发明的初级构建体或mmRNA可以包括至少一
个编码的蛋白质切割信号，所述编码的蛋白质切割信号含有至少一个蛋白质
切割位点。编码的蛋白质切割信号可以包括，但不限于前蛋白转化酶(或激素
原转化酶)、凝血酶和/或因子Xa蛋白质裂解信号。本领域技术人员可以使用
上表1或其他已知的方法以确定合适的编码的蛋白质切割信号以纳入本发明
的初级构建体或mmRNA中。例如，始于一个信号序列并且考虑表1的密码
子，可以设计用于初级构建体的信号，所述信号可以在所得的多肽中产生蛋
白质信号。

在一个实施方案中，本发明的多肽包括至少一个蛋白质切割信号和/或位
点。

作为一个非限制性例子，通过引用的方式完整并入本文的美国专利号
7,374,930和美国公开号20090227660使用弗林蛋白酶切割位点以切割来自细
胞高尔基体的表达产物中GLP-1的N末端甲硫氨酸。在一个实施方案中，本
发明的多肽包含至少一个蛋白质裂解信号和/或位点，条件是该多肽不是
GLP-1。

在一个实施方案中，本发明的初级构建体或mmRNA包含至少一个编码
的蛋白质裂解信号和/或位点。

在一个实施方案中，本发明的初级构建体或mmRNA包含至少一个编码
的蛋白质裂解信号和/或位点，条件是初级构建体或mmRNA不编码GLP-1。

在一个实施方案中，本发明的初级构建体或mmRNA可以包含多于一个
编码区。在本发明的初级构建体或mmRNA中存在多个编码区的情况下，多
个编码区可以由编码的蛋白质切割位点分离。作为一个非限制性例子，初级
构建体或mmRNA可以按有序样式标示。这样的一种样式符合AXBY形式，
其中A和B是编码区，所述编码区可以是相同或不同的编码区和/或可以编
码相同或不同的多肽，并且X和Y是编码的蛋白质裂解信号，所述编码的蛋
白质裂解信号可以编码相同或不同的蛋白质切割信号。这样的第二种样式符
合AXYBZ形式，其中A和B是编码区，所述编码区可以是相同或不同的编
码区和/或可以编码相同或不同的多肽，并且X、Y和Z是编码的蛋白质裂解
信号，所述编码的蛋白质裂解信号可以编码相同或不同的蛋白质切割信号。
第三样式符合形式ABXCY，其中A、B和C是编码区，所述编码区可以是
相同或不同的编码区和/或可以编码相同或不同的多肽，并且X和Y是编码
的蛋白质裂解信号，所述编码的蛋白质裂解信号可以编码相同或不同的蛋白
质切割信号。

在一个实施方案中，多肽、初级构建体和mmRNA还可以含有序列，所
述序列如此编码蛋白质切割位点，从而通过用所述蛋白质切割位点的特异性
蛋白酶处理，可以从载体区域或融合配偶体释放多肽、初级构建体和
mmRNA。

III.修饰

本文中，在多核苷酸(如初级构建体或mRNA分子)中，术语“修饰”或(如
果适宜)“修饰的”指相对于A、G、U或C核糖核苷酸的修饰。通常，本文中，
这些术语不意在指在天然存在的5’-末端mRNA帽部分中的核糖核苷酸修饰。
在多肽中，术语“修饰”指与20种氨基酸的常规集合、部分相比的修饰。

修饰可以是多种不同的修饰。在一些实施方案中，编码区、侧翼区和/
或末端区可以含有一个、两个或更多个(任选不同的)核苷修饰或核苷酸修饰。
在一些实施方案中，与未修饰的多核苷酸、初级构建体或mmRNA相比，向
细胞引入的修饰多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以在细胞中显示出降解
减少。

多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以包括任何有用的修饰，如对糖、
核碱基或核苷间连接(例如对连接性磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)
的修饰。嘧啶核碱基的一种或多种原子可以用任选取代的氨基、任选取代的
巯基、任选取代的烷基(例如，甲基或乙基)或卤素(例如，氯或氟)替换或取代。
在某些实施方案中，修饰(例如，一个或多个修饰)是存在于每个糖和核苷间
连接中。本发明的修饰可以是核糖核酸(RNA)至脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖
核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂分子的修
饰)。本文中描述了额外的修饰。

如本文所述的，本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA基本上不诱
导向其中引入mRNA的细胞的先天免疫反应。诱导的先天免疫反应的特征包
括1)促炎细胞因子的表达增加，2)胞内PRR激活(RIG-I、MDA5等，和/或
3)蛋白质翻译终止或减少。

在某些实施方案中，可能期望胞内降解引入细胞中的修饰核酸分子。例
如，如果蛋白质的产生需要精确时程，则降解修饰的核酸分子可能是优选的。
因此，在一些实施方案中，本发明提供含有降解结构域的修饰核酸分子，所
述降解结构域能够在细胞内部以受指引的方式受到作用。

多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以任选地包含其他物质(例如，诱导
RNAi的物质、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催
化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适配体、载体等)。在一些实施
方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以包括一个或多个信使
RNA(mRNA)和一个或多个修饰的核苷或核苷酸(例如，mmRNA分子)。下文
是这些多核苷酸、初级构建体和mmRNA的详述。

多核苷酸和初级构建体

本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA包括编码目的多肽的连接的
核苷的第一区域、位于第一区域5’末端处的第一侧翼区，和位于第一区域3’
末端处的第二侧翼区。

在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA(例如，第一区域、
第一侧翼区或第二侧翼区)包含n个的连接的核苷，所述核苷具有任意碱基、
糖、主链、结构单元或其他结构或式，包括但不限于式I至IX的那些)，或
其任何亚结构，如2012年10月3日提交的国际申请PCT/US12/58519(代理
人案号：M009.20)中所述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
这类结构含对糖、核碱基、核苷间连接或其组合的修饰。

化学性修饰的组合包括在2012年10月3日提交的国际申请
PCT/US12/58519中教授的那些，包括但不限于在该文献中描述的那些(代理
人案号：M009.20)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。

本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的合成可以根据2012年10
月3日提交的国际申请PCT/US12/58519(代理人案号：M009.20)中所述方法
的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。

在一些实施方案中，核碱基选自胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶。

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。示例性核碱基和具
有修饰的尿嘧啶的核苷包括假尿苷(ψ)、嘧啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、
6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s²U)、4-硫代-尿苷(s⁴U)、4-
硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟-尿苷(ho⁵U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤素
-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m³U)、5-甲氧基-尿苷
(mo⁵U)、尿苷5-氧乙酸(cmo⁵U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo⁵U)、5-羧甲基-尿
苷(cm⁵U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧羟甲基-尿苷(chm⁵U)、5-羧羟甲基-尿苷甲
基酯(mchm⁵U)、5-甲氧羰基甲基-尿苷(mcm⁵U)、5-甲氧羰基甲基-2-硫代-尿苷
(mcm⁵s²U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm⁵s²U)、5-甲氨基甲基-尿苷(mnm⁵U)、
5-甲氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm⁵s²U)、5-甲氨基甲基-2-硒-尿苷(mnm⁵se²U)、
5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm⁵U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm⁵U)、5-羧甲基
氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm⁵s²U)、5-炔丙基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛
磺酸甲基-尿苷(τm⁵U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷
(τm⁵s²U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿苷(m⁵U，即具有核碱基脱
氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m¹ψ)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m⁵s²U)、1-甲基-4-
硫代-假尿苷(m¹s⁴ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m³ψ)、2-硫代-1-
甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二
氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m⁵D)、2-硫代-二
氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧
基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)
尿苷(acp³U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp³ψ)、5-(异戊烯氨基甲基)
尿苷(inm⁵U)、5-(异戊烯氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm⁵s²U)、α-硫代-尿苷、2’-O-
甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m⁵Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫
代-2’-O-甲基-尿苷(s²Um)、5-甲氧羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm⁵Um)、5-氨
甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm⁵Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷
(cmnm⁵Um)、3.2’-O-二甲基-尿苷(m³Um)、5-(异戊烯氨基甲基)-2’-O-甲基-尿
苷(inm⁵Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-ara-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-ara-
尿苷、5-(2-羰基甲氧乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的胞嘧啶。具有修饰的胞嘧啶
的示例性核碱基和核苷包括5-氮杂-胞苷、6-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-
胞苷(m³C)、N4-乙酰基-胞苷(ac⁴C)、5-甲酰基-胞苷(f⁵C)、N4-甲基-胞苷(m⁴C)、
5-甲基-胞苷(m⁵C)、5-卤素-胞苷(例如，5-碘-胞苷)、5-(羟甲基)-胞苷(hm⁵C)、
1-甲基-假异胞苷、吡咯-胞苷、吡咯-假异胞苷、2-硫代-胞苷(s²C)、2-硫代-5-
甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-去
氮杂-假异胞苷、1-甲基-1-去氮杂-假异胞苷、zebularine、5-氮杂-zebularine、
5-甲基-zebularine、5-氮杂-2-硫代-zebularine、2-硫代-zebularine、2-甲氧基-
胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞
苷、赖胞苷(k²C)、α-硫代-胞苷、2’-O-甲基-胞苷(Cm)、5,2’-O-二甲基-胞苷
(m⁵Cm)、N4-乙酰基-2’-O-甲基-胞苷(ac⁴Cm)、N4,2’-O-二甲基-胞苷(m⁴Cm)、
5-甲酰基-2’-O-甲基-胞苷(f⁵Cm)、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷(m⁴₂Cm)、1-硫代-
胞苷、2’-F-ara-胞苷、2’-F-胞苷、和2’-OH-ara-胞苷。

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的腺嘌呤。具有修饰的腺嘌呤
的示例性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤素-
嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤素-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲
基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-去
氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-去氮杂-2,6-二氨基嘌呤、
7-去氮杂-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1A)、2-甲甲基-腺嘌呤(m²A)、
N6-甲基-腺苷(m⁶A)、2-甲基硫基-N6-甲甲基-腺苷(ms²m⁶A)、N6-异戊烯基-
腺苷(i⁶A)、2-甲基硫基-N6-异戊烯基-腺苷(ms²i⁶A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺
苷(io⁶A)、2-甲基硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷(ms²io⁶A)、N6-甘氨酰氨甲
酰基-腺苷(g⁶A)、N6-苏氨酰氨甲酰基-腺苷(t⁶A)、N6-甲基-N6-苏氨酰氨甲酰
基-腺苷(m⁶t⁶A)、2-甲基硫基-N6-苏氨酰氨甲酰基-腺苷(ms²g⁶A)、N6,N6-二甲
基-腺苷(m⁶₂A)、N6-羟基正缬氨酰氨甲酰基-腺苷(hn⁶A)、2-甲基硫基-N6-羟基
正缬氨酰氨甲酰基-腺苷(ms²hn⁶A)、N6-乙酰基-腺苷(ac⁶A)、7-甲基-腺嘌呤、
2-甲基硫代-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2’-O-甲基-腺苷(Am)、
N6,2’-O-二甲基-腺苷(m⁶Am)、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷(m⁶₂Am)、1,2’-O-二甲
基-腺苷(m¹Am)、2’-O-核糖基腺苷(磷酸酯)(Ar(p))、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、
1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2’-F-ara-腺苷、2’-F-腺苷、2’-OH-ara-腺苷和
N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。

在一些实施方案中，修饰的核碱基是修饰的鸟嘌呤。具有修饰的鸟嘌呤
的示例性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m¹I)、丫苷(imG)、甲基丫
苷(mimG)、4-去甲基-丫苷(imG-14)、异丫苷(imG2)、怀丁苷(wybutosine，
yW)、过氧怀丁苷(o₂yW)、羟怀丁苷(OHyW)、未修饰的羟怀丁苷(OHyW*)、
7-去氮杂-鸟苷、辫苷(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-
辫苷(manQ)、7-氰基-7-去氮杂-鸟苷(preQ₀)、7-氨基甲基-7-去氮杂-鸟苷
(preQ₁)、古细菌苷(archaeosine，G+)、7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、
6-硫代-7-去氮杂-鸟苷、6-硫代-7-去氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m⁷G)、6-
硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m¹G)、N2-甲
基-鸟苷(m²G)、N2,N2-二甲基-鸟苷(m²₂G)、N2,7-二甲基-鸟苷(m^2,7G)、N2,N2,7-
二甲基-鸟苷(m^2,2,7G)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟
苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2’-O-
甲基-鸟苷(Gm)、N2-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m²Gm)、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-
鸟苷(m²₂Gm)、1-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m¹Gm)、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷
(m^2,7Gm)、2’-O-甲基-肌苷(Im)、1,2’-O-二甲基-肌苷(m¹Im)和2’-O-核糖基鸟
苷(磷酸酯)(Gr(p))。

核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶类似物。例如，
核碱基可以各自独立地选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。
在另一个实施方案中，核碱基还可以例如包括天然存在的和合成的碱基衍生
物，所述碱基衍生物包含吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-(羟甲
基)胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和
其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、
2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-炔丙基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞
嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素(例如，8-溴)、
8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-
卤素特别地5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌
呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、去氮杂鸟嘌呤、7-去氮
杂鸟嘌呤、3-去氮杂鸟嘌呤、去氮杂腺嘌呤、7-去氮杂腺嘌呤、3-去氮杂腺嘌
呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑并[1.5-a]1,3,5三嗪酮、9-去氮杂嘌呤、咪唑并[4,5-d]
吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、哒嗪；和1,3,5三嗪。当
使用速记A、G、C、T或U描述核苷酸时，每个字母指代表的碱基和/或其
衍生物，例如，A包括腺嘌呤或腺嘌呤类似物，例如，7-去氮杂腺嘌呤)。

修饰的核苷和核苷酸(例如，结构单元分子)可以根据Ogata等人,J.Org.
Chem.74:2585-2588(2009)；Purmal等人,Nucl.AcidsRes.22(1):72-78,
(1994)；Fukuhara等人,Biochemistry,1(4):563-568(1962)；和Xu等人,
Tetrahedron,48(9):1729-1740(1992)中描述的合成方法制备，每一篇的内容通
过引用的方式完整并入本文。

本发明的多肽、初级构建体和mmRNA可以沿整个分子长度均匀地修饰
或可以沿整个分子长度不均匀地修饰。例如，一种或多种或全部类型的核苷
酸(例如，嘌呤或嘧啶，或任一种或多种或全部的A、G、U、C)可以在本发
明的多核苷酸中或在其给出的预先确定序列区域(例如图1中代表的一种或
多种序列区域)内均匀地被修饰或可以在其中不均匀地被修饰。在一些实施方
案中，在本发明多核苷酸中(或在其给定的序列区域内)的全部核苷酸X均被
修饰，其中X可以是核苷酸A、G、U、C的任一种，或组合A+G、A+U、
A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C的任一种。

不同的糖修饰、核苷酸修饰和/或核苷间连接(例如，主链结构物)可以在
多核苷酸、初级构建体或mmRNA中的各种位置存在。本领域普通技术人员
将理解，核苷酸类似物或其他修饰可以位于多核苷酸、初级构建体或mmRNA
的任何位置处，从而使多核苷酸、初级构建体或mmRNA的功能基本上不降
低。修饰也可以是5’端或3’端修饰。多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以
含有约1％至约100％的修饰核苷酸(相对于核苷酸总含量，或相对于一个或多
个类型的核苷酸，即A、G、U或C的任一者或多者)或居间的任何百分数(例
如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、
1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、
10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至
25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％
至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、
50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至
100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％
以及95％至100％)。

在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA包括修饰的嘧啶
(例如，修饰的尿嘧啶/尿苷/U或修饰的胞嘧啶/胞苷/C)。在一些实施方案中，
可以将多核苷酸、初级构建体或mmRNA分子中的尿嘧啶或尿苷(通常：U)
替换为约1％至约100％修饰的尿嘧啶或修饰的尿苷(例如，1％至20％、1％至
25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、
10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至
80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、
20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至
100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、
50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至
90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％、和95％至100％
修饰的尿嘧啶或修饰的尿苷)。修饰的尿嘧啶或尿苷可以由具有单一独特结构
的化合物或通过具有不同结构(例如，如本文所述的2、3，4种或更多种独特
结构)的多种化合物替换。

在一些实施方案中，可以将多核苷酸、初级构建体或mmRNA分子中的
胞嘧啶或胞苷(通常：C)替换为约1％至约100％修饰的胞嘧啶或修饰的胞苷
(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至
80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％
至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、
20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至
90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、
50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至
95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、
90％至100％、和95％至100％修饰的胞嘧啶或修饰的胞苷)。修饰的胞嘧啶或
胞苷可以由具有单一独特结构的化合物或通过具有不同结构(例如，如本文所
述的2、3，4种或更多种独特结构)的多种化合物替换。

在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA是可翻译的。

多核苷酸、初级构建体和mmRNA的其他组分是任选的，并且在一些实
施方案中是有益的。例如，提供5’非翻译区(UTR)和/或3’UTR，其中任一者
或二者均可以独立地含有一个或多个不同的核苷酸修饰。在这类实施方案中，
核苷酸修饰也可以存在于可翻译区域中。还提供了含有aKozak序列的多核
苷酸、初级构建体和mmRNA。

在一些实施方案中，至少25％的胞嘧啶由式(b10)-(b14)的化合物替换(例
如，至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至
少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约
80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％)。

在一些实施方案中，至少25％的尿嘧啶由式(b1)-(b9)的化合物替换(例如，
至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约
55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、
至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％)。

在一些实施方案中，至少25％的胞嘧啶由式(b10)-(b14)的化合物替换，
并且至少25％的尿嘧啶由式(b1)-(b9)的化合物替换(例如，至少约30％、至少
约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、
至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约
90％、至少约95％或约100％)。

IV.药物组合物

配制、施用、递送和给药

本发明提供与一种或多种可药用赋形剂组合的多核苷酸、初级构建体和
mmRNA组合物和复合物。药物组合物可以任选地包含一种或多种额外的活
性物质，例如有治疗和/或预防活性的物质。在配制和/或制造药剂
(pharmaceuticalagent)中的一般考虑事项可以例如在Remington：TheScience
andPracticeofPharmacy第21版,LippincottWilliams&Wilkins,20055(通过
引用的方式完整并入本文)中找到。

在一些实施方案中，将组合物施用至人类、人类患者或受试者。出于本
公开的目的，短语“有效成分”通常指如本文所述那样递送的多核苷酸、初级
构建体和mmRNA。

虽然本文提供的药物组合物描述主要涉及适于施用于人类的药物组合
物，技术人员将理解这类组合物通常适于施用于任何其他动物，例如，施用
于非人类动物，例如非人类哺乳动物。本领域完全理解，修饰适于施用于人
类的药物组合物以使得该组合物适于施用于多种动物，并且普通技术的兽医
药理学家可以仅用普通(如果有的话)实验即可设计和/或开展这类修饰。药物
组合物施用的受试者包括但不限于人类和/或其他灵长类；哺乳类，包括有商
业意义的哺乳动物如牛、猪、马、羊、猫、犬、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，
包括有商业意义的鸟类如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。

本文所述药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知或此后开发的任何
方法制备。通常而言，这类制备方法包括步骤：使有效成分与赋形剂和/或一
种或多种其他辅助成分结合，并且随后，如果需要和/或合乎需要的，将产品
分割、成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。

可以将本发明的药物组合物作为单一单位剂量，和/或作为多个单一单位
剂量制备、包装、和/或散装出售。如本文所用，“单位剂量”是分立量的药物
组合物，其包含预定量的有效成分。有效成分的量通常等于将施用至受试者
的有效成分的剂量和/或这种剂量的便利部分，例如，如一半或三分之一的这
种剂量。

本发明药物组合物中有效成分、可药用赋形剂，和/或任何额外成分的相
对量将根据受到治疗的受试者的身份、体格大小和/或状况变动并且进一步取
决于组合物待施用的途径。以举例方式，组合物可以包含0.1％和100％之间、
例如0.5％和50％之间、1-30％之间、5-80％之间、至少80％(w/w)的有效成分。

本文所述的任一种多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以如2012年12
月14日提交的名为“修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物”的国际申请号
PCT/US2012/069610中所述那样配制，所述文献的内容通过引用的方式完整
并入本文。

制剂

可以使用一种或多种赋形剂配制本发明的多核苷酸、初级构建体和
mmRNA以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许缓释或延迟释放(例
如，从多核苷酸、初级构建体或mmRNA的贮库制剂释放)；(4)改变生物分
布(例如，指引多核苷酸、初级构建体或mmRNA至特定组织或细胞类型)；
(5)增加所编码蛋白质的体内翻译；和/或(6)改变所编码蛋白质的体内释放谱。
除传统赋形剂如任意和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散
助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂之外，本
发明的赋形剂可以包括而不限于类脂质、脂质体、脂质纳米粒子、聚合物、
lipoplex、核-壳纳米粒子、肽、蛋白质、用多核苷酸、初级构建体或mmRNA
转染的细胞(例如，以便移植入受试者)、透明质酸酶、纳米粒子模拟物及其
组合。因此，本发明的制剂可以包括一种或多种各自处于以下量的赋形剂，
所述量共同增加多核苷酸、初级构建体或mmRNA的稳定性、增加多核苷酸、
初级构建体或mmRNA对细胞的转染、增加多核苷酸、初级构建体或mmRNA
编码的蛋白质的表达，和/或改变多核苷酸、初级构建体或mmRNA编码的蛋
白质的释放谱。另外，可以使用自装配核酸纳米粒子配制本发明的初级构建
体和mmRNA。

本文所述药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知或此后开发的任何
方法制备。通常而言，这类制备方法包括步骤：使有效成分与赋形剂和/或一
种或多种其他辅助成分结合。

可以将本公开的药物组合物作为单一单位剂量，和/或作为多个单一单位
剂量制备、包装、和/或散装出售。如本文所用，“单位剂量”指分立量的药物
组合物，其包含预定量的有效成分。有效成分的量可以通常等于将施用至受
试者的有效成分的剂量和/或这种剂量的便利部分，包括但不限于一半或三分
之一的这种剂量。

本公开的药物组合物中有效成分、可药用赋形剂，和/或任何额外成分的
相对量将根据受到治疗的受试者的身份、体格大小和/或状况变动并且进一步
取决于组合物待施用的途径。例如，组合物可以包含0.1％和99％(w/w)之间
的有效成分。

在一些实施方案中，本文所述的制剂可以含有至少一种mmRNA。作为
一个非限制性例子，制剂可以含有1、2、3、4或5种mmRNA。在一个实施
方案中，制剂可以含有编码蛋白质的修饰的mRNA，所述蛋白质选自多个类
别，如但不限于人蛋白质、兽蛋白质、细菌蛋白、生物学蛋白质、抗体、免
疫原性蛋白、治疗性肽和蛋白质、分泌型蛋白、质膜蛋白、胞质蛋白和细胞
骨架蛋白、胞内膜结合蛋白质、核蛋白、与人类疾病相关的蛋白质和/或与非
人类疾病相关的蛋白质。在一个实施方案中，制剂含有至少3种编码蛋白质
的修饰的mRNA。在一个实施方案中，制剂含有至少5种编码蛋白质的修饰
的mRNA。

药物制剂可以另外包含可药用赋形剂，如本文所用，所述的可药用赋形
剂包括，但不限于任何和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分
散助剂或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，其
适合于所需的具体剂型。用于配制药物组合物的多种赋形剂和用于制备组合
物的技术是本领域已知的(参见Remington:TheScienceandPracticeof
Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,
MD,2006；通过引用方式并入本文)。除了任何常规赋形剂介质可能与某物质
或其衍生物不相容的情况(如因产生任何不想要的生物学效应或另外以有害
方式与药物组合物的任何其他组分相互作用)，否则在本公开的范围内可以包
括使用常规赋形剂介质。

在一些实施方案中，可以增加和/或减少脂质纳米粒子的粒度。粒度的变
化可以能够帮助对抗生物学反应如，但不限于炎症，或可以增加向哺乳动物
输送的修饰的mRNA的生物学效果。

药物组合物制造中所用的可药用赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、表面
活性剂和/或乳化剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。这类赋形剂可以任
选地纳入本发明的药物制剂中。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以随可以掩
蔽分子(如胆固醇)的纳米结构物中或随之一起施用，在所述纳米结构物中配
制或随之一起递送。这些纳米结构物的非限制性例子和制造这些纳米结构物
的方法在美国专利公开号US20130195759中描述，所述文献的内容通过引用
的方式完整并入本文。这些纳米结构物的示例性结构在美国专利公开号
US20130195759的图1中显示，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本
文，并且可以包括芯部和包围芯部的壳。

类脂质(Lipidoids)

类脂质的合成已有广泛描述并且含有这些化合物的制剂特别适用于递送
多核苷酸、初级构建体或mmRNA(参见Mahon等人,BioconjugChem.2010
21:1448-1454；Schroeder等人,JInternMed.2010267:9-21；Akinc等人,Nat
Biotechnol.200826:561-569；Love等人,ProcNatlAcadSciUSA.2010
107:1864-1869；Siegwart等人,ProcNatlAcadSciUSA.2011108:12996-3001；
所述文献均完整并入本文)。

尽管这些类脂质已经用来在啮齿类和非人灵长类中有效递送双链小干扰
性RNA分子(参见Akinc等人,NatBiotechnol.200826:561-569；
Frank-Kamenetsky等人,ProcNatlAcadSciUSA.2008105:11915-11920；
Akinc等人,MolTher.200917:872-879；Love等人,ProcNatlAcadSciUSA.
2010107:1864-1869；Leuschner等人,NatBiotechnol.201129:1005-10100；全
部文献均完整并入本文)，本公开描述了它们的配制和在递送单链多核苷酸、
初级构建体或mmRNA中的用途。可以制备含有这些类脂质的复合物、胶束、
脂质体或粒子，并且因此，它们可以导致多核苷酸、初级构建体或mmRNA
的有效递送，如通过局部和/或全身性施用途径注射脂质制剂之后产生的编码
蛋白质所判定。多核苷酸、初级构建体或mmRNA的类脂质复合物可以通过
各种手段施用，包括但不限于静脉内、肌内或皮下途径。

体内递送核酸可能受许多参数影响，包括但不限于制剂组成、粒子PEG
化的性质、装载程度，寡核苷酸与脂质之比和生物物理参数如粒度(Akinc等
人,MolTher.200917:872-879；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。作
为一个例子，聚(乙二醇))(PEG)脂质的锚定链长度的微小变化可能导致显著
影响体内效力。可以对具有不同类脂质的制剂测试体内活性，所述类脂质包
括但不限于五[3-(1-月桂基氨基丙酰基)]-三乙烯四胺盐酸盐(TETA–5LAP；aka
98N12-5，参见Murugaiah等人,AnalyticalBiochemistry,401:61(2010))、
C12-200(包括衍生物和变体)和MD1。

本文中称作“98N12-5”的类脂质由Akinc等人,MolTher.200917:872-879
公开并且通过引用的方式完整并入。

本文中称作“C12-200”的类脂质由Love等人,ProcNatlAcadSciUSA.
2010107:1864-1869及Liu和Huang,MolecularTherapy.2010669-670公开；
所述两篇文献通过引用的方式完整并入本文。类脂质制剂可以包含粒子，除
多核苷酸、初级构建体或mmRNA之外，所述粒子还包含3或4种或更多种
组分。作为一个例子，具有某些类脂质的制剂包含但不限于98N12-5并且可
以含有42％类脂质、48％胆固醇和10％PEG(C14烷基链长度)。作为另一个
例子，具有某些类脂质的制剂包括但不限于C12-200并且可以含有50％类脂
质、10％二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％胆固醇及1.5％PEG-DMG。

在一个实施方案中，用类脂质配制以全身性静脉内施用的多核苷酸、初
级构建体或mmRNA可以靶向肝。例如，一种使用多核苷酸、初级构建体或
mmRNA，并包含42％98N12-5、48％胆固醇和10％PEG-脂质的脂质摩尔组
成，总脂质对多核苷酸、初级构建体或mmRNA的最终重量比是约7.5至1，
在PEG脂质上具有C14烷基链长度，平均粒度大约50–60nm的最终优化的
静脉内制剂可以导致该制剂超过90％分布至肝脏(参见，Akinc等人,MolTher.
200917:872-879；所述文献在本文完整并入)。在另一个例子中，一种使用
C12-200(参见美国临时申请61/175,770和公开的国际申请WO2010129709，
所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)类脂质的静脉内制剂可以
有效递送多核苷酸、初级构建体或mmRNA至肝细胞，所述静脉内制剂可以
具有50/10/38.5/1.5的C12-200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG摩尔
比、7:1的总脂质与多核苷酸、初级构建体或mmRNA重量比和80nm的平
均粒度(参见，Love等人,ProcNatlAcadSciUSA.2010107:1864-1869，所述
文献通过引用方式并入本文)。在另一个实施方案中，含有MD1类脂质的制
剂可以用来在体内有效递送多核苷酸、初级构建体或mmRNA至肝细胞。用
于肌内或皮下途径的优化类脂质制剂的特征可以根据靶细胞类型和制剂穿过
胞外基质扩散进入血液的能力显著地变动。尽管小于150nm的粒度可以因
内皮窗孔的大小而是有效肝细胞递送所需的(参见，Akinc等人,MolTher.
200917:872-879，所述文献通过引用方式并入本文)，但是使用类脂质配制的
多核苷酸、初级构建体或mmRNA递送制剂至其他细胞类型(包括但不限于内
皮细胞、髓样细胞和肌肉细胞)可能类似地不受大小限制。已经报道使用类脂
质制剂在体内递送siRNA至其他非肝细胞如髓样细胞和内皮(参见Akinc等
人,NatBiotechnol.200826:561-569；Leuschner等人,NatBiotechnol.2011
29:1005-1010；Cho等人Adv.Funct.Mater.200919:3112-3118；8th
InternationalJudahFolkmanConference,Cambridge,MAOctober8-9,2010，所
述文献通过引用的方式完整并入本文)。有效递送至髓样细胞如单核细胞，类
脂质制剂可以具有相似的组分摩尔比。类脂质和其他组分(包括但不限于二硬
脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG)的不同比率可以用来优化多核苷酸、
初级构建体或mmRNA的制剂以递送至不同的细胞类型，包括但不限于肝细
胞、髓样细胞、肌肉细胞等。例如，组分摩尔比可以包括，但不限于50％
C12-200、10％二硬脂酰磷脂酰胆碱、38.5％胆固醇和1.5％PEG-DMG(参见
Leuschner等人,NatBiotechnol201129:1005-1010；所述文献通过引用的方式
完整并入本文)。脂质制剂通过皮下或肌内递送用于局部递送核酸至细胞(如，
但不限于脂肪细胞和肌肉细胞)的用途可能不需要全身性递送所需的全部制
剂组分，并且本身可以仅包含类脂质和多核苷酸、初级构建体或mmRNA。

不同类脂质的组合可以用来改善多核苷酸、初级构建体或mmRNA指导
的蛋白质产生的效能，因为这些类脂质可能能够增加多核苷酸、初级构建体
或mmRNA的细胞转染；和/或增加所编码蛋白质的翻译(参见Whitehead等
人,Mol.Ther.2011,19:1688-1694，所述文献通过引用的方式完整并入本文)。

脂质体(liposome)、Lipoplexes和脂质纳米粒子

可以使用一种或多种脂质体、lipoplex或脂质纳米粒子，配制本发明的
多核苷酸、初级构建体和mmRNA。在一个实施方案中，多核苷酸、初级构
建体或mmRNA的药物组合物包含脂质体。脂质体是人工制备的小泡，所述
小泡可以主要由脂质双层组成并且可以用作递送溶媒以施用养分和药物制
剂。脂质体可以具有不同规格，如但不限于直径可以是数百纳米并且可以含
有一系列由狭窄水质区室分隔的同心双层的多层小泡(MLV)；直径可以小于
50nm的小单膜小泡(SUV)和直径可以在50和500nm之间的大单层小泡
(LUV)。脂质体设计可以包含但不限于调理素(opsonins)或配体，以改善脂质
体与不健康组织结合或以激活事件，如，但不限于内吞。脂质体可以含有低
pH或高pH，以改善药物制剂递送。

脂质体的形成可以取决于多种物理化学特征，如，但不限于包埋的药物
制剂和脂质体成分、其中分散有脂质小泡的介质的性质、所包埋物质的有效
浓度和其潜在毒性、在施加和/或递送小泡期间涉及的任何额外过程、优化规
格、多分散性和小泡相对于预期应用的货架期，和批次间重现性和大规模生
产安全且高效脂质体产品的可能性。

在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以包含而不限于多种脂质
体，如从1,2-二油基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)脂质体形成的那些脂
质体、来自MarinaBiotech(Bothell,WA)的DiLa2脂质体、1,2-二亚油氧基-3-
二甲氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂
环戊烯(DLin-KC2-DMA)和MC3(US20100324120；所述文献通过引用的方式
完整并入本文)和可以递送小分子药物的脂质体，如，但不限于来自Janssen
Biotech,Inc.(Horsham,PA)的。

在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以包含而不限于多种脂质
体，如从合成先前已经描述并显示适用于体外和体内递送寡核苷酸的稳定化
质粒-脂质粒子(SPLP)或稳定化核酸脂质粒子(SNALP)形成的那些脂质体(参
见Wheeler等人,GeneTherapy.19996:271-281；Zhang等人,GeneTherapy.
19996:1438-1447；Jeffs等人,PharmRes.200522:362-372；Morrissey等人,Nat
Biotechnol.20052:1002-1007；Zimmermann等人,Nature.2006441:111-114；
Heyes等人,JContrRel.2005107:276-287；Semple等人,NatureBiotech.2010
28:172-176；Judge等人,JClinInvest.2009119:661-673；deFougerollesHum
GeneTher.200819:125-132；所述文献均完整并入本文)。Wheeler等人的原
始制造方法是去垢剂透析法，所述方法稍后由Jeffs等人改进，并且称作自发
性小泡形成法。除多核苷酸、初级构建体或mmRNA之外，脂质体制剂还包
含3至4种脂质组分。作为一个例子，脂质体可以含有但不限于55％胆固醇、
20％二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、10％PEG-S-DSG和15％1,2-二油基氧基
-N,N-二甲氨基丙烷(DODMA)，如Jeffs等人所描述。作为另一个例子，某些
脂质体制剂可以含有但不限于48％胆固醇、20％DSPC、2％PEG-c-DMA和
30％阳离子脂质，其中阳离子脂质可以是1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲氨基丙
烷(DSDMA)、DODMA、DLin-DMA或1,2-二亚麻基氧基-3-二甲氨基丙烷
(DLenDMA)，如Heyes等人所描述。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以在脂质小
泡中配制，所述脂质小泡在官能化脂质双层之间可以具有交联。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以在脂质-
聚阳离子复合物中配制。脂质-聚阳离子复合物的形成可以通过本领域已知的
方法和/或如美国公开号20120178702中所述那样实现，所述文献通过引用的
方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，聚阳离子可以包含阳离子肽或
多肽如，但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸。在一个实施方案中，
多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以在脂质-聚阳离子复合物中配制，
所述质-聚阳离子复合物还可以包含中性脂质，如，但不限于胆固醇或二油酰
磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

脂质体制剂可能受到但不限于选择阳离子脂质组分、阳离子脂质饱和度、
PEG化的性质、全部组分比率和生物物理参数如大小的影响。在Semple等
人(Semple等人,NatureBiotech.201028:172-176)的一个例子中，脂质体制剂
由57.1％阳离子脂质、7.1％二棕榈酰磷脂酰胆碱、34.3％胆固醇和1.4％
PEG-c-DMA组成。作为另一个例子，改变阳离子脂质的组成可能更有效地
递送siRNA至多种抗原呈递细胞(Basha等人,MolTher.201119:2186-2200；
所述文献通过引用的方式完整并入本文)。

在一些实施方案中，可以增加或减少LNP制剂中PEG的比率和/或可以
调整PEG脂质的碳链长度从C14至C18，以改变LNP制剂的药代动力学和/
或生物分布。作为一个非限制性例子，LNP制剂可以含有与阳离子脂质相比
1-5％脂质摩尔比的PEG-c-DOMG、DSPC和胆固醇。在另一个实施方案中，
可以将PEG-c-DOMG替换为PEG脂质如，但不限于PEG-DSG(1,2-二硬脂
酰-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)或PEG-DPG(1,2二棕榈酰-sn-甘油，甲氧基聚
乙二醇)。阳离子脂质可以选自本领域已知的任何脂质，如，但不限于
DLin-MC3-DMA、DLin-DMA、C12-200和DLin-KC2-DMA。

在一个实施方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于国际公开号
WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、
WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、
WO2012044638、WO2010080724、WO201021865和WO2008103276、美国
专利号7,893,302和7,404,969和美国专利公开号US20100036115中描述的阳
离子脂质；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施
方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于在国际公开号WO2012040184、
WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、WO2011043913、
WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365和WO2012044638中描
述的式A；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在又一个实施
方案中，阳离子脂质可以选自，但不限于国际公开号WO2008103276的式
CLI-CLXXIX、美国专利号7,893,302的式CLI-CLXXIX、美国专利号7,404,969
的式CLI-CLXXXXII和美国专利公开号US20100036115的式I-VI；所述文献
的每一篇通过引用的方式完整并入本文。作为一个非限制性例子，阳离子脂
质可以选自(20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-20,23-二烯-10-胺、
(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-9-胺、(1Z,19Z)-N5N-二甲基二十
五碳-16,19-二烯-8-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲基二十二碳-13J16-二烯-5-胺、
(12Z,15Z)-NJN-二甲基二十一碳-12,15-二烯-4-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十
三碳-14,17-二烯-6-胺、(15Z,18Z)-N,N-二甲基二十四碳-15,18-二烯-7-胺、
(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十七碳-18,21-二烯-10-胺、(15Ζ,18Ζ)-Ν,Ν-二甲基二
十四碳-15,18-二烯-5-胺、(14Z,17Z)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-4-胺、
(19Z,22Z)-N,N-二甲基二十八碳-19,22-二烯-9-胺、(18Z,21Z)-N,N-二甲基二十
七碳-18,21-二烯-8-胺、(17Z,20Z)-N,N-二甲基二十六碳-17,20-二烯-7-胺、
(16Z,19Z)-N,N-二甲基二十五碳-16,19-二烯-6-胺、(22Z,25Z)-N,N-二甲基三十
七碳-22,25-二烯-10-胺、(21Z,24Z)-N,N-二甲基三十碳-21,24-二烯-9-胺、
(18Z)-N,N-二甲基二十七碳-18-烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十六碳-17-烯-9-
胺、(19Z,22Z)-NJN-二甲基二十八碳-19,22-二烯-7-胺、N,N-二甲基二十七烷
-10-胺、(20Z,23Z)-N-乙基-N-甲基二十九碳-20J23-二烯-10-胺、1-[(11Z,14Z)-1-
壬基二十碳-11,14-二烯-1-基]吡咯烷、(20Z)-N,N-二甲基二十七碳-20-烯-10-
胺、(15Z)-N,N-二甲基二十七碳-15-烯-10-胺、(14Z)-N,N-二甲基二十九碳-14-
烯-10-胺、(17Z)-N,N-二甲基二十九碳-17-烯-10-胺、(24Z)-N,N-二甲基三十三
碳-24-烯-10-胺、(20Z)-N,N-二甲基二十九碳-20-烯-10-胺、(22Z)-N,N-二甲基
三十六碳-22-烯-10-胺、(16Z)-N,N-二甲基二十五碳-16-烯-8-胺、
(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、(13Z,16Z)-N,N-二甲
基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]
十七碳-8-胺、1-[(1S,2R)-2-己基环丙基]-N,N-二甲基十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲
基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十九碳-10-胺、N,N-二甲基-21-[(1S,2R)-2-辛基环
丙基]二十一碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}
环丙基]十九碳-10-胺、Ν,Ν-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十六碳-8-胺、
Ν,Ν-二甲基H-[(1R,2S)-2-十一基环丙基]十四碳-5-胺、N,N-二甲基
-3-{7-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]庚基}十二碳-1-胺、1-[(1R,2S)-2-庚基环丙
基]-Ν,Ν-二甲基十八碳-9-胺、1-[(1S,2R)-2-癸基环丙基]-N,N-二甲基十五碳-6-
胺、N,N-二甲基-1-[(1S,2R)-2-辛基环丙基]十五碳-8-胺、R-N,N-二甲基
-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、S-N,N-二甲基
-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-{2-[(9Z,12Z)-十
八碳-9,12-二烯-1-基氧]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吡咯烷、(2S)-N,N-二甲基
-1-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-3-[(5Z)-辛-5-烯-1-基氧]丙-2-胺、
1-{2-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]-1-[(辛氧基)甲基]乙基}吖丁啶、
(2S)-1-(己氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、
(2S)-1-(庚氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、
Ν,Ν-二甲基-1-(壬氧基)-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、Ν,Ν-
二甲基-1-[(9Z)-十八碳-9-烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺(化合物9)；(2S)-N,N-
二甲基-1-[(6Z,9Z,12Z)-十八碳-6,9,12-三烯-1-基氧]-3-(辛氧基)丙-2-胺、
(2S)-1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(戊氧基)丙-2-胺、
(2S)-1-(己氧基)-3-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基丙-2-胺、
1-[(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-基氧]-Ν,Ν-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、
1-[(13Z,16Z)-二十二碳-l3,16-二烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、
(2S)-1-[(13Z,16Z)-二十二碳-13,16-二烯-1-基氧]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-
胺、(2S)-1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧]-3-(己氧基)-N,N-二甲基丙-2-胺、
1-[(13Z)-二十二碳-13-烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、1-[(9Z)-十
六碳-9-烯-1-基氧]-N,N-二甲基-3-(辛氧基)丙-2-胺、(2R)-N,N-二甲基-H(1-甲基
辛基)氧]-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、(2R)-1-[(3,7-二甲基辛
基)氧]-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧]丙-2-胺、N,N-二甲
基-1-(辛氧基)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-戊基环丙基]甲基}环丙基]辛基}
氧)丙-2-胺、N,N-二甲基-1-{[8-(2-辛基环丙基)辛基]氧}-3-(辛氧基)丙-2-胺和
(11E,20Z,23Z)-N,N-二甲基二十九碳-11,20,2-三烯-10-胺或其可药用盐或立体
异构体。

在一个实施方案中，阳离子脂质可以通过本领域已知和/或如国际公开号
WO2012040184、WO2011153120、WO2011149733、WO2011090965、
WO2011043913、WO2011022460、WO2012061259、WO2012054365、
WO2012044638、WO2010080724和WO201021865中所述的方法合成；所述
文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA的LNP制剂
可以含有PEG-c-DOMG3％脂质摩尔比。在另一个实施方案中，多核苷酸、
初级构建体和/或mmRNA的LNP制剂可以含有PEG-c-DOMG1.5％脂质摩尔
比。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA的药物组合物
可以包含至少一种在国际公开号2012099755中描述的聚乙二醇化脂质，所述
文献通过引用方式并入本文。

在一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG2000(1,2-二肉豆蔻酰
-sn-甘油酰-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000)。在一个实施方案中，
LNP制剂可以含有PEG-DMG2000、本领域已知的阳离子脂质和至少一个其
他组分。在另一个实施方案中，LNP制剂可以含有PEG-DMG2000、本领域
已知的阳离子脂质、DSPC和胆固醇。作为一个非限制性例子，LNP制剂可
以含有PEG-DMG2000、DLin-DMA、DSPC和胆固醇。作为另一个非限制
性例子，LNP制剂可以含有摩尔比2:40:10:48的PEG-DMG2000、DLin-DMA、
DSPC和胆固醇(参见Geall等人,Nonviraldeliveryofself-amplifyingRNA
vaccines,PNAS2012；PMID:22908294)。

在一个实施方案中，LNP制剂可以由国际公开号WO2011127255或
WO2008103276中描述的方法配制，所述文献的每一篇通过引用的方式完整
并入本文。作为一个非限制性例子，本文所述的修饰的RNA可以是囊化于
如WO2011127255和/或WO2008103276中所述的LNP制剂中；所述文献的
每一篇通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂可以包含聚阳离子组合物。作
为一个非限制性例子，聚阳离子组合物可以选自美国专利公开号
US20050222064的式1-60；所述文献通过引用的方式完整并入本文。在另一
个实施方案中，包含聚阳离子组合物的LNP制剂可以用于体内和/或体外递
送本文所述的修饰的RNA。

在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂可以另外包含渗透促进分子。
非限制的渗透促进分子在美国专利公开号US20050222064中描述；所述文献
通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，药物组合物可以配制在脂质体中，所述脂质体例如
是但不限于DiLa2脂质体(MarinaBiotech,Bothell,WA)、
(MarinaBiotech,Bothell,WA)、基于中性DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆
碱)的脂质体(例如，递送siRNA至卵巢癌(Landen等人,CancerBiology&
Therapy20065(12)1708-1713))和透明质糖包覆的脂质体(QuietTherapeutics,
Israel)。

通过将阳离子脂质替换为称作快速消除性脂质纳米粒子(reLNP)的生物
可降解阳离子脂质，可以改进脂质纳米粒子制剂。可电离阳离子脂质，如，
但不限于DLinDMA、DLin-KC2-DMA和DLin-MC3-DMA，已经显示随时间
推移蓄积在血浆和组织中并且可能是毒性的潜在来源。快速消除性脂质的快
速代谢可以改善脂质纳米粒子在大鼠中的耐受性和治疗指数为从1mg/kg剂
量至10mg/kg剂量的数量级。纳入酶促降级的酯连接可以改善阳离子组分的
降解与代谢谱，同时仍然维持reLNP制剂的活性。酯键可以内在地位于脂质
链内部或它可以末端地位于脂质链的终末端处。内部酯连接可以替换脂质链
中的任何碳。

在一个实施方案中，内部酯连接可以位于饱和碳的任一侧面上。reLNP
的非限制性例子包括

在一个实施方案中，可以通过递送可以包含纳米物质、聚合物和免疫原
的脂质纳米粒子激发免疫反应。(美国公开号20120189700和国际公开号
WO2012099805；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。聚合物
可以囊化纳米物质或部分地囊化纳米物质。

脂质纳米粒子可以经工程化以改变粒子表面特性，从而脂质纳米粒子可
以穿透粘膜屏障。黏液位于黏膜组织上，如但不限于口腔组织(例如，颊部和
食管膜和扁桃体组织)、眼组织、胃肠道组织(例如，胃、小肠、大肠、结肠、
直肠)、鼻组织、呼吸道组织(例如，鼻组织、咽组织、气管和支气管膜)、生
殖器(例如，阴道、颈部和尿道膜)。已经认为优选用于更高药物囊化效率并
提供广泛类型药物的持久递送能力的大于10-200nm的纳米粒子太大，而不
能穿过黏膜屏障快速扩散。黏液被连续分泌、散播、弃去或消化并再循环，
从而大部分截获的粒子可以在数秒内或数小时内从黏膜组织移除。已经用低
分子量聚乙二醇(PEG)致密包覆的大型聚合物纳米粒子(直径200nm-500nm)
穿过黏液的扩散过程仅是相同粒子在水中扩散的四分之一到六分之一(Lai等
人,PNAS2007104(5):1482-487；Lai等人,AdvDrugDelivRev.200961(2):
158-171；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。可以使用渗透
速率和/或荧光显微技术确定纳米粒子的转运，所述荧光显微技术包括但不限
于光漂白后荧光恢复法(FRAP)和高分辨多粒子跟踪法(MPT)。

工程化以渗透黏液的脂质纳米粒子可以包含聚合物(即聚合物芯部)和/或
聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。聚合物可以包括但不限于聚胺、
聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰
胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸
酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳酯。高分子材料可以是生物可降解的
和/或生物相容的。具体聚合物的非限制性例子包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯醋
酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、
聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D,L-丙交
酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D,L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D,L-丙交
酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共-PEO-共-D,L-丙交酯)、聚(D,L-
丙交酯-共-PPO-共-D,L-丙交酯)、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、聚-L-赖氨
酸(PLL)、羟丙基甲基丙烯酸酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟酸)、
聚酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚亚烷基类如
聚乙烯和聚丙烯、聚二醇如聚(乙二醇)(PEG)、聚亚烷基氧化物(PEO)、聚亚
烷基对苯二酸酯类如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯醚、
聚乙烯酯如聚(醋酸乙烯酯)、聚卤乙烯如聚(乙烯氯化物)(PVC)、聚乙烯吡咯
烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生化纤维素如烷基纤维素、羟
烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤
维素、丙烯酸的聚合物、如聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸乙
酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚
(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯
酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八酯)及其共聚
物和混合物、聚二噁烷酮及其共聚物、聚羟基链烷酸酯、聚丙烯延胡索酸酯、
聚氧甲烯、泊洛沙姆、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内
酯)和碳酸三亚甲酯、聚乙烯吡咯烷酮。脂质纳米粒子可以用共聚物包覆或与
之缔合，如，但不限于嵌段共聚物，和(聚(乙二醇)))-(聚(环氧丙烷))-(聚(乙二
醇))三嵌段共聚物(参见美国公开20120121718和美国公开20100003337；所
述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。共聚物可以是通常视作安全
(GRAS)的聚合物并且脂质纳米粒子可以按如此方式形成，从而不产生新化学
实体。例如，脂质纳米粒子可以包含泊洛沙姆包覆的PLGA纳米粒子而不产
生新化学实体，所述PLGA纳米粒子仍然能够快速渗透人黏液(Yang等人,
Angew.Chem.Int.Ed.201150:2597-2600；所述文献通过引用的方式完整并入
本文)。

聚合物-维生素缀合物的维生素可以是维生素E。缀合物的维生素部分可
以用其他的合适组分置换，所述合适组分例如是，但不限于维生素A、维生
素E、其他维生素、胆固醇、其他表面活性剂的疏水性部分或疏水性组分(例
如，固醇链、脂肪酸、烃链和环氧烷烃链)。

经工程化以渗透黏液的脂质纳米粒子可以包含表面改变剂，如，但不限
于mmRNA、阴离子蛋白(例如、牛血清白蛋白)、表面活性剂(例如、阳离子
表面活性剂如例如二甲基双十八烷基-溴化铵)、糖或糖衍生物(例如、环糊精)、
核酸、聚合物(例如、肝素、聚乙二醇和泊洛沙姆)、粘液溶解剂(例如、N-乙
酰半胱氨酸、艾蒿提取物(mugwort)、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、大青属提取
物(clerodendrum)、乙酰半胱氨酸、溴已新(bromhexine)、羧甲司坦
(carbocisteine)、依普拉酮(eprazinone)、美司钠(mesna)、氨溴索(ambroxol)、
索布瑞醇(sobrerol)、多米奥醇(domiodol)、来托司坦(letosteine)、司替罗宁
(stepronin)、硫普罗宁(tiopronin)、凝溶胶蛋白(gelsolin)、胸腺肽β4阿法链道
酶(dornasealfa)、奈替克新(neltenexine)、厄多司坦(erdosteine))和多种DNA
酶、包括rhDNase。表面改变剂可以嵌入或卷入粒子的表面中或布置(例如，
通过包覆、吸附、共价连接或其他过程)在脂质纳米粒子的表面上。(参见美
国公开20100215580和美国公开20080166414；所述文献的每一篇通过引用
的方式完整并入本文)。

渗透黏液的脂质纳米粒子可以包含本文所述的至少一种mmRNA。
mmRNA可以囊化在脂质纳米粒子中和/或设置在粒子的表面上。mmRNA可
以共价偶联于脂质纳米粒子。渗透黏液的脂质纳米粒子的制剂可以包含多个
纳米粒子。另外，制剂可以含有粒子，所述粒子可以与黏液相互作用并改变
周围黏液的结构特性和/或粘附特性以降低黏液粘附作用，这可以增加渗透黏
液的脂质纳米粒子递送至黏膜组织。

在一个实施方案中，将多核苷酸、初级构建体或mmRNA配制为lipoplex，
如，而不限于，来自SilenceTherapeutics(伦敦，英国)的ATUPLEXTM系统、
DACC系统、DBTC系统和其他siRNA-lipoplex技术，来自
(Cambridge,MA)的STEMFECTTM，和基于聚乙烯亚胺(PEI)或鱼精蛋白的定
向及非定向核酸递送(Aleku等人,CancerRes.200868:9788-9798；Strumberg
等人,IntJClinPharmacolTher201250:76-78；Santel等人,GeneTher2006
13:1222-1234；Santel等人,GeneTher200613:1360-1370；Gutbier等人,Pulm
Pharmacol.Ther.201023:334-344；Kaufmann等人,MicrovascRes2010
80:286-293Weide等人,JImmunother.200932:498-507；Weide等人,J
Immunother.200831:180-188；PascoloExpertOpin.Biol.Ther.4:1285-1294；
Fotin-Mleczek等人,2011J.Immunother.34:1-15；Song等人,NatureBiotechnol.
2005,23:709-717；Peer等人,ProcNatlAcadSciUSA.20076；104:4095-4100；
deFougerollesHumGeneTher.200819:125-132；所述文献通过引用的方式完
整并入本文)。

在一个实施方案中，也可以构建这类制剂或改变组合物，从而它们被动
或主动地在体内指向不同细胞类型，包括但不限于肝细胞、免疫细胞、肿瘤
细胞、内皮细胞、抗原呈递细胞和白细胞(Akinc等人,MolTher.2010
18:1357-1364；Song等人,NatBiotechnol.200523:709-717；Judge等人,JClin
Invest.2009119:661-673；Kaufmann等人,MicrovascRes201080:286-293；
Santel等人,GeneTher200613:1222-1234；Santel等人,GeneTher2006
13:1360-1370；Gutbier等人,PulmPharmacol.Ther.201023:334-344；Basha
等人,Mol.Ther.201119:2186-2200；FenskeandCullis,ExpertOpinDrugDeliv.
20085:25-44；Peer等人,Science.2008319:627-630；PeerandLieberman,Gene
Ther.201118:1127-1133；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。向肝脏细
胞被动靶向制剂的一个例子包括DLin-DMA、DLin-KC2-DMA和MC3-基于
的脂质纳米粒子制剂，已经显示所述制剂与载脂蛋白E结合并在体内促进这
些制剂的结合及摄入肝细胞(Akinc等人,MolTher.201018:1357-1364；所述
文献通过引用的方式完整并入本文)。制剂也可以通过在其表面上表达不同配
体被选择性地靶向，作为示例如叶酸靶向、转铁蛋白靶向、N-乙酰半乳糖胺
(GalNAc)和抗体靶向方法，但不限于此(Kolhatkar等人,CurrDrugDiscov
Technol.20118:197-206；Musacchio和Torchilin,FrontBiosci.2011
16:1388-1412；Yu等人,MolMembrBiol.201027:286-298；Patil等人,CritRev
TherDrugCarrierSyst.200825:1-61；Benoit等人,Biomacromolecules.2011
12:2708-2714Zhao等人,ExpertOpinDrugDeliv.20085:309-319；Akinc等人,
MolTher.201018:1357-1364；Srinivasan等人,MethodsMolBiol.2012
820:105-116；Ben-Arie等人,MethodsMolBiol.2012757:497-507；Peer2010J
ControlRelease.20:63-68；Peer等人,ProcNatlAcadSciUSA.2007
104:4095-4100；Kim等人,MethodsMolBiol.2011721:339-353；Subramanya
等人,MolTher.201018:2028-2037；Song等人,NatBiotechnol.2005
23:709-717；Peer等人,Science.2008319:627-630；PeerandLieberman,Gene
Ther.201118:1127-1133；所述文献通过引用的方式完整并入本文)。

在一个实施方案中，将多核苷酸、初级构建体或mmRNA配制为固态脂
质纳米粒子。固态脂质纳米粒子(SLN)可以为球状，平均直径在10至1000nm
之间。SLN拥有可以溶解亲脂分子并可以用表面活性剂和/或乳化剂稳定化的
固态脂质芯部基质。在又一个实施方案中，脂质纳米粒子可以是自装配脂质-
聚合物纳米粒子(参见Zhang等人,ACSNano,2008,2(8),第1696–1702页；
所述文献通过引用的方式完整并入本文)。

脂质体、lipoplex或脂质纳米粒子可以用来改善多核苷酸、初级构建体
或mmRNA指导的蛋白质产生的效率，因为这些制剂可能能够增加多核苷酸、
初级构建体或mmRNA转染细胞；和/或增加所编码蛋白质的翻译。这样一个
例子涉及使用脂质囊化过程以能够有效全身性递送polyplex质粒DNA
(Heyes等人,MolTher.200715:713-720；所述文献通过引用的方式完整并入
本文)。脂质体、lipoplexe或脂质纳米粒子也可以用来增加多核苷酸、初级构
建体或mmRNA的稳定性。

在一个实施方案中，可以配制本发明的多核苷酸、初级构建体和/或
mmRNA，用于控释和/或定向递送。如本文所用，“控释”指符合特定释放模
式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放谱。在一个实施方案中，多核
苷酸、初级构建体或mmRNA可以囊化入本文所述和/或本领域已知的递送剂
中以便控释和/或定向递送。如本文所用，术语“囊化”意指围绕、包围或包裹。
在它涉及本发明化合物的制剂时，囊化可以是基本上的、完全的或部分的。
术语“基本上囊化”意指至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％、99.9％、99.9％或大于99.999％的本发明药物组合物
或化合物可以封闭、包围或包裹在递送剂内部。“部分囊化”意指小于10％、
10％、20％、30％、40％、50％或更少的本发明药物组合物或化合物可以封闭、
包围或包裹在递送剂内部。有利地，可以通过使用荧光和/或电子显微照片测
量本发明药物组合物或化合物的逃逸或活性，测定囊化。例如，至少1％、
5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大99.99％的本发明药物组合物或
化合物囊化在递送剂中。

在另一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以囊化入脂
质纳米粒子或快速消除性脂质纳米粒子中，并且脂质纳米粒子或快速消除性
脂质纳米粒子随后可以囊化入本文所述的和/或本领域已知的聚合物、水凝胶
和/或手术密封剂中。作为一个非限制性例子，聚合物、水凝胶或外科密封剂
可以是PLGA、乙烯醋酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、
(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、(Halozyme
Therapeutics,SanDiegoCA)、外科密封剂如纤维蛋白原聚合物(EthiconInc.
Cornelia,GA)、(BaxterInternational,IncDeerfield,IL)、基于PEG
的密封剂和(BaxterInternational,IncDeerfield,IL)。

在一个实施方案中，脂质纳米粒子可以囊化到本领域已知的可以在注入
受试者时形成凝胶的任何聚合物或水凝胶中。作为另一个非限制性例子，脂
质纳米粒子可以囊化入可以呈生物可降解的聚合物基质中。

在一个实施方案中，用于控释和/或定向递送的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA制剂还可以包含至少一个控释涂料。控释涂料包括但不限于
聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基
甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、
和纤维素衍生物如乙基纤维素含水分散体(和
)。

在一个实施方案中，控释和/或定向递送制剂可以包含至少一种可以含有
聚阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-
丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)及其组合。在另一个实施方案中，
可降解聚酯可以包含PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以
囊化于治疗性纳米粒子中。治疗性纳米粒子可以通过本文所述的和本领域已
知的方法配制，如，但不限于国际公开号WO2010005740、WO2010030763、
WO2010005721、WO2010005723、WO2012054923、美国公开号
US20110262491、US20100104645、US20100087337、US20100068285、
US20110274759、US20100068286和美国专利号8,206,747；所述文献的每一
篇通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，治疗性聚合物纳米
粒子可以通过美国公开号US20120140790中描述的方法鉴定，所述文献通过
引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，可以配制治疗性纳米粒子用于缓释。如本文所用，“缓
释”指在特定时间段范围内符合释放速率的药物组合物或化合物。时间段可以
包括，但不限于数小时、数天、数周、数月和数年。作为一个非限制性例子，
缓释纳米粒子可以包含聚合物和治疗药，如，但不限于本发明的多核苷酸、
初级构建体和mmRNA(参见国际公开号2010075072和美国公开号
US20100216804和US20110217377，所述文献的每一篇通过引用的方式完整
并入本文)。

在一个实施方案中，可以配制治疗性纳米粒子使其具有靶特异性。作为
一个非限制性例子，治疗性纳米粒子可以包含皮质类固醇(参见国际公开号
WO2011084518)。在一个实施方案中，可以配制治疗性纳米粒子使其具有癌
特异性。作为一个非限制性例子，治疗性纳米粒子可以配制在国际公开号
WO2008121949、WO2010005726、WO2010005725、WO2011084521和美国
公开号US20100069426、US20120004293和US20100104655中描述的纳米粒
子中，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，本发明的纳米粒子可以包含聚合物基质。作为一个
非限制性例子，纳米粒子可以包含两种或更多种聚合物，如但不限于聚乙烯、
聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚
醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚
丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚
赖氨酸、聚(乙烯)亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟
-L-脯氨酸酯)或其组合。

在一个实施方案中，双嵌段共聚物可以包含与以下聚合物组合的PEG，
如但不限于聚乙烯、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、
聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、
聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、
聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯)亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-
共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)或其组合。

在一个实施方案中，治疗性纳米粒子包含双嵌段共聚物。作为一个非限
制性例子，治疗性纳米粒子包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见美国公开号
US20120004293和美国专利号8,236,330，通过引用的方式完整并入本文)。
在另一个非限制性例子中，治疗性纳米粒子是包含PEG和PLA或PEG和
PLGA的双嵌段共聚物的隐形纳米粒子(参见美国专利号8,246,968，所述文献
的每一篇通过引用方式完整并入本文)。

在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含至少一种丙烯酸聚合物。
丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚
物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、氨
基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯
及其组合。

在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含本文所述的和/或本领域已
知的至少一种阳离子聚合物。

在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含至少一种含胺聚合物，如，
但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰氨基胺)树状物及其组合。

在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包含至少一种可以含有聚阳离
子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-
共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)及其组合。在另一个实施方案中，可降解
聚酯可以包含PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。

在另一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以包括至少一种导引配体的缀
合。

在一个实施方案中，治疗性纳米粒子可以配制在可以用来靶向癌的水溶
液中(参见国际公开号WO2011084513和美国公开号US20110294717，所述文
献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以囊化于合成
的纳米载体中、与之连接和/或缔合。可以使用本领域已知的和/或本文所述
的方法配制合成的纳米载体。作为一个非限制性例子，合成纳米载体可以通
过国际公开号WO2010005740、WO2010030763和美国公开号
US20110262491、US20100104645和US20100087337中描述的方法配制，所
述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，合成
纳米载体制剂可以通过国际公开号WO2011072218和美国专利号8,211,473
中描述的方法冻干；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，合成纳米载体可以含有反应基团以释放本文所述的
多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA(参见国际公开号WO20120952552和美
国公开号US20120171229，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本
文)。

在一个实施方案中，合成纳米载体可以含有免疫刺激剂以增强来自递送
合成纳米载体的免疫反应。作为一个非限制性例子，合成纳米载体可以包含
Th1免疫刺激性剂，所述Th1免疫刺激性剂可以增强基于Th1的免疫系统反
应(参见国际公开号WO2010123569和美国公开号US20110223201，所述文献
的每一篇通过引用方式完整并入本文)。

在一个实施方案中，可以配制合成纳米载体用于定向释放。在一个实施
方案中，配制合成纳米载体使其在指定的pH和/或在所需的时间区间后释放
多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA。作为一个非限制性例子，可以配制合
成性纳米粒子以在24小时后和/或在pH4.5释放多核苷酸、初级构建体和/
或mmRNA(参见国际公开号WO2010138193和WO2010138194和美国公开
号US20110020388和US20110027217，所述文献的每一篇通过引用的方式完
整并入本文)。

在一个实施方案中，可以配制合成纳米载体用于控释和/或缓释本文所述
的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA。作为一个非限制性例子，用于缓释
的合成纳米载体可以通过本领域已知、本文所述和/或如国际公开号
WO2010138192和美国公开号20100303850中所述的方法配制，所述文献的
每一篇通过引用的方式完整并入本文。

聚合物、生物可降解纳米粒子和核-壳纳米粒子

可以使用天然和/或合成聚合物配制本发明的多核苷酸、初级构建体和
mmRNA。可以用于递送的聚合物的非限制性例子包括但不限于来自
Bio(Madison,WI)和RocheMadison(Madison,WI)的Dynamic
POLYCONJUGATE^TM制剂、PHASERX^TM聚合物制剂，如，而不限于SMARTT
POLYMERTECHNOLOGY^TM(Seattle,WA)、DMRI/DOPE、泊洛沙姆、来自
Vical(SanDiego,CA)的辅助剂、壳聚糖、来自Calando
Pharmaceuticals(Pasadena,CA)的环糊精、树状物和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)
聚合物。RONDEL^TM(RNAi/寡核苷酸纳米粒子递送)聚合物(Arrowhead
ResearchCorporation,Pasadena,CA)和pH响应性嵌段共聚合物，如，但不限
于PHASERX^TM(Seattle,WA)。

PLGA制剂的非限制性例子包括但不限于PLGA可注射用储库(例如，通
过在66％N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中溶解PLGA而形成并且剩余部分是水
溶剂和亮丙瑞林的一旦注射，则PLGA和亮丙瑞林肽沉淀至
皮下腔隙中)。

许多的这些聚合物方案已经证明了在体内递送寡核苷酸至细胞胞质中的
功效(在deFougerollesHumGeneTher.200819:125-132中综述；所述文献通
过引用的方式完整并入本文)。已经引起显著的核酸体内递送(在这种情况下
是是使用小干扰性RNA(siRNA))的两种聚合物方案是动态聚缀合物(dynamic
polyconjugate)和基于环糊精的纳米粒子。这些递送方案的第一种使用动态聚
缀合物并且已经显示在体内在小鼠中有效递送siRNA并沉默肝细胞中的内
源靶mRNA(Rozema等人,ProcNatlAcadSciUSA.2007104:12982-12887)。
这种具体方案是多组分聚合物体系，其关键特征包括有膜活性的聚合物，所
述聚合物通过二硫键与核酸(在这种情况下是siRNA)共价偶联并且其中
PEG(用于电荷掩蔽)基团和N-乙酰半乳糖胺(用于肝细胞靶向)基团均通过pH
敏感键连接(Rozema等人,ProcNatlAcadSciUSA.2007104:12982-12887)。
一旦与肝细胞结合并进入内体中，聚合物复合物在低pH环境中分解，聚合
物暴露其正电荷，导致siRNA逃逸内体以及从聚合物的胞质释放。通过将
N-乙酰半乳糖胺基团替换为甘露糖基团，显示可以将靶向作用从表达脱唾液
酸糖蛋白受体的肝细胞改变成窦样内皮和枯否细胞。另一个聚合物方案涉及
使用靶向转铁蛋白的含有环糊精的聚阳离子纳米粒子。这些纳米粒子具有已
证明的靶向沉默表达转铁蛋白受体的Ewing肉瘤细胞中的EWS-FLI1基因产
物(Hu-Lieskovan等人,CancerRes.200565:8984-8982)并且在这些纳米粒子中
配制的siRNA在非人灵长类中耐受良好(Heidel等人,ProcNatlAcadSciUSA
2007104:5715-21)。这两种递送策略均合并了同时使用靶向递送和内体逃逸
机理的理性方案。

聚合物制剂可以允许缓释或延迟释放多核苷酸、初级构建体或mmRNA
(例如，在肌内或皮下注射之后)。改变的多核苷酸、初级构建体或mmRNA
释放谱可以导致，例如，在延长的时间段范围内翻译编码的蛋白质。聚合物
制剂也可以用来增加多核苷酸、初级构建体或mmRNA的稳定性。生物可降
解聚合物先前已经用来保护除mmRNA之外的核酸免于降解并且已经显示导
致酬载(payload)在体内缓释(Rozema等人,ProcNatlAcadSciUSA.2007
104:12982-12887；Sullivan等人,ExpertOpinDrugDeliv.20107:1433-1446；
Convertine等人,Biomacromolecules.2010Oct1；Chu等人,AccChemRes.
2012Jan13；Manganiello等人,Biomaterials.201233:2301-2309；Benoit等人,
Biomacromolecules.201112:2708-2714；Singha等人,NucleicAcidTher.2011
2:133-147；deFougerollesHumGeneTher.200819:125-132；Schaffert和Wagner,
GeneTher.200816:1131-1138；Chaturvedi等人,ExpertOpinDrugDeliv.2011
8:1455-1468；Davis,MolPharm.20096:659-668；Davis,Nature2010
464:1067-1070；所述文献的每一篇通过引用方式完整并入本文)。

在一个实施方案中，药物组合物可以是缓释制剂。在又一个实施方案中，
缓释制剂可以用于皮下递送。缓释制剂可以包括但不限于PLGA微球、乙烯
醋酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,
FL)、(HalozymeTherapeutics,SanDiegoCA)、外科密封剂如纤
维蛋白原聚合物(EthiconInc.Cornelia,GA)、(BaxterInternational,
IncDeerfield,IL)、基于PEG的密封剂和(BaxterInternational,Inc
Deerfield,IL)。

作为一个非限制性例子，修饰的mRNA可以通过以下方式配制在PLGA
微球中：制备具有可调释放速率(例如，数日和数周)的PLGA微球并将修饰
的mRNA囊化在PLGA微球中，同时在囊化过程期间维持修饰的mRNA的
完整性。EVAc是生物不可降解的生物相容性聚合物，所述聚合物广泛地用
于中临床前缓释植入物应用(例如，延长释放产品Ocusert，用于青光眼的毛
果芸香碱眼科用插入物，或progestasert，孕酮缓释子宫内装置；透皮递送系
统Testoderm、Duragesic和Selegiline；导管)。泊洛沙姆F-407NF是一种亲
水性、非离子型表面活性聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物，其在
低于5℃的温度具有低粘度并在高于15℃的温度形成固态凝胶。基于PEG
的外科密封剂包含在输送装置中混合的两种合成的PEG组分，其可以在1
分钟内准备好，在3分钟内密封并且在30天内重吸收。和天然聚
合物能够在施用部位原位凝胶化。它们已经显示通过离子相互作用与治疗性
候选蛋白质和肽相互作用以提供稳定化作用。

也可以通过表达不同配体选择性地靶向聚合物制剂，作为示例所述配体
如叶酸、转铁蛋白和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，但不限于此(Benoit等人,
Biomacromolecules.201112:2708-2714；Rozema等人,ProcNatlAcadSciUS
A.2007104:12982-12887；Davis,MolPharm.20096:659-668；Davis,Nature
2010464:1067-1070；所述文献的每一篇通过引用方式完整并入本文)。

本发明的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以用聚合化合物配制或
配制在其中。聚合物可以包括至少一种聚合物，如但不限于聚乙烯、聚乙二
醇(PEG)、聚(l-赖氨酸)(PLL)、接枝至PLL的PEG、阳离子脂质聚合物、生
物可降解的阳离子脂质聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、交联分枝型聚(亚烷基亚
胺)、聚胺衍生物、改性泊洛沙姆、生物可降解的聚合物、生物可降解的嵌段
共聚物、生物可降解的随机共聚物、生物可降解的聚酯共聚物、生物可降解
的聚酯嵌段共聚物、生物可降解的聚酯嵌段随机共聚物、线型生物可降解的
共聚物、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸)(PAGA)、生物可降解的交联型阳离子
多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酐、聚羟酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰
胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨
酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯
乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-
赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)、丙烯酸聚合物、含胺聚合物或其组合。

作为一个非限制性例子，本发明的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA
可以用PLL接枝的PEG的聚合化合物配制，如通过引用的方式完整并入本
文的美国专利号6,177,274中所述。该制剂可以用于体外转染细胞或用于体内
递送多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA。在另一个例子中，多核苷酸、初
级构建体和/或mmRNA可以是悬浮在含有阳离子聚合物的溶液或介质中、干
燥药物组合物中或能够被干燥的溶液中，如美国公开号20090042829和
20090042825中所述，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

作为另一个非限制性例子，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA
可以用PLGA-PEG嵌段共聚物配制(参见美国公开号US20120004293和美国
专利号8,236,330，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。作为
一个非限制性例子，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用PEG
和PLA或PEG和PLGA的双嵌段共聚物配制(参见美国专利号8,246,968，所
述文献通过引用的方式完整并入本文)。

聚胺衍生物可以用来递送核酸或治疗和/或预防疾病或纳入到可植入或
可注射的装置中(通过引用的方式完整并入本文的美国公开号20100260817)。
作为一个非限制性例子，药物组合物可以包括在美国公开号20100260817中
描述的修饰的核酸和mmRNA及聚胺衍生物(所述文献的内容通过引用的方
式完整并入本文)。

本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用至少一种丙烯酸聚合
物配制。丙烯酸聚合物包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙
烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧乙酯、甲基丙烯酸氰
乙酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基
丙烯酸酯及其组合。

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用
国际公开号WO2011115862、WO2012082574和WO2012068187中描述的至
少一种聚合物配制，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在另
一个实施方案中，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用如
WO2011115862中所述的式Z聚合物配制，所述文献通过引用的方式完整并
入本文。在又一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用如
WO2012082574或WO2012068187中所述的式Z、Z’或Z”聚合物配制，所述
文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。用本发明的修饰的RNA配制
的聚合物可以通过WO2012082574或WO2012068187中描述的方法合成，所
述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

本发明多核苷酸、初级构建体或mmRNA的制剂可以包含至少一种含胺
聚合物，如，但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰氨基胺)树状物或其组
合。

例如，本发明的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以配制在药物化
合物中，所述药物化合物包括聚(亚烷亚胺)、生物可降解的阳离子脂质聚合
物、生物可降解的嵌段共聚物、生物可降解聚合物或生物可降解的随机共聚
物、生物可降解的聚酯嵌段共聚物、生物可降解的聚酯聚合物、生物可降解
的聚酯随机共聚物、生物可降解的线型共聚物、PAGA、生物可降解的交联
阳离子的多嵌段共聚物或其组合。可以通过本领域已知的和/或在美国专利号
6,696,038、美国申请号20030073619和20040142474中描述的方法产生生物
可降解的阳离子脂质聚合物，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本
文。可以使用本领域已知的和/或如美国公开号20100004315中所述的方法产
生聚(亚烷基亚胺)，所述文献通过引用的方式完整并入本文。可以使用本领
域已知的和/或如美国专利号6,517,869和6,267,987中所述的方法产生生物可
降解的聚合物、生物可降解的嵌段共聚物、生物可降解的随机共聚物、生物
可降解的聚酯嵌段共聚物、生物可降解的聚酯聚合物或生物可降解的聚酯随
机共聚物，所述每篇文献的内容通过引用的方式完整并入本文。可以使用本
领域已知的和/或如美国专利号6652886中所述的方法产生生物可降解的线
型共聚物。可以使用本领域已知的和/或如美国专利号6,217,91中所述的方法
产生PAGA聚合物，所述文献通过引用的方式完整并入本文。PAGA聚合物
可以与聚合物如但不限于聚-L-赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、组蛋白、抗生
物素蛋白、鱼精蛋白、聚乳酸和聚(丙交酯-共-乙交酯)共聚以形成共聚物或嵌
段共聚物。可以通过本领域已知的和/或在美国专利号美国专利号8,057,821
或美国公开号2012009145中描述的方法产生生物可降解的交联的阳离子多
嵌段共聚物，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。例如，可以
使用嵌段合成多嵌段共聚物，与分枝的聚乙烯亚胺相比，所述线型聚乙烯亚
胺(LPEI)嵌段具有不同样式。另外，可以通过本领域已知、本文所述或如美
国公开号20100004315或美国专利号6,267,987和6,217,912中所述的方法产
生组合物或药物组合物，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以用可以含有聚阳离子侧
链的至少一种可降解聚酯配制。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-
丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟-L-脯氨酸酯)及其组合。在另一个实施方案中，
可降解聚酯可以包含PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。

在一个实施方案中，本文所述的聚合物可以缀合至脂质封端的PEG。作
为一个非限制性例子，PLGA可以缀合至形成脂质封端的PEG，形成
PLGA-DSPE-PEG。作为另一个非限制性例子，国际公开号WO2008103276
中描述了随本发明一起使用的PEG缀合物，所述文献通过引用的方式完整并
入本文。

在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可
以与另一种化合物缀合。缀合物的非限制性例子在美国专利号7,964,578和
7,833,992中描述，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。在另一
个实施方案中，本发明的多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以缀合至如
美国专利号7,964,578和7,833,992中所述的式1-122的缀合物，所述文献的
每一篇通过引用的方式完整并入本文。

如通过引用方式完整并入本文的美国公开号20100004313中所述，基因
递送组合物可以包含核苷酸序列和泊洛沙姆。例如，本发明的多核苷酸、初
级构建体和/或mmRNA可以用于美国公开号20100004313中描述的含有泊洛
沙姆的基因递送组合物中。

在一个实施方案中，本发明的聚合物制剂可以通过以下方式稳定化：将
可以包括阳离子载体的聚合物制剂与可以共价连接至胆固醇和聚乙二醇基团
的阳离子脂质聚合物接触。可以使用美国公开号20090042829中描述的方法，
使聚合物制剂与阳离子脂质聚合物接触，所述文献通过引用的方式完整并入
本文。阳离子载体可以包括，但不限于聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四
亚甲基亚胺)、聚亚丙基亚胺、氨基糖甙类-聚胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、
精胺、亚精胺、聚甲基丙烯酸(2-二甲氨基)乙酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、
聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状物、壳聚糖、1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙
烷)(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、
1-[2-(油酰氧)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑鎓(DOTIM)、2,3-二油基氧基
-N-[2(精胺羰酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、
3B-[N-(N’,N’-二甲氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HCl)、双十
七烷基氨基甘氨酰亚精胺(DOGS)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵
(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵
(DMRIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵DODAC)及其组合。

也可以使用聚合物、脂质和/或其他生物可降解物质(如，但不限于磷酸
钙)的组合，将本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA配制为纳米粒子。
各组分可以在核-壳、杂合和/或层-接-层构造中合并，以允许精细调节纳米粒
子，从而可以增强多核苷酸、初级构建体和mmRNA的递送(Wang等人,Nat
Mater.20065:791-796；Fuller等人,Biomaterials.200829:1526-1532；DeKoker
等人,AdvDrugDelivRev.201163:748-761；Endres等人,Biomaterials.2011
32:7721-7731；Su等人,MolPharm.2011Jun6；8(3):774-87；所述文献通过引
用的方式完整并入本文)。

与脂质和/或聚合物组合的生物可降解磷酸钙纳米粒子已经显示在体内
递送多核苷酸、初级构建体和mmRNA。在一个实施方案中，脂质包覆的磷
酸钙纳米粒子(其还可以含有靶向配体如茴香酰胺)可以用来递送本发明的多
核苷酸、初级构建体和mmRNA。例如，为了在小鼠转移性肺模型中有效递
送siRNA，使用脂质包覆的磷酸钙纳米粒子(Li等人,JContrRel.2010142:
416-421；Li等人,JContrRel.2012158:108-114；Yang等人,MolTher.2012
20:609-615)。这种递送系统结合靶向的纳米粒子和增强内体逃逸的组分(磷酸
钙)，以改善siRNA的递送。

在一个实施方案中，磷酸钙连同PEG-聚阴离子嵌段共聚物可以用来递送
多核苷酸、初级构建体和mmRNA(Kazikawa等人,JContrRel.2004
97:345-356；Kazikawa等人,JContrRel.2006111:368-370)。

在一个实施方案中，PEG-电荷可转化聚合物(Pitella等人,Biomaterials.
201132:3106-3114)可以用来形成递送本发明的多核苷酸、初级构建体和
mmRNA的纳米粒子。PEG-电荷可转化聚合物可以通过在酸性pH被切割成
聚阳离子而改善PEG-聚阴离子嵌段共聚物，，由此增强内体逃逸。

核-壳纳米粒子的用途还致力于高通量方案以合成阳离子交联纳米凝胶
芯部和各种壳(Siegwart等人,ProcNatlAcadSciUSA.2011
108:12996-13001)。可以通过改变纳米粒子的芯部组分和壳组分两者的化学组
成，精确地控制聚合物纳米粒子的复合、递送和内化。例如，核-壳纳米粒子
可以在其将胆固醇与纳米粒子共价连接后有效地递送siRNA至小鼠肝细胞。

在一个实施方案中，包含PLGA中间层和含有PEG的中性脂质外层的中
空脂质芯部可以用来递送本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA。作为
一个非限制性例子，在携带表达萤光素酶的肿瘤的小鼠中，确定与常规的
lipoplex相比，脂质-聚合物-脂质杂合纳米粒子显著地抑制萤光素酶表达(Shi
等人,AngewChemIntEd.201150:7027-7031)。

肽和蛋白质

本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以随肽和/或蛋白质一起配
制，以提高所述多核苷酸、初级构建体或mmRNA对细胞的转染。在一个实
施方案中，诸如但不限于细胞渗透性肽的肽和能够实现胞内递送的蛋白质和
肽，可以用来递送药物制剂。可以随本发明药物制剂使用的细胞渗透性肽的
非限制性例子包括与促进递送至细胞内间隙的聚阳离子连接的细胞渗透肽序
列，例如，HIV衍生的TAT肽、渗透素(penetratin)、transportan或hCT衍生
的细胞渗透肽(参见，例如，Caron等人,Mol.Ther.3(3):310-8(2001)；Langel,
Cell-PenetratingPeptides:ProcessesandApplications(CRCPress,BocaRaton
FL,2002)；El-Andaloussi等人,Curr.Pharm.Des.11(28):3597-611(2003)；和
Deshayes等人,Cell.Mol.LifeSci.62(16):1839-49(2005)，所述全部文献均通
过引用的方式并入本文)。也可以配制组合物使其包含增强该组合物递送至细
胞内间隙的细胞渗透物质，例如，脂质体。本发明的多核苷酸、初级构建体
和mmRNA可以与肽和/或蛋白质复合，如，但不限于来自AileronTherapeutics
(Cambridge,MA)和PermeonBiologics(Cambridge,MA)的肽和/或蛋白质，以
实现胞内递送(Cronican等人,ACSChem.Biol.20105:747-752；McNaughton
等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2009106:6111-6116；Sawyer,ChemBiolDrug
Des.200973:3-6；VerdineandHilinski,MethodsEnzymol.2012；503:3-332；503：
3-33；所述全部文献均通过引用的方式完整并入本文)。

在一个实施方案中，细胞渗透性多肽可以包含第一结构域和第二结构域。
第一结构域可以包含超正电荷的多肽。第二结构域可以包含蛋白质-结合配偶
体。如本文所用，“蛋白质-结合配偶体”包括，但不限于抗体及其功能性片段、
支架蛋白或肽。细胞渗透性多肽还可以包含针对蛋白质-结合配偶体的胞内结
合配偶体。细胞渗透性多肽可能能够从其中可以引入多核苷酸、初级构建体
或mmRNA的细胞分泌出来。

包含肽或蛋白质的制剂可以用来通过多核苷酸、初级构建体或mmRNA
的细胞转染，改变多核苷酸、初级构建体或mmRNA的生物分布(例如，通过
靶向特定组织或细胞类型)，和/或增加所编码蛋白质的翻译。

细胞

可以将本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA离体转染至细胞中，
所述细胞随后移植至受试者中。作为非限制性例子，药物组合物可以包含向
肝和髓样细胞递送修饰的RNA的红细胞、在病毒样粒子(VLP)中递送修饰的
RNA的病毒体和电穿孔的递送修饰的RNA的细胞，如，但不限于来自
(Gaithersburg,MD)和来自(Lyon,法国)的细胞。已
经文献报告了使用红细胞、病毒粒子和电穿孔的细胞递送除mmRNA之外的
酬载的例子(Godfrin等人,ExpertOpinBiolTher.201212:127-133；Fang等人,
ExpertOpinBiolTher.201212:385-389；Hu等人,ProcNatlAcadSciUSA.
2011108:10980-10985；Lund等人,PharmRes.201027:400-420；Huckriede等
人,JLiposomeRes.2007；17:39-47；Cusi,HumVaccin.20062:1-7；deJonge等
人,GeneTher.200613:400-411；所述全部文献均通过引用的方式完整并入本
文)。

可以在通过国际公开号WO2011085231和美国公开号20110171248中所
述方法合成的合成性VLP中递送多核苷酸、初级构建体和mmRNA，所述文
献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

本发明多核苷酸、初级构建体和mmRNA的基于细胞的制剂可以用来确
保细胞转染(例如，在细胞载体中)、改变多核苷酸、初级构建体或mmRNA
的生物分布(例如，通过靶向细胞载体到特定组织或细胞类型)和/或增加所编
码蛋白质的翻译。

多种方法是本领域已知的并且适于将核酸引入细胞中，包括病毒介导和
非病毒介导的技术。非病毒介导的常见技术的例子包括但不限于电穿孔法、
磷酸钙介导的转移法、核转染法、声致穿孔法(sonoporation)、热休克法、磁
性转染、脂质体介导的转移法、微注射法、微抛射体介导的转移法(纳米粒子)、
阳离子聚合物介导的转移法(DEAE-葡聚糖、聚乙烯亚胺、聚乙二醇(PEG)等)
或细胞融合法。

声致穿孔技术或细胞超声处理是利用声音(例如，超声频率)以调节细胞
质膜的通透性。声致穿孔法是本领域那些技术人员已知的并且用来在体内递
送核酸(Yoon和Park,ExpertOpinDrugDeliv.20107:321-330；Postema和Gilja,
CurrPharmBiotechnol.20078:355-361；Newman和Bettinger,GeneTher.2007
14:465-475；全部通过引用的方式完整并入本文)。声致穿孔法是本领域已知
的并且当它涉及细菌时还例如在美国专利公开20100196983中教授并且当它
涉及细菌时还例如在美国专利公开20100009424中教授，所述每篇文献通过
引用的方式完整并入本文。

电穿孔技术也是本领域熟知的并用来在体内和临床上递送核酸(Andre等
人,CurrGeneTher.201010:267-280；Chiarella等人,CurrGeneTher.2010
10:281-286；Hojman,CurrGeneTher.201010:128-138；全部文献通过引用的
方式完整并入本文)。在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA
可以通过如实施例26中所述的电穿孔法递送。

透明质酸

肌内或皮下局部注射本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以包
含透明质酸酶，所述酶催化透明质糖的水解。通过催化透明质糖(间质屏障的
组分)水解，透明质酸酶降低了透明质糖的粘度，因而增加了组织通透性(Frost,
ExpertOpin.DrugDeliv.(2007)4:427-440；所述文献通过引用的方式完整并入
本文)。它可用于加速其分散和由转染细胞产生的编码蛋白质的全身性分布。
备选地，透明质酸酶可以用来增加暴露于肌内或皮下施用的本发明多核苷酸、
初级构建体或mmRNA的细胞的数目。

纳米粒子模拟物

本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以囊化在纳米粒子模拟物
内部和/或吸附到其上。纳米粒子模拟物可以模拟执行递送功能的生物或粒
子，如但不限于病原体、病毒、细菌、真菌、寄生体、朊病毒和细胞。作为
一个非限制性例子，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以囊化于
能够模拟病毒递送功能的非病毒子粒子(参见国际公开号WO2012006376，所
述文献通过引用的方式完整并入本文)。

纳米管

本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以连接或否则结合于至少
一个纳米管，如，但不限于莲座丛纳米管、具有孪生基部连同接头的莲座丛
纳米管、碳纳米管和/或单壁碳纳米管。多核苷酸、初级构建体或mmRNA可
以通过各种力如，但不限于立体力、离子力、共价力和/或其他力与纳米管结
合。

在一个实施方案中，纳米管可以释放一种或多种多核苷酸、初级构建体
或mmRNA至细胞中。可以改变至少一种纳米管的大小和/或表面结构，从而
掌控纳米管在身体内部的相互作用和/或以连接或结合至本文公开的多核苷
酸、初级构建体或mmRNA。在一个实施方案中，可以改变与至少一种纳米
管的结构单元连接的结构单元和/或官能团以调节纳米管的尺度和/或特性。
作为一个非限制性例子，可以改变纳米管的长度以阻止纳米管穿过正常血管
壁中的孔，但是仍然足够小以穿过肿瘤组织的血管中的较大孔。

在一个实施方案中，至少一种纳米管也可以用增强递送的化合物包覆，
所述化合物包括聚合物，如，但不限于聚乙二醇。在另一个实施方案中，至
少一种纳米管和/或多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以与可药用赋形剂和
/或递送溶媒混合。

在一个实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA连接和/或否则结
合于至少一种莲座丛纳米管。莲座丛纳米管可以通过本领域已知的方法/或通
过国际公开号WO2012094304中描述的方法形成，所述文献通过引用的方式
完整并入本文。至少一种多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以通过如国
际公开号WO2012094304中所述的方法连接和/或否则结合于至少一种莲座
丛纳米管，所述文献通过引用的方式完整并入本文，其中将莲座丛纳米管或
形成莲座丛纳米管的模块在含有至少一种多核苷酸、初级构建体和/或
mmRNA的含水介质中，在可以造成至少一种多核苷酸、初级构建体或
mmRNA连接或否则结合于莲座丛纳米管的条件下混合。

缀合物

本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA包含与载体或靶向基团共价
连接或包含两个编码区的缀合物，如多核苷酸、初级构建体或mmRNA，所
述两个编码区一起产生融合蛋白(例如，携带靶向基团和治疗性蛋白或肽)。

本发明的缀合物可以包含天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋
白(HSA)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；糖类(例如，
葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或脂质。
配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如，合成的聚氨基酸、寡
核苷酸(例如适配体)。聚氨基酸的例子包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(PLL)、
聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-
乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚
物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、
N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的例子包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨
酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟物聚胺、树状物聚胺、
精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子的卟啉、多胺季盐或α螺旋肽。

教授制备多核苷酸缀合物、尤其RNA缀合物的代表性美国专利包括但
不限于，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；
5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；
5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；
4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；
4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；
5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；
5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203,5,451,463；5,510,475；5,512,667；
5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；
5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；
6,783,931；6,900,297；7,037,646；所述文献的每一篇通过引用的方式完整并
入本文。

在一个实施方案中，本发明的缀合物可以作为本发明多核苷酸、初级构
建体和/或mmRNA的载体发挥作用。缀合物可以包含阳离子聚合物如，但不
限于与聚(乙二醇)接枝的聚胺、聚赖氨酸、聚亚烷基亚胺和聚乙烯亚胺。作
为一个非限制性例子，缀合物可以类似于聚合缀合物并且合成聚合缀合物的
方法在通过引用的方式完整并入本文的美国专利号6,586,524中描述。

缀合物还可以包含靶向基团，例如，与特定的细胞类型如肾细胞结合的
细胞或组织靶向剂，例如，凝集素，糖蛋白，脂质或蛋白质，例如，抗体。
靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质
A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙
酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁
蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、
叶酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适配体。

靶向基团可以是蛋白质，例如，糖蛋白，或肽，例如，对辅助配体具有
特异亲和力的分子，或抗体，例如，与特定细胞类型如癌细胞、内皮细胞或
骨细胞结合的抗体。靶向基团还可以包括激素和激素受体。它们也可以包括
非肽物质，如脂类、凝集素、糖类、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳
糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖或适配
体。配体可以是例如脂多糖或p38MAP激酶的激活物。

靶向基团可以是能够靶向特定受体的任何配体。例子包括，而不限于叶
酸、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、适配体、整联蛋白受体配体、
趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、
GCPII、生长抑素、LDL和HDL配体。在具体的实施方案中，靶向基团是适
配体。适配体可以未经修饰或具有本文公开的修饰的任何组合。

在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以包括化学性修饰，如，但
不限于与锁核酸相似的修饰。

教导锁核酸(LNA)制备的代表性美国专利，如来自Santaris的那些，包括
但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；
7,053,207；7,084,125；和7,399,845，所述专利的每一份通过引用的方式完整
并入本文。

教授制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号
5,539,082；5,714,331；和5,719,262，所述文献的每一篇通过引用的方式并入
本文。对PNA化合物的其他教授内容可以在例如Nielsen等人,Science,1991,
254,1497-1500中找到。

本发明中表征的一些实施方案中包括的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA具有硫代磷酸酯骨架和寡核苷，所述寡核苷具有其他修饰的骨架，，
并且尤其-上文所提及美国专利号5,489,677的CH₂-NH-CH₂-、
-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-[称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、
-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-和-N(CH₃)-CH₂-CH₂-[其中天
然磷酸二酯骨架表述为-O-P(O)₂-O-CH₂-]，以及上文所参考的美国专利号
5,602,240的酰胺骨架。在一些实施例中，本文表征的多核苷酸具有上文所提
及的美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构。

在2’位置处的修饰也可以有助于递送。优选地，在2’位置处的修饰不位
于编码多肽的序列中，即，不位于可翻译区域中。在2’位置处的修饰可以位
于5’UTR、3’UTR和/或加尾区。在2’位置处的修饰可以在2’位置包含以下
之一：H(即，2’-脱氧)；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或
N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的
C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基和炔基。示例的合适修饰包括O[(CH₂)_nO]_mCH₃、
O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂和
O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂，其中n和m是1至约10。在其他实施方案中，多
核苷酸、初级构建体或mmRNA在2’位置包含以下之一：C₁至C₁₀低级烷基、
取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、
Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂
环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割
基团、报道基团、嵌入剂、用于改善药物代谢动力学特性的基团、或用于改
善药效特征的基团和具有相似特性的其他取代基。在一些实施例中，修饰包
括2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH₂CH₂OCH₃，也称作2’-O-(2-甲氧乙基)或
2’-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)即，烷氧基-烷氧基。
另一个示例性修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基，即，O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，
也称作2’-DMAOE，如下文实施例中所述，和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在
本领域中也称作2’-O-二甲基氨基乙氧乙基或2’-DMAEOE)，即，
2’-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂，也在下文实施例中描述。其他修饰包括2’-甲氧基
(2’-OCH₃)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH₂CH₂CH₂NH₂)和2’-氟(2’-F)。相似修饰也
可以在其他位置作出，尤其在3’末端核苷酸上或在2’-5’连接的dsRNA中的
糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。本发明的多核苷酸也可以具有糖模拟
物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基。教授制备这类修饰糖结构的代表性美国
专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；
5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；
5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；
5,670,633及5,700,920，并且所述文献的每一篇通过引用的方式并入本文。

在另外的实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA共价缀合至细
胞渗透性多肽。细胞渗透肽还可以包含信号序列。本发明的缀合物可以设计
成具有增加的稳定性；增加的细胞转染；和/或改变的生物分布(例如，靶向
特定组织或细胞类型)。

自装配的核酸纳米粒子

自装配的纳米粒子具有可以精确控制的充分界定的尺度，因为核酸链可
以容易地再编程。例如，靶向癌的纳米递送载体的最佳粒度是20-100nm，
因为大于20nm的直径避免肾清除并通过增强的渗透性和滞留效应而增强递
送到某些肿瘤。使用自装配的核酸纳米粒子，获得大小和形状均匀的单一群
体，其具有精确受控的靶向癌的配体的空间取向和密度以增强递送。作为一
个非限制性例子，使用短DNA片段和治疗性siRNA的可编程自装配过程，
制备寡核苷酸纳米粒子。这些纳米粒子在分子学上相同，具有可控的粒度以
及靶配体位置和密度。DNA片段和siRNA自装配成单步骤反应物以产生用
于体内靶向递送的DNA/siRNA四面体纳米粒子。(Lee等人,Nature
Nanotechnology20127:389-393)。

赋形剂

药物制剂可以另外包含可药用赋形剂，如本文所用，所述的可药用赋形
剂包括任何和全部溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体溶媒、分散助剂或悬
浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固态结合剂、润
滑剂等等，适用于所需的具体剂型。Remington’sTheScienceandPracticeof
Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,
MD,2006；所述通过引用方式并入本文)公开了配制药物组合物使用的各种赋
形剂和已知制备其的技术。除了任何常规赋形剂介质与某物质或其衍生物不
相容的情况下(如因产生任何不想要的生物学效应或另外以有害方式与药物
组合物的任何其他组分相互作用)，其用途处于本发明的范围内。

在一些实施方案中，可药用赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、
至少98％、至少99％、或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂经批准用
于人类中和经批准用于兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂由美国食品药
品管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是药用级的。在一些实施方案中，
赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。

药物组合物制造中所用的可药用赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散
剂/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、
润滑剂和/或油。这类赋形剂可以任选地纳入药物组合物中。

示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸氢二钙、硫
酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露
醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、粉状糖等和/或其组合。

示例性造粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀
粉、淀粉羟乙酸钠、黏土、海藻酸、瓜耳胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维
素和木材产物、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交
联聚(乙烯基咯烷酮)(交联聚维酮)、羧甲基淀粉钠(淀粉羟乙酸钠)、羧甲基纤
维素、交联钠羧甲基纤维素(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预糊化淀粉(淀
粉1500)、微晶淀粉、非水溶淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝
十二烷基硫酸钠、季铵化合物等和/或其组合。

示例性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如，阿位伯
树胶、琼脂、海藻酸、藻酸钠、黄蓍胶、软骨酸、胆固醇、黄原胶、果胶、
明胶、卵黄、酪蛋白、羊毛脂肪、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶态粘土(例如，
膨润土[硅酸铝]和[硅酸镁铝])、长链氨基酸衍生物、高分子量醇
(例如，硬脂醇、鲸蜡基醇、油醇、三醋精单硬脂酸酯、乙二醇二硬脂酸酯、
单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯、聚乙烯醇)、卡波姆(例如，羧聚甲烯、
聚丙烯酸、丙烯酸聚合物和羧乙烯基聚合物)、角叉菜胶、纤维素衍生物(例
如，羧甲基纤维素钠、粉状纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基
甲基纤维素、甲基纤维素)、山梨糖醇酐脂肪酸酯(例如，聚氧乙烯山梨糖醇
酐单月桂酸酯聚氧乙烯脱水山梨糖醇聚氧乙
烯山梨醇酐单油酸酯山梨糖醇酐单棕榈酸酯山
梨糖醇酐单硬脂酸酯山梨糖醇酐三硬脂酸酯单油酸
甘油酯、山梨醇酐单油酸酯聚氧乙烯酯(例如，聚氧乙烯单硬
脂酸酯聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙氧基蓖麻油、聚氧甲烯硬脂
酸酯和)、蔗糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯(例如，
)、聚氧乙烯醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚聚(乙
烯吡咯烷酮)、二甘醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺、油酸钠、油酸钾、油酸乙
酯、油酸、乙基月桂酸酯、十二烷基硫酸钠、
西曲溴铵、氯化十六烷基吡啶嗡、苯扎氯铵、多库酯钠
等和/或其组合。

示例性结合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例
如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然树胶
和合成树胶(例如阿位伯树胶、藻酸钠、爱尔兰苔提取物、潘瓦尔胶(panwar
gum)、茄替胶、isapolhusk的粘质、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维
素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸
纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、硅酸镁铝和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；
藻酸盐；聚环氧乙烷；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；
水；醇；等及其组合。

示例性防腐剂可以包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、
抗真菌药防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。示例性抗氧化剂
包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁化羟基茴香醚、
丁化羟基甲苯、硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、
亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸
(EDTA)、一水合柠檬酸、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、延胡索酸、苹
果酸、磷酸、钠依地酸、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包
括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴硝丙二醇(bronopol)、西三溴胺
(cetrimide)、氯化十六烷基吡啶嗡、氯己定、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲
酚、乙醇、丙三醇、海克替啶、咪脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙基醇、硝酸苯
汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于尼泊金丁酯、尼
泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山
梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、
聚乙二醇、苯酚、酚化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙基醇。
示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜
素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包
括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸次肟酯(deteroximemesylate)、西
三溴胺(cetrimide)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、
十二烷基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、
亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、GLYDANT尼泊金甲酯、
NEOLONE^TM、KATHON^TM和/或

示例性缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸
盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸
钙、葡糖酸钙、D-葡糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、
磷酸氢二钙、磷酸、磷酸钙、磷酸氢钙、乙酸钾、氯化钾、葡糖酸钾、钾混
合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化
钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三
醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer’s
solution)、乙醇等和/或其组合。

示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、
滑石、麦芽、甘油二十二烷酸酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸
钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、十二烷基硫酸钠等及其组合。

示例性油包括但不限于扁桃油、杏仁油、鳄梨油、佛手柑油、香柠檬油、
黑加仑籽油、玻璃苣油、杜松油、春黄菊油、卡诺拉油、藏茴香油、巴西棕
榈蜡、蓖麻油、肉桂油、可可脂、椰油、鳕鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽
油、鸸鹋油、桉油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇、葫芦油、葡萄籽
油、榛油、牛膝草、肉豆蔻酸异丙酯、霍霍巴油、夏威夷坚果油、熏衣草油、
薰衣草油(lavender)、柠檬油、山鸡椒油、澳洲坚果油、锦葵、芒果种子、绣
线菊籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄、橙、橘刺鲷、棕榈油、棕榈仁、桃仁油、
花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花、檀香
木油、山茶花(sasquana)油、皱叶甘蓝(savoury)油、沙棘油、芝麻油、乳木果
油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、椿花油、香根油、胡桃油和
小麦胚芽油。示例性油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油
三酯、环甲基硅酮、癸二酸二乙酯、聚二甲基硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙酯、
矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。

根据制剂师的判断，赋形剂如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味
剂、矫味剂和/或香味剂可以存在于组合物中。

递送

本公开涵盖了考虑可能的药物递送科学进展同时，通过任何适宜途径递
送多核苷酸、初级构建体或mmRNA，用于治疗、药物、诊断或成像用途中
任一者。递送可以是裸的或配制的。

裸递送

本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以输送至裸细胞。如本文
所用在中，“裸”指不含促进转染的物质情况下递送多核苷酸、初级构建体或
mmRNA。例如，递送至细胞的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以不含
有修饰。使用本领域已知的和本文所述的施用途径，可以将裸多核苷酸、初
级构建体或mmRNA递送至细胞。

制剂递送

可以使用本文所述的方法，配制本发明的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA。制剂可以含有可以经修饰的和/或未经修饰的多核苷酸、初级构建
体或mmRNA。制剂还可以包括但不限于细胞渗透剂、可药用载体、递送剂、
生物溶蚀性或生物相容性聚合物、溶剂和缓释递送储库。使用本领域已知的
和本文所述的施用途径，可以将配制的多核苷酸、初级构建体或mmRNA递
送至细胞。

也可以配制组合物制以按照本领域几种方式中任一方式，直接递送至器
官或组织，所述方式包括但不限于直接浸泡或浸浴、通过导管、通过凝胶剂、
散剂、油膏剂、乳膏剂、凝胶剂、洗剂和/或滴剂、通过使用以该组合物涂覆
或浸渍的基质如织物或生物可降解材料等。

施用

本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以通过产生治疗有效结果
的任何途径施用。这些途径包括但不限于肠内、胃肠、硬膜外、口、经皮、
硬膜外(epidural,peridural)、脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮的(施
加到皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、经鼻施用(通过鼻)、
静脉内(进入静脉)、动脉内(进入动脉)、肌内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、
骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内、(输注或注射进入腹膜)、膀
胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵体内注射(进入阴茎基部)、阴道内施用、
子宫内、羊膜外施用、经皮(扩散穿过完整皮肤以便全身性分布)、经黏膜(扩
散穿过黏膜)、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠、滴眼剂(滴到结膜上)或在滴
耳剂中。在具体实施方案中，组合物可以按照允许它们跨越血-脑屏障、血管
屏障或其他上皮屏障的方式施用。下文描述本发明的多核苷酸、初级构建体
或mmRNA的非限制施用途径。

胃肠道外和注射施用

用于口服和肠胃外施用的液态剂型包括但不限于可药用的乳剂、微乳剂、
溶液剂、悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除有效成分之外，液态剂型可以包含本领
域常使用的惰性稀释剂如，例如，水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、
异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、
二甲基甲酰胺、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖
麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其
混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物可以包含辅助剂，如润湿剂、乳化
剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和/或香味剂。在肠胃外施用的某些实施方案中，
组合物与增溶剂如醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、
环糊精、聚合物和/或其组合混合。

可以根据已知技术，使用合适的分散剂、润湿剂和/或助悬剂配制可注射
制品，例如，无菌可注射的水性或油性混悬剂。无菌可注射制品可以是肠胃
外可接受的无毒稀释剂和/或溶剂中的无菌注射溶液剂、混悬剂和/或乳剂，
例如，作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的溶媒和溶剂包括水、
林格溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。常规地施用无菌的非挥发性油作溶剂或
助悬介质。出于这个目的，可以使用任何温和的非挥发性油，包括合成性甘
油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可以同样用于注射剂的制备。

可注射制剂可以例如通过截留细菌的滤器过滤和/或通过掺入无菌固体
组合物形式的消毒剂制备，其中所述的消毒剂可以在使用之前溶解于或分散
在无菌水或其他无菌的可注射介质中。

为了延长有效成分的效果，经常希望减缓所述有效成分从皮下或肌内注
射的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形物质的液态悬液而实现。
药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率转而可能依赖于其晶体大
小和结晶形式。可选地，肠胃外施用药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解
或混悬于油溶媒中实现。通过形成所述药物在诸如聚丙交酯-聚乙交酯的可生
物降解的聚合物中的微胶囊基质，来制备注射用储器剂型。根据药物对聚合
物的比例以及所用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生
物可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。可注射性贮库制剂通过将
药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。

直肠施用和阴道施用

用于直肠或阴道施用的组合物一般是栓剂，所述栓剂可以通过将组合物
与无刺激性的合适赋形剂如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，其中所
述赋形剂在室温是固体，但是在体温下为液体，并且因此在直肠或阴道腔中
融化并且释放有效成分。

口服施用

用于口服给药的固态剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在
这类固态剂型中，有效成分与以下至少一种惰性可药用赋形剂混合，如柠檬
酸钠或磷酸氢二钙和/或填料或增容剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、
甘露醇和硅酸)、结合剂(例如，羧甲基纤维素、藻朊、明胶、聚乙烯吡咯烷
酮、蔗糖和阿位伯树胶)、保润剂(例如，甘油)、崩解剂(例如，琼脂、碳酸钙、
马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠)、溶液阻滞剂(例如，石
蜡)、吸收加速剂(例如，季铵化合物)、润湿剂(例如，鲸蜡基醇和单硬脂酸甘
油酯)、吸收剂(例如，高岭土和膨润土、黏土)和润滑剂(例如，滑石、硬脂酸
钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)及其混合物。在胶囊剂、片
剂和丸剂的情况下，该剂型可以包含缓冲剂。

局部(topical)施用或经皮施用

如本文所述，可以配制含有本发明多核苷酸、初级构建体或mmRNA的
组合物用于局部施用。皮肤可以是递送的理想靶位点，因为它是轻易可及的。
基因表达可以不仅限于皮肤，从而可能避免非特异性毒性，还限于皮肤内部
的特定层和细胞类型。

所递送的组合物的皮肤表达的位点将取决于核酸递送途径。常考虑三个
途径用于递送多核苷酸、初级构建体或mmRNA至皮肤：(i)局部施加(例如对
于局部/区域治疗和/或化妆品施加)；(ii)真皮内注射(例如用于局部/区域治疗
和/或化妆品施加)；和(iii)全身性递送(例如用于治疗影响皮肤和皮肤外区域的
皮肤病学疾病)。可以通过本领域已知的几种不同方案递送多核苷酸、初级构
建体或mmRNA至皮肤。已经显示大部分局部递送方案有效递送DNA，如，
但不限于局部施加非阳离子脂质体–DNA复合物方案、阳离子脂质体–DNA
复合物、粒子介导(基因枪)方案、穿刺介导的基因转染方案和病毒递送方案。
在递送核酸后，已经在多种不同的皮肤细胞类型中检出基因产物，所述皮肤
细胞类型包括但不限于基底角质形成细胞、皮脂腺细胞、皮肤成纤维细胞和
皮肤巨噬细胞。

在一个实施方案中，本发明提供多种敷料(例如，伤口敷料)或绷带(例如，
胶布绷带)用于便利和/或有效地实施本发明的方法。一般辅料或绷带可以包
含足够量的本文所述的药物组合物和/或多核苷酸、初级构建体或mmRNA，
以允许使用者对受试者实施多次治疗。

在一个实施方案中，本发明提供在多于一次注射中递送的多核苷酸、初
级构建体或mmRNA组合物。

在一个实施方案中，在局部和/或经皮施用之前，至少一个组织区域，如
皮肤，可以接受可以增加通透性的装置和/或溶液处理。在一个实施方案中，
组织可以接受擦伤装置处理以皮肤的通透性(参见美国专利公开号
20080275468，所述文献通过引用的方式完整并入本文)。在另一个实施方案
中，组织可以接受超声增强装置处理。超声增强装置可以包括，但不限于美
国公开号20040236268和美国专利号6,491,657和6,234,990中描述的装置；
所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。增强组织通透性的方法在
美国公开号20040171980和20040236268和美国专利号6,190,315中描述；所
述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，装置可以用来在递送本文所述的多核苷酸、初级构
建体和mmRNA制剂之前增加组织通透性。可以通过本领域已知和/或在美国
专利号6,190,315中描述的方法测量皮肤的通透性，所述文献通过引用的方式
完整并入本文。作为一个非限制性例子，可以通过美国专利号6,190,315中描
述的药物递送方法递送修饰的mRNA制剂，所述文献通过引用的方式完整并
入本文。

在另一个非限制性例子中，组织可以在组织可以接受可增加通透性的装
置处理之前、期间和/或之后用局部麻醉药(EMLA)乳膏剂的共晶混合物处理。
Katz等人(AnesthAnalg(2004)；98:371-76；所述文献通过引用的方式完整并入
本文)显示，使用与低能量组合的EMLA乳膏剂，观察到在低能超声预处理
后浅表皮肤痛觉缺失的发作快至5分钟。

在一个实施方案中，促进剂可以在已经处理组织以增加通透性之前、期
间和/或之后施加至组织。促进剂包括但不限于转运促进剂、物理促进剂和空
蚀促进剂。促进剂的非限制性例子在美国专利号6,190,315中描述，所述文献
通过引用的方式完整并入本文。

在一个实施方案中，装置可以用来在递送本文所述的多核苷酸、初级构
建体和/或mmRNA的制剂之前增加组织通透性，所述制剂还可以含有激发免
疫反应的物质。在另一个非限制性例子中，含有激发免疫反应的物质的制剂
可以通过美国公开号20040171980和20040236268中描述的方法递送；所述
文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。

用于局部和/或经皮施用组合物的剂型可包括油膏剂、糊剂、乳膏剂、洗
剂、凝胶剂、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂和/或贴剂。通常，如果需要，
有效成分在无菌条件下与可药用赋形剂和/或任何所需防腐剂和/或缓冲剂混
合。

另外，本发明还包括使用透皮贴剂，所述透皮贴剂具有向身体提供受控
的化合物递送的附加优点。这类剂型可以例如通过在恰当介质中溶解和/或分
散化合物来制备。备选地或另外，可以通过提供速率控制膜和/或通过在聚合
物基质和/或凝胶中分散化合物，控制速率。

适于局部施用的制剂包括但不限于液态和/或半液态制剂如搽剂、洗剂、
水包油和/或油包水乳剂如乳膏剂(cream)，油膏剂(ointment)和/或糊剂，和/
或溶液剂和/或悬剂。局部可施用制剂可以，例如，包含约0.1％至约10％(w/w)
的有效成分，不过有效成分的浓度可以高达有效成分在溶剂中的溶解度极限。
局部施用制剂还可以包含本文所述的一种或多种额外成分。

储库施用

如本文所述，在一些实施方案中，组合物配制在储库中用于延长的释放。
通常，靶向特定器官或组织(“靶组织”)以给药。

在本发明的一些方面，多核苷酸、初级构建体或mmRNA在空间滞留在
靶组织内部或靠近靶组织。提供了通过以下方式向哺乳动物受试者的靶组织
提供组合物的方法：使靶组织(其含有一个或多个靶细胞)与组合物在如此条
件下接触，从而组合物、尤其组合物的核酸组分基本上滞留在靶组织中，这
意指至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或超过99.99％的组合物滞留
在靶组织中。有利地，通过测量进入一个或多个靶细胞的组合物中存在的核
酸的量，确定滞留。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％
或超过99.99％向受试者施用的核酸在施用之后的一段时间存在于胞内。例
如，使用含有核糖核酸和转染试剂的含水组合物向哺乳动物受试者进行肌内
注射，并且通过测量肌细胞中存在的核糖核酸的量确定组合物的滞留。

本发明的多个方面涉及通过以下方式向哺乳动物受试者的靶组织提供组
合物的方法：使靶组织(其含有一个或多个靶细胞)与组合物在如此条件下接
触，从而组合物基本上滞留在靶组织中。组合物含有有效量的多核苷酸、初
级构建体或mmRNA，从而目的多肽在至少一个靶细胞中产生。虽然还包括
“裸”核酸(如不伴有细胞渗透剂或其他物质的核酸)，但组合物通常含有细胞
渗透剂和可药用载体。

在一些情况下，由组织中细胞产生的蛋白质的量合乎需要地增加。优选
地，蛋白质产生的这种增加在空间限于靶组织内部的细胞。因此，提供了增
加哺乳动物受试者的组织中目的蛋白产生的方法。提供一种含有多核苷酸、
初级构建体或mmRNA的组合物，其特征在于已经确定组合物的单位量以在
预定体积的靶组织内部所含有的相当大百分比的细胞中产生目的多肽。

在一些实施方案中，该组合物包括多个不同的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA，其中一种或多于一种多核苷酸、初级构建体或mmRNA编码目的
多肽。任选地，该组合物还含有辅助胞内递送组合物的细胞渗透剂。确定在
预定体积的靶组织内部所含有的相当大百分比的细胞产生目的多肽所需要的
组合物的剂量(通常，不在与预定体积毗邻或靶组织远端的组织中诱导目的多
肽的显著产生)。这种测定后，接着将确定的剂量直接引入哺乳动物受试者的
组织中。

在一个实施方案中，本发明提供了在多于一次注射中或通过分割剂量注
射递送的多核苷酸、初级构建体或mmRNA组合物。

在一个实施方案中，本发明可以利用小型一次性药物储器或贴附泵留在
靶组织附近。贴附泵的非限制性例子包括由(FranklinLakes,NJ)、Insulet
Corporation(Bedford,MA)、SteadyMedTherapeutics(SanFrancisco,CA)、
Medtronic(Minneapolis,MN)、UniLife(York,PA)、Valeritas(Bridgewater,NJ)
和SpringLeafTherapeutics(Boston,MA)制造和/或出售的那些。

肺施用

药物组合物可以以适合通过颊腔肺施用的制剂而制备、包装和/或出售。
这种制剂可以包含干粒子，所述干粒子包含有效成分并且具有范围从约0.5
nm至约7nm或从约1nm至约6nm的直径。这类组合物适当地处于使用某
装置施用的干燥粉末形式，所述装置包括干燥粉末储器(推进流可指向该储器
以分散粉末)和/或使用自推进溶剂/粉末分配容器，如在密封容器中包含溶解
和/或悬浮在低沸点推进剂内的有效成分的装置。这类粉末包含粒子，其中以
重量计至少98％的粒子具有大于0.5nm的直径并且按数目计至少95％的粒子
具有小于7nm的直径。备选地，以重量计至少95％的粒子具有大于1nm的
直径并且按数目计至少90％的粒子具有小于6nm的直径。干粉组合物可以
包括固态细粉稀释剂如糖并且便利地以单位剂量形式提供。

低沸腾推进剂通常包括在常压具有65°F以下沸点的液态推进剂。通常，
推进剂可以占50％至99.9％(w/w)的组合物，并且有效成分可以构成0.1％至
20％(w/w)的组合物。推进剂还可以包含额外成分如液态非离子型和/或固体
阴离子表面活性剂和/或固态稀释剂(其可以具有与包含有效成分的粒子相同
级别的粒度)。

经配制用于肺递送的药物组合物配制可以提供溶液剂和/或混悬剂液滴
形式的有效成分。这类制剂可以作为包含有效成分的任选无菌的水质和/或稀
醇质溶液剂和/或混悬剂制备、包装和/或出售，并且可以便利地使用任何气
雾化(nebulization)和/或喷雾化(atomization)装置施用。这类制剂还可以包含一
种或多种额外成分，包括但不限于矫味剂如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面
活性剂和/或防腐剂如羟基苯甲酸甲酯。通过这种施用途径提供的液滴可以具
有范围从约0.1nm至约200nm的平均直径。

鼻内、经鼻和口颊施用

如可用于肺递送的本文所述制剂可用于鼻内递送药物组合物。适于鼻内
施用的另一个制剂是包含有效成分并具有约0.2μm至500μm平均粒径的粗
粉。这种制剂按其中服用嗅剂的形式施用，即从靠近鼻子所持的含有该粉末
的容器经鼻道快速吸入。

适于经鼻施用的制剂可以例如包含约少达0.1％(w/w)和多达100％(w/w)
的有效成分，并且可以包含本文所述的一种或多种额外成分。药物组合物可
以以适于口颊施用的制剂而制备、包装和/或出售。这类制剂可以例如处于使
用常规方法制造的片剂和/或锭剂形式，并且可以含有例如0.1％至20％(w/w)
的有效成分，余量包含口服可溶解和/或可降解组合物和任选地本文所述的一
种或多种额外成分。备选地，适于口颊施用的制剂可以包括包含有效成分的
散剂和/或气雾化和/或雾化溶液剂和/或混悬剂。当分散时，这类粉状、气雾
化和/或雾化制剂可以具有范围从约0.1nm至约200nm的平均粒子和/或液滴
大小，并且还可以包含本文所述的一种或多种任何额外成分。

眼科施用

药物组合物可以以适于眼科施用的制剂而制备、包装和/或出售。这类制
剂可以例如处于滴眼剂形式，所述滴眼剂例如包括在水质或油质液态赋形剂
中含有效成分的0.1/1.0％(w/w)的溶液和/或混悬液。这类滴剂还可以包含本
文所述的缓冲剂、盐和/或一种或多种其他任意额外成分。可用的其他眼科可
施用制剂包括这些制剂，所述制剂包含微晶形式和/或在脂质体制备物中的有
效成分。滴耳剂和/或滴眼剂包含在本发明的范围内。

酬载施用：可检测物质和治疗剂

本文所述的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用于其中需要向生物
学靶递送物质(“酬载”)(例如递送可检测物质以检测该靶或治疗药的递送)的
众多不同情景。检测方法可以包括但不限于体外成像法和体内成像方法，例
如，免疫组织化学、生物发光成像(BLI)、磁共振成像(MRI)、正电子发射断
层摄影术(PET)、电子显微术、X射线计算机断层成像、Raman成像、光学相
干断层摄影术、吸收成像、热成像、荧光反射成像、荧光显微术、荧光分子
断层成像、核磁共振成像、X射线成像、超声成像、光声成像、lab测定法、
或在其中需要加标签/染色/成像的任何情况下。

多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以设计成以任意有用取向包括接头
和酬载两者。例如，具有两个末端的接头用来将一个末端与酬载连接并将另
一端与核碱基连接，如在去氮杂-腺苷或去氮杂-鸟苷的C-7或C-8位置或连
接至胞嘧啶或尿嘧啶的N-3或C-5位置。本发明的多核苷酸可以包含多于一
种酬载(例如，标记物和转录抑制剂)，以及可切割接头。在一个实施方案中，
修饰的核苷酸是修饰的7-去氮杂-三磷酸腺苷，其中可切割接头的一个末端连
接至7-去氮杂-腺嘌呤的C7位置，接头的另一端连接至抑制剂(例如，连接至
胞苷上核碱基的C5位置)，并且标记物(例如，Cy5)连接至接头的中心(参见，
例如，在美国专利号7,994,304的图5和第9栏和第10栏中的A*pCpC5Parg
Caples的化合物1，所述文献通过引用方式并入本文)。一旦将修饰的7-去氮
杂-三磷酸腺苷掺入编码区中，所产生的多核苷酸将具有与标记物和抑制剂
(例如，聚合酶抑制剂)连接的可切割接头。一旦切割接头(例如，采用还原性
条件以还原具有可切割二硫键部分的接头)，则释放标记物和抑制剂。本文中
描述了额外的接头和酬载(例如，治疗剂、可检测标记物和细胞渗透性酬载)。

例如，本文所述的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用于诱导的多
潜干细胞(iPS细胞)中，这可以与团簇中的总细胞相比而直接追踪转染的细
胞。在另一个例子中，可以通过接头与多核苷酸、初级构建体或mmRNA连
接并且可以荧光标记的药物可以用来在体内(例如胞内)追踪该药物。其他例
子包括，但不限于，使用多核苷酸、初级构建体或mmRNA可逆性递送药物
至细胞中。

本文所述的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用于胞内靶向酬载(例
如，可检测物质或治疗剂)到特定的细胞器。示例性胞内靶可以包括，但不限
于，用于晚期mRNA加工的核定位或与含有抑制剂的mRNA连接核定位序
列(NLS)。

此外，本文所述的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用来递送治疗
剂至细胞或组织，例如，在活动物中递送。例如，通过接头与治疗药连接的
多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以促进元件渗透，从而允许治疗药穿行
进入细胞以抵达胞内靶。

在一些实施方案中，酬载可以是治疗剂如细胞毒素、放射性离子、化疗
药或其他治疗药。细胞毒素或细胞毒药物包括可能有害于细胞的任何物质。
例子包括但不限于紫杉酚、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、
丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、
佐柔比星、二氢蒽二酮(dihydroxyanthracinedione)、米托蒽醌、光神霉素、放
线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘
洛尔、嘌呤霉素、类美登素(maytansinoid)，例如美登醇(参见完整并入本文的
美国专利号5,208,020)、rachelmycin(CC-1065，参见美国专利号5,475,092、
5,585,499、和5,846,545，所述全部文献均通过引用的方式并入本文)及其类
似物或同源物。放射性离子包括但不限于碘(例如，碘125或碘131)、锶89、
磷、钯、铯、铱、磷酸盐、钴、钇90、钐153和镨。其他治疗药包括但不限
于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿
嘧啶达卡巴嗪)、烷基化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、rachelmycin
(CC-1065)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消
安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、
蒽环类(例如，佐柔比星(旧称柔红霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉
素(dactinomycin)(旧称放线菌素D)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))
以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱、长春碱、紫杉酚和类美登素
(maytansinoid))。

在一些实施方案中，酬载可以是可检测物质，如各种有机小分子、无机
化合物、纳米粒子、酶或酶底物、荧光物质、发光物质(例如，鲁米诺)、生
物发光物质(例如，萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白)、化学发光物质、放
射性物质(例如，¹⁸F、⁶⁷Ga、^81mKr、⁸²Rb、¹¹¹In、¹²³I、¹³³Xe、²⁰¹Tl、¹²⁵I、³⁵S、
¹⁴C、³H或^99mTc(例如，如过锝酸盐(锝酸盐(VII)、TcO_4-))和造影剂(例如，金
(例如，金纳米粒子)、钆(例如，螯合Gd)、铁氧化物(例如，超顺磁氧化铁(SPIO)、
单晶氧化铁纳米粒子(MIONs)和超小超顺磁氧化铁(USPIO))、锰螯合物(例如，
Mn-DPDP)、硫酸钡、碘化造影剂(iohexol)、微泡或全氟碳)。这类种光学可
检测的标记物包括例如而不限于4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸茋-2,2’-二磺酸；吖
啶和衍生物(例如，吖啶和吖啶异硫氰酸酯)；5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸
(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐；N-(4-苯胺
基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄(BrilliantYellow)；
香豆素和衍生物(例如，香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC、香豆素120)和
7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151))；菁染料；焰红染料；4’,6-二脒基-2-
苯基吲哚(DAPI)；5’,5"-二溴连苯三酚磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基
-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4’-二异硫氰
酸基二氢-茋-2,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸基茋-2,2’-二磺酸；5-[二甲氨基]-
萘-1-磺酰氯(DNS、丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯
(DABITC)；伊红和衍生物(例如，伊红和伊红异硫氰酸酯)；赤藓红和衍生物
(例如，赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯)；乙锭；荧光素和衍生物(例如，5-羧
基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’,7’-二甲氧基
-4’,5’-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、异硫氰酸荧光素、X-罗丹明-5-(和-6)-异
硫氰酸酯(QFITC或XRITC)和荧光胺)；2-[2-[3-[[1,3-二氢-1,1-二甲基-3-(3-磺
丙基)-2H-苯并[e]吲哚-2-亚基]亚乙基]-2-[4-(乙氧羰基)-1-哌嗪基]-1-环戊烯-1-
基]乙烯基]-1,1-二甲基-3-(3-磺酰丙基)-1H-苯并[e]吲哚鎓氢氧化物、内盐、与
n,n-二乙基乙胺的化合物(1:1)(IR144)；5-氯-2-[2-[3-[(5-氯-3-乙基-2(3H)-苯并
噻唑-亚基)亚乙基]-2-(二苯基氨基)-1-环戊烯-1-基]乙烯基]-3-乙基苯并噻唑高
氯酸盐(IR140)；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；
副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘和衍生物(例如，芘、丁酸芘和琥
珀酰亚胺基1-芘)；丁酸酯量子点；反应红4(CIBACRON^TM亮红3B-A)；罗
丹明和衍生物(例如，6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺
罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明x异硫氰酸
酯、磺酰罗丹明B、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(得克
萨斯红)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)四甲基罗丹明、和四甲基
罗丹明异硫氰酸酯(TRITC))；核黄素；玫红酸；铽螯合物衍生物；花青-3(Cy3)；
花青-5(Cy5)；花青-5.5(Cy5.5)、花青-7(Cy7)；IRD700；IRD800；Alexa647；
LaJolta蓝；酞菁；和萘酞菁。

在一些实施方案中，可检测物质可以是在激活时变得可检测的不可检测
前体(例如，荧光团四嗪-荧光团构建体(例如，四嗪-BODIPYFL，四嗪-俄勒
冈绿488或四嗪-BODIPYTMR-X)或酶可激活的荧光团物质(例如，
(VisEnMedical))。其中可以使用酶标记组合物的体外测定法包
括，但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定法、免疫荧光法、酶
免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)和蛋白质印迹分析。

组合

多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以与一种或多种其他治疗药、预防
药、诊断药或成像剂组合使用。“与……组合”不意在暗示所述药物必须在相
同的时间施用和/或配制在一起递送，不过这些递送方法处于本公开的范围
内。组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医疗方法同时、在其之前
或之后施用。通常而言，每种药剂将按确定用于该药剂的剂量和/或按确定用
于该药剂的时间方案施用。在一些实施方案中，本公开涵盖递送与可以改善
其生物利用率，减少和/或调节其代谢、抑制其排泄和/或调节其体内分布的
物质组合的药物、预防性、诊断性或成像组合物。作为一个非限制性例子，
多核苷酸、初级构建体和/或mmRNA可以与治疗癌症或控制过度增殖性细胞
的药剂(pharmaceuticalagent)组合使用。在过引用方式完整并入本文的美国专
利号7,964,571中，描述了治疗原发或转移实体肿瘤的联合疗法，所述联合疗
法使用包括编码白介素-12的DNA质粒连同脂质聚合物的药物组合物以及还
施用至少一个抗癌药或化疗药。另外，编码抗增殖性分子的本发明多核苷酸、
初级构建体和/或mmRNA可以处于含有脂质聚合物的药物组合物中(参见例
如，通过引用方式完整并入本文的美国公开号20110218231，所述文献要求
保护包含编码抗增殖性分子的DNA质粒和脂质聚合物的药物组合物)，所述
药物组合物可以随至少一个化疗药或抗癌药一起施用。

定剂量(dosing)

本发明提供了包括向有需求的受试者施用本发明多核苷酸、初级构建体
和/或mmRNA及其编码的蛋白质或复合物的方法。可以使用有效预防、治疗、
诊断疾病、病症和/或病状(例如，涉及工作记忆缺失的疾病、病症和/或病状)
或对其成像的任何量和任何施用途径，施用核酸、蛋白质或复合物或其药物、
成像性、诊断性或预防性组合物至受试者。所要求的确切量将在受试者之间
不同，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、疾病严重程度、具体组合
物、其施用模式、其活性模式等。本发明的组合物一般以易于施用和剂量均
匀的剂量单位形式配制。然而，将理解，本发明组合物的每日总用量可以由
主治医师在正确医学判断的能力范围内决定。任何特定患者的具体的治疗有
效、预防有效或适宜成像的剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的病
症和病症的严重性；所用特定化合物的活性；所用的特定组成；患者的年龄、
体重、总体健康、性别和膳食；所用特定化合物的施用时间、施用途径和排
泄速率；治疗持续期；与所用特定化合物联合或同时使用的药物和医学领域
中熟知的类似因素。

在某些实施方案中，本发明组合物可以按照足以每日递送约0.0001
mg/kg至约100mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约
0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、
约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约
30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg或约1
mg/kg至约25mg/kg受试者体重的剂量水平一日一次或多次施用，以获得所
需的治疗、诊断、预防或成像效果。所需的剂量可以一日3次、一日2次、
一日1次、每隔1日、每隔2日、每周、每两周、每三周或每四周递送。在
某些实施方案中，可以使用多次施用(例如、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14次或更多次施用)，递送所需的剂量。

根据本发明，已经发现以分割剂量方案施用mmRNA在哺乳动物受试者
中产生较高水平的蛋白质。如本文所用，“分割剂量”是单个单位剂量或每日
总剂量分成两个或更多个剂量，例如单个单位剂量的两次或更多次施用。如
本文所用，“单个单位剂量”是以一个剂量/在一个时间/单个途径/单个接触点
(即，单个施用事件)施用的任何治疗药的剂量。如本文所用，“每日总剂量”
是在24小时时间给予或开具的量。它可以作为单个单位剂量施用。在一个实
施方案中，将本发明的mmRNA按分割剂量施用至受试者。mmRNA可以配
制在仅缓冲剂中或在本文所述的制剂中。

剂型

本文所述的药物组合物可以配制成本文所述的剂型，如局部用、鼻内、
气管内或可注射用(例如，静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、心内、腹膜内、
皮下)。

液态剂型

用于肠胃外施用的液态剂型包括但不限于可药用的乳剂、微乳剂、溶液
剂、混悬剂、糖浆剂和/或酏剂。除有效成分之外，液态剂型可以包含本领域
常使用的惰性稀释剂包括，但不限于水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、
异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、
二甲基甲酰胺、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖
麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其
混合物。在肠胃外施用的某些实施方案中，组合物可以与增溶剂如
醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/
或其组合混合。

可注射用

可注射制品，例如，无菌可注射的水性或油性混悬剂可以根据已知技术
配制并且可以包含合适的分散剂、润湿剂和/或助悬剂。无菌可注射制品可以
是肠胃外可接受的无毒稀释剂和/或溶剂中的无菌注射溶液剂、混悬剂和/或
乳剂，例如，1,3-丁二醇中的溶液剂。可以使用的可接受的溶媒和溶剂包括
但不限于水、林格溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。常规地施用无菌的非挥发
性油作溶剂或助悬介质。出于这个目的，可以使用任何温和的非挥发性油，
包括合成性甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可以用于注射剂的制备。

可注射制剂可以例如通过截留细菌的滤器过滤和/或通过掺入无菌固体
组合物形式的消毒剂制备，其中所述的消毒剂可以在使用之前溶解于或分散
在无菌水或其他无菌的可注射介质中。

为了延长有效成分的效果，可能希望减缓所述有效成分从皮下或肌内注
射的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液态悬液而实现。
多核苷酸、初级构建体或mmRNA的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解
速率转而可能依赖于其晶体大小和结晶形式。可选地，肠胃外施用的多核苷
酸、初级构建体或mmRNA的延迟吸收可以通过将多核苷酸、初级构建体或
mmRNA溶解或混悬于油溶媒中实现。通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯的可生
物降解的聚合物中形成所述多核苷酸、初级构建体或mmRNA的微胶囊基质，
来制备注射用储器剂型。取决于多核苷酸、初级构建体或mmRNA对聚合物
的比例以及所用的特定聚合物的性质，可以控制多核苷酸、初级构建体或
mmRNA释放的速率。其他生物可降解聚合物的例子包括但不限于聚(原酸酯)
和聚(酐)。可以通过将多核苷酸、初级构建体或mmRNA包裹在与身体组织
相容的脂质体或微乳液中，来制备可注射贮库制剂。

肺用

可用于肺递送的本文所述制剂也可以用于鼻内递送药物组合物。适于鼻
内施用的另一个制剂可以是包含有效成分并具有约0.2μm至500μm平均粒
径的粗粉。这种制剂可以按其中服用嗅剂的形式施用，即从靠近鼻子所持的
含有该粉末的容器经鼻道快速吸入。

适于经鼻施用的制剂可以例如包含约少达0.1％(w/w)和多达100％(w/w)
的有效成分，并且可以包含本文所述的一种或多种额外成分。药物组合物可
以以适于口颊施用的制剂而制备、包装和/或出售。这类制剂可以例如处于使
用常规方法制造的片剂和/或锭剂形式，并且可以含有例如约0.1％至20％
(w/w)的有效成分，其中余量可以包含口服可溶解和/或可降解组合物和任选
地本文所述的一种或多种额外成分。备选地，适于口颊施用的制剂可以包括
包含有效成分的散剂和/或气雾化和/或喷雾化溶液剂和/或混悬剂。当分散时，
这类粉状、气雾化和/或喷雾化制剂可以具有范围从约0.1nm至约200nm的
平均粒子和/或液滴大小，并且还可以包含本文所述的任意一种或多种额外成
分。

在配制和/或制造药剂(pharmaceuticalagent)中的一般考虑事项可以例如
在Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy第21版,Lippincott
Williams&Wilkins,20055(通过引用的方式并入本文)中找到。

包衣或壳

片剂、锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固态剂型可以用包衣和壳(如肠衣
和药物配制领域中熟知的其他包衣)制备。它们可以任选地包含遮光剂并且可
以是这样一种组合物，它们仅或优选地在肠道的某些部分中，任选地以延迟
方式释放有效成分。可以使用的包埋型组合物的实例包含聚合物质和蜡。可
以使用相似类型的固体组合物作为使用这类赋形剂如乳糖或奶糖(milksugar)
以及高分子量聚乙二醇等的软质和硬质填胶胶囊剂中的填料。

药物组合物的特性

本文所述的药物组合物可以通过生物利用率、治疗窗口和/或分布容积中
一者或多者来表征。

生物利用率

当配制成含有如本文所述的递送剂的组合物时，与缺少如本文所述的递
送剂的组合物相比，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以显示出生物利用
率增加。如本文所用，术语“生物利用率”指施用至哺乳动物的给定量的多核
苷酸、初级构建体或mmRNA的全身利用率。可以通过施用化合物至哺乳动
物之后测量未改变形式的化合物的曲线下面积(AUC)或最大血清或血浆浓度
(C_max)，评估生物利用率。AUC是沿纵坐标(Y-轴)的化合物血清或血浆浓度对
沿横坐标(X-轴)的时间作图的曲线下面积测定值。通常，特定化合物的AUC
可以使用本领域普通技术人员已知的和如G.S.Banker,ModernPharmaceutics,
DrugsandthePharmaceuticalSciences,v.72,MarcelDekker,NewYork,Inc.,
1996中所述的方法计算，所述文献通过引用方式并入本文。

C_max值是施用化合物至哺乳动物之后在哺乳动物血清或血浆中实现的最
高化合物浓度。特定化合物的C_max值可以使用本领域普通技术人员已知的方
法测量。如本文所用的短语“增加生物利用率”或“改善药代动力学”意指与如
本文所述的递送剂一起共施用时，在哺乳动物中作为AUC、C_max或C_min测量
的第一多核苷酸、初级构建体或mmRNA全身利用率是比不进行这类共施用
时更大。在一些实施方案中，多核苷酸、初级构建体或mmRNA的生物利用
率可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、
至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约
50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、
至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％。

治疗窗口

当配制成含有如本文所述的递送剂的组合物时，与缺少如本文所述的递
送剂时施用的多核苷酸、初级构建体或mmRNA组合物的治疗窗口相比，多
核苷酸、初级构建体或mmRNA可以显示所施用的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA组合物的治疗窗口增加。如本文所用，“治疗窗口”指作用部位处治
疗活性物质的血浆浓度范围或水平范围，具有高的激发治疗效果的概率。在
一些实施方案中，与如本文所述的递送剂共施用时，多核苷酸、初级构建体
或mmRNA的治疗窗口可以增加至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少
约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、
至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约
70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或
约100％。

分布容积

当配制入含有如本文所述的递送剂的组合物时，与缺少如本文所述的递
送剂的组合物相比，多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以显示出改善(例如，
减少或定向)的分布容积(V_dist)。分布容积(V_dist)使身体内药物的量与药物在血
液或血浆中的浓度关联。如本文所用，术语“分布容积”指以按照与血液或血
浆中相同的浓度在身体内含有药物总量时所需要的流体体积：V_dist等于身体
内药物的量/药物在血液或血浆中的浓度。例如，对于10mg剂量和10mg/L
血浆浓度，分布容积将为1升。分布容积反映了药物在血管外组织中存在的
程度。大的分布容积反映了与血浆蛋白结合作用相比，化合物与组织组分结
合的倾向性。在临床环境下，V_dist可以用来确定负荷剂量以实现稳态浓度。
在一些实施方案中，与如本文所述的递送剂共施用时，多核苷酸、初级构建
体或mmRNA的分布容积可以减少至少约2％、至少约5％、至少约10％、至
少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约
40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、
至少约70％。

生物学效果

在一个实施方案中，可以通过分析动物中的蛋白质表达，将向动物输送
的修饰的mRNA的生物学效果进行归类。可以通过分析从施用过本发明修饰
的mRNA的哺乳动物采集的生物样品，确定再编程的蛋白质表达。在一个实
施方案中，可以优选由至少50pg/ml施用至哺乳动物的修饰的mRNA编码
的蛋白质表达。例如，针对递送至哺乳动物的修饰的mRNA编码的蛋白质，
50-200pg/ml蛋白质表达可被视为哺乳动物中该蛋白质的治疗有效量。

通过质谱法检测修饰的核酸

质谱法(MS)是可以在分子转化成离子后提供关于分子的结构和分子质
量/浓度的信息的分析技术。分子首先电离以获得正电荷或负电荷并且随后它
们穿过质量分析器以根据其质量/电荷(m/z)比到达检测器的不同区域。

使用质谱仪实施质谱法，所述质谱仪包括用于电离分级样品并产生用于
进一步分析的带电荷分子的离子源。例如，可以通过电喷雾电离(ESI)、常压
化学电离(APCI)、光电离、电子电离、快原子轰击(FAB)/液体二次电离
(LSIMS)、基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)、场致电离、场致解吸附、热
喷雾/等离子喷雾电离和粒子束电离，实施样品的电离。技术人员将理解，电
离方法的选择可以确定根据待测量的分析物、样品类型、检测器类型、正模
式与负模式的选择等。

在样品已经电离后，可以分析如此产生的带正电荷离子或带负电荷离子
以确定质荷比(即，m/z)。确定质荷比的合适分析仪包括四级分析仪、离子阱
分析仪和飞行时间分析仪。可以使用几种检测模式检测离子。例如，所选择
的离子(即，使用选择性离子监测模式(SIM))，或备选地，离子可以使用扫描
模式，例如，多反应监测(MRM)或选择的反应监测(SRM)，检测。

已经显示液相色谱-多反应监测(LC-MS/MRM)偶联稳定同位素标记的肽
标准品稀释物法是验证蛋白质的有效方法(例如Keshishian等人,MolCell
Proteomics20098:2339-2349；Kuhn等人,ClinChem200955:1108-1117；
Lopez等人,ClinChem201056:281-290)。不同于生物标记物发现研究中经常
所用的非靶向质谱法，靶向MS法是基于肽序列的MS模式，其重点在于仪
器对复杂混合物中数十种至数百种所选肽的完整分析能力。通过将检测和片
段化限制至仅对衍生自目的蛋白的那些肽，与发现模式MS法相比，敏感性
和重现性大幅度改善。通过对临床样品的快速、靶向、多重蛋白质表达概况
分析，这种基于质谱法的多反应监测(MRM)蛋白质定量方法可以大幅度影响
生物标记物的发现和定量。

在一个实施方案中，可以通过MRM-MS法分析生物样品，所述生物样
品可能含有由本发明的至少一种修饰的mRNA编码的至少一种蛋白质。生物
样品定量还可以包含但不限于同位素标记的肽或蛋白质作为内标物。

根据本发明，一旦从受试者获得，生物样品可以接受酶消化。如本文所
用，术语“消化”意指分解成较短的肽。如本文所用，短语“处理样品以消化蛋
白质”意指以如此方式处理样品，从而分解样品中的蛋白质。这些酶包括但不
限于胰蛋白酶、蛋白内切酶Glu-C和胰凝乳蛋白酶。在一个实施方案中，可
以使用酶消化生物样品，所述生物样品可含有由本发明的至少一种修饰的
mRNA编码的至少一种蛋白质。

在一个实施方案中，可以使用电喷雾电离法分析生物样品的蛋白质，所
述生物样品可含有由本发明的修饰的mRNA编码的蛋白质。电喷雾电离(ESI)
质谱法(ESIMS)使用电能以辅助离子在通过质谱法分析前从溶液转移至气
相。可以使用本领域已知的方法分析样品(例如，Ho等人,ClinBiochemRev.
200324(1):3-12)。通过分散带电液滴的细喷雾、蒸发溶剂并从带电荷液滴抛
射离子以产生高度带电荷的液滴雾，可以将溶液中所含的离子物质转移至气
体相中。可以使用至少1台、至少2台、至少3台或至少4台质量分析器如，
但不限于四极质量分析器，分析高度带电荷的液滴雾。另外，质谱法可以包
括纯化步骤。作为一个非限制性例子，可以设定第一四极以选择单一m/z比
率，从而它可以滤除具有不同m/z比的其他分子离子率，这可以消除MS分
析之前复杂和费时的样品纯化程序。

在一个实施方案中，可以在串联ESIMS系统(例如，MS/MS)中分析生物
样品的蛋白质，所述生物样品可含有由本发明的修饰的mRNA编码的蛋白
质。作为非限制性例子，可以使用产物扫描(或子代扫描)、前体扫描(母体扫
描)、中性丢失或多反应监测法，分析液滴。

在一个实施方案中，可以使用基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)质谱法
(MALDIMS)分析生物样品，所述生物样品可含有由本发明的修饰的mRNA
编码的蛋白质。MALDI提供大分子和小分子(如蛋白质)的非毁灭性蒸发和电
离。在MALDI分析中，分析物首先与巨大摩尔过量的基质化合物共结晶，
所述基质化合物还可以包含，但不限于紫外吸收性弱有机酸。MALDI中使
用的基质的非限制性例子是α-氰-4-羟肉桂酸、3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸和
2,5-二羟苯甲酸。对分析物-基质混合物的激光辐射可以导致基质和分析物的
蒸发。激光引起的解吸附提供了完整分析物的高离子产率并允许以高准确度
测量化合物。可以使用本领域已知的方法分析样品(例如，Lewis,Wei和
Siuzdak,EncyclopediaofAnalyticalChemistry2000:5880-5894)。作为非限制性
例子，MALDI分析中使用的质量分析器可以包括线性飞行时间(TOF)、TOF
反射器或傅立叶变换质量分析器。

在一个实施方案中，可以使用干燥液滴法形成分析物-基质混合物。生物
样品与基质混合以产生饱和的基质溶液，其中基质-对-样品之比大约是
5000:1。随后允许饱和基质溶液的等分试样(大约0.5-2.0μL)干燥，以形成分
析物-基质混合物。

在一个实施方案中，可以使用薄层法形成分析物-基质混合物。首先形
成均匀的基质薄膜并且随后施加样品并且样品可以被基质吸附以形成分析物
-基质混合物。

在一个实施方案中，可以使用厚层法形成分析物-基质混合物。用硝基-
纤维素基质添加物形成均匀的基质薄膜。一旦获得均匀的硝基-纤维素基质
层，则施加样品并且吸附至基质中以形成分析物-基质混合物。

在一个实施方案中，可以使用夹心法形成分析物-基质混合物。如薄层法
中那样制备基质晶体的薄层，随后添加含水三氟乙酸、样品和基质的液滴。
样品是随后吸附至基质中以形成分析物-基质混合物。

V.本发明多核苷酸、初级构建体和mmRNA的用途

本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以用来改变细胞的表型。
本发明的多核苷酸、初级构建体和mmRNA可以编码肽、多肽或多个蛋白质
以产生目的多肽。目的多肽可以用于治疗药中和/或临床环境和研究环境下。
作为一个非限制性例子，目的多肽可以包括再编程因子、分化因子和去分化
因子。

治疗药

治疗剂

本文所述的本发明多核苷酸、初级构建体或mmRNA，如修饰的核酸和
修饰的RNA和从中翻译的蛋白质可以用作治疗药或预防药。将它们提供用
于药物、疗法和预防性治疗中。例如，本文所述的多核苷酸、初级构建体或
mmRNA可以施用至受试者，其中所述多核苷酸、初级构建体或mmRNA在
体内翻译以在受试者中产生治疗性或预防性多肽。提供了用于诊断、治疗或
预防人类和其他哺乳动物中疾病或病状的组合物、方法、试剂盒和试剂。本
发明的有效治疗剂包括多核苷酸、初级构建体或mmRNA，含有多核苷酸、
初级构建体或mmRNA的细胞，或从多核苷酸、初级构建体或mmRNA翻译
的多肽。

在某些实施方案中，本文提供了含有一种或多种含有编码一种或多种蛋
白质的可翻译区的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的组合治疗药。

本文提供了使用本文所述的多核苷酸、初级构建体或mmRNA诱导重组
多肽在细胞群体中翻译的方法。这种翻译可以是体内、离体、在培养物中或
体外。细胞群体与有效量的组合物接触，所述组合物含有具有至少一个核苷
修饰和编码重组多肽的可翻译区的核酸。在如此条件下接触细胞群体，从而
使核酸定位于细胞群体的一个或多个细胞中并且重组多肽在细胞中从核酸翻
译出来。

至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用手段、核酸的物理特征(例如，
修饰的核苷的大小和程度)和其他决定因素，提供“有效量”的组合物。通常，
有效量的组合物在细胞中产生有效的蛋白质产生，优选地比含有相应的未修
饰核酸的组合物更高效。增加的效率可以由细胞转染(即，核酸转染的细胞的
百分数)增加，来自核酸的蛋白质翻译增加、核酸降解减少(如通过例如来自
修饰的核酸的蛋白质翻译持续时间增加所证明)或宿主细胞的先天免疫反应
减少证实。

本发明的多个方面涉及在有需要的哺乳动物受试者中诱导重组多肽体内
翻译的方法。因此，使用本文所述的递送方法，将有效量的组合物施用至受
试者，所述组合物含有具有至少一个结构性或化学性修饰和编码重组多肽的
可翻译区的核酸。核酸以某个量并且在其他条件下如此提供，从而核酸定位
于受试者的细胞中并且重组多肽在细胞中从核酸翻译出来。可以通过一轮或
多于一轮核酸施用，靶向其中定位有核酸的细胞或其中存在该细胞的组织。

在某些实施方案中，施用的多核苷酸、初级构建体或mmRNA指导一种
或多种重组多肽的产生，所述重组多肽提供了在翻译重组多肽的细胞、组织
或生物中基本上不存在的功能活性。例如，丢失的功能活性可以在本质上是
酶促、结构或基因调节的。在相关的实施方案中，施用的多核苷酸、初级构
建体或mmRNA指导一种或多种重组多肽的产生，所述重组多肽增加(例如，
协同地增加)在翻译重组多肽的细胞中存在但明显不足的功能活性。

在其他实施方案中，施用的多核苷酸、初级构建体或mmRNA指导一种
或多种重组多肽的产生，所述重组多肽替换在翻译重组多肽的细胞中基本上
不存在的一种多肽(或多种多肽)。这类不存在可以归因于编码基因或其调节
途径的遗传突变。在一些实施方案中，重组多肽增加了细胞中内源蛋白的水
平到合乎需要的水平；这种增加可以导致内源蛋白的水平从逊常水平到正常
水平或从正常水平到超正常水平。

备选地，重组多肽发挥作用以拮抗在细胞中存在、在细胞表面上或从细
胞分泌的内源蛋白的活性。通常，内源蛋白的活性有损于受试者；例如，归
因于导致活性或定位改变的内源蛋白突变。另外，重组多肽功能直接或间接
拮抗在细胞中存在、在细胞表面上或从细胞分泌的生物部分的活性。拮抗的
生物部分的例子包括脂质(例如，胆固醇)、脂蛋白(例如，低密度脂蛋白)、核
酸、糖、蛋白质毒素如志贺氏毒素和破伤风毒素、或小分子毒素如肉毒杆菌
毒素、霍乱毒素和白喉毒素。另外，所拮抗的生物分子可以是显示出不利活
性如细胞毒活性或细胞抑制活性的内源蛋白。

本文所述的重组蛋白可以工程化以定位于细胞内部、可能定位于特定区
室如胞核内部，或经工程化以便从细胞分泌或转运到细胞的质膜上。

本公开的其他方面涉及移植含有多核苷酸、初级构建体或mmRNA的细
胞至哺乳动物受试者。向哺乳动物受试者施用细胞是本领域普通技术人员已
知的，并且包括，但不限于局部植入法(例如，局部或皮下施用)、器官递送
或全身注射(例如，静脉内注射或吸入)和可药用载体中的细胞制剂。可以配
制含有多核苷酸、初级构建体或mmRNA的这类组合物，用于肌内、经动脉、
腹腔内、静脉内、鼻内、皮下、内窥方式、经皮或鞘内施用。在一些实施方
案中，可以配制组合物用于延长的释放。

可以对其施用治疗药的受试者患有疾病、病症或有害病状或可以面临形
成疾病、病症或有害病状的风险。提供了根据这些碱基鉴定、诊断受试者和
对其分类的方法，所述方法可以包括临床诊断、生物标记物水平、全基因组
关联研究(GWAS)和其他本领域已知的方法。

疾病或病症

家族性高胆固醇血症

在一个实施方案中，本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以用
来治疗家族性高胆固醇血症(FH)。如本文所用，术语“家族性高胆固醇血症”
或“FH”指一种常染色体显性遗传病，特征为血浆中低密度脂蛋白(LDL)结合
的胆固醇水平升高。与正常患者中LDL胆固醇水平(例如，<130mg/dL)相比，
杂合和纯合FH患者中的水平经常分别升至350-550mg/dL和>600mg/dL。
FH患者或受试者中的LDL胆固醇在这些水平的升高导致组织内部胆固醇沉
积并且可能在年轻时具有增加的心血管疾病风险。在一些实施方案中，这些
个体的血液中的LDL高水平可能是编码LDL受体的基因中突变的结果。通
过富含三酰甘油的极低密度脂蛋白或VLDL的脂肪分解性分解代谢，在循环
内部产生LDL。在脂质转移和酯化反应之后，认为并且不意在限制的是，LDL
受体结合循环中的LDL并促进LDL内吞至表达受体的肝细胞表面上。当这
种受体机能不良时，LDL水平在它们在血流中的延长滞留期间在循环中保持
升高，并且促进动脉粥样硬化的形成。LDLR基因中的失活性突变在是大部
分FH病例的原因，杂合和纯合患者中的LDLR表达分别通常是正常者的约
50％和约10-15％。FH个体可能对FH相关的基因突变杂合或纯合。杂合FH
是最常见的遗传病之一，在一般群体中流行率为大约1/500；而本病的纯合
形式更罕见，流行率为大约1/1,000,000。纯合个体中的症状可能更严重。在
儿童或成年早期期间通过本领域已知的方法，包括但不限于揭示黄瘤(脂性皮
肤生长物)的体检，诊断是可能的。可以通过分析家族史和遗传学，进行FH
早期诊断。(Sjouke,B.等人,Familialhypercholesterolemia:presentandfuture
management.CurrCardiolRep.2011Dec；13(6):527-36；Avis,H.J.等人,A
systematicreviewandmeta-analysisofstatintherapyinchildrenwithfamilial
hypercholesterolemia.ArteriosclerThrombVascBiol.2007Aug；27(8):1803-10；
所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文)。

现有治疗剂，如他汀类、烟酸和树脂，可以通过诱导肝脏中的LDLR表
达，直接或间接地降低血清胆固醇水平。尽管对许多杂合FH患者有效，但
这些方案可能存在问题。至少25-30％服用这些药物的患者不能实现他们想要
的LDL胆固醇目标。这些药物可能甚至在治疗纯合FH时效力更低，主要原
因在于这些患者的肝脏中功能性LDLR的低残余水平。这些患者大部分不响
应于他汀类并且在疾病的严重形式下，治疗限于LDL去除疗法和肝移植。当
前治疗并不总是成功降低LDL-胆固醇水平至目标；因此，迫切需要新治疗。

在一个实施方案中，可以对FH患者施用包含本发明的至少一种多核苷
酸、初级构建体或mmRNA的组合物。多核苷酸、初级构建体或mmRNA可
以编码肽、蛋白质或其片段如，但不限于低密度脂蛋白受体(LDLR)、载脂蛋
白B(APOB)和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(PCSK9)。

在一个实施方案中，可以通过施用本发明的组合物治疗FH，所述组合
物包含编码LDLR的肽、蛋白质或其片段的至少一种多核苷酸、初级构建体
或mmRNA。在另一个实施方案中，可以通过施用本发明的组合物治疗FH，
所述组合物包含编码肽、蛋白质或其片段的至少一种多核苷酸、初级构建体
或mmRNA。

在一个实施方案中，可以通过施用本发明的组合物治疗FH，所述组合
物包含编码APOB的肽、蛋白质或其片段的至少一种多核苷酸、初级构建体
或mmRNA。在另一个实施方案中，可以通过施用本发明的组合物治疗FH，
所述组合物包含编码肽、蛋白质或其片段的至少一种多核苷酸、初级构建体
或mmRNA。在一个实施方案中，可以通过施用本发明的组合物治疗FH，所
述组合物包含编码PCSK9的肽、蛋白质或其片段的至少一种多核苷酸、初级
构建体或mmRNA。在另一个实施方案中，可以通过施用本发明的组合物治
疗FH，所述组合物包含编码肽、蛋白质或其片段的至少一种多核苷酸、初
级构建体或mmRNA。

在另一个实施方案中，可能有用的是优化特定多肽在有潜在意义的细胞
系或细胞系保藏物中表达，尤其目的多肽如具有已知活性的参比蛋白的蛋白
质变体。在一个实施方案中，提供了一种通过以下方式优化目的多肽在靶细
胞中表达的方法：提供多个靶细胞类型并且使多个靶细胞类型的每一者独立
地与每种编码多肽的修饰的mRNA接触。另外，可以改变培养条件以增加蛋
白质产生效率。随后，检测和/或定量多个靶细胞类型中目的多肽的存在和/
或水平，从而允许通过选择有效靶细胞和与之相关的细胞培养条件，优化目
的多肽的表达。当目的多肽含有一个或多个翻译后修饰或具有经常使高效蛋
白质产生复杂化的大量三级结构时，可以使用这类方法。

本文所述的方法和组合物可以用来产生能够在哺乳动物受试者中减弱或
阻断内源激动剂生物学反应和/或拮抗受体或信号传导分子的蛋白质。例如，
IL-12和IL-23受体信号传导可能在慢性自身免疫疾病如多发性硬化和炎性疾
病如类风湿性关节炎、银屑病、红斑狼疮、强直性脊柱炎和Chron氏病中增
强(KiklyK,LiuL,NaS,SedgwichJD(2006)Cur.Opin.Immunol.18(6):
670-5)。在另一个实施方案中，核酸编码趋化因子受体的拮抗剂。趋化因子
受体CXCR-4和CCR-5是HIV进入宿主细胞需要的(Arenzana-SeisdedosF等
人,(1996)Nature.Oct3；383(6599):400)。

配体或受体在细胞表面的表达

在本文所述多个方面的一些方面和实施方案中，本文所述的多核苷酸、
初级构建体或mmRNA可以用来在细胞的表面上表达配体或配体受体(例如，
归巢部分)。与细胞表面结合的配体或配体受体部分可以允许细胞在体内与组
织或药物具有所需的生物学相互作用。配体可以是抗体、抗体片段、适配体、
肽、维生素、糖、蛋白质或多肽、受体例如细胞表面受体、黏附分子、糖蛋
白、糖残基，治疗药、药物、糖胺聚糖或其任意组合。例如，配体可以是识
别癌细胞特异性抗原的抗体，从而使得能够与肿瘤细胞偏好性相互作用的细
胞允许修饰细胞的肿瘤特异性定位。配体可以赋予细胞组合物在待治疗的组
织中蓄积的能力，因为优选的配体可以能够与待治疗组织的外侧面上的靶分
子相互作用。通常优选与其他组织具有有限交叉反应性的配体。

在一些情况下，配体可以充当允许细胞靶向特定组织或与特定配体相互
作用的归巢部分(homingmoiety)。这类归巢部分可以包括，但不限于特异性
结合对子、抗体、单克隆抗体或其衍生物或类似物的任何成员，包括而不限
于：Fv片段、单链Fv(scFv)片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单结构域抗体、
骆驼化抗体和抗体片段、人源化抗体和抗体片段和前述的多价形式；多价结
合试剂，包括而不限于单特异性或双特异性抗体,如二硫键稳定的Fv片段、
scFv串联((scFv)2片段)、双体抗体、三体或四体抗体，其一般是共价连接或
另外稳定的(即，亮氨酸拉链或螺旋稳定化)scFv片段；和其他归巢部分，例
如包括适配体、受体和融合蛋白。

在一些实施方案中，归巢部分可以是表面结合的抗体，其可以允许调节
细胞靶向作用特异性。这特别有用，因为可以针对目的表位产生高度特异性
抗体用于所需的靶向位点。在一个实施方案中，在细胞的表面上表达多种抗
体，并且每种抗体可以针对所需的靶具有不同特异性。这类方案可以增加归
巢相互作用的亲合力和特异性。

技术人员可以基于所需的细胞定位或功能选择任何归巢部分，例如雌激
素受体配体如他莫昔芬，可以将细胞靶向在细胞表面上具有增加数目的雌激
素受体的雌激素依赖性乳腺癌细胞。配体/受体相互作用的其他非限制性例子
包括CCRI(例如，用于治疗类风湿性关节炎中发炎的关节组织或脑，和/或多
发性硬化)、CCR7、CCR8(例如，靶向至淋巴结组织)、CCR6、CCR9，CCR10(例
如，以靶向至肠组织)、CCR4、CCR10(例如，用于靶向至皮肤)、CXCR4(例
如，用于广泛增强的变移)、HCELL(例如，用于治疗炎症和炎性疾病、骨髓)、
α4β7(例如，用于靶向肠粘膜)、VLA-4/VCAM-1(例如，靶向至内皮)。通常而
言，参与靶向作用(例如，癌转移)的任何受体可以用于本文所述的方法和组
合物中。

VI.试剂盒和装置

本发明提供了用于便利和/或有效实施本发明方法的多种试剂盒。一般试
剂盒将包含足够数量和/或数目的组分以允许使用者对受试者进行多次治疗
和/或以进行多次实验，及接触细胞和/或细胞群体至少一次。

在一个方面，本发明提供了包含本发明分子(多核苷酸、初级构建体或
mmRNA)的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含一种或多种有功能的抗
体或其功能片段。

可与本发明多核苷酸、初级构建体或mmRNA组合使用的试剂盒和装置
包括在2012年12月14日提交的待决美国临时专利申请号61/737,130中公
开的那些，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。

VII.定义

在本说明书中的各个位置，本公开化合物的取代基以群组或范围公开。
本公开特别意在包括这类群组和范围的各成员的每个和每种单独子组合。例
如，术语“C_1-6烷基”特别地意在单独公开甲基、乙基、C₃烷基、C₄烷基、C₅
烷基和C₆烷基。

约：如本文所用，术语“约”意指所述值的+/-10％。

组合施用：如本文所用，术语“组合施用”或“联合施用”意指将两种或更
多种药物(药剂、试剂)在相同时间或在如此间隔时间内施用至受试者，从而
每种药物在该患者上的作用可能存在重叠。在一些实施方案中，将它们在彼
此的约60、30、15、10、5或1分钟范围内施用。在一些实施方案中，药物
的施用足够紧密地如此间隔，从而实现联合(例如，协同)效应。

动物：如本文所用，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施方案
中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”指处于任
何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，
啮齿类、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、羊、牛、灵长类或猪)。在一些实施
方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行类、两栖类、鱼类和蠕虫类。
在一些实施方案中，动物是转基因动物、基因修饰动物或克隆。

大约：如本文所用，术语“大约”或“约”如适用于一个或多个目的值时，
指与所述参比值相似的值。在某些实施方案中，除非另外声明或否则从上下
文显而易见(例外是其中这类数目将超过100％的可能值)，术语“大约”或“约”
指以任一方向(大于或更小)落于所述参比值的25％、20％、19％、18％、17％、
16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、
3％、2％、1％或更小的范围内的数值范围。

与……缔合：如本文所用，术语“与……缔合”、“缀合”、“连接”、“结合”
和“系留”，当相对于两个或更多个部分(moiety)使用时，意指所述部分在物理
上彼此直接或通过一个或多个充当连接剂的额外部分缔合或连接，以形成这
样的结构，所述结构足够地稳定，从而各部分在其中使用该结构的条件(例如，
生理条件)下保持物理缔合。“缔合”不必要严格地通过直接共价化学键进行。
它还可以表示足够稳定从而“所缔合的”实体保持物理缔合的离子键合作用或
氢键合作用或基于杂交的连接。

双官能：如本文所用，术语“双官能的”指能够执行或维持至少两种功能
的任何物质、分子或部分。所述功能可以实现相同结果或不同结果。产生功
能的结构可以是相同或不同的。例如，本发明的修饰的双官能RNA可以编
码细胞毒性肽(第一功能)，而包含编码RNA的那些核苷本身具有细胞毒性(第
二功能)。在这个例子中，向癌细胞递送修饰的双官能RNA将不仅产生可以
改善或治疗癌症的肽或蛋白质分子，且如果修饰的RNA降解而非发生翻译
时，还将向细胞递送细胞毒性核苷酬载。

生物相容性：如本文所用，术语“生物相容”意指与活细胞、组织、器官
或系统相容，带来微小的损伤、毒性或免疫系统排异风险或不带来所述风险。

生物可降解：如本文所用，术语“生物可降解的”意指能够通过活生命的
作用分解成无害产物。

生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”指在生物系统和/或生物中
具有活性的任何物质特征。例如，施用某物质至生物时，该物质对该生物具
有生物学效果，则认为该物质是生物活性的。在具体的实施方案中，如果甚
至本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA的一部分有生物活性或模拟生
物学学上相关的活性，则本发明的多核苷酸、初级构建体或mmRNA可以视
为有生物活性。

癌干细胞：如本文所用，“癌干细胞”是可以发生自我更新和/或异常增殖
和分化以形成肿瘤的细胞。

化学术语：本文中不另外定义的化学术语将符合在2012年12月14日提
交的待决美国临时专利申请号61/737,130中提供的化学术语，所述文献的内
容通过引用的方式完整并入本文。

如本文所用，术语“非对映异构体”意指彼此并非为镜像并且彼此不可叠
合的立体异构体。

如本文所用，术语药物(药剂、试剂)的“有效量”是这样的量，所述量足
以实现有益或所需的结果，例如，临床结果，并且因此“有效量”取决于应用
它的情境。例如，在施用治疗癌症的药物情境下，药物的有效量例如是这样
的量，与不施用所述药物情况下获得的反应相比，所述量足以实现如本文定
义的癌症治疗。

如本文所用，术语“对映异构体”意指本发明化合物的每种独立光学活性
形式，所述的光学活性形式具有至少80％(即，至少90％的一种对映异构体和
最多10％的另一种对映异构体)、优选地至少90％和更优选地至少98％的光
学纯度或对映异构过量(如通过本领域标准的方法所测定)。

如本文所用，术语“异构体”意指本发明任何化合物的任何互变异构体、
立体异构体、对映异构体或非对映异构体。认识到本发明的化合物可以具有
一个或多个手性中心和/或双键并且因此作为立体异构体如双键异构体(即，
几何E/Z异构体)或非对映异构体(例如，对映异构体(即，(+)或(-))或顺/反式
异构体)存在。根据本发明，本文所述的化学结构和因此本发明的化合物涵盖
了全部的相应立体异构体，即，立体异构上纯的形式(例如，几何上纯、对映
上纯或非对映上纯)形式以及对映异构和立体异构混合物，例如，消旋物。通
过熟知方法，如手性-相气相色谱、手性-相高效液相色谱、使化合物结晶为
手性盐复合物或使化合物在手性溶剂中结晶，本发明化合物的对映异构和立
体异构混合物一般可以分解成其组分对映异构体或立体异构体。对映异构体
和立体异构体也可以通过熟知的非对称合成方法由立体异构或对映异构纯的
中间体、试剂和催化剂获得。

如本文所用，术语“立体异构体”指化合物(例如，本文所述的任何式化
合物)可能拥有的全部可能的不同异构形式以及构象形式，尤其全部可能的立
体化学和构象学异构形式、基本分子结构的全部非对映异构体、对映异构体
和/或构象异构体。本发明的一些化合物可以按不同的互变异构形式存在，后
者全部纳入本发明的范围内。

化合物：如本文所用，术语“化合物”意在包括所述结构的全部立体异构
体、几何异构体、互变异构体和同位素。

本文所述的化合物可以是非对称的(例如，具有一个或多个立构中心)。
除非另外说明，否则意指全部立体异构体，如对映异构体和非对映异构体。
含有非对称取代的碳原子的本发明化合物可以按光学活性形式或外消旋形式
分离。关于如何从自光学活性原料制备光学活性形式的方法是本领域已知的，
如通过拆分外消旋混合物或通过立体选择性合成制备。烯烃、C＝N双键等的
许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，并且本公开中包括全部
这类稳定的异构体。描述了本公开的化合物的顺式几何异构体和反式几何异
构体并且它们可以作为异构体混合物或作为分离的异构形式分离。

本公开的化合物还包括互变异构形式。互变异构形式来自于与毗邻双键
交换单键和质子同步移行。互变异构形式包括质子转移互变异构体，所述质
子转移互变异构体是具有相同实验式和总电荷的异构质子化状态。质子转移
互变异构体的例子包括酮–烯醇对、酰胺–亚胺酸对、内酰胺–内酰亚胺对、酰
胺–亚胺酸对、烯胺–亚胺对和其中质子可能占据杂环体系的两个或更多个位
置的环形式，如1H-和3H-咪唑、1H-、2H-和4H-1,2,4-三唑、1H-和2H-异吲
哚、以及1H-和2H-吡唑。互变异构形式可以处于平衡或通过适宜取代在空
间上锁定成一种形式。

本公开的化合物还包括在中间体化合物或最终化合物中出现的原子的全
部同位素。“同位素”指具有相同原子数，但是因原子核内中子数不同而产生
的不同质量数的原子。例如，氢的同位素包括氚和氘。

本公开的化合物和盐可以通过例行方法与溶剂或水分子组合的情况下制
备，以形成溶剂化物和水合物。

定向(committed)：如本文所用，当提到细胞时，术语“定向”意指当细胞
远未进入分化途径时，在此细胞在正常环境下将继续分化成特定细胞类型或
细胞类型亚类，而不是分化成不同的细胞类型或逆转成分化程度较低的细胞
类型。

保守：如本文所用，术语“保守”指多核苷酸序列或多肽序列各自的核苷
酸或氨基酸残基，所述核苷酸或氨基酸残基是在正在比较的两个或更多个序
列的相同位置中未改变的那些。相对保守的核苷酸或氨基酸是在更相关的序
列中与所述序列中其他地方出现的核苷酸或氨基酸相比保守的那些。

在一些实施方案中，如果两个或更多个序列是100％彼此相同的，则称
它们是“完全保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少
70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同，则称它们是“高
度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此约70％相同、
约80％相同、约90％相同、约95％、约98％、或约99％相同，则称它们是“高
度保守的”。在一些实施方案中，如果两个或更多个序列彼此至少30％相同、
至少40％相同、至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相
同、至少90％相同或至少95％相同，则称它们是“保守的”。在一些实施方案
中，如果两个或更多个序列彼此约30％相同、约40％相同、约50％相同、约
60％相同、约70％相同、约80％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相
同或约99％相同，则称它们是“保守的”。序列的保守可以适用于寡核苷酸或
多肽的整个长度或可以适用于其部分、区域或特征。

控释：如本文所用，术语“控释”指符合特定释放模式以产生治疗结果的
药物组合物或化合物释放谱。

环状或环化：如本文所用，术语“环状的”指存在连续环。环状分子不必
是圆形的，只要连接以形成不断裂的亚单位链。环状分子如本发明的工程化
RNA或mRNA可以是单个单位或多聚体或包含复杂的或更高级的结构的一
个或多个组分。

抑制细胞的：如本文所用，“抑制细胞的”指抑制、减少、压制细胞(例如，
哺乳动物细胞(例如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊
病毒或其组合生长、分裂或倍增。

细胞毒的：如本文所用，“细胞毒的”指杀死细胞(例如，哺乳动物细胞(例
如，人细胞))、细菌、病毒、真菌、原生动物、寄生虫、朊病毒或其组合或
对其造成有害、有毒或致死效果。

递送：如本文所用，“递送”指递送化合物、物质、实体、部分、载货或
酬载的行为或方式。

递送剂：如本文所用，“递送剂”指促进(至少部分地)多核苷酸、初级构
建体或mmRNA体内递送至所靶向细胞的任何物质。

去稳定：如本文所用，术语“可去稳定的”、“去稳定”或“去稳定区域”意
指与相同区域或分子的起始、野生型或天然形式相比较不稳定的区域或分子。

可检测标记物：如本文所用，“可检测标记物”指与另一种实体连接、合
并或缔合的一种或多种标记、信号或部分，其中通过本领域已知的方法轻易
检测到所述另一种实体，所述方法包括放射线照相术、荧光、化学发光、酶
活性、吸光度等。可检测标记物包括放射性同位素、荧光团、发色团、酶、
染料、金属离子、配体如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素和半抗原、量
子点等。可检测标记物可以位于本文公开的肽或蛋白质中的任何位置。它们
可以位于氨基酸、肽或蛋白质内部，或位于N-末端或C-末端处。

发育潜能：如本文所用，“发育潜能”或“发育能力”指当分化时细胞可实
现的全部发育细胞命运或细胞类型的总和。

发育潜能改变因子：如本文所用，“发育潜能改变因子”指可以改变细胞
发育潜能的蛋白质或RNA。

消化：如本文所用，术语“消化”意指分解成更小的小片或组分。当指多
肽或蛋白质时，消化导致肽的产生。

分化的细胞：如本文所用，术语“分化的细胞”指在其天然形式下不是多
潜能的任何体细胞。分化的细胞还涵盖部分分化的细胞。

分化(名词)：如本文所用，术语“分化因子”指可以诱导细胞分化成所需
细胞类型的发育潜能改变因子，如蛋白质、RNA或小分子。

分化(动词)：如本文所用，“分化”指其中未定向或定向程度较小的细胞
获得定向细胞特征的过程。

远端：如本文所用，术语“远端”意指远离中心或远离目的点或目的区域
存在。

剂量分割因素(DSF)-剂量分割治疗的PUD除以每日总剂量或单个单位
剂量的PUD之比。该值来自给药方案组的比较。

胚胎干细胞：如本文所用，术语“胚胎干细胞”指胚胎胚泡内部细胞团的
天然存在的多潜能干细胞。

囊化：如本文所用，术语“囊化”意指围绕、包围或包裹。

编码的蛋白质切割信号：如本文所用，“编码的蛋白质切割信号”指编码
蛋白质切割信号的核苷酸序列。

工程化：如本文所用，当本发明的实施方案设计成具有与起始、野生型
或天然分子不同的(结构性或化学性)特征或性质时，本发明的实施方案被“工
程化”。

外来体：如本文所用，“外来体”是由哺乳动物细胞分泌的小泡或RNA
降解中涉及的复合物。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”指以下一个或多个事件：(1)从
DNA序列(例如，通过转录)产生RNA模板；(2)加工RNA转录物(例如，通
过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’端加工)；(3)RNA翻译成多肽或蛋白质；和
(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

特征：如本文所用，“特征”指性质、特性或不同元素。

制剂：如本文所用，“制剂”至少包含多核苷酸、初级构建体或mmRNA
和递送剂。

片段：如本文所用，“片段”指部分。例如，蛋白质的片段可以包括通过
消化从培养细胞分离的全长蛋白质获得的多肽。

功能性(有功能的)：如本文所用，“功能性(有功能的)”生物分子是处于这
种形式的生物分子，其中所述生物分子显示作为其特征的特性和/或活性。

同源性：如本文所用，术语“同源性”指聚合物分子之间例如核酸分子(例
如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些
实施方案中，如果聚合物分子的序列是至少25％、30％、35％、40％、45％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同或
相似的，则认为它们彼此“同源”。术语“同源的”必然地指至少两个序列(多核
苷酸序列或多肽序列)之间的比较。根据本发明，如果两个多核苷酸序列编码
的多肽就至少约20个氨基酸的至少一个片段而言至少约50％、60％、70％、
80％、90％、95％或甚至99％相同，则认为这两个多核苷酸序列同源。在一
些实施方案中，同源多核苷酸序列以编码至少4–5个唯一指定氨基酸的片段
的能力为特征。对于小于60个核苷酸长度的多核苷酸序列，通过编码至少4–5
个唯一指定氨基酸的片段的能力确定同源性。根据本发明，如果两种蛋白质
就至少一个至少约20个氨基酸的片段而言至少约50％、60％、70％、80％或
90％相同，则认为这两个蛋白质序列同源。

同一性：如本文所用，术语“同一性”指聚合物分子之间例如寡核苷酸分
子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。例
如，可以通过以下方式实施两个多核苷酸序列的同一性百分数计算：将两个
序列为最佳比较目的比对(例如，可以为最佳比对结果而在第一和第二核酸序
列之一或二者中引入空位并且可以为比较目的而抛弃不相同的序列)。在某些
实施方案中，为比较目的所比对的序列的长度是至少30％、至少40％、至少
50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的参
考序列长度。随后比较相应核苷酸位置处的核苷酸。在第一序列中的位置由
第二序列中在对应位置处的相同核苷酸占据时，则所述分子在该位置处是相
同的。考虑到为最佳比对两个序列而需要引入的空位的数目和每个空位的长
度，两个序列之间的同一性百分数使所述序列共有的相同位置数的函数。可
以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。例如，
两个核苷酸序列之间的同一性百分数可以使用多种方法如在以下文献中描述
的那些方法来确定：ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.编著,Oxford
UniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenome
Projects,Smith,D.W.编著,AcademicPress,NewYork,1993；SequenceAnalysis
inMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；ComputerAnalysis
ofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编著,HumanaPress,New
Jersey,1994；以及SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.编著,
MStocktonPress,NewYork,1991；所述文献的每一篇通过引用的方式并入本
文。例如，可以利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller算法
(CABIOS,1989,4:11-17)，使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12、空
位罚分4，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。可以备选地使用GCG
软件包中的GAP程序，利用NWSgapdna.CMP矩阵，确定两个核苷酸序列之
间的同一性百分数。常用来确定序列之间同一性百分数的方法包括但不限于
在Carillo,H.和Lipman,D.,SIAMJAppliedMath.,48:1073(1988)中公开的那
些；所述文献通过引用方式并入本文。另外，确定同一性的技术编纂于公众
可获得的计算机程序中。确定两个序列之间同源性的示例性计算机软件包括
包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人,NucleicAcidsRes12(1):387
(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215,
403(1990))。

抑制基因表达：如本文所用，短语“抑制基因表达”意指造成基因表达产
物量减少。表达产物可以是从基因转录的RNA(例如，mRNA)或从转录自基
因的mRNA翻译的多肽。一般，mRNA水平降低导致从其中翻译的多肽的
水平降低。可以使用测量mRNA或蛋白质的标准技术确定表达的水平。

体外：如本文所用，术语“体外”指在人工环境下例如在试管或反应容器
中、在细胞培养物中、在皮式培养皿中等发生，而不是在生物(例如，动物、
植物或微生物)内部发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”指在生物(例如，动物、植物或微生物或
其细胞或组织)内部发生的事件。

分离的：如本文所用，术语“分离的”指已经与至少同它们结合的一些组
分分离(是否在自然界中或在实验环境中)的物质或实体。分离的物质可以根
据同它们结合的物质具有变动的纯度水平。分离的物质和/或实体可以与至少
约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、
约90％或更多起初同它们结合的其他组分分离。在一些实施方案中，所分离
的药物纯度大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约
94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％。如本文所
用，如果某物质基本上不含其他组分，则它是“纯的”。

基本上分离的：“基本上分离的”意指化合物基本上与形成或检测到它的
环境中分离。部分的分离可以例如包括富含本公开化合物的组合物。基本上
分离可以包括含有以重量计至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约
80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％本公开化合物或
其盐的组合物。用于分离化合物及其盐的方法是本领域常规的。

接头：如本文所用，接头指一组原子，例如，10-1,000个原子，并且可
以由原子或基团如但不限于碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰、羰
基和亚胺组成。接头可以在第一末端连接至核碱基或糖部分上的修饰的核苷
或核苷酸，并且在第二末端连接至酬载，例如，可检测物质或治疗剂。接头
可以具有足够长度，从而不干扰向核酸序列中并入。接头可以用于任何可用
目的，如用来形成mmRNA多聚体(例如，通过两个或更多个多核苷酸、初级
构建体或mmRNA分子的连接)或mmRNA缀合物，以及用来施用酬载，如
本文所述。可以并入接头中的化学基团的例子包括但不限于烷基、链烯基、
炔基、酰氨基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，
每种基团可以是任选取代的，如本文所述。接头的例子包括但不限于不饱和
链烷、聚乙二醇(例如，乙二醇或丙二醇单体单位，例如，二甘醇、双丙甘醇、
三乙基二醇、三丙基二醇、四乙二醇或四乙二醇)和葡聚糖聚合物。其他例子
包括但不限于接头内部可以利用还原剂或光解作用切割的可切割部分，如，
例如，二硫键(-S-S-)或偶氮键(-N＝N-)。可选择性切割键的非限制性例子包括
可以例如通过利用三(2-羧乙基)膦)(TCEP)或其他还原剂和/或光解作用切割
的酰氨基键以及可以例如通过酸性或碱性水解切割的酯键。

微RNA(miRNA)结合位点：如本文所用，微RNA(miRNA)结合位点表示
核酸转录物中与至少miRNA“种子区结合的核苷酸位置或区域。

修饰的：如本文所用“修饰的”指本发明分子的改变的状态或结构。分子
可以按多种方式修饰，包括在化学、结构和功能上的修饰。在一个实施方案
中，通过引入非天然核苷和/或核苷酸修饰本发明的mRNA分子，例如，在
它涉及天然核糖核苷酸A、U、G和C时。非规范核苷酸如帽结构不视为“修
饰的”，虽然它们与A、C、G、U核糖核苷酸的化学结构不同。

黏液：如本文所用，“黏液”指粘稠并且包含黏蛋白糖蛋白的天然物质。

多能：如本文所用，当提及细胞时，“多能”或“部分分化细胞”指一种细
胞，所述细胞具有分化成一个或多个胚层细胞、但并非分化成全部三个胚层
细胞的发育潜能。

天然存在的：如本文所用，“天然存在的”意指在自然界中无人工辅助情
况下存在。

非人类脊椎动物：如本文所用，“非人类脊椎动物”包括除智人(Homo
sapiens)之外的全部脊椎动物，包括野生和驯化物种。非人类脊椎动物的例子
包括但不限于哺乳动物，如驼羊、爪哇野牛、野牛、骆驼、猫、牛、鹿、犬、
驴、大额牛、山羊、豚鼠、马、羊驼、骡、猪、兔、驯鹿、羊、水牛和牦牛。

脱靶：如本文所用，“脱靶”指对任一个或多个靶、基因或细胞转录物的
任何非预期效果。

寡能：如本文所用，当提及细胞时，“寡能”意指产生比多能干细胞更受
限制的细胞谱系亚组。

可读框：如本文所用，“可读框”或“ORF”指在给定的阅读框中不含有终
止密码子的序列。

有效连接：如本文所用，短语“有效连接”指两个或更多个分子、构建体、
转录物、实体、部分等之间有功能的连接。

任选取代的：本文中，短语形式“任选取代的X”(例如，任选取代的烷基)
意在等同于“X，其中X是任选取代的”(例如，“烷基，其中所述烷基是任选
取代的”)。它不意指特征“X”(例如烷基)本身是任选的。

肽：如本文所用，“肽”长度小于或等于50个氨基酸，例如，长度约5、
10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。

互补位：如本文所用，“互补位”指抗体的抗原结合位点。

患者：如本文所用，“患者”指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接
受治疗、将会接受治疗的受试者，或因特定疾病或病状而在训练有素的专业
人员护理下的受试者。

可药用：短语“可药用的”在本文中用来指这些化合物、物质、组合物和/
或剂型，其中它们在合理医学判断力范围内，适用于接触人和动物的组织而
没有过多毒性、刺激性、变态反应或其他问题或并发症，与合理益处/风险比
相称。

可药用赋形剂：如本文所用，短语“可药用赋形剂”指除本文所述的化合
物之外(例如，能够悬浮或溶解活性化合物的溶媒)并具有在患者中基本上无
毒和非炎性特性的任何成分。赋形剂可以包括例如抗粘附剂、抗氧化剂、结
合剂、包衣、压制助剂、崩解剂、染料(色料)、软化剂、乳化剂、填料(稀释
剂)、成膜物质或包衣、风味剂、香料、助流剂(流动增进剂)、润滑剂、防腐
剂、印刷墨、吸附剂、助悬剂或分散剂、甜味剂和水化的水。示例性赋形剂
包括但不限于：丁化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸(氢二)钙、硬脂酸钙、交
联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、
乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、
麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、尼泊金甲酯、微晶纤维素、聚
乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预糊化淀粉、尼泊金丙酯、视黄醇棕榈
酸酯、紫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉羟乙酸钠、山梨
醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维
生素C和木糖醇。

可药用盐：本公开还包括本文所述化合物的可药用盐。如本文所用，“可
药用盐”指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸部分或碱部分转化成
其盐形式(例如，通过游离碱基团与合适的有机酸反应)修饰母体化合物。可
药用盐的例子包括但不限于碱性残基如胺的无机盐和有机酸盐；酸性残基如
羧酸的碱式盐或有机盐等。代表性酸加成盐包含乙酸盐、己二酸盐、海藻酸
盐、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸
盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二
烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、
庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸
盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、
甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双
羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、
特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、
甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、
钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四
乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙基、乙胺等。本公开的可药用盐包括
形成的母体化合物的常规无毒盐，例如，从无毒无机酸或有机酸形成。本公
开的可药用盐可以通过常规化学方法从含有碱性部分或酸性部分的母体化合
物合成。简而言之，这类盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学
计量数量的适宜碱或酸在水中或在有机溶剂中或在这二者的混合物中反应来
制备；通常，优选非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐
的清单存在以下文献中：PharmaceuticalSciences,第17版,MackPublishing
Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,PharmaceuticalSalts:Properties,
Selection,andUse,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编著),Wiley-VCH,2008以及
Berge等人,JournalofPharmaceuticalScience,66,1-19(1977)，所述文献的每
一篇通过引用方式完整地并入本文。

药代动力学：如本文所用，“药代动力学”表示施用至活生物的物质的命
运有关的分子或化合物的任一种或多种特性。药代动力学分成几个领域，包
括吸收的程度和速率、分布、代谢和排泄。这常称作ADME，其中：(A)吸
收是物质进入血液循环的过程；(D)分布是物质分散或散布遍及身体的流体和
组织各处；(M)代谢(或生物转化)是母体化合物不可逆性转化成子代谢物；和
(E)排泄(或清除)指物质从身体清除。在罕见情况下，一些药物不可逆地蓄积
在身体组织中。

可药用溶剂化物：如本文所用，术语“可药用溶剂化物”意指其中合适溶
剂的分子掺入晶体晶格中的本发明化合物。合适的溶剂是在施用的剂量上生
理可耐受的。例如，可以通过结晶、再结晶或沉淀由包含有机溶剂、水或其
混合物的溶液制备溶剂化物。合适溶剂的例子是乙醇、水(例如、一水合物、
二水合物和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)、N,N’-
二甲基甲酰胺(DMF)、N,N’-二甲基乙酰胺(DMAC)、1.3-二甲基-2-咪唑啉酮
(DMEU)、1.3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二
醇、乙酸乙酯、苄醇、2-吡咯、苄基苯甲酸盐等。当水是溶剂时，溶剂化物
称作“水合物”。

物理化学：如本文所用，“物理化学”意指或涉及物理和/或化学特性。

多能的：如本文所用，“多能的”指在不同条件下具有发育潜能以分化成
作为全部三个胚层特征的细胞类型的细胞。

多能性：如本文所用，“多能性”或“多能的状态”指细胞的发育潜能，其
细胞具有分化成全部三个胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的能力。

预防：如本文所用，术语“预防”指部分地或完全地延迟感染、疾病、病
症和/或病状发作；部分地或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或病状的
一种或多种症状、特征或临床表现发作；部分地或完全地延迟特定感染、疾
病、病症和/或病状的一种或多种症状、特征或表现发作；部分地或完全地延
迟自感染、特定疾病、病症和/或病状的进展；和/或降低形成与感染、疾病、
病症和/或病状相关的病变的风险。

前药：本公开还包括本文所述化合物的前药。如本文所用，“前药”指任
何物质、分子或实体，其所处的性质据预测该物质、分子或实体在化学或物
理改变后即用作治疗药。前药可以按某种方式共价地结合或掩蔽并且在施用
至哺乳动物受试者之前、之时或其后释放或被转化成活性药物部分。前药可
以通过以下方式制备：以如此方式修饰化合物中存在的官能团，从而相对于
母体化合物，以例行操作或在体内切去所述修饰。前药包含这样的化合物，
其中羟基、氨基、硫氢基或羧基与施用至哺乳动物受试者时遭受切割以分别
形成游离羟基、氨基、硫氢基或羧基的任何基团结合。在T.Higuchi和V.Stella,
“Pro-drugsasNovelDeliverySystems,”A.C.S.SymposiumSeries第14卷以及
BioreversibleCarriersinDrugDesign,编者EdwardB.Roche,American
PharmaceuticalAssociationandPergamonPress,1987中讨论了前药的制备和
施用，所述两篇文献因而通过引用的方式完整并入。

增殖：如本文所用，术语“增殖”意指生长、扩大或增加或造成快速地生
长、扩大或增加。“增殖性”意指具有增殖能力。“抗增殖性”意指具有与增殖
性特性对抗或不适合增殖的特性。

祖先细胞：如本文所用，术语“祖先细胞”指相对于它可以通过分化产生
的细胞而具有更大发育潜能的细胞。

蛋白质切割位点：如本文所用，“蛋白质切割位点”指其中可以通过化学、
酶促或光化学手段完成氨基酸链的受控切割的位点。

蛋白质切割信号：如本文所用，“蛋白质切割信号”指标示或标记多肽以
便切割的至少一个氨基酸。

目的蛋白：如本文所用，术语“目的蛋白”或“所需的蛋白质”包括本文提
供的那些及其片段、突变体、变体和改变。

近端：如本文所用，术语“近端的”意指更靠近中心或更靠近目的点或目
的区域存在。

纯化：如本文所用，“所纯化的”、“纯化的”、“纯化”意指使得基本上纯
的或不包含不想要的组分、污秽物质、混合物或杂质。

反复转染：如本文所用，术语“反复转染”指用多核苷酸、初级构建体或
mmRNA多次转染相同的细胞培养物。可以将细胞培养物转染至少2次、至
少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次、
至少10倍、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、
至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次、至少25次、
至少30次、至少35次、至少40次、至少45次、至少50次或更多次。

再编程：如本文所用，“再编程”指逆转一个细胞或细胞群体的发育潜能
的过程。

再编程因子：如本文所用，术语“再编程因子”指发育潜能改变因子如蛋
白质、RNA或小分子，所述发育潜能改变因子的表达有助于细胞再编程到分
化程度更小或未分化的状态。

样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”指其组织、细胞或组分部
分的子集(例如体液，包括但不限于血液、黏液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾
液、羊水、羊膜脐带血、尿、阴道液和精液)。样品还可以包括从完整生物或
其组织、细胞或组分部分的子集制备的匀浆、裂解物或提取物、或其级分或
部分，包括但不限于例如，血浆、血清、脊液、淋巴液、皮肤外断面、呼吸
道、肠道和生殖泌尿道、泪、唾液、牛奶、血细胞、肿瘤、器官。样品还涉
及培养基，如营养培养液或凝胶，其可以含有细胞组分，如蛋白质或核酸分
子。

信号序列：如本文所用，短语“信号序列”指可以指导蛋白质转运或定位
的序列。

单个单位剂量：如本文所用，“单个单位剂量”是在一个剂量中/在一个时
间/单个途径/单个接触点(即，单个施用事件)所施用的任何治疗药的剂量

相似性：如本文所用，术语“相似性”指聚合物分子之间例如多核苷酸分
子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。可
以按照与计算同一性百分数相同的方式计算聚合物分子彼此间的相似性百分
数，例外是如本领域理解相似性百分数的计算考虑保守性置换。

体细胞：如本文所用，“体细胞”指除生殖细胞之外的任何细胞、在植入
前胚胎中存在或从其获得的细胞或因这种细胞的体外增殖产生的细胞。

成体干细胞：如本文所用，“成体干细胞”指衍生自非胚组织(包括胎儿组
织、幼体组织和成体组织)的任何多潜能或多能干细胞。

成体多能细胞：如本文所用，“成体多能细胞”指已经使其发育潜能改变
成多能状态发育潜能的体细胞。

分割剂量：如本文所用，“分割剂量”是单个单位剂量或每日总剂量分成
两个或更多个剂量。

稳定的：如本文所用“稳定的”指充分稳健以承受从反应混合物分离至有
用纯度的分离并且优选地能够配置成有效治疗剂的化合物。

稳定化：如本文所用，术语“稳定化”、“稳定化的”、“稳定化的区域”意
指使得或变得稳定。

干细胞：如本文所用，术语“干细胞”指处于未分化状态或部分分化状态
的细胞，所述细胞具有自我更新特性并且具有分化成多个细胞类型的发育潜
能，而无特定发育潜能。干细胞可能能够增殖并产生更多的这类干细胞，同
时维持其发育潜能。

受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”指可以例如出于实验、诊
断、预防和/或治疗目的而向其施用本发明组合物的任何生物。常见的受试者
包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类和人)和/或植物。

基本上：如本文所用，术语“基本上”指显示目的特征或性质的总程度或
近似总程度或度的定性条件。普通生物技术人员将理解，生物学现象和化学
现象很少(就算有的话)达到完成和/或很少推进到完全或者很少实现或避免绝
对结果。术语“基本上”因此在本文中用来包括许多生物学现象和化学现象中
内在的完整性的可能缺乏。

基本上相等的：如本文所用在它涉及剂量之间的时间区别时，该术语意
指加/减2％。

基本上同时：如本文所用并且在它涉及多个剂量时，该术语意指2秒范
围内。

患有：正在“患有”疾病、病症和/或病状的个体已经诊断患有或显示疾病、
病症和/或病状的一种或多种症状。

易患：“易患”某疾病、病症和/或病状的个体尚未诊断患有该疾病、病症
和/或病状和/或可以不显示出该疾病、病症和/或病状的症状，但是存在形成
疾病或其症状的倾向性。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或病状(例
如，癌症)的个体可以由以下一项或多项表征：(1)与形成该疾病、病症和/或
病状相关的基因突变；(2)与形成该疾病、病症和/或病状相关的遗传多态性；
(3)与该疾病、病症和/或病状相关的蛋白质和/或核酸的表达和/或活性增加和/
或减少；(4)与形成该疾病、病症和/或病状相关的习惯和/或生活方式；(5)该
疾病、病症和/或病状的家族史；和(6)暴露于与形成该疾病、病症和/或病状
相关的微生物和/或被其感染。在一些实施方案中，易患某疾病、病症和/或
病状的个体将形成该疾病、病症和/或病状。在一些实施方案中，易患某疾病、
病症和/或病状的个体将不形成该疾病、病症和/或病状。

缓释：如本文所用，术语“缓释”指在特定时间段范围内符合释放速率的
药物组合物或化合物释放谱。

合成的：术语“合成的”意指借助人手产生、制备和/或制造。本发明多核
苷酸或多肽或其他分子的合成可以是化学或酶促的。

靶向的细胞：如本文所用，“靶向的细胞”指任一种或多种目的细胞。所
述细胞可以在体外、在体内、原位存在或在生物的组织或器官中存在。生物
可以是动物，优选地是哺乳动物，更优选地是人，并且最优选地是患者。

治疗剂：术语“治疗剂”指当施用至受试者时具有治疗、诊断和/或预防效
果和/或激发所需生物学和/或药理学效果的任何物质。

治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指待递送物质(例如，核
酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，在施用至患有或易患感染、疾
病、病症和/或病状的受试者时，所述量足够治疗该感染、疾病、病症和/或
病状，改善其症状、诊断、预防该感染、疾病、病症和/或病状和/或延迟其
发作。

治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感
染、疾病、病症和/或病状的受试者中足以治疗该感染、疾病、病症和/或病
状，改善其症状、诊断、预防该感染、疾病、病症和/或病状和/或延迟其发
作的结果。

每日总剂量：如本文所用，“每日总剂量”是在24小时时间给予或开具的
量。它可以作为单个单位剂量施用。

全能性：如本文所用，“全能性”指具有产生在成年身体以及胚外组织(包
括胎盘)中存在的全部细胞的发育潜能的细胞。

转录因子：如本文所用，术语“转录因子”指例如，通过激活或阻遏转录
而调节DNA转录成RNA的DNA结合蛋白。一些转录因子单独实现转录的
调节作用，而其他与其他蛋白质一起发挥作用。一些转录因子可以在某些条
件下激活和阻抑转录。通常而言，转录因子在靶基因调节区中与特定靶序列
或与高度相似于特定共有序列的序列结合。转录因子可以单独或在具有其他
分子的复合物中调节靶基因的转录。

转染：如本文所用，术语“转染”指将外源核酸引入细胞中的方法。转染
方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。

转分化：如本文所用，“转分化”指一个类型的分化细胞丧失鉴别性特征
并且将其表型变成其他充分分化的细胞表型的能力。

治疗：如本文所用，术语“治疗”指部分地或完全地缓和、改善、改量、
减轻特定感染、疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征，延迟其发作、
抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率。例如，“治疗”癌症可以指
抑制肿瘤存活、生长和/或扩散。可以将治疗施用至不显示疾病、病症和/或
病状迹象的受试者和/或施用至仅显示疾病、病症和/或病状早期迹象的受试
者，目的在于降低形成与该疾病、病症和/或病状相关的病变的风险。

未修饰：如本文所用，“未修饰的”指以任何方式改变之前的任何物质、
化合物或分子。未修饰可以指，但不总是指生物分子的野生型或天然形式。
分子可以经历一系列修饰，因而每种修饰的分子可以充当后续修饰的“未修饰
的”起始分子。

等同物和范围

本领域那些普通技术人员会认识到或将能够利用不超出常规的实验确定
本文所述的本发明具体实施方案的许多等同物。本发明的范围不意在限于以
上描述，而是如所附权利要求书所述。

权利要求书中，除非根据上下文有相反或其他的证据，所述“a”、“an”和
“the”可以表示一个或多于一个。除非相反地指示或从上下文显而易见，否则，
如果某群组的一个、多于一个或全部成员均存在于给定的产物或过程中、用
于其中或与之相关，则将该群组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求
或说明视为满足。本发明包括其中该群组的一个成员完全存在于给定的产物
或过程中、用于其中或与之相关的实施方式。本发明包括其中该群组的多于
一个或全部成员均存在于给定的产物或过程中、用于其中或与之相关的实施
方案。

还应当指出，术语“包含”意在是开放式的并且允许但不要求纳入额外的
要素或步骤。当本文中使用术语“包含”时，因此还涵盖和公开术语“由……组
成”。

在给出范围的情况下，包括端值。另外，应当理解，除非另外说明或另
外从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则，作为范围表述的
值可以在本发明的不同实施方案中采取所述范围内部的任何特定值或子范
围，至该范围下限的十分之一单位，除非上下文另外清楚地说明。

此外，应当理解，落在现有技术范围内的本发明的任何具体实施方案可
以从任一项或多项权利要求中明确地排除。由于这类实施方案视为本领域普
通技术人员已知，所以可以排除它们，即使这种排除并未在本文中明确地阐
明。本发明组合物的任何具体实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；
任何产生方法；任何使用方法等)可以因任何原因从任一项或多项权利要求排
除，无论是否与现有技术的存在相关。

全部援引的来源，例如，本文中援引的参考文献、出版物、数据库，数
据库条目和论文，均通过参考并入本申请，即便没有在引文中明确地描述。
在援引的来源和本申请的描述发生冲突的情况下，本申请中的描述应当占主
导地位。

章节和表头不意在是限制的。

实施例

实施例1.修饰的mRNA的产生

可以使用标准实验室方法和材料，产生本发明的修饰的mRNA
(mmRNA)。目的基因的可读框(ORF)可以旁侧分布有可以含有强Kozak翻译
起始信号的5’非翻译区(UTR)和/或可以包括寡聚(dT)序列用于聚腺苷酸尾模
板化添加的α-珠蛋白3’UTR。可以将修饰的mRNA进行修饰以减少细胞先
天免疫反应。减少细胞反应的修饰可以包括假尿苷(ψ)和5-甲基-胞苷(5meC、
5mc或m⁵C)。(参见，KarikoK等人,Immunity23:165-75(2005)；KarikoK等
人,MolTher16:1833-40(2008)；AndersonBR等人,NAR(2010)；所述文献的
每一篇通过引用的方式完整并入本文)。

ORF还可以包含多种上游或下游添加物(如，但不限于β-珠蛋白、标签
等)，可以订购自优化服务，如，但不限于DNA2.0(MenloPark，CA)，并可
以含有可具有XbaI识别位点的多克隆位点。一旦收到构建体，可以将它重
建并转化入化学感受态大肠杆菌。

对于本发明，使用NEBDH5-α感受态大肠杆菌。根据NEB说明书，使
用100ng质粒进行转化。方案如下：

1.在冰上融化管中的NEB5-α感受态大肠杆菌细胞10分钟。

2.添加含有1pg-100ng质粒DNA的1-5μl至细胞混合物。小心甩动该
管4-5次以混合细胞和DNA。不要涡旋混合。

3.将混合物置于冰上30分钟。不要混合

4.在42℃热休克刚好30秒。不要混合

5.置于冰上5分钟。不要混合

6.吸出950μl室温SOC至混合物。

7.置于37℃持续60分钟。剧烈振摇(250转/分钟)或转动。

8.将选择平板加温至37℃.

9.通过甩动该管和颠倒彻底地混合细胞。

备选地，在30℃温育24-36小时或在25℃温育48小时。

随后使用单菌落接种5ml使用适宜抗生素的LB生长培养基并且随后允
许其生长(250转/分钟，37℃)5小时。这种培养物随后用来接种200ml培养
基和允许在相同条件下生长过夜。

为了分离质粒(达850μg)，使用InvitrogenPURELINK^TMHiPureMaxiprep
试剂盒(Carlsbad，CA)，遵循制造商的说明书，进行大量制备。

为了产生体外转录(IVT)用cDNA，首先使用限制性酶如XbaI，将质粒
线性化。采用XbaI的常见限制性消化将包含以下：质粒1.0μg；10x缓冲
液1.0μl；XbaI1.5μl；dH₂O直至10μl；在37℃温育1小时。如果以实验
室规模(<5μg)进行，使用Invitrogen的PURELINK^TMPCRMicro试剂盒
(Carlsbad，CA)，遵循制造商的说明书，净化反应物。更大规模的纯化可能
需要用具有更大荷载容量的产品如Invitrogen的标准PURELINK^TMPCR试剂
盒(Carlsbad，CA)进行。在净化之后，使用NanoDrop将线性化载体定量并
使用琼脂糖凝胶电泳分析以证实线性化。

作为一个非限制性例子，G-CSF可以代表目的多肽。表3中显示了在实
施例1-5中概述的步骤内使用的序列。应当指出在表3的每个序列中起始密
码子(ATG)均已经加下划线。

表3.G-CSF序列

实施例2：产生cDNA的PCR

使用2xKAPAHIFI^TMHotStartReadyMix由KapaBiosystems(Woburn，
MA)执行用于制备cDNA的PCR程序。这个体系包括2xKAPAReadyMix12.5
μl；正向引物(10μM)0.75μl；反向引物(10μM)0.75μl；模板cDNA100ng；
和dH₂O，稀释至25.0μl。反应条件是95℃，5分钟；以下25个循环：98℃
20秒，随后58℃15秒，随后72℃45秒；随后72℃5分钟，然后4℃至
终止。

本发明反向引物并入聚-T₁₂₀，用于mRNA中的聚-A₁₂₀。具有更长或更短
聚(T)串的其他反向引物可以用来调节mRNA中聚(A)尾的长度。

使用Invitrogen的PURELINK^TMPCRMicro试剂盒(Carlsbad，CA)，遵
循制造商的说明书，净化反应物(达5μg)。更多反应物将需要使用具有更大
容量的产品净化。在净化之后，使用NanoDrop将cDNA定量并通过琼脂糖
凝胶电泳分析以证实cDNA具有预期大小。随后提交cDNA用于测序分析，
之后推进至体外转录反应。

实施例3.体外转录(IVT)

体外转录反应产生含有修饰的核苷酸的mRNA或修饰的RNA。使用天
然和非天然NTP，自行产生输入的核苷酸三磷酸(NTP)混合物。

常见体外转录反应包含以下：

在37℃温育3小时-5小时。

粗制IVT混合物可以贮存在4℃过夜以便次日净化。1U无RNA酶的
DNA酶随后用来消化原始模板。在37℃温育15分钟后，使用Ambion的
MEGACLEAR^TM试剂盒(Austin，TX)遵循制造商的说明书，纯化mRNA。这
个试剂盒可以纯化达500μgRNA。在净化之后，使用NanoDrop将RNA定
量并通过琼脂糖凝胶电泳分析以证实RNA具有正确大小并且RNA未发生降
解。

实施例4.mRNA的酶促加帽

如下进行mRNA加帽，其中混合物包含：IVTRNA60μg-180μg和dH₂O
直至72μl。将混合物在65℃温育5分钟以使RNA变性，并且随后立即转
移到冰上。

该方案随后涉及混合10x加帽缓冲液(0.5MTris-HCl(pH8.0)，60mM
KCl，12.5mMMgCl₂)(10.0μl)；20mMGTP(5.0μl)；20mMS-腺苷酰甲硫
氨酸(2.5μl)；RNA酶抑制剂(100U)；2’-O-甲基转移酶(400U)；痘苗病毒加
帽酶(鸟苷酰基转移酶)(40U)；dH₂O(达28μl)；并且对于60μgRNA，在37
℃温育30分钟或对于180μgRNA温育达2小时。

随后，使用Ambion的MEGACLEAR^TM试剂盒(Austin，TX)遵循制造商
的说明书，纯化mRNA。在净化之后，使用NANODROP^TM(ThermoFisher,
Waltham,MA)将RNA定量并通过琼脂糖凝胶电泳分析以证实RNA具有正确
大小并且RNA未发生降解。也可以通过运行逆转-转录-PCR以产生测序用
cDNA，将RNA产物测序。

实施例5.聚腺苷酸加尾反应

在cDNA中无聚-T的情况，必须在净化终产物之前进行聚腺苷酸加尾反
应。这通过以下方式做到：混合加帽的IVTRNA(100μl)；RNA酶抑制剂(20
U)；10x加尾缓冲液(0.5MTris-HCl(pH8.0)，2.5MNaCl，100mMMgCl₂)(12.0
μl)；20mMATP(6.0μl)；聚腺苷酸聚合酶(20U)；dH₂O达到123.5μl并在
37℃温育30分钟。如果聚腺苷酸尾已经存在于转录物中，则加尾反应可以
略过并直接推进到用Ambion’sMEGACLEAR^TM试剂盒(Austin，TX)(达到500
μg)净化。聚腺苷酸聚合酶优选地是酵母中表达的重组酶。

对于本文中进行和所述的研究，聚腺苷酸尾在IVT模板中编码以包含
160个核苷酸长度。然而，应当理解，聚腺苷酸加尾反应的持续合成能力或
完整性并不总是产生刚好160个核苷酸。因此，大约160个核苷酸，例如约
150-165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164或165个
核苷酸的聚腺苷酸尾在本发明的范围内。

实施例6.天然5’帽和5’帽类似物

根据制造商的方案，修饰的RNA的5’-加帽可以在体外-转录反应期间使
用以下化学性RNA帽类似物同步完成以产生5’-鸟苷帽结构：
3′-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G[ARCA帽]；G(5’)ppp(5’)A；G(5’)ppp(5’)G；
m7G(5’)ppp(5’)A；m7G(5’)ppp(5’)G(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)。修
饰的RNA的5’-加帽可以使用痘苗病毒加帽酶转录后完成以产生“帽0”结构：
m7G(5’)ppp(5’)G(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)。帽1结构可以使用痘
苗病毒加帽酶和2’-O甲基-转移酶生成以产生：m7G(5’)ppp(5’)G-2’-O-甲基。
帽2结构可以从帽1结构生成，随后使用2’-O甲基-转移酶对5’-倒数第三个
核苷酸进行2’-O-甲基化。帽3结构可以从帽2结构生成，随后使用2’-O甲
基-转移酶对5’-倒数第四个核苷酸进行2’-O-甲基化。酶优选地衍生自重组来
源。

当转染入哺乳动物细胞时，修饰的mRNA具有12-18小时之间或长于18
小时(例如，24、36、48、60、72小时或长于72小时)的稳定性。

实施例7.加帽

A.蛋白质表达测定法

含有ARCA(3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)帽类似物或帽1结构的编码人
G-CSF的合成mRNA(SEQIDNO:30中所示的mRNA序列，序列中长大约
160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示)可以按相等的浓度转染入人原代角质形成
细胞。转染后6、12、24和36小时，可以通过ELISA测定分泌入培养基的
G-CSF的量。分泌更高水平G-CSF至培养基中的合成性mRNA将对应于具
有更高翻译能力的帽结构的合成mRNA。

B.纯度分析合成

使用变性琼脂糖-脲凝胶电泳或HPLC分析，可以比较含有ARCA帽类
似物或帽1结构的编码人G-CSF的合成mRNA(SEQIDNO:30中所示的
mRNA序列，序列中长大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示)粗制合成产物
的纯度。与具有多个条带或波纹条带的合成性mRNA相比，电泳时具有单一
齐整条带的合成mRNA对应于较高纯度的产物。具有单个HPLC峰的合成
mRNA将也对应于较高纯度的产物。效率较高的加帽反应将提供更纯的
mRNA群体。

C.细胞因子分析

含有ARCA帽类似物或帽1结构的编码人G-CSF的合成mRNA(SEQID
NO:30中所示的mRNA序列，序列中长大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未
显示)可以按多个浓度转染入人原代角质形成细胞。转染后6、12、24和36
小时，可以通过ELISA测定分泌入培养基的促炎性细胞因子如TNF-α和
IFN-β的量。分泌更高水平促炎细胞因子至培养基中的合成mRNA将对应于
含有免疫激活性帽结构的合成mRNA。

D.加帽反应效率

可以在加帽mRNA核酸酶处理后，通过LC-MS分析含有ARCA帽类似
物或帽1结构的编码人G-CSF的合成性mRNA(SEQIDNO:30中所示的
mRNA序列，序列中长大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示)的加帽反应效
率。核酸酶处理加帽的mRNA将产生通过LC-MS可检测的游离核苷酸和加
帽的5’-5-三磷酸帽结构的混合物。LC-MS谱上加帽产物的量可以表述为来
自反应的总mRNA的百分数并且将对应于加帽反应效率。具有较高加帽反应
效率的帽结构将具有由LC-MS确定的量更多的加帽产物。

实施例8.修饰的RNA或RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳

将各种修饰的RNA(20μl体积中200-400ng)或逆转录的PCR产物
(200-400ng)装入非变性1.2％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上的
孔中并根据制造商方案运行12-15分钟。

实施例9.修饰的RNA的Nanodrop定量和紫外光谱数据

TE缓冲液(1μl)中的修饰RNA用于Nanodrop紫外吸光度读数，以定量
来自体外转录反应的每种修饰的RNA的产率。

实施例10.筛选蛋白质表达的方法

A.电喷雾电离

制备可能含有由施用至受试者的修饰的RNA编码的蛋白质的生物样品
并根据制造商的电喷雾电离(ESI)方案，使用1、2、3或4台质量分析器分析。
也可以使用串联ESI质谱系统分析生物样品。

将蛋白质片段或完整蛋白质的图案与给定蛋白质的已知对照比较，并且
通过比较确定身份。

B.基质辅助激光解吸附/电离

制备可能含有由施用至受试者的修饰的RNA编码的蛋白质的生物样品，
并根据制造商的基质辅助激光解吸附/电离(MALDI)的方案分析。

将蛋白质片段或完整蛋白质的图案与给定蛋白质的已知对照比较并且通
过比较确定身份。

C.液相色谱-质谱-质谱法

可能含有由修饰的RNA编码的蛋白质的生物样品可以用胰蛋白酶处理
以消化其内部所含的蛋白质。通过液相色谱-质谱-质谱法(LC/MS/MS)分析所
产生的肽。将肽在质谱仪中片段化以产生诊断用图案，所述图案可以借助计
算机算法与蛋白质序列数据库匹配。可以稀释消化的样品以产生给定蛋白质
的1ng或更低起始材料。含有单纯缓冲液背景(例如水或挥发性盐)的生物样
品可用于直接溶液中消化；更复杂的背景(例如去垢剂、非挥发性盐、甘油)
需要额外的净化步骤以促进样品分析。

将蛋白质片段或完整蛋白质的图案与给定蛋白质的已知对照比较并且通
过比较确定身份。

实施例11.LDL-R1突变体mRNA序列

表4中给出了编码一种或多种在PCSK9结合作用方面缺陷的LDL-R蛋
白的序列。RNA的起始位点是加下划线“AUG”，并且5’UTR以及3’UTR加
粗。

表4.LDL-R序列

实施例12.LDLR1蛋白质序列

表5中给出了一个或多个突变的LDL-R1蛋白质的序列。

表5.蛋白质序列

实施例13.Cyp7a1序列

表6中给出编码CYP7A1蛋白可读框的序列以及5’UTR和3’UTR。还
显示编码的蛋白质的序列。

表6.CYP7a1序列

实施例14.NASHHCC动物模型

包括本发明多核苷酸、初级构建体和mmRNA的混合物可以在非酒精性
脂肪性肝炎(NASH)的动物模型中测试。一个模型涉及STAM(TM)小鼠(Stelic
InstituteandCo，东京日本)的使用。

实施例15-20的材料

表7中给出编码LDLR蛋白可读框、mCherry蛋白可读框和萤光素酶蛋
白可读框的序列以及5’UTR和3’UTR。RNA的起始位点是加下划线“AUG”，
并且5’UTR以及3’UTR加粗。

表7.LDLR、mCherry和萤光素酶序列

实施例15.哺乳动物中的LDLR体内研究

通过混合8.0μgmRNA与Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)至终体积
0.2mL，将低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)mRNA(SEQIDNO:42中所示的
mRNA序列；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；在序列中未
显示160个核苷酸的聚腺苷酸尾)与Lipofectamine2000复合。

将Lipofectamine2000用DMEM稀释12.5倍并且与等体积稀释的LDL
受体mRNA溶液混合。将样品在室温温育5分钟并将0.1mL体积复合的
mRNA混合物注入三只C57BL/6小鼠各自的尾静脉。每只动物接受2.0μg
LDL受体mRNA的总剂量。在6小时后，处死动物并取出脾。将脾细胞根
据标准程序(不事先裂解红细胞)分离并用等量的对人LDL受体特异的IgG或
作为对照的非免疫IgG染色。

通过流式细胞术评估LDL受体的表达，对CD11b+脾细胞群体设门。如
图4中所示，在三只独立小鼠的每只中证实了LDL受体在CD11b+脾细胞群
中的体内表达，这通过与用非免疫IgG染色的细胞(非免疫IgG)相比，用LDL
受体IgG染色的细胞(LDLRIgG)向右偏移峰的存在证实，。

对于单独用lipofectamine处理的小鼠，未观察到LDL受体特异性峰并且
染色相似于用非免疫IgG观察到的染色。

实施例16.LDLR在小鼠中的体内表达

LDLR-/-小鼠用来检验LDLRmmRNA的体内表达。通过注射将LDLR
mmRNA施用至LDLR-/-小鼠。对来自小鼠的组织检查LDLR表达。实施小
鼠组织的蛋白质印迹分析，以寻找因施用LDLRmmRNA所致的LDLR蛋白
质表达。对小鼠组织实施实时RT-PCR以寻找LDLR基因表达。

实施例17.证实肽身份

可以使用液相色谱-质谱串联质谱法(LC-MS/MS)连同定量性LC-多反应
监测(MRM)评价蛋白质，以证实肽的身份。

可以使用液相色谱-质谱串联质谱法(LC-MS/MS)连同定量性LC-多反应
监测(MRM)测定法(BiognosysAG,SchlierenSwitzerland)，评价本文所述的任
何蛋白质靶的身份。使用LC-MS/MS连同定量LC-MRM测定法(Biognosys,
SchlierenSwitzerland)评价含有从修饰的mRNA表达的蛋白质的HeLa细胞裂
解物，目的在于证实细胞裂解物中肽的身份。使用本领域已知和/或所述的方
法，将鉴定的肽片段与已知的蛋白质(包括同种型)比较。

A.样品制备

通过在37℃与5mM三(2-羧乙基)膦)(TCEP)温育1小时，还原裂解缓冲
液中每份样品的蛋白质。使用10mM碘乙酰胺在暗处在室温实施烷基化30
分钟。使用胰蛋白酶(测序级,PromegaCorporation,Madison,WI)按蛋白酶:蛋
白质比率1:50，将蛋白质消化成肽。在37℃过夜实施消化(总消化时间是12
小时)。使用C18离心柱(TheNestGroup,Southborough,MA)根据制造商的说
明，将肽净化用于质谱分析。将肽干燥至完全干透并重悬于LC溶剂A(1％
乙腈，0.1％甲酸(FA))中。全部溶剂均是来自(St.Louis，MO)
的HPLC级并且在不说明的情况下，全部化学品均从获得
(St.Louis，MO)。

B.LC-MS/MS和LC-MRM

将肽注射入ProxeonEasynLC纳米-液相色谱系统上的C18装填柱(Magic
AQ，3μm粒度，孔径，MichromBioresources,Inc(Auburn,CA)；11cm
柱长度，75μm内径，NewObjective(Woburn,MA))中，用于全部质谱分析。
LC溶剂是A：含0.1％FA的水中的1％乙腈；B：含0.1％FA的乙腈中的3％
水。用于鸟枪法分析的LC梯度是在120分钟内为5-35％溶剂B，随后在2
分钟内是35-100％溶剂B以及100％溶剂B持续8分钟(梯度总时长是130分
钟)。用于发现肽的LC-MS/MS鸟枪法试验在配备标准纳米-电喷雾源的
ThermoScientific(ThermoFisherScientific)(Billerica,MA)QExactive质谱仪
上实施。用于LC-MRM的LC梯度是在30分钟内为5-35％溶剂B，随后在2
分钟内为35-100％溶剂B以及100％溶剂B持续8分钟(梯度总时长是40分
钟)。ThermoScientific(ThermoFisherScientific)(Billerica,MA)TSQVantage
三重四极质谱仪配备有标准纳米-电喷雾源。在用于再校正的计划外MRM模
式下，将它按20ms驻留时间/跃迁运行。为了将各样品间的肽相对定量，TSQ
Vantage以计划MRM模式运行，采集窗口时长4分钟。LC洗脱剂按1.9kV
进行电喷雾并且使用0.7Da的Q1峰宽度进行MRM分析。根据供应商的说
明书，通过线性回归计算用于TSQVantage的碰撞能。

C.测定法设计、数据处理和分析

为了产生LC-MRM测定法，以计划的LC-MRM模式测量来自
LC-MS/MS分析的12个最强烈的片段离子，并且使用(Cluetec，
卡尔斯鲁厄，德国)(mProphet的评分部分)处理数据(Reiter等人,mProphet:
Automateddataprocessingandstatisticalvalidationforlarge-scaleSRM
experiments,NatureMethods,2011(8),430-435；所述文献的内容通过引用的
方式并入本文)。手工验证测定法，测定确切片段强度并相对于Biognosys’s
iRT-肽分配iRT(指数化保留时间)(Escher等人.UsingiRT,anormalized
retentiontimeformoretargetedmeasurementofpeptides,Proteomics,2012(12),
1111-1121；所述文献的内容通过引用的方式并入本文)。

为了将各样品系列间的肽相对定量，各样品系列间测量每个测定法的8
个最强烈跃迁。使用SpectroDive^TM(Biognosys,SchlierenSwitzerlan)实施数据
分析。针对所选择的肽比较总峰面积并且使用0.05的假发现率。排除Q值低
于0.05d肽并且视为在相应的样品中未检出。

实施例18.证实来自含有化学修饰的修饰的mRNA的肽身份

如实施例17中所述，使用LC-MS/MS联合定量性LC-MRM，评价含有
从低密度脂蛋白受体(LDLR)修饰的mRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA
序列；序列中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲
基胞嘧啶和假尿苷完全修饰)产生的蛋白质的细胞裂解物。表8中显示针对评
价的蛋白质所鉴定的肽片段。全部肽均对母蛋白和LDLR特异并且HFE2对
母蛋白和其同种型特异。在表8中，“UniprotID”指当肽片段序列针对数据库
中的全部评审蛋白质检索时，来自UniProt数据库的蛋白质识别码。表9中
显示用来评价细胞裂解物中蛋白质的持家蛋白。

表8.蛋白质和肽片段序列

表9.持家蛋白

实施例19.检测细胞培养物中的低密度脂蛋白受体表达

A.HeLa细胞转染

将Hela细胞铺种至24孔培养皿(CorningLifeSciences，Tewksbury，MA)
(7.5x10⁴个细胞/孔)中补充有10％胎牛血清(FCS,LifeTechnologies,Grand
Island,NY)和1Xglutamax试剂(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)的Eagles
极限基本培养基(EMEM,LifeTechnologies,GrandIsland,NY)内，并在标准细
胞培养条件下培养过夜。通过以下方式为待处理的每个孔制备转染溶液：将
250ng低密度脂蛋白受体(LDLR)修饰mRNA(SEQIDNO:42中所示的
mRNA序列；序列中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；
用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰)、mCherry修饰的mRNA(SEQIDNO:43
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰)或萤光素酶修饰的mRNA(SEQ
IDNO:44中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未
显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰)与50μlOpti-MEM试
剂(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)在第一管中合并以及与50μl
Opti-MEM中的1μlL2000转染试剂(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)在第
二管中合并。在制备后，将第一管和第二管在室温温育5分钟，之后合并每
管的内容物。将合并的转染溶液在室温温育15分钟。随后添加100μl转染
溶液至每个孔。将细胞培养额外的16小时，之后继续分析。

B.通过流式细胞术的LDLR检测

在转染后，从细胞移除培养基并将60μl0.25％胰蛋白酶(Life
Technologies,GrandIsland,NY)添加至每个孔。将细胞用胰蛋白酶消化2分
钟，之后添加240μl/孔胰蛋白酶抑制物(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)。
将所得的细胞溶液转移至96孔平板(CorningLifeSciences,Tewksbury,MA)，
通过离心沉淀细胞(800x重力持续5分钟)并且弃去上清液。将细胞沉淀物用
PBS洗涤并重悬于Foxp3固定/透化液(eBioscience,SanDiego,CA)中45分
钟。将细胞通过离心(800x重力持续5分钟)再次沉淀并且重悬于透化缓冲液
(eBioscience,SanDiego,CA)中10分钟。将细胞通过离心(800x重力持续5分
钟)再次沉淀并且在透化缓冲液中洗涤。细胞随后用针对LDLR的第一抗体处
理，随后用藻红蛋白标记的第二抗体处理。随后将标记的细胞与FACS缓冲
液(含1％牛血清白蛋白和0.1％叠氮钠的PBS)组合并且转移至排管。如图5
中所示，随后使用BDAccuri(BDBiosciences,SanJose,CA)，通过流式细胞
术分析标记的细胞。

C.通过免疫荧光法的LDLR检测

将转染的细胞用PBS洗涤，并用固定液(含4％甲醛的PBS)在室温处理
20分钟。随后将细胞用PBS洗涤并用透化/封闭液(含有5％牛血清白蛋白及
0.1％Tween-20的Tris缓冲液盐水)处理。将细胞在温和搅拌下在室温温育2
小时，之后用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤3次。随后将细胞在室温用
第一抗体(山羊抗LDLR,R&DSystems,Minneapolis,MN)或正常IgG对照处
理或不用其处理2小时，用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤3次并用第二
抗体溶液处理，所述第二抗体溶液含有1:200稀释度的带荧光标记物的驴抗
山羊IgG(R&DSystems,Minneapolis,MN)。细胞再次用含有0.05％Tween-20
的PBS洗涤并通过荧光显微成像术检查。在无荧光免疫染色情况下，通过荧
光显微术检查瞬时表达萤光素酶或mCherry的细胞。

实施例20.低密度脂蛋白受体(LDLR)表达

A.体外LDLR表达

在6孔板(BDBiosciences,SanJose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)细
胞(LGCstandardsGmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约500,000个细胞
的密度接种在3mL细胞培养基中。按每孔4000、800、400、40和4ngLDLR
修饰的mRNA的量接种细胞并温育之后，直接添加单独的Lipofectomine或
含有LDLRmRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA；用5-甲基胞嘧啶和1-
甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1，大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾(序列中
未显示))的Lipofectomine或含有对照G-CSFmRNA(SEQIDNO:30中所示的
mRNA；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中大约160
个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示)的Lipofectomine。在37℃温育18小时后，
将细胞洗涤、固定并染色。将G-CSFmRNA转染的细胞用抗LDLR抗体处
理并将一组LDLR转染的细胞用正常山羊IgG处理作为对照。用藻红蛋白(PE)
标记的第二抗体处理之后，通过FACS分析检测结合的第一抗体。

如图6A中所示，FACS分析的结果显示，检测到全部设门的活细胞的
74.8％在800ng剂量的LDLRmRNA时表达LDLR。在40ng剂量的LDLR
mRNA时，检测到全部设门的活细胞的11.6％表达LDLR。在LDLRmRNA
处理的用对照非免疫IgG染色的细胞中未观察到染色。在用G-CSFmRNA
转染的细胞中未检测到LDLR阳性细胞。

B.蛋白质蓄积

在6孔板(BDBiosciences,SanJose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)细
胞(LGCstandardsGmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约500,000个细胞
的密度接种在3mL细胞培养基中。在接种细胞至每孔中并温育后，直接添
加Lipofectamine或含有LDLRmRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA；用
5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，帽1，大约160个核苷酸的聚
腺苷酸尾(序列中未显示))的Lipofectamine或含有对照G-CSFmRNA(SEQID
NO:30中所示的mRNA；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；
序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示)的Lipofectamine。15小时后，
将转染培养基替换为完全培养基。在培养基替换后0、2、4、8、24、48和
72小时处收获转染的细胞。将转染的细胞用藻红蛋白(PE)缀合的抗LDLR抗
体处理并将一组LDLR转染的细胞用PE缀合的正常山羊IgG处理作为对照。
如上文所述，通过FACS分析检测结合的第一抗体。

如图6B中所示，FACS分析显示，检测到全部设门的活细胞中约65％
在洗去转染培养基后的0.0小时时间点(转染后15.0小时)表达LDLR。阳性
细胞百分数在37℃随时间而下降，从而截止移除转染培养基后24小时，检
测不到LDLR。

C.-标记的LDLR

为了评价表达的LDLR是否有功能的，使用标记的LDL(Life
Technologies,Woburn,MA)。将HEK293细胞用LDLR修饰的mRNA(SEQID
NO:42中所示的mRNA；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰；5’帽，
帽1，大约16个核苷酸的聚腺苷酸尾(序列中未显示))或G-CSF修饰的
mRNA(SEQIDNO:30中所示的mRNA；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；
5’帽，帽1；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示)转染过夜，用渐
增量的BODIPY-LDL将细胞洗涤并且温育。在在37℃温育1.0小时后，洗
涤细胞并通过FACS评估BODIPY-LDL的结合作用。BODIPY-LDL与LDLR
mRNA转染的细胞的结合具有高亲和力(Kd约60ng/mL)并且是可饱和的，如
图6C中所显示。相反，对G-CSF修饰的mRNA转染的细胞，未观察到结合
作用。

为了评价LDL结合特异性，研究了是否可以通过用未标记的LDL竞争，
减少LDL-BODIPY结合信号。HEK293细胞用LDLR和作为对照的G-CSF
mRNA转染过夜。将0.5μg/mLLDL-BODIPY连同0.01、0.1、0.5、1.0、10、
100或500μg/mL未标记的BODIPY同时添加至转染的细胞。表10中显示了
设门的转染的活细胞百分数，所述活细胞通过流式细胞仪针对标记的LDL
检测到为阳性。随着添加更多未标记的LDL，LDL-BODIPY信号逐渐减少。

表10.标记的LDL染色百分数

在竞争研究中，可以通过未标记的LDL以剂量-依赖性方式减少
BODIPY-LDL的结合作用(图6D)。这些数据显示BODIPY-LDL与表达DLR
mRNA的细胞的结合是可饱和的、特异的并具有高亲和力。

为了评估LDLRmRNA在体内的表达是否可能降低血浆胆固醇水平，将
LDLR敲除小鼠(JacksonLaboratories,Barharbor,Maine)通过单次0.1mL静脉
内注射在Lipofectamine2000中的2.0μgLDLRmRNA处理或对其注射单独
的Lipofectamine2000(图6E中显示为“阴性”)。在24.0小时后，将血清从每
只小鼠分离并且通过快速蛋白质液相色谱(FPLC)、通过大小排阻层析分级。
作为阳性对照，还使用活性蛋白质人生长激素(Abcam，目录号ab116162)作
为阳性对照(图6E中显示为“生长激素)。图6E中显示每个级分的总胆固醇含
量。SDS-PAGE分析显示，含有apoB的脂蛋白(VLDL、IDL和LDL)限于级
分3-5。对于阴性对照，级分3至级分6的平均总胆固醇是416.1μg，对于阳
性对照(生长激素)是409.0μg，并且对于施用编码LDLR的mRNA的小鼠是
321.3μg。相对于注射载体，用单次注射LDLRmRNA处理LDLR敲除小鼠
降低VLDL+IDL+LDL级分中的胆固醇含量大约20％。这些数据显示，LDLR
敲除小鼠中LDLRmRNA的表达可以降低富含胆固醇的脂蛋白的血清水平。

实施例21.来自含有化学修饰的修饰的mRNA的肽身份的证实

如实施例17中所述，使用LC-MS/MS联合定量性LC-MRM评价含有从
低密度脂蛋白受体(LDLR)修饰的mRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA序
列；序列中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1)和
LDLR-PCSK9-4A修饰的mRNA(SEQIDNO:12中所示的mRNA序列；序列
中大约140个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和
假尿苷完全修饰(5mC和pU)，用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰
(5mC和1mpU)，用假尿苷(pU)完全修饰，用1-甲基假尿苷(1mpU)完全修饰
或其中25％的尿苷残基用2-硫代尿苷修饰和25％的胞嘧啶残基用5-甲基胞嘧
啶用修饰(s2U和5mC))产生的蛋白质的细胞裂解物。表11中显示针对评价
的蛋白质所鉴定的肽片段。

表11：蛋白质和肽片段序列

实施例22.设计和合成野生型LDLR修饰的和PCSK9结合作用缺陷型
LDLR修饰的mRNA

A.LDLR修饰的mRNA

编码LDLR的修饰的mRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA序列；序
列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用1-甲基假尿苷
和5-甲基假尿苷完全修饰)如先前所述那样合成。用Agilent2100生物分析仪
分析修饰的mRNA产物，并且如图7中所显示，在约2.8Kb的预期大小检
查到单一条带。

B.PCSK9结合作用缺陷型LDLR修饰的mRNA

编码人PCSK9结合作用缺陷型LDLR的修饰的mRNA如先前所述那样
合成。修饰的mRNA编码PCSK9结合作用缺陷型突变体LDLR，该突变体
具有单氨基酸置换如Y336A(SEQIDNO.37)、E317A(SEQIDNO.36)、
N316A(SEQIDNO.35)、L339D(SEQIDNO.34)或D331E(SEQIDNO.33)
或编码具有氨基酸置换N316A、E317A、Y336A和D331A的四重突变变体
(SEQIDNO.38)，其中，例如，“N316A”意指位置316处的氨基酸天冬酰胺
置换为氨基酸丙氨酸。突变的LDLRmRNA还包括本文所述的化学修饰。通
过本领域已知的方法如生物分析仪和肽消化进行修饰的mRNA产物的证实。

实施例23.LDLR修饰的mRNA的体外表达

将人胚肾293(HEK293)细胞用单独的Lipofectamine、含有编码LDLR的
修饰的mRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA序列；序列中大约160个核
苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用1-甲基假尿苷和5-甲基胞嘧啶完
全修饰)的Lipofectamine或含有编码G-CSF的修饰的RNA(SEQIDNO:30中
所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，
帽1；用1-甲基假尿苷和5-甲基胞嘧啶完全修饰)的Lipofectamine对照转染。
在37℃温育18小时后，将细胞洗涤、固定并用藻红蛋白(PE)标记的抗人
LDLR抗体(R&DSystems,Minneapolis,MN；人LDLR亲和纯化的多克隆
AbAF2148)或PE标记的山羊非免疫IgG(R&DSystems,Minneapolis,MN；
R&DSystems纯化的山羊IgG，R&DSystems目录号AC-108-C)染色。用
Innovabioscienceslightning-link缀合试剂盒(Lightning-LinkR-PE抗体标记试
剂盒，Novus生物学的目录号：703-0010)完成与PE的缀合。

通过流式细胞术监测人LDLR的表达。用递增量(4-4000ng)的LDLR修
饰的mRNA转染增加了用PE标记的抗LDLRIgG染色的细胞的百分数，但
是在用G-CSF修饰的mRNA对照转染的细胞中不增加。图8中显示800ng
编码LDLR的修饰的mRNA转染。在LDLR修饰的mRNA转染的细胞中不
存在用PE标记的非免疫IgG检测到的阳性染色。

LDLR表达在转染后8至24小时达到峰值并且此后下降。

实施例24.LDLR的检测

将人胚肾293(HEK293)细胞用单独的Lipofectamine、含有编码LDLR的
修饰的mRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA；序列中大约160个核苷酸的
聚腺苷酸未显示；5’帽，帽1；用1-甲基假尿苷和5-甲基胞嘧啶完全修饰)的
Lipofectamine或含有编码G-CSF的修饰的mRNA(SEQIDNO:30中所示的
mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；
用1-甲基假尿苷和5-甲基胞嘧啶完全修饰)的Lipofectamine对照转染。在
37℃温育16小时后，将细胞洗涤并替换完全生长培养基。在转染后0、2、
4和8小时收获细胞并针对LDLR染色。如图9中所示，在转染后68.1％的
活细胞中检测到LDLR并且在不存在转染培养基的情况下在8小时减少至
27.6％。在图9中，第1和第2栏用编码LDLR的mRNA转染并且第3栏用
编码G-CSF的对照mRNA转染。将第1栏和第3栏用藻红蛋白(PE)标记的
抗人LDLR抗体(R&DSystems,Minneapolis,MN；人LDLR亲和纯化的多克
隆AbAF2148)染色并且将第2栏用PE缀合的山羊IgG(R&DSystems,
Minneapolis,MN；R&DSystems纯化的山羊IgG，R&DSystems目录号
AC-108-C)染色作为对照。用Innovabioscienceslightning-link缀合试剂盒
(Lightning-LinkR-PE抗体标记试剂盒，Novus生物学的目录号：703-0010)
完成与PE的缀合。

实施例25.PCSK9结合作用缺陷型LDLR修饰的mRNA的体外表达

编码人和小鼠野生型LDLR和人PCSK9结合作用缺陷型LDLR的修饰
的mRNA如本文所述那样合成。通过本领域已知的方法，用修饰的mRNA
转染HEK293细胞。在转染后筛选野生型LDLR和PCSK9结合作用缺陷型
LDLR突变体的表达，以确定表达最高的修饰的mRNA。

实施例26.Hep-G2细胞中LDLR的PCSK9下调

将人肝细胞癌(Hep-G2)细胞培养于完全培养基(含10％脂蛋白缺陷型血
清(IntracelResources，Frederick，MD)的DMEM培养基)中以下调内源LDLR。
将通过已知的方法评估PCSK9下调LDLR表达(例如，参见Lipari等人,
Furin-cleavedProproteinConvertaseSubtilisin/KexinType9(PCSK9)IsActive
andModulatesLowDensityLipoproteinReceptorandSerumCholesterolLevels.
JBiolChem.2012,287(52):43482-43491；McNutt等人，AntagonismofSecreted
PCSK9IncreasesLowDensityLipoproteinReceptorExpressioninHepG2Cells.
JBiolChem.2009.284(16):10561-10570；所述文献的每一篇通过引用方式完
整并入本文)。

一种评估LDLR表达下调的方法是用如本文所述的野生型LDLR修饰的
mRNA或PCSK9结合作用缺陷型LDLR修饰的mRNA转染Hep-G2细胞。
用LDLR修饰的mRNA转染之前，将Hep-G2细胞培养在完全培养基中以下
调内源LDLR。在37℃温育24小时后，在外源PCSK9(R&DSystems，
Minneapolis,MN)存在和不存在下，通过蛋白质印迹分析细胞裂解物
(PROTEINSIMPLETM,SantaClara,CA)并通过流式细胞术(例如，FACS分选
法)评估来自编码野生型LDLR或PCSK9结合作用缺陷型LDLR的修饰的
mRNA转染的LDLR的周转(turnover)。确定编码PCSK9最不敏感的LDLR
的修饰的mRNA。

实施例27.肝脏细胞转导制剂

使用本领域已知、本文所述和/或在通过引用方式完整并入本文的名为
“修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物”的PCT/US2012/069610中描述的方法，
配制脂质纳米粒子(LNP)。本文所用的LNP可以包含可解离脂质
DLin-KC2-DMA或阳离子脂质C12-200。

将编码萤光素酶的修饰的mRNA(例如，SEQIDNO:44；序列中未显示
至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾；5’帽，帽1；用本文所述的至少一种化学
性修饰所修饰)配制在包含DLin-KC2-DMA或C12-200的LNP中。将配制的
萤光素酶施用至野生型小鼠和LDLR缺陷小鼠。在施用修饰的mRNA后以预
定时间间隔，使用本领域已知或本文所述的方法测量萤光素酶在野生型小鼠
和LDLR缺陷小鼠的肝脏细胞中的表达。在成像之前20分钟，用D-萤光素
溶液以150mg/kg腹腔内注射小鼠。将动物麻醉并且用VISluminaII成像系
统(PerkinElmer,Waltham,MA)获得图像。将生物发光作为总通量(光子/秒)测
量。

实施例28.LDLR在小鼠中的体内表达

LDLR-/-小鼠用来检验编码野生型人或鼠LDLR或编码PCSK9结合作用
缺陷型人或鼠LDLR的修饰的mRNA(统称为，“LDLR修饰的mRNA”)的体
内表达。将配制在脂质纳米粒子中的LDLR修饰的mRNA通过0.1ml静脉
内注射剂施用至LDLR-/-小鼠，所述静脉内注射剂含有0.005-0.5mg/kg之间
(例如0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.015mg/kg、0.020mg/kg、0.030mg/kg、
0.040mg/kg、0.050mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg和
0.5mg/kg)递增剂量的LDLR修饰的mRNA。在各个时间如注射后2小时和
96小时之间(例如，2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6
小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、24小时、48小时、72
小时和96小时)处死小鼠。切取肝脏并且制备细胞裂解物和肝用于分析。使
用抗LDLR抗体，通过蛋白质印迹分析测量LDLR蛋白质表达和mRNA转
录物的药物水平变化，并且通过实时RT-PCR分析小鼠组织中修饰的LDLR
mRNA的表达。在注射修饰的mRNA后的各个时间点收集血清并使用小鼠
组分析细胞因子组。将剩余血清部分通过FPLC分级，用于分析
VLDL+IDL+LDL胆固醇(参见Garber等人.Asensitiveandconvenientmethod
forlipoproteinprofileanalysisofindividualmouseplasmasamples.Journalof
LipidResearch.2000.14:1020-1026中描述的方法；所述文献通过引用的方式
完整并入本文)。

在又一项研究中，对LDLR-/-小鼠多于一次施用编码野生型人或鼠
LDLR或编码PCSK9结合作用缺陷型人或鼠LDLR的修饰的mRNA。在注
射修饰的mRNA后的各个时间点收集血清，并使用小鼠组分析
细胞因子组，并且分析VLDL+IDL+LDL胆固醇。还处死小鼠，并且切取肝
脏并且制备细胞裂解物用于分析。

实施例29.LDLR在Watanabe(WHHL)兔中的体内表达

Watanabe(WHHL)兔用来检验编码野生型人LDLR或编码PCSK9结合作
用缺陷型人LDLR的修饰的mRNA(“LDLR修饰的mRNA”)的体内表达。通
过注射剂向兔施用配制在脂质纳米粒子中的LDLR修饰的mRNA，所述注射
剂含有0.005-0.5mg/kg之间(例如0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.015mg/kg、
0.020mg/kg、0.030mg/kg、0.040mg/kg、0.050mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、
0.3mg/kg、0.4mg/kg和0.5mg/kg)的LDLR修饰的mRNA。在注射后2小时
和96小时之间(例如，2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、
6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、24小时、48小时、72
小时和96小时)处死WHHL兔，并且切取肝脏并制备细胞裂解物用于分析。
使用抗LDLR抗体，通过蛋白质印迹分析在细胞裂解物中测量LDLR蛋白质
表达和mRNA转录物的变化，并且通过实时RT-PCR分析兔组织中LDLR的
表达。在注射修饰的mRNA后的各个时间点收集血清并分析细胞因子组，并
且分析VLDL+IDL+LDL胆固醇。

实施例30.LDLR在LDLR缺陷型猪中的体内表达

LDLR缺陷型猪(ExemplarGenetics,SiouxCenter,IA)用来检验编码野生
型人LDLR或编码PCSK9结合作用缺陷型人LDLR的修饰的mRNA(“LDLR
修饰的mRNA”)的体内表达。通过注射剂向LDLR缺陷型猪施用配制在脂质
纳米粒子中的LDLR修饰的mRNA，所述注射剂含有0.005-0.5mg/kg之间(例
如0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.015mg/kg、0.020mg/kg、0.030mg/kg、0.040
mg/kg、0.050mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg和0.5mg/kg)
的LDLR修饰的mRNA。在注射后2小时和96小时之间(例如，2小时、2.5
小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、
10小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时)处死猪，并且切取
肝脏并制备细胞裂解物用于分析。使用抗LDLR抗体，通过蛋白质印迹分析
在细胞裂解物中测量LDLR蛋白质表达和mRNA转录物的变化，并且通过实
时RT-PCR分析猪组织中LDLR的表达。在注射修饰的mRNA后的各个时间
点收集血清并分析细胞因子组，并且分析VLDL+IDL+LDL胆固醇。

实施例31.LDLR在LDLR缺陷型恒河猴中的体内表达

LDLR缺陷型恒河猴(SouthwestNationalPrimateResearchCenter,San
Antonio,TX)用来检验编码野生型人LDLR或编码PCSK9结合作用缺陷型人
LDLR的修饰的mRNA(“LDLR修饰的mRNA”)的体内表达。通过注射剂向
LDLR缺陷型猴施用配制在脂质纳米粒子中的LDLR修饰的mRNA，所述注
射剂含有0.005-0.5mg/kg之间(例如0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.015mg/kg、
0.020mg/kg、0.030mg/kg、0.040mg/kg、0.050mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、
0.3mg/kg、0.4mg/kg和0.5mg/kg)的LDLR修饰的mRNA。在注射后2小时
和96小时之间(例如，2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、
6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、24小时、48小时、72
小时和96小时)处死猴，并且切取肝脏并制备细胞裂解物用于分析。使用抗
LDLR抗体，通过蛋白质印迹分析在细胞裂解物中测量LDLR蛋白质表达和
mRNA转录物的变化，并且通过实时RT-PCR分析猴组织中LDLR的表达。
在注射修饰的mRNA后的各个时间点收集血清并分析细胞因子组，并且分析
VLDL+IDL+LDL胆固醇。

实施例32.多剂量研究

使用LDLR-/-小鼠设计了使用多个剂量的研究并实施研究。对小鼠经
28天静脉内注射8次(一周2次)0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg或0.0005
mg/kg配制在脂质纳米粒子中的编码人或小鼠野生型LDLR或编码PCSK9
结合作用缺陷型人LDLR的修饰的LDLRmRNA。使用抗LDLR抗体，通过
蛋白质印迹分析在细胞裂解物中测量LDLR蛋白质表达和mRNA转录物的变
化，并且通过实时RT-PCR分析组织中LDLR的表达。按预定时间间隔采集
血清并分析细胞因子组并且如本文所述分析VLDL+IDL+LDL胆固醇。

实施例33.在野生型小鼠和LDLR敲除小鼠中的总胆固醇

从三只野生型小鼠(C57BL/6J)和三只LDLR敲除小鼠(B6.
129S7-ldlrtm1Her/J，JacksonLaboratories,BarHarbor,Maine)采集血清并通过
FPLC分级。在260nm和280nm测量来自野生型小鼠和LDLR敲除小鼠的
洗脱的血清级分的吸光度。通过Wako胆固醇E酶促比色法(Wako,Richmond,
VA)分析每个级分的总胆固醇。如图10A中所示，吸光度曲线显示两个小鼠
品系中的三个不同蛋白质峰(图10A)。在第一峰中，图10B中的从级分3至
级分6，在LDLR敲除小鼠中检验到胆固醇最高。在第二峰中，图10B中的
从级分7至级分12，在野生型小鼠中检验到总胆固醇最高。在第三峰中，图
10B中的从级分14至级分18，在两个小鼠品系中均检验到胆固醇低或呈阴
性。

实施例34.野生型LDLR和PCSK9结合缺陷型变体的表达

在48孔板(BDBiosciences,SanJose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)
细胞(LGCstandardsGmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约60,000个细
胞的密度接种在0.2mL细胞培养基中。按每孔60,000的量接种细胞并温育
之后，添加含有1μLLipofectamine和150ng野生型(WT)LDLRmRNA(SEQ
IDNO:42中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未
显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或150ngLDLR
序列变体mRNA或对照G-CSFmRNA(SEQIDNO:30中所示的mRNA；用
5-甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中大约160个核苷酸的聚
腺苷酸尾未显示)的制剂。

制备和测试的LDLRmRNA序列变体包括：四氨基酸置换变体(4A：
N316A、E317A、D331A和Y336A)(SEQIDNO:12中所示的mRNA序列；
序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧
啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(SEQIDNO:
11中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、E317A(SEQIDNO:10
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、N316A(SEQIDNO:9
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、L339D(SEQIDNO:8
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、D331E(SEQIDNO:7
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。

作为对照，将G-CSFmRNA转染的细胞用抗LDLR抗体(R&DSystems,
Minneapolis,MN；人LDLR亲和纯化的多克隆AbAF2148)处理并将一组
LDLR转染的细胞用正常山羊IgG(R&DSystems,Minneapolis,MN；纯化的山
羊IgGR&DSystems目录号AC-108-C)处理。用藻红蛋白(PE)标记的抗体
(R&DSystems,Minneapolis,MN)处理之后，通过FACS分析检测结合的第一
抗体。用Innovabioscienceslightning-link缀合试剂盒(Lightning-LinkR-PE抗
体标记试剂盒，Novus生物学的目录号：703-0010)完成与PE的缀合。

如图11中所示，FACS分析显示，检测到32％全部设门的活细胞在150ng
剂量野生型LDLRmRNA(图11中的WT)时表达LDLR。类似地，对于用LDLR
mRNA变体转染的细胞，在150ng剂量时检测到12-33％之间全部设门的活
细胞表达LDLR。在LDLRmRNA处理的用对照非免疫IgG染色的细胞中未
观察到染色(LDLRWT转染，同种型染色)，并且在G-CSFmRNA转染的细
胞没有检测到LDLR阳性细胞(GCSF转染，LDLR染色)。

实施例35.通过外源PCSK9下调LDLR

在48孔板(BDBiosciences,SanJose,美国)上接种人胚肾上皮(HEK293)
细胞(LGCstandardsGmbH,Wesel,德国)。将HEK293以每孔约60,000个细
胞的密度接种在0.2mL细胞培养基中。按每孔800ng的量接种细胞并在60
μg/ml的外源人PCSK9存在时和不存在的情况下温育之后，添加含有
1μLLipofectamine2000和150ng野生型(WT)LDLRmRNA(SEQIDNO:42中
所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，
帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或150ngLDLR序列变体
mRNA或150ng对照G-CSFmRNA(SEQIDNO:30中所示的mRNA；用5-
甲基胞嘧啶和假尿苷完全修饰；5’帽，帽1；序列中大约160个核苷酸的聚
腺苷酸尾未显示)的制剂。

制备和测试的LDLRmRNA序列变体包括：四氨基酸置换变体(4A：
N316A、E317A、D331A和Y336A)(SEQIDNO:12中所示的mRNA序列；
序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧
啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(SEQIDNO:
11中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、E317A(SEQIDNO:10
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、N316A(SEQIDNO:9
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、L339D(SEQIDNO:8
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、D331E(SEQIDNO:7
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。

在37℃15小时后，移除转染培养基，将细胞洗涤并用藻红蛋白(PE)缀
合的抗LDLR抗体(R&DSystems,Minneapolis,MN；人LDLR亲和纯化的多
克隆AbAF2148)如上文所述那样处理。将一组LDLR转染的细胞用PE缀合
的正常山羊IgG(R&DSystems,Minneapolis,MN；纯化的山羊IgGR&D
Systems目录号AC-108-C)处理并使用另一组未转染的细胞作为对照。使用
G-CSF修饰的mRNA转染的细胞作为额外的阴性对照。用Innovabiosciences
lightning-link缀合试剂盒(Lightning-LinkR-PE抗体标记试剂盒，Novus生物
学的目录号：703-0010)完成与PE的缀合。如上文所述，通过流式细胞术分
析检测结合的第一抗体。

如图12中所示，FACS分析显示，在野生型LDLRmRNA转染的细胞中
51.6％设门的活细胞在细胞表面表达LDLR。当细胞转染期间添加外源PCSK9
至培养基时，这个值减降低至21.5％设门的活细胞。与之相反，在PCSK9结
合结构域中具有置换的每种LDLRmRNA变体显示对外源PCSK9下调作用
较不敏感(表12)，(与随野生型LDLR观察到的58％减少相比)减少百分值范
围从-8.1％至29％。

表12.外源PCSK9下调细胞表面LDLR表达

实施例36.变异LDLRmRNA表达的LDLR的功能

为了评价表达的LDLR是否有功能，使用BODIPY标记的LDL。60,000
HEK293个细胞/孔用制剂转染过夜，所述制剂含有1μLLipofectamine2000
和150ng编码野生型(WT)LDLRmRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA序
列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基
胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)或150ngLDLR变体mRNA或150ng对照
G-CSFmRNA(SEQIDNO:30中所示的mRNA；用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完
全修饰；5’帽，帽1；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示)。

制备和测试的LDLR变体mRNA序列包括：四氨基酸置换变体(4A：
N316A、E317A、D331A和Y336A)(SEQIDNO:12中所示的mRNA序列；
序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧
啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换变体：Y336A(SEQIDNO:
11中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、E317A(SEQIDNO:10
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、N316A(SEQIDNO:9
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、L339D(SEQIDNO:8
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)、D331E(SEQIDNO:7
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。

将细胞洗涤并且与递增量(0μg/ml、0.1μg/ml、1.0μg/ml、10μg/ml或50
μg/ml)的BODIPY-LDL温育。在在37℃温育1小时后，洗涤细胞并通过流
式细胞术评估结合细胞的BODIPY-LDL。图13A中显示等值线图。对于野生
型(WT)和LDLRPCSK9结合变体，BODIPY-LDL与LDLRmRNA转染的细
胞结合是明显的，因为设门细胞群体中随BODIPY-LDL浓度而增加的右偏
移。对用每种LDLRmRNA构建体转染的细胞，在设门的细胞群体中均观察
到相似的右偏移。如图13B中显示，对于用野生型或PCSK9结合缺陷型LDLR
mRNA转染的细胞的BODIPY-LDL结合作用而言，半数最大细胞结合作用
相同。对于每个构建体，BODIPY-LDL结合作用具有高亲和力(0.6-0.7ng/mL
之间的半数最大结合作用)并且是可饱和的。对于用G-CSFmRNA转染的细
胞，没有观察到BODIPY-LDL结合作用。

实施例37.评价细胞表面LDLR的半寿期

为了评估外源PCSK9是否可以在LDLRmRNA转染的细胞中调节细胞
表面LDL受体的表观半寿期，将HEK293细胞铺种在24孔平板上，130,000
个细胞/孔，用LDLRmRNA转染并且如上文所述温育14小时。将细胞单层
洗涤并且添加含PCSK9(60μg/ml)或不含PCSK9的新鲜培养基。在37℃温
育各种时间后，使用如上文所述的抗LDLR抗体，通过流式细胞术监测细胞
表面LDLR表达。如图14A中显示，在用300ng野生型LDLRmRNA(SEQID
NO:42中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显
示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)转染的细胞中，
细胞表面LDLR以时间依赖性方式减少，表观半寿期为大约13小时。添加
PCSK9至用野生型LDLRmRNA转染的细胞的培养基将细胞表面LDLR的
表观半寿期降低至约4小时。在图14A中，“*”表示统计检验时显著差异。

与之相比，添加PCSK9至用300ngPCSK9结合缺陷型LDLRmRNA转
染的细胞的培养基对细胞表面LDLR的表观半寿期产生很小变化或不产生变
化(图13B-13G)。制备和测试的PCSK9结合缺陷型LDLRmRNA序列包括：
四氨基酸置换变体(4A：N316A、E317A、D331A和Y336A)(SEQIDNO:12
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)，或以下单氨基酸置换
变体：Y336A(SEQIDNO:11中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷
酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全
修饰)、E317A(SEQIDNO:10中所示的mRNA序列；序列中大约160个核
苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完
全修饰)、N316A(SEQIDNO:9中所示的mRNA序列；序列中大约160个核
苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完
全修饰)、L339D(SEQIDNO:8中所示的mRNA序列；序列中大约160个核
苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完
全修饰)、D331E(SEQIDNO:7中所示的mRNA序列；序列中大约160个核
苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完
全修饰)。

图14B-14G中的这些数据显示，用编码PCSK9结合位点中具有突变的
LDLR的LDLRmRNA转染的细胞不能响应于外源PCSK9，表明这些结合性
变体可能在体内比野生型LDLR具有更长的半寿期并且可用于治疗高胆固醇
血症患者。

实施例38.渐增PCSK9量对细胞表面LDLR的影响

为了评价添加至完全细胞培养基的渐增量PCSK9对细胞表面LDLR表
达的下调作用，将MEM(GlutaMAX,LifeScience,目录号41090-036)补充
10％胎牛血清。将HEK293细胞按300,000个细胞/孔铺种，温育6小时，并
用300ng野生型LDLRmRNA(SEQIDNO:42中所示的mRNA序列；序列
中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和
1-甲基假尿苷完全修饰)或编码PCSK9结合变体的LDLRmRNA转染15小
时。制备和测试的PCSK9结合变体mRNA序列包括N316A(SEQIDNO:9
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)和D331E(SEQIDNO:7
中所示的mRNA序列；序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’
帽，帽1；用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰)的单氨基酸置换变体。
还使用编码UGT1A1的对照mRNA(SEQIDNO:61中所示的mRNA序列；
序列中大约160个核苷酸的聚腺苷酸尾未显示；5’帽，帽1；用5-甲基胞嘧
啶和1-甲基假尿苷完全修饰)。

在温育15小时后，将细胞单层洗涤并且添加单独的缓冲液或含有渐增量
PCSK9的缓冲液。将细胞温育5小时并且通过流式细胞术如上文所述测量细
胞表面LDLR表达。如图15中显示，在用野生型LDLRmRNA转染的细胞
中细胞表面LDL受体以剂量-依赖性方式被PCSK9减少。LDLR的最大减少
在在20μg/ml外源PCSK9时实现。与之相比，PCSK9对用编码PCSK9结
合缺陷型变体N316A或D331E的LDLRmRNA转染的细胞中的细胞表面
LDLR没有影响。在用编码UGT1A1的mRNA转染的HEK293细胞中未检
测到细胞表面LDLR。这些数据显示，从编码在PCSK9结合位点中具有突变
的LDLRmRNA表达的LDLR不对外源PCSK9敏感。

实施例39.LDLR的肝脏细胞转导制剂

使用本领域已知、本文所述和/或在通过引用方式完整并入本文的名为
“修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物”的PCT/US2012/069610中描述的方法，
配制脂质纳米粒子(LNP)。本文所用的LNP可以包含可解离脂质
DLin-KC2-DMA或阳离子脂质C12-200。

编码LDLR或LDLR突变体的修饰的mRNA(例如，SEQIDNO:7-12；
序列中未显示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾；5’帽，帽1；用本文所述的
至少一种化学性修饰所修饰)配制在包含DLin-KC2-DMA或C12-200的LNP
中。将配制的LDLR或LDLR突变体施用至野生型小鼠和LDLR缺陷小鼠。
在施用修饰的mRNA后以预定时间间隔，使用本领域已知或本文所述的方法
测量LDLR在野生型和LDLR缺陷小鼠的肝脏细胞中的表达。

实施例40.递送LNP配制的修饰的mRNA

将萤光素酶mRNA(SEQIDNO:44中所示的mRNA序列；序列中未显
示至少140个核苷酸的聚腺苷酸尾；5’帽，帽1)用5-甲基胞嘧啶和假尿苷完
全修饰、用5-甲基胞嘧啶和1-甲基假尿苷完全修饰、用假尿苷完全修饰，用
1-甲基假尿苷完全修饰，或者25％的尿苷残基用2-硫代尿苷修饰并且25％的
胞嘧啶残基用5-甲基胞嘧啶修饰。随后将萤光素酶mRNA配制在包含阳离子
脂质DLin-KC2-DMA(KC2)或C12-200的脂质纳米粒子中。如表13中所概述，
将PBS中的配制LNP或单独的对照PBS静脉内施用给LDLR-/-小鼠或正常
小鼠。在注射后2小时、8小时、24小时和48小时对小鼠成像。在成像之前
10分钟用D-萤光素溶液以150mg/kg腹腔内注射小鼠。随后将动物麻醉并且
用IVISLuminaII成像系统(PerkinElmer)获得图像。

表13.给药方案

实施例41.研究施用UGT1A1修饰的mRNA的哺乳动物

A.啮齿类

设计了利用多个剂量的研究并使用大鼠和/或小鼠(例如LDLR-/-小鼠)实
施研究。在7天时间内用0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg或0.0005mg/kg
本文中所述的编码人、小鼠或大鼠LDLR或其同工型或变体的修饰的LDLR
mRNA肌内或静脉内注射啮齿类多于一次。将LDLRmRNA配制在5％蔗糖、
盐水或脂质纳米粒子中。使用抗LDLR抗体，通过蛋白质印迹分析在细胞裂
解物中测量LDLR蛋白质表达和mRNA转录物的变化，并且通过实时RT-PCR
分析组织中的药物水平和LDLR转录物。如本文所述，在预定时间间隔期间
从大鼠采集血清并分析细胞因子组并且分析胆固醇水平。

B.非人灵长类(NHP)

将配制在5％蔗糖、盐水或脂质纳米粒子中的LDLR修饰的mRNA肌内
或静脉内施用至非人灵长类。注射剂含有0.005-0.5mg/kg之间(例如0.005
mg/kg、0.010mg/kg、0.015mg/kg、0.020mg/kg、0.030mg/kg、0.040mg/kg、
0.050mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg和0.5mg/kg)的
LDLRmRNA剂量。使用抗LDLR抗体通过蛋白质印迹分析测量LDLR蛋白
质表达和mRNA转录物的药物水平变化，并且通过实时RT-PCR分析肌肉组
织中修饰的LDLRmRNA的水平。如本文所述，按注射后预定的时间间隔从
非人灵长类采集血清并分析细胞因子组并且分析胆固醇水平。

实施例42.UGT1A1修饰的mRNA在哺乳动物中的重复剂量施用研究

A.啮齿类

使用大鼠和/或小鼠(例如LDLR-/-小鼠)设计了利用多个剂量的研究并实
施研究。对啮齿类用0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg或0.0005mg/kg编
码人LDLR或大鼠LDLR的修饰的LDLRmRNA经4周时间肌内或静脉内注
射多于一次(例如，每日一次，一周两次，每五日一次、每周一次、每十日一
次、每二周一次)。将LDLRmRNA配制在5％蔗糖、盐水或脂质纳米粒子中。

使用抗LDLR抗体通过蛋白质印迹分析在细胞裂解物中测量LDLR蛋白
质表达和mRNA转录物的变化，并且通过实时RT-PCR分析组织中的药物水
平和LDLR转录物。如本文所述，在预定时间间隔期间从大鼠采集血清并分
析细胞因子组并且分析胆固醇水平。

B.非人灵长类(NHP)

将配制在5％蔗糖、盐水或脂质纳米粒子中的LDLR修饰的mRNA经4
周时间肌内或静脉内施用至非人灵长类多于一次(例如，每日一次，一周两次，
每五日一次、每周一次，每十日一次、每二周一次)。注射剂含有0.005-0.5
mg/kg之间(例如0.005mg/kg、0.010mg/kg、0.015mg/kg、0.020mg/kg、0.030
mg/kg、0.040mg/kg、0.050mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg
和0.5mg/kg)的LDLRmRNA剂量。

非人灵长类在开始研究之前称重并且在第8日、第15日和在研究结束时
称重。使用抗LDLR抗体通过蛋白质印迹分析测量LDLR蛋白质表达和
mRNA转录物的药物水平变化，并且通过实时RT-PCR分析肌肉组织中修饰
的LDLRmRNA的水平。如本文所述，按注射后预定的时间间隔从非人灵长
类采集血清并分析细胞因子组并且分析胆固醇水平。

实施例43.微生理系统

使用本文所述的方法之一如在缓冲液、脂质纳米粒子和PLGA中配制本
文所述的编码LDLR的修饰的mRNA和其变体。随后将这些制剂施用至如国
际公开号WO2013086502、WO2013086486和WO2013086505中所述从器官
芯片产生的微生理系统或与之接触，所述每篇文献的内容通过引用的方式完
整并入本文。

实施例44.LDLR突变

在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸编码至少一种在PCSK9结合作
用方面缺陷的LDLR蛋白。作为一个非限制性例子，LDLR蛋白可以包含至
少一个突变以便具有如本文所述的PCSK9结合作用缺陷。

在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以在与失效同源物2有丝分
裂原反应磷蛋白(DAB2)结合方面缺陷。尽管不希望受理论约束，DAB2结合
缺陷型LDLR可以限制LDLR经DAB2途径内化并且因此减少LDLR摄取。

在一个实施方案中，可以修饰LDLR的NPXY基序以改变用于通过
LDLR的被膜小窝快速内吞的信号。NPXY基序可以包含至少一个突变、至
少两个突变、至少三个突变、至少四个突变或超过四个突变。作为一个非限
制性例子，NPXY基序可以包含LDLR序列的氨基酸822至氨基酸829。作
为另一个非限制性例子，NPXY基序可以包含序列NFDNPVYQ(SEQIDNO:
62)。

在一个实施方案中，LDLR序列不包含NPXY基序中的突变。在另一个
实施方案中，LDLR序列可以包含突变，但是该突变可以不在LDLR的位置
822、826、827或828处，其中LDLR的氨基酸822至氨基酸829在(SEQID
NO:62)中显示。

在另一个实施方案中，可以修饰LDLR的NPXY基序以减少分选微管连
接蛋白17(SNX17)与LDLR的NPXY基序的结合。SNX17与LDLR的NPXY
基序的结合的减少可以用来调节受体的内体再循环。

在一个实施方案中，SNX17的PX结构域(PI3P结合)可以包含至少一个
突变。所述至少一个突变可以改变SNX17与LDLR的NPXY基序结合的能
力并且因此调节受体的内体再循环。

在一个实施方案中，SNX17的FERM样结构域可以包含至少一个突变。
所述至少一个突变可以改变SNX17与LDLR的NPXY基序结合的能力并且
因此调节受体的内体再循环。

在一个实施方案中，SNX17的Ras缔合结构域可以包含至少一个突变。
所述至少一个突变可以改变SNX17与LDLR的NPXY基序结合的能力并且
因此调节受体的内体再循环。

在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以包含至少一个已经磷酸
化的氨基酸。作为一个非限制性例子，序列NQDGYSYPSR(SEQIDNO:63)
中的至少一个氨基酸可以磷酸化。作为一个非限制性例子，LDLR的SEQID
NO:63中的两个酪氨酸(Y)可以磷酸化。作为另一个非限制性例子，本文所
述的LDLR序列中的至少一个酪氨酸(Y)可以磷酸化。作为又一个非限制性例
子，在本文所述的LDLR的位置845处的酪氨酸和在其位置847处的酪氨酸
磷酸化。

在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以包含至少一个已经磷酸
化的氨基酸，但是位置828处的酪氨酸未磷酸化。

在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以包含至少一个已经磷酸
化的氨基酸，其中至少一个氨基酸是位置828处的酪氨酸。

在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列可以包含末端序列LEDDVA
(SEQIDNO:64)中的至少一个C氨基酸突变。作为一个非限制性例子，SEQ
IDNO:64可以是LDLR序列的氨基酸855至氨基酸860。

在一个实施方案中，LDLR序列可以在LDLR序列的N-联糖基化位点处
包含至少一个突变。作为一个非限制性例子，至少一个突变可以位于氨基酸
97、156、272、515和/或657处。

在另一个实施方案中，LDLR序列可以在LDLR序列的O-联糖基化位点
处包含至少一个突变。作为一个非限制性例子，至少一个突变可以位于氨基
酸721-768处。

在另一个实施方案中，LDLR序列可以在N-联糖基化位点处包含至少一
个突变并且在O-联糖基化位点处包含至少一个突变。

在一个实施方案中，本文所述的多核苷酸可以在与低密度脂蛋白受体衔
接子蛋白1(LDLRAP1)结合方面缺陷。尽管不希望受理论约束，LDLRAP1
结合缺陷型LDLR可以限制LDLR的结合和内化并且因此减少LDLR摄取。

在一个实施方案中，本文所述的LDLR序列和构建体的胞外结构域
(ecto-domain)可以与胞质结构域融合。作为一个非限制性例子，LDLR胞外
结构域可以与叶酸受体TM-胞质结构域融合。作为另一个非限制性例子，
LDLR胞外结构域可以与GPI-连接的受体TM-胞质结构域融合。

其他实施方案

应当理解，已经使用的词是描述性词汇，而非限制性作用的，并且可以
所附权利要求书的范围内作出改变，而在其更宽方面不脱离本发明的实际范
围和精神。

尽管已经就几个所述的实施方案而言相当详尽且相当特定的描述了本发
明，但不希望的是本发明被限于任何这类细节或实施方案或任何具体实施方
案，而是它将参考所附权利要求加以解释，从而考虑现有技术而提供这类权
利要求的最广泛可能解释并因此将有效涵盖本发明的预期范围。

本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方
式完整地并入。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)将居主导。此外，章
节标题、材料、方法和实施例仅为示例性的，而不意在限制。