固定化模板指导的寡核苷酸合成方法 本发明涉及寡核苷酸的合成方法，尤指以固定化模板为指导的单核苷酸或寡核苷酸片段之间的化学连接合成寡核苷酸的方法。
寡核苷酸合成在近几十年中发展很快，到八十年代后期核酸自动合成仪已经问世。对生物和医学的研究起了很大的促进作用。寡核苷酸，包括反义寡核苷酸、抗基因寡核苷酸是近年来发展起来的一种新的治疗药物(Wagner，RW，Nature，1994，372，333-335；Crook，ST，Annu.Rev.Pharmacol.Toxical.，1992，32，329-376；Helene，C，Eur.J.Cancer，1994，30A，1721-1726；Crooke，ST，AntisenseNucleic acids Drug Dev.，1996，6，141-147.)。将寡核苷酸作为药物就要求发展出大规模的经济的合成寡核苷酸的方法。目前使用的是用全合成的方法，虽然通过放大规模可以大大降低合成成本(Geiser，T.Aids：Anti-HIV Agents，Therapies，and Vaccines 1990，616，173-183.)，但成本仍然还比较高。其原因在于从核苷制成保护核苷，再制成活性单体，再合成寡核苷酸，每一步都需一定的成本。此外，用这种方法，需要昂贵的合成仪，合成规模愈扩大，需要设备的投资愈大。用新的思路，发展新的合成方法仍是非常重要。
除了全合成方法外，用化学方法连接单核苷酸或寡核苷酸也有一些报导。Orgel等在探索生命的起源中以多聚rC为模板，以EDC〔(1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐〕为缩合剂，甲基咪唑为催化剂从单核苷酸合成了寡聚rG，用GGCGG为模板从单核苷酸合成了五核苷酸CCGCC(Joice，GF etal.，Nature，1984，310，602-604；Isoue，T.et al.，J.Mol.Biol.1984，178，669-676.)。他们又用PNA作模板从单核苷酸合成了寡聚rG(Bohler C.et al.，Nature，1995，376，578-581.)。Shabarova等用EDC或溴化氰实现了模板指导的DNA片段的连接(Shabarova，ZAet al.，Nuleic Acids Res.1991，19，4247-4251；Dolinnaya，NGet al.，Nuleic Acids Res.1991，19，3067-3072.)。他们的工作仅仅是在溶液中实现了单核苷酸或寡核苷酸的连接。这种方法在水溶液中进行，不需要对碱基进行保护，但连接率不高，更主要地是连接需要先合成模板，因此，此方法本身不可能发展成为一种寡核苷酸的合成方法。
为了寻找更好的合成寡核苷酸的方法，本发明人进行了进一步的研究。采取上面两种合成方法各自之优点，发展了一种新的适合于大规模合成寡核苷酸的方法。
本发明的目的是提供一种固定化模板指导的合成寡核苷酸的新方法，该方法是先提供一条寡核苷酸作为模板，再将它固定到固相载体柱上，然后将单核苷酸或与模板配对的数段寡核苷酸片段分别通入柱中与模板通过碱基配对排列在一起，在缩合剂的作用下使单核苷酸连接成寡核苷酸或使短的寡核苷酸片段连接成长的寡核苷酸片段。该方法只需要提供一条寡核苷酸作为模板，这条模板固定化后可以反复用于寡核苷酸的合成，因而可以大大降低合成成本。
本发明提供的固定化模板指导的寡核苷酸合成方法是基于利用碱基配对，在缩合剂作用下模板指导的化学连接合成寡核苷酸，该法是以一条寡核苷酸为模板进行固定化，可以反复使用来指导寡核苷酸合成的方法。它包括下列步骤：
1.提供一条寡核苷酸作为模板，此寡核苷酸可以用全合成方法(固相法，液相法)合成，也可用其他方法得到，此寡核苷酸可以是DNA，RNA，PNA或修饰衍生物；
2.将该寡核苷酸的一端通过共价连接固定到固相载体上并装柱，固相载体可以是微孔玻璃颗粒或交联琼脂糖或其他有机高聚体(聚苯乙烯，聚丙烯酰胺等)，连接方法可以通过寡核苷酸5’或3’的磷酸基团或氨臂与固相载体上的氨基或羧基相连接；
3.将单核苷酸或数段与模板配对的短片段寡核苷酸分别通入柱中与模板通过碱基配对，所用的单核苷酸或短片段寡核苷酸可以是由核酸酶将天然DNA切割成的单核苷酸或短寡核苷酸片段，也可以是用DNA合成仪合成短的寡核苷酸片段；
4.通入缩合剂使单核苷酸连接成寡核苷酸或使数段短片段寡核苷酸连接成长片段寡核苷酸产物，缩合剂可以是EDC或BrCN，或其他缩合剂；
5.通入热水使产物与模板解离，得到所需产物，而模板仍然留在柱上可以反复使用。
本发明以固定化的6聚寡核苷酸为模板指导的2片段化学连接，以17聚寡核苷酸为模板指导的5片段化学连接及以3聚寡核苷酸为模板指导的单核苷酸化学连接为例，进行试验证明固定化模板为指导的寡核苷酸片段的化学连接发展成为寡核苷酸的合成方法是有效可行的。
如实施例3所介绍的，本发明先将一条合成的6聚寡核苷酸固定化后装入一根柱中，按图1所示与检测仪，收集器联接起来，依次将二段与模板配对的3聚寡核苷酸通入柱中与模板配对，再通入缩合剂，便可将二段3聚寡核苷酸连接成6聚寡核苷酸，经鉴定洗下的产物中80％以上是6聚寡核苷酸(图2)。如实施例4所介绍的，几条短寡核苷酸一起连接也是可行的，每二个片段之间的连接率也在80％左右(图3)。从中可以看到，采用本方法装置简单，方便有效，一个循环时间很短，对于大规模合成非常有利。
本发明的优点：本发明是提供一种合成寡核苷酸的新方法，此方法采用单核苷酸或短的寡核苷酸片段，以固定化的寡核苷酸为模板，利用碱基配对由模板将相邻的单核苷酸或寡核苷酸片段排列在一起，由缩合剂缩合起来。这个方法的优点首先在于此方法中，一条固定化的寡核苷酸模板可以反复用于寡核苷酸的合成，而在模板上进行缩合的可以采用由核酸酶将天然DNA切割成的单核苷酸或短寡核苷酸片段，因此可以避免从核苷制成保护核苷，再制成活性单体，再合成寡核苷酸的步骤，直接从单核苷酸或短的寡核苷酸片段连接产生所需要的产物，因而可以大大降低合成成本。一条模板反复使用，可以合成出10倍乃至100倍的产物，成本就可以降低几倍至几十倍。即使采用合成仪合成的短寡核苷酸片段进行连接，由于合成短的DNA片段的得率高于合成长的片段，因而也可以降低成本。以每一步的缩合率为98％计算，合成一条24聚的寡核苷酸片段的理论得率为0.628，而合成3聚寡核苷酸片段的理论得率为0.96。虽然片段的连接率也不可能百分之百，由于未连接的小片段还可回收再用，最终寡核苷酸片段的利用率就比较高。其次反应可以在水溶液中进行，不需要特殊的仪器设备，可大大减少对仪器设备的投资。再者，本发明提供的方法在规模上没有限制，模板量越多，合成的规模就越大，而现有的合成仪最大为10毫摩尔起始，一次合成约几十克。最后，本发明所用的寡核苷酸片段可以是3′-单磷酸也可以是5′-单磷酸，可以是天然的单核苷酸或寡核苷酸短片段，也可以是带修饰的寡核苷酸片段。因此，此方法有望成为一种大规模生产寡核苷酸药物的有效的方法。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限止本发明的范围。
附图说明：
图1 以固定化模板合成寡核苷酸的装置示意图。
图2 6聚寡核苷酸为模板的2片段化学连接产物的电泳鉴定
样品2为3核苷酸对照；
样品4为6核苷酸对照；
样品1与3为二次连接的产物。
图3 17聚寡核苷酸为模板的5片段化学连接产物的电泳鉴定
样品1为3核苷酸对照；
样品3为6核苷酸对照；
样品7为17核苷酸对照；
样品2为片段1与2组合连接的产物；
样品4为片段1，2，3组合连接的产物；
样品5为片段1，2，3，4组合连接的产物；
样品6为片段1，2，3，4，5组合连接的产物。
实施例1 3′-单磷酸寡核苷酸片段和其它实验用寡核苷酸片段的合成
利用ABI公司的391EP DNA合成仪合成下列8种寡核苷酸片段，其DNA序列及修饰情况如下：
(1)5’d(CGC)p 3′ 3聚
(2)5′d(ATG)p 3′ 3聚
(3)5′d(TTGA)p 3′ 4聚
(4)5′d(CAAC)p 3′ 4聚
(5)5’d(AAG)3’ 3聚
(6)5’ H2N-C6-P-d(CTTGTTGTCAACATGCG)3’17聚
(7)5’H2N-C6-P-CATGCG 3’6聚
(8)5’H2N-C6-P-CAT 3’3聚
第(1)，(2)，(3)，(4)条寡核苷酸的3′为磷酸基团；第(5)条寡核苷酸的3′为OH基团；
第(6)，(7)，(8)条寡核苷酸的5’为通过磷酸基团连接的六碳原子长的氨臂，3′为OH基团；
第(1)，(2)，(3)，(4)条3′-单磷酸寡核苷酸使用0.2μmole 3′磷酸固相柱(3′-phosphate CPG Glen Research公司产品，全称2-[2-(4，4’-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰长链烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4，4’-Dimethoxytrityloxy)ethylsulfomyl]ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG)，在ABI 391EP DNA合成仪上用0.2μmole合成顺序合成。第(5)，(6)，(7)条3′为OH的寡核苷酸用0.2μmole dG固相柱(Glen Research产品)，用相同的合成顺序合成。第(8)条用dT固相柱(Glen Research产品)，用相同的合成顺序合成，最后(6)，(7)，(8)用5’加氨臂试剂(5’六碳氨基修饰试剂，英文商品名5’-Amino-Modifier C6，Peninsula Laboratories Inc.产品)加上六碳原子的氨臂。合成结束后，取出挂有寡核苷酸的载体，用浓氨水55℃处理15小时脱去保护基，吸出溶液，真空浓缩至干，重新溶解于200μl 50％甲酰胺中，经7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，紫外灯下割带，重蒸水浸泡，透析去盐，浓缩后-20℃保存。测A260，计算产物量。
实施例2 6聚寡核苷酸模板的固定化
先将6-氨基己酸4克加入到5克BrCN活化的琼脂糖凝胶(Sepharose4B)，在50毫升10mM磷酸钾缓冲液pH8.0，4℃反应2小时，使氨基连接到Sepharose4B上，洗净。再将实施例1中合成的第(7)条5’带有六碳原子氨臂的6聚寡核苷酸5’H2N-C6-P-CATGCG 3’0.315 OD加入500mg上述树脂，加0.115克缩合剂EDC，加水至1毫升，23℃旋转反应20小时，最终约有0.1 OD 6聚寡核苷酸被固定化在树脂上。
实施例3 以固定化的6聚寡核苷酸为模板的2片段化学连接将连接有6聚寡核苷酸的树脂装入一个小柱，并与蠕动泵，紫外检测仪，记录仪如图1连接。
通过蠕动泵依次将下列溶液输入柱中：
1，二段与6聚寡核苷酸模板配对的三核苷酸片段与模板配对：
1)0.2M NaCl 0℃平衡柱；
2)第一条三核苷酸d(ATG)p通入：d(ATG)p的0.2 NaCl水溶液0℃上柱，在柱中停留5分钟，与模板配对，然后用0.2M NaCl 0℃洗柱到无紫外吸收；
3)第二条三核苷酸d(CGC)p通入：d(CGC)p的0.2M NaCl水溶液0℃上柱，在柱中停留5分钟，与模板配对。然后用0.2M NaCl 0℃洗柱到无紫外吸收；
2，缩合：
1)0.2M MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)-三乙胺pH7.5，20mM MgCl2，0℃平衡柱；
2)缩合剂0.4M BrCN，及0.2 MES pH 7.5，20mM MgCl2，0℃上柱，在柱中停留5分钟，进行连接反应，连接后用0.2M MES-三乙胺pH 7.5，0℃洗柱；
3，产品洗脱：
1)ddH2O 0℃洗柱；
2)ddH2O 37℃洗脱，收集样品。重复上述过程，可以进行第二次，第三次，---合成。
4，产品鉴定：
以6聚寡核苷酸为模板的2片段化学连接产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。取2次连接产物加入[γ-32P]ATP和T4PNK在5’标记磷32，标记条件为取约1pmole样品加50μ Ci[γ-32p]-ATP，2单位T4多聚核苷酸激酶，1μl 10倍缓冲液，加双蒸水至10μl，37℃保温1小时。取5μl加等体积上样缓冲液混匀，用7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳。以d(CGC)p同样进行标记作对照，结果见图2。产物的80％为6聚寡核苷酸，少量3聚寡核苷酸，连接产率很好。实施例4以17聚寡核苷酸模板为指导的5片段化学连接
以实施例1中所得到的17聚寡核苷酸片段H2N-C6-P-d(CTTGTTGTCAACATGCG)3’为模板，同实施例2固定在Sepharose4B上。将实施例1中所得到的第(1)条d(CGC)p用T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)在其5′端标记上32P，标记条件为取实施例1中所得到的第(1)条寡核苷酸1pmol加50μ Ci[γ-32p]-ATP，2单位T4多聚核苷酸激酶，1μl 10倍缓冲液，加双蒸水至10μl，37℃保温1小时，同实施例1一样，用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化标记的寡核苷酸，加入未标记的寡核苷酸至10pmol，分别与40pmol实施例1中所得到的第(2)，(3)，(4)，(5)条寡核苷酸片段进行不同组合通入柱中，形成氢键配对如下：
5’CTT GTTG TCAACAT GCG 3’
3’GAApCAACpAGTTpGTApCGCp325’
(5) (4) (3) (2) (1)
同实施例3，通入缩合剂BrCN进行连接，连接反应在含0.25M MES-三乙胺缓冲液pH 7.5，20mM MgCl2，0.4M BrCN，中进行，0℃，5分钟。反应后收集产物，取10μl加等体积上样缓冲液混匀，用7mol/L尿素-20％聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，放射性自显影。由于只有寡核苷酸(1)标有同位素，连接产物中只有有第(1)条寡核苷酸片段的才能显影。因此除了都有寡核苷酸片段(1)以外，能看到的(1)与(2)组合的连接产物为6核苷酸，(1)与(2)与(3)组合的连接产物为6核苷酸和10核苷酸，(1)与(2)与(3)与(4)组合的连接产物为3个片段：6核苷酸，10核苷酸和14核苷酸，(1)与(2)与(3)与(4)与(5)组合的连接产物应为4个片段：6核苷酸，10核苷酸，14核苷酸和17核苷酸。结果如图3所示，在5片段连接反应中可以见到片段(1)以及2片段，3片段，4片段，5片段连接产物。割下条带测定放射性，计算连接率为：(1)与(2)与(3)与(4)与(5)组合时，2片段46％，3片段17％，4片段12％，5片段10％，实际上片段(1)与(2)之间的连接率为：46％+17％+12％+10％＝85％。看来，每二个片段之间的连接率虽然可达80％以上，多片段连接的最后产率还不高。因此，先分别进行2片段连接，再进行连接产物之间的连接，效果更好。
实施例5，以3聚寡核苷酸模板为指导的单核苷酸化学连接
以实施例1中所得到的3聚寡核苷酸片段5’H2N-C6-P-CAT 3’为模板，同实施例2固定在Sepharose4B上。混合核苷酸(5’dAMP，5’dTMP，5’dGMP)与缩合剂EDC，催化剂咪唑一起通入柱中，反应体系为0.1M EDC，0.2M MES-三乙胺pH 6.0，20mM MgCl2，0.1M咪唑，10mM 5’dNMP，0℃，过夜。先用ddH2O0℃洗柱，洗去未连接的单核苷酸，而连接产生的3核苷酸与模板配对留在柱上。再用37℃ ddH2O洗脱，将3核苷酸洗下收集，得到pATG。