修饰的生理活性蛋白及含有 该蛋白的药物组合物 【技术领域】
本发明涉及一种具有肝脏累积特性的修饰的蛋白，其对存在于肝实质细胞表面脱唾液酸糖蛋白受体较对脱唾液酸血清类粘蛋白的结合亲和力更低，并且可以通过将含有为转谷氨酰胺酶底物的Gln残基的生理活性蛋白与由在转谷氨酰胺酶存在下含有分支Gal或分支GalNAc的氨基酸衍生物所组成的分支链配体反应从而在该生理活性蛋白中的谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基与此分支链配体中地末端伯氨基之间形成酰胺键，用于制备该蛋白的方法和含有上述蛋白的药物组合物。
本发明的修饰蛋白用作药物的活性成分因为用作起始物质的该生理活性蛋白维持有生理活性。
技术背景
近年来，由于生物技术的发展，可以大量制备多种生理活性蛋白，并且可期望它们成为新药的候选物质。然而，为了将其投入实际使用还有大量问题有待解决。当然，已经认为对其药物动力学的严格控制为增加治疗效果和降低副作用的重要主题。例如，已经对重组人白细胞介素-2(rhIL-2)的抗肿瘤效效应进行了大量的研究。已鉴定其小鼠肉瘤和乳腺癌的效应，并且其对黑素瘤和血管内皮瘤的抗肿瘤效应进行了临床鉴定。然而，在动物试验或临床上仅仅rhIL-2对消化器官实体瘤的预期效应还没有鉴定出。此外，由rhIL-2在静脉内施用后在血液中具有短的半寿期，所以需要高剂量以显示出抗癌活性。然而，当rhIL-2施用达高剂量时，一种称为毛细血管泄漏综合症的严重副作用出现，导致对肺或肝脏影响如水肿等。为了增加rhIL-2的治疗效应控制其化疗命运是必要的。为了解决这种问题，最近通过用含有rhIL-2的脂质体或含有半乳糖的脂质体制品而在肝脏窦状细胞周围积累rhIL-2和增加肝脏窦状淋巴细胞等的活性对转移和早期肝癌的免疫疗法进行了研究(日本癌症化疗杂志。(1994),21(13),2105-2107)。
同时，已知哺乳动物肝细胞具有脱唾液酸糖蛋白受体(之后简称为“ASGR”)，其为对在分支糖链末端中具有半乳糖(之后简称为“Gal”)或N-乙酰葡糖胺(之后简称为“GalNAc”)的糖蛋白特异性的膜结合受体(Ashwell,G.，等.，生化年鉴，1982,51,531-554)。糖蛋白与受体的摄入机制具有高的结合亲和力并且是强烈的。鉴于这些特性和在肝细胞中ASGR的特异性存在，故作为在代谢重要的靶细胞中特异性运载药物或遗传DNAs的靶向系统，上述的受体得到了重视(Wu,G.,Y.等.，生物化学杂志.，(1987),262,4429-4432)。
由于对在该糖识别机制中分离的分支寡糖链或合成Gal衍生物与上述受体间结构-活性相互关系的研究，已弄清Gal残基与分支模式之间的距离，即结合亲和力的强度为如下的顺序：四-天线(antenna)型Gal＞三-天线型Gal＞二-天线型Gal＞单-天线型Gal(Lee,Y.C.等.，生物化学杂志，(1983),258,199-202；Kawaguchi,K.等.,Arch.Biochem Biophys.,(1980),205,388-395；Connolly D.T.等.，生物化学杂志.,(1982),257,939-945；Lee,R.T.，等.，生物化学(1984),23,4255-4259)。
根据这些发现，试图用含有分支Gal或GalNAc的合成配体在肝脏中积累DNAs或脂质体并且将其掺入到细胞中(日本公开(Kokai)No.202,085、1993；Haensler J.等.，生物缀合物(Bioconjugate)化学.，(1993),4,85-93，和Merwin,J.R，生物缀合物化学.，(1994),5,612-620)。
然而，在用内吞机制经这种受体的药物运输系统(之后简称为“DDS”)中，经合成配体向细胞内低效率的摄入还有待解决。已经清楚这是因为这种合成配体对ASGR的结合亲和力低于天然配体糖蛋白如脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)、脱唾液酸胎球蛋白等的糖链[Lee,R.T.等.，糖缀合物杂志.，(1987)4,317-328；和Biessen,E.A.L.等.，医学化学杂志.，1995,38,1538-1546]。由于该低的结合亲和力，具有Gal和GalNAc的合成配体不能很好地结合到ASGR上，并且难以将ASGR掺入到肝细胞中。因此，没有显示出良好的药效。
另一方面，我们开发出一种方法，其中的蛋白用动物转谷氨酰胺酶以各种化合物的烷胺基(alkylamine)衍生物进行定点修饰。然而，在此方法中，将烷胺基衍生物结合到具有生理活性蛋白，例如，rhIL-2氨基酸序列中的谷氨酰胺残基上是困难的。因此，通过用动物转谷氨酰胺酶将具有可结合谷氨酰胺残基的肽导入生理活性蛋白中而将修饰化合物中的烷胺基衍生物结合到生理活性蛋白衍生物上(PCT/JP95/00298(WO96/06181))。
我们进一步研究证明该生理活性蛋白氨基酸序列中的谷氨酸胺残基可用不同的转谷氨酰胺酶，尤其是来自微生物并且对蛋白的Gln残基具有广泛底物特异性的转谷氨酰胺酶(B-TG)和聚亚烷基二醇如聚乙二醇进行定点修饰而不新导入肽分子进入生理活性蛋白如rhIL-2等的氨基酸序列中(日本专利申请No.270,102/1994(日本公开No.89,278/1996))；和PCT/JP 95/01994(WO96/10089)。
本发明者进行各种研究以解决用此合成配体修饰的化合物对ASGR具有低亲和力的问题和该修饰的化合物几乎不掺入肝实质细胞中的问题。并且为了制备用该合成配体修饰的这种化合物，具有Gln残基的肽不得不结合到生理活性的蛋白上。
本发明者对以下的事实进行了关注，即如果以这种合成配体修饰的该生理活性蛋白可直接作用于除肝细胞以外的细胞，如肝窦状淋巴细胞以显示出该生理活性蛋白的药效时，那么该生理活性蛋白如细胞因子等无需使用由这种合成配体修饰化合物提供的对肝实质细胞的低结合亲和力即可积累于肝脏中，并且由于该生理活性物质几乎不掺入到肝细胞中，故其可维持于肝脏中，结果预计细胞因子的此活性通过结合到存在于肝脏中其它靶细胞膜上的特异性受体而显示出来。
向肝脏中的靶向导致了降低待运向肺等蛋白的量，也使通过非靶器官的器官中的rhIL-2而降低副作用成为可能。
并且正考虑到为了有效显示具有这种肝脏积累特性的生理活性蛋白对增加肝脏窦状淋巴细胞的活性而又不掺入该蛋白至肝细胞中的药效，此生理活性蛋白不得不直接修饰同时尽可能多地维持该生理活性蛋白的活性而不用脂质体等将此生理活性蛋白制成制品。
例如，注意力已集中到下面的事实上，即如果以分支合成的配体如Gal或GalNAc定点修饰rhIL-2而同时维持rhIL-2活性并且积累于肝实质细胞周围而不掺入到肝细胞中是可能的话，那么其结合到作为靶细胞的肝脏窦状淋巴细胞上的IL-2受体(IL-2R)继而其活性得到增强并且对转移和早期肝癌的抗肿瘤效应得以预期。
然而，仍没有获得有关以这种分支配体修饰的蛋白在肝脏中积累的知识以及其活性在肝脏中形成的知识。不必说，还根本没有获得有关在除靶器官以外器官中副作用下降的知识。
【发明内容】
本发明者已发现用源于微生物的转谷氨酰胺酶(B-TG)以具有酸性或碱性氨基酸结构的分支Gal配体定点修饰的重组人白细胞介素-2(rhIL-2)较未修饰的rhIL-2维持生物学活性，显示肝脏积累特性，几乎不掺入肝实质细胞中并且进一步显著而最大限度地减少小鼠肝脏肿瘤模型中的肿瘤。同样，已发现以分支Gal配体修饰的人干扰素-α较未修饰的干扰素-α维持生物学活性并且显示肝脏积累特性。
已经进一步发现通过用二种转谷氨酰胺酶而定点导入一分子Gal配体和一分子聚乙二醇衍生物得到的IL-2融合蛋白显示出更高的肝脏积累特性。
本发明已根据此发现完成。
即，提供一种修饰的生理活性蛋白以及含有该蛋白并且具有优良肝脏积累特性的药物组合物是本发明一个目的，其中的生理活性蛋白通过用合成配体对ASGR较天然糖链对ASGR具有较低的结合亲和力而以合成配体修饰预计在肝脏中显示出生理活性的蛋白而获得，继而该生理活性蛋白选择性地积累于此肝脏中，靶向细胞至存在于肝脏中此生理活性蛋白被激活，或形成的活性氧被去除以增加抗肿瘤效应、抗病毒效应和抗炎症效应，并且运送至血液和其它器官中该修饰的生理活性蛋白降低以减小副作用。
本发明的另一目的是提供含有上述修饰的生理活性蛋白和药物上可接受载体的药物组合物，该组合物具有肝脏积累特性并减少副作用。
本发明的另一目的是提供用于通过以源自微生物的转谷氨酰胺酶定点修饰生理活性蛋白而制备修饰的具有生理活性的蛋白。
本发明涉及具有肝脏积累特性，包括修饰的具有生理活性蛋白的药物组合物，其中的生理活性蛋白可通过将含有成为转谷氨酰胺酶底物的至少一个Gln残基并具有1×103至2×105分子量的生理活性蛋白与由含有成为转谷氨酰胺酶底物的氨基和半乳糖(Gal)基或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)基的氨基酸衍生物所组成的分支链配体在源自微生物的转谷氨酰胺酶存在下起反应，其中的分支链配体对存在于肝细胞表面上的脱唾液酸糖蛋白受体较脱唾液酸血清类粘蛋白具有更低的结合亲和力，从而在该生理活性蛋白中谷氨酰胺的γ-羧基酰胺基与此分支链配体中的末端氨基之间形成酰胺键；和药物上可接受的载体。
此外，本发明涉及具有肝脏积累特性的修饰的生理活性蛋白，其对存在于肝实质细胞表面上脱唾液酸糖蛋白的结合亲和力低于对脱唾液酸血清类粘蛋白的结合亲和力，并且可通过将含有成为转谷氨酰胺酶底物的至少一个Gln残基且具有1×103到2×105分子量的生理活性蛋白与由含有成为转谷氨酰胺酶底物的氨基和半乳糖(Gal)基或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的氨基酸衍生物所组成的分支链配体在源自微生物的转谷氨酰胺酶存在下起反应，其中的分支链配体对存在于肝实质细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体较对脱唾液酸血清类粘蛋白具有更低的结合亲和力，从而在该生理活性蛋白中谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基与此分支链配体中的末端氨基之间形成酰胺键。
更进一步，本发明涉及用于制备该修饰的具有生理活性蛋白的方法，其包括将含有至少一个作为转谷氨酰胺酶底物的Gln和具有1×103到2×105分子量的生理活性蛋白与由含有作为转氨酰胺酶底物的氨基和半乳糖(Gal)基或N-乙酰半乳糖(GalNAc)基的氨基酸衍生物所组成的分支链配体在源自微生物的转谷氨酰胺酶存在下起反应，其中的分支链配体对存在于肝实质细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体较对脱唾液酸血清类粘蛋白具有更低的结合亲和力，从而在该生理活性蛋白中谷氨酰胺残基的γ-羧基酰胺基与分支链配体中末端氨基之间形成酰胺键。
附图简述
图1为合成(Gal)3的流程图。
图2为合成PEG12的流程图。
图3为合成(GalNAc)3的流程图。
图4为合成(Gal)3-Tyr-Boc和(GalNAc)3-Tyr-Boc的流程图。
图5为显示血浆和肝脏中(Gal)3-rhIL-2、(GalNac)3-rhIL-2和ASOR量的变化图。
图6为显示通过同时施用ASOR在器官中(Gal)3-rhIL-2的量的图。
图7为显示通过同时施用ASOR后(Gal)3-INF-α的量的图。
图8为显示血浆和肝脏中PEG12、(Gal)3-rX-2-IL-2量变化的图。
图9为显示小鼠分离肝细胞中(Gal)3-rhIL-2和(GalNAc)3-rhIL-2摄入变化和其分解量的图。
图10显示(Gal)3-rhIL-2在S908.D2.VPZ肝移值小鼠中的效应。
图11为显示(Gal)3-rhIL-2副作用结果(测量器官的重量)的表。
图12为显示(Gal)3-rhIL-2副作用结果(血液生化测试)的表。完成本发明的最佳方式
本发明详述如下。
在本发明中，含有成为转谷氨酰胺酶底物的至少一个Gln残基并且具有1×103到2×105，优选2×103到2×105，更为优选5×103到2×105分子量的生理活性蛋白为通过积累于肝脏中而增加活性和降低副作用的蛋白，优选地，此生理活性蛋白分子中如果具有成为源自微生物转谷氨酰胺酶底物的至少一个谷氨酰胺残基，那么此蛋白没有特别的限制。本发明中此生理活性蛋白的实例包括肝细胞生长调节因子如肝细胞生长因子(HGF)；细胞因子如白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-12(L-12)、干扰素-α、干扰素-β和肝瘤坏死因子(TNF)，和抗氧化酶如超氧歧化酶(SOD)。特别地，白细胞介素-2(IL-2)和干扰素是优选的因为预计它们积累于肝脏中。
这些生理活性蛋白可源自动物、植物或微生物。此外，通过掺入这些蛋白的基因进入大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢细胞等而制备的蛋白也可得到。更进一步，为了最大限度地降低共存蛋白的影响在使用前很好地纯化本发明的生理活性蛋白是可取的。
本发明生理活性蛋白分子中优选具有成为转谷氨酰胺酶，优选源自微生物的转谷氨酰胺酶底物的至少一个Gln残基。根据Sato等方法(PCT/JP95/00298)可检测该生理活性蛋白分子中的Gln残基是否可成为源自微生物的转谷氨酰胺酶的底物，该方法中鉴定作为荧光剂的MDC的导入。
当此Gln残基不存在于该生理活性蛋白分子中时，通过结合具有成为源自微生物转谷氨酰胺酶底物的至少一个Gln残基的肽至该生理活性蛋白的C-末端或N-末端而导入成为源自微生物转谷氨酰胺酶底物的Gln残基至生理活性蛋白也是可能的。此时，该肽由3到20个氨基酸所组成并且含有至少一个Gln残基。这种肽的具体实例包括那些具有由氨基酸单一字母命名所代表的下面氨基酸序列的肽。
P-K-P-Q-Q-F-M,
R-P-K-P-Q-Q-F-G-L，和
R-P-K-P-Q-Q-F-M。
含有成为源自微生物转谷氨酰胺酶底物的Gln残基的肽可通过Sato等方法(WO96/06181)导入该生理活性蛋白中。
即使当该生理活性蛋白分子中(如IL-2)含有成为源自微生物转谷氨酰胺酶底物的Gln残基时，上述的肽仍可进一步结合到其上。在这种情况，源自微生物的转谷氨酰胺酶选择性地与该分子中的Gln残基起反应，并且该生理活性蛋白可通过以除源自微生物转谷氨酰胺酶以外的具有不同底物特异性的转谷氨酰胺酶，例如源自动物的转谷氨酰胺酶反应该肽的Gln残基而以2个或更多个不同的配体加以修饰。
对于IL-2，例如，具有氨基酸序列如P-K-P-Q-Q-F-M的肽结合到IL-2的N-末端并且将如聚乙二醇烷基胺的配体用源自动物的转谷氨酰胺酶导入到该肽的Gln残基中是可能的。然后，用源自微生物的转谷氨酰胺酶将本发明的分支链配体选择性导入到IL-2的氨基酸序列中。
所需的配体可用源自微生物的转谷氨酰胺酶选择性地导入该分子特定位点中仅有的Gln残基中也是本发明的发现之一。
用于本发明中的分支链配体为对存在于肝细胞表面ASGR较对ASOR具有更低结合亲和力的配体，更为优选地为其中的修饰蛋白用小鼠分离的肝细胞的掺入测试中不掺入细胞中的配体。即，其为含有双-分支或三-分支半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的配体，其根据在末端具有脱唾液酸胎球蛋白或ASOR糖链的半乳糖的分支糖链结构而形成。用于分支的该结构的实例包括酸性或碱性氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸以及三(羟甲基)氨基甲烷。此外，由于该结构变成了转谷氨酰胺酶的底物，故其末端具有烷基胺基团。
更为具体地，由具有成为本发明中转谷氨酰胺酶底物的氨基和半乳糖(Gal)基或N乙酰半乳糖胺(GalNAC)基的氨基酸衍生物所组成的分支链配体优选为具有分支Gal或GalNAc的氨基酸衍生物，由下面式(Ⅰ)所代表
Z-AA-W (Ⅰ)
其中
AA代表一个或二个碱性或酸性氨基酸，其中的Z或W可以为N-末端，并且当AA为二个氨基酸时，它们可以在α-位置或其它位置具有酰胺键，W为由式-X1-(CH2)nNH2所代表的烷基胺衍生物，其中的n为从1到8的整数，当W结合到由AA所代表的氨基酸的氨基上时X1代表-CO-，并且当W结合到由AA所代表氨基酸的羧基上时代表-NH-，并且Z为含有半乳糖(Gal)或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的基团，由式-X2-(CH2CH2O-)p-R或式-X2-(CH2)q-OR所代表，其中的R代表Gal或GalNAc,p为从1到6的整数，q为从1到18的整数，X2当Z结合到由AA所代表的氨基酸氨基上时代表-CO-，并且当Z结合到由AA所代表的氨基酸羧基上时代表-NH-。
由式(Ⅰ)所代表的分支链配体的AA基团优选为源自一个或二个相同或不同谷氨酸或天冬氨酸的基团。
更为具体地，本发明分支链配体的实例包括由式(Ⅱ)到(ⅩⅤ)所代表的化合物。其中X代表R-(O-CH2CH2)p-NH-或R-O(CH2)q-NH-，其中R代表半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，p为从1到6的整数，并且q为从1到18的整数，Y代表-CO(CH2)nNH2，其中的n为从1到8的整数。其中Z代表R(OCH2CH2)pCO-或R-O(CH2)qCO-，其中的R代表半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，p为从1到6的整数，并且q为从1到18的整数，并且W代表-NH(CH2)nNH2，其中的n为从1到8的整数。其中Q代表R(OCH2CH2)p-或R-O(CH2)q-，其中R代表半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，p为从1到6的整数，并且q为从1到18的整数，并且Y代表-CO(CHx)nNH2，其中的n为从1到8的整数。
可根据目的和该生理活性蛋白的类型将上述的化合物用作本发明的分支链配体。式(Ⅳ)的三-天线型配体是优选的。具体地，由式(ⅩⅥ)所代表的配体。
其中Gal代表半乳糖或由式(ⅩⅦ)所代表的配体
其中GalNAc代表N-乙酰半乳糖胺(之后也称为“(GalNAc)3”)是更为优选的。由式(ⅩⅥ)所代表的配体(Gal)3是图1中化合物(3-14)所表示的配体，并且由式(ⅩⅦ)所代表的配体(GalNAc)3是图3中化合物(14)所表示的配体。
本发明的分支配体可通过有机化学常用的方法制备。一般地，将含有以肽化学中常用保护基，如丁氧羰基保护的氨基的烷基衍生物与单-或双-氨基酸反应以形成含有保护单-或双-氨基酸的烷基胺衍生物，并且去除保护基后，将含有Gal基或GalNAc基的基团导入其中。因此，可形成所需的配体。在上述反应中，导入烷基胺基团和含有Gal基或GalNAc基的基团的顺序可以颠倒。
更为具体地，例如，式(Ⅱ)至(Ⅺ)的分支链配体可通过下面的方法形成。即，根据日本专利公开No.202,085/1993中所述方法，用谷氨酸或天冬氨酸形成具有N-Boc-烷基胺结合其中的分支结构。将其羧基在脱水-缩合条件下，具体为在不参与反应的溶剂(例如，乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷或二氯乙烷中在适当的催化剂(例如，N-羟基琥珀酰亚胺或N,N′-二环己基碳二亚胺)存在下于0°到室温的反应温度与含有乙酰基-保护该糖羟基的三乙二醇胺衍生物的氨基反应1到24小时，且然后进行解保护以获得分支链配体。
对于由式(Ⅻ)至(ⅩⅣ)所代表的化合物的合成，可根据Haesler等方法(生物偶合物化学.，(1993),4,85-93)用赖氨酸形成结合烷基胺的分支结构。
对于由式(ⅩⅤ)所代表化合物的合成，可根据Biessen等方法(医学化学杂志.，(1995),38,1538-1546)用三(羟甲基)氨基甲烷形成结合烷基胺的分支结构。
由式(ⅩⅥ)所代表的配体可根据上述方法(参考图1)制备。此外，由式(ⅩⅦ)所代表的(GalNAc)3也可根据这些方法制备。其可通过下面的方法有效制备(参考图3)。
首先，将半乳糖胺或其盐乙酰化以获得具有保护基保护羟基的N-乙酰半乳糖胺。然后，在缩合剂如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸等存在下将该化合物闭环化以形成由式(ⅩⅧ)所代表的化合物
其中Q代表氢原子或羟基的保护基。其中的保护基为乙酰基并由此式(ⅩⅧ)所代表的化合物在图3中示为化合物(8)。
同时，将2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(图3中的化合物(1))用金属亚氨化物如邻苯二甲酰亚氨钾氨基化，并将得到的氨基以保护基如苄氧羰基等保护以制备化合物(图3中的化合物(4))。
将得到的氨基保护的2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇在缩合剂如三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸的存在下与由式(ⅩⅧ)所代表的化合物反应，然后去除该保护基。结果，可制备由式(ⅩⅨ)所代表的化合物
其中Q代表氢原子或羟基的保护基。其中的N-乙酰半乳糖胺羟基的保护基为乙酰基并由式(ⅩⅨ)所代表的化合物在图3中示为化合物(10)。
由式(ⅩⅨ)所代表的得到的化合物以由式(ⅩⅩ)所代表的化合物加以浓缩
其中Q代表氢原子或氨基的保护基其可用N-(叔丁氧羰基)-L-谷氨酸-α-苄酯和L-谷氨酸-α,γ-二苄酯邻甲苯磺酸盐作为起始物质在缩合剂的存在下形成，并且按需要去除该保护基，使制备由式(ⅩⅦ)所代表的所需配体成为可能。
作为示为替代物Q的羟基或氨基的保护基，可以使用那些在常规肽化学中使用的肽。作为乙酰基，叔丁氧羰基(Boc)和苄氧羰基(Cbz)是优选的。
因此，本发明提供通过上述方法制备由式(ⅩⅦ)所代表配体的方法。
根据Takahara等方法(日本公开(Kokai)No.89,278/1996)或Sato等方法(WO96/06181)在源自微生物的转谷氨酰胺酶(B-TG)的存在下将这些分支链配体与该生理活性蛋白起反应。即，将该生理活性蛋白、合成配体与转谷氨酰胺酶，优选为源自微生物的转谷氨酰胺酶在水溶液中，优选为pH约7.5下室温反应12小时。该生理活性蛋白与合成配体的浓度比例优选在1∶100和1∶2000之间。此外，使用的转谷氨酰胺酶的量在每nmol蛋白0.01到1单位之间。更进一步，以合成配体和同时以聚乙二醇烷基胺衍生物的二-分子修饰提高了该蛋白在血液中的维持时间及其稳定性并增加积累于肝脏中该蛋白的量。即，用2种具有不同底物特异性的转谷氨酰胺酶，优选为源自微生物的转谷氨酰胺酶和源自豚鼠的转谷氨酰胺酶定点结合2种不同的底物。
本发明的药物组合物根据待结合到配体上的生理活性蛋白可用作恶性肿瘤治疗剂、抗病毒剂、抗风湿剂、抗变态反应剂、免疫调节剂、循环功能改进剂、内分泌功能改进剂、用于治疗由蛋白异常形成或其异常功能所致疾病的药剂。
本发明的药物组合物可制成制剂如静脉内或肌肉内注射、直肠施用剂、疏水栓剂、水溶性栓剂等。这些制剂可按需要以常规方式制成常用的赋形剂、填充剂、粘合剂、增湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、缓冲剂、保存剂、增溶剂、防腐剂、止痛、稳定剂等。可用的无毒添加剂实例包括，例如，乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、白明胶、碳酸镁、合成硅酸镁、滑石、硬脂酸镁、甲基纤维素、羧甲基纤维素或其盐、阿拉伯树胶、聚乙二醇、糖浆、凡土林、甘油、乙醇、丙二醇、柠檬酸、氯化钠、亚硫酸钠和磷酸钠。
本发明药物组合物的施用实例包括肠道外施用如静脉内施用、皮下施用、肌肉内施用和粘膜施用。静脉内施用是优选的。为了最大限度地提高运输到肝脏中的效率，该药物组合物的剂量低于其结合到存在于肝实质细胞中脱唾液酸糖蛋白受体的饱和剂量是可取的。本发明中修饰的生理活性蛋白的剂量可调整至低于常规未修饰生理活性蛋白的剂量(前者至少约为后者的四分之一)。
其剂量不仅依使用的生理活性蛋白而改变，而且也考虑其用途以及病人年龄、性别和病情发展程度而适当地加以确定。本发明药物组合物的剂量由于其肝脏积累特性而可减少至未修饰蛋白剂量的几分之一。
此外，本发明提供治疗或预防动物包括人类疾病如恶性肿瘤、病毒感染、变态反应疾病、免疫疾病、循环器官疾病，内分泌疾病等的方法。
更进一步，本发明提供含有所需剂量修饰的生理活性蛋白药剂在治疗或预防中的使用，该药剂的实例为恶性肿瘤治疗剂、抗病毒剂、抗风湿剂、抗变态反应剂、免疫调节剂、循环功能促进剂、内分泌功能治疗剂等。
实施例
本发明通过参照下面的实施例更加具体地加以说明。然而，本发明并不限于这些实施例。实施例1
(Gal)3-rhIL-2的制备
将溶解于含有0.25-M NaCl的50mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)中的rhIL-2溶液(39ml)应用于以200-mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的Sephadex G-25柱(由发玛西亚提供)中，并以上述缓冲液洗脱。洗脱液在280nm吸收处加以监测以获得蛋白洗脱级份(48ml)。将此洗脱级份的蛋白调整至5μM的浓度(330ml)。
向此洗脱级份中加入根据Sato等方法(PCT/JP/95/00298)形成的分支Gal配体((Gal)3,472mg)，如图1中所示。
向此反应溶液中加入60U的源自微生物的转谷氨酰胺酶，并将混合物于室温孵育过夜。
将反应溶液以“Sep-Pak C8 Cartridge”(由Waters提供)预处理，并且然后经用“YMC-Pack C8-AP”柱(4.6×250mm，由Yamamura Kagaku K.K提供)的反相HPLC纯化数次以去除未反应的rhIL-2级份和(Gal)3。
纯化产物的纯度用“Phast系统”(由发玛西亚提供)经SDS-PAGE(用“Homogenious 20”胶)加以检测。结果，对于(Gal)3-修饰的产物((Gal)3-rhIL-2)，仅在分子量增加约2KDa的位置鉴定到该蛋白-衍生的带可能因为一分子(Gal)3结合到此未修饰的产物上去的缘故。
该未修饰产物的量为5.3mg(产率21％)。取样一部分该级份，并且然后应用于以PBS(-)(pH7.5)平衡的Sephadex G-25柱中，并且以上述缓冲液洗脱以得到该蛋白级份(量3.1mg)。实施例2
PEG12,(Gal)3-rX2-IL-2的制备
(1)PEG12-rX2-IL-2的制备
将5毫升通过Sato等方法(PCT/JP/95/00298)制备的rX2-IL-2(通过添加P-K-P-Q-Q-F-M氨基酸序列至hIL-2N-末端而获得的融合蛋白)应用至以100-mM Tris-盐酸缓冲液(含有10-mM CaCl2,pH7.5)平衡的Sephadex G-25柱(由发玛西亚提供)，并且以上述缓冲液洗脱。在280nm处监测此洗脱物以获得蛋白洗脱级份(6ml)。将此洗脱级份的蛋白调至25μM/ml的浓度(10ml)。
向此洗脱级份中加入图2中所示通过Sato等方法(PCT/JP/95/002980)制备的聚乙二醇烷基胺(图2中式(2-3),PEG12,平均分子量12KDa,750mg)。
向此反应溶液中加入2U的源自豚鼠肝脏的转谷氨酰胺酶(由Sigma提供)，并将该混合物于室温孵育过夜。
将该反应溶液以“Sep-Pak C8 Cartndge”(由Waters提供)预处理，并且然后用“YMC-Pack C8-AP”柱(4.6×250mm，由Yamamura Kagaku K.K.提供)经反相HPLC纯化数次以去除未反应的rX2-IL-2级份和PEG12。
用“Phast系统”(由发玛西亚提供)经SDS-PAGE(用“Homogeniou 20”胶)测定纯化产物的纯度。结果，对于PEG12修饰的产物(PEG12-rX2-IL-2)，仅在分子量增加约20KDa的位置鉴定到该蛋白衍生的带可能因为一分子PEG12结合到此未修饰产物上的缘故。该修饰产物的量为0.484mg(产率2％)。
(2)PEG12,(Gal)3-rX2-IL-2的制备
将上述PEG12-rX2-IL-2溶液应用至以200mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的Sephadex G-25柱(由发玛西亚提供)，并且以上述缓冲液洗脱。于280nm吸收处监测洗脱液以获得蛋白洗脱级份(3ml)。将该洗脱级份蛋白调至5μM/ml的浓度(3ml)。向其中添加根据Sato等方法(PCT/JP/95/00298)形成的半乳糖配体((Gal)3，17mg)。向此反应溶液中加入15U源自微生物的转谷氨酰胺酶，并将该混合物于室温中孵育过夜。
将反应液以“Sep-Pak C8 Cartridge”(由Waters供应)预处理，且然后用“YMC-Pack C8-AP”柱(4.6×250mm，由Yamamura Kagaku K.K提供)经反相HPLC纯化数次以去除未反应的PEG12-rX2-IL2级份和(Gal)3。
纯化产物的纯度用“Phast system”(由发玛西亚提供)经SDS-PAGE(用“同质20”胶)加以测定。结果，对于以PEG12和(Gal)3修饰的产物(PEG12,(Gal)3-rX2-IL-2)，仅在分子量增加约2KDa的位置鉴定出该蛋白衍生的带可能是因为一分子(Gal)3结合到PEG12-rX2-IL-2上的缘故。修饰产物的量为0.05mg(产率1％)。实施例3
〔(GalNAc)3(参考图3)〕的合成
(1)化合物(4)的合成
根据改进Yamada等的方法(日本公开No.202,085/1993)进行化合物(4)的合成。将500克(2.96摩尔)2-[2-(2-氯乙氧基)乙氧基]乙醇(化合物(1))加入到596g(3.22摩尔)邻苯二甲酰亚氨钾和DMF(3.5升)的混合溶液中，并将该混合物在油浴(100℃)加过过程中搅拌17小时。将反应液冷却至室温，并过滤出不溶性物质。将滤液在减压下浓缩。残余物以二氯甲烷(300ml)提取，并将溶剂蒸馏以获得895.6g如黄油的化合物(2)(粗产物)。
将得到的粗产物溶解于EtOH(14升)中，并且向其中加入198ml(3.27摩尔)80-％的-水合肼。然后，将混合物加热回流2小时同时以机械搅拌器搅拌。将此反应溶液冷却至室温，然后过滤掉不溶性物质。在减压下浓缩滤液。向该残余物中加入3升二氯甲烷，并将混合物于室温搅拌30分钟。然后，过滤掉不溶性物质。将滤液在减压下浓缩以获得484g如黄油状化合物(3)(粗产物)。
将上述的化合物(3)(483.8g)溶解于5.4升水中，并将该溶液于冰水浴中冷却。作为选择，可分别加入NaHCO3(273g)和苄氧羰基氯化物(33-％甲苯溶液，1.550ml)5次同时搅拌，并将该混合物于室温搅拌过夜。反应溶液分成数层，并且水层以乙酸乙酯提取。混合的有机层以氯化钠饱和水溶液洗，且然后用无水硫酸镁干燥。将溶剂在减压下蒸馏，并将获得的残余物用乙酸乙酯经硅胶柱层析(硅胶=4kg)加以纯化以获得393g如无色油的上述化合物(4)。
(2)化合物(9)的合成
通过日本公开No.202,085/1993方法进行为半乳糖胺衍生物的化合物(9)的合成。
即，将150g半乳糖胺盐酸盐(化合物(5))溶解于2.8升MeOH和190ml三乙胺的混合溶剂中，并且于室温逐滴向其中加入1.25升的乙酸酐。将该溶液于室温搅拌过夜，在减压下将溶剂蒸馏。随后，向其中加入1,500ml吡啶和500ml乙酸酐，并将混合物于室温搅拌过夜。溶剂在减压下再次蒸馏后，将残余物形成乙酸乙酯溶液，以水洗，并且进一步浓缩。
经过滤收集沉淀的结晶，并且将此滤液浓缩。然后经硅胶层析纯化此残余物以获得89.4gα,β-乙酸酯(化合物(7),(6)混合物)(2∶1)(硅胶=4kg,CHCl3∶MeOH=10∶1)。
此外，将母液浓缩至干，并将得到的产物然后经硅胶柱层析纯化以获得23.9gα-乙酸酯(化合物(7))(硅胶=4kg,AcOET)。
将上述α,β-乙酸酯(化合物(7),(6))混合物(2∶1)(81.4g)溶解于1升1,2-二氯乙烷(EDC)中，并且于室温逐滴向其中加入39.8ml的三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸(TMSOTf)。将该混合物于40℃反应过夜，并将2等份的Et3N加入其中。随后，将该溶剂蒸馏。同时，将23.9g上述α-乙酸酯(化合物(7))溶解于300ml的1,2-二氯乙烷(EDC)，并于室温向其中逐滴加入11.7ml的TMSOTf。将此反应于40℃进行3小时，向其中加入2等份的Et3N，然后将此溶剂蒸馏。收集残余物，并经硅胶层析纯化以获得83.6g化合物(8)(硅胶=4kg,CHCl3∶MeOH=20∶1)。
将上述已合成的化合物(8)(83.0g)和142.8g化合物(4)溶解于1升1,2-二氯甲烷中，并且于50℃在MS4A(分子筛4A)存在下逐滴向其中加入53.2ml TMSOTf。将该混合物于室温反应过夜同时搅拌。然后，向其中加入1升水，并用2升氯仿提取该混合物。以水和饱和氯化钠水溶液洗该提取物，然后经无水硫酸钠干燥。之后，在减压下蒸馏此溶剂。将此残余物经硅胶柱层析纯化2次以获得145g上述化合物(化合物(9))(硅胶=4kg,AcOEt-CHCl3∶MeOH=20∶1至10∶1)。
(3)化合物(14)((GalNAc)3)的合成
将上述化合物(9)(71.1g)溶解于1.5升的EtOH中，并将22.8g邻甲苯磺酸-水化合物加入其中。将该混合物在22.6g 5-％Pd/C存在下在氢环境中于室温搅拌过夜。用Celite过滤此反应溶液，且然后在减压下浓缩至干。将此残余物溶解于500ml乙腈中，并且浓缩至干，并且将此程序重复4次。将残余物溶解于200ml乙腈中，并且向其中加入13.3ml N-甲基吗啉以制备化合物(10)的溶液。
同时，将100ml含有19.3g由Sato等方法(PCT/JP 95/00298(WO96/06181))用N-(叔丁氧羰基)-L-谷氨酸-α-苄酯和L-谷氨酸-α,γ-二苄酯邻甲苯磺酸盐作为起始物质而形成的化合物(11)的DMF溶液于冰水浴中冷却。向其中加入N-羟基琥珀酰亚胺(13.7g)和4.63g DCC，并将该混合物搅拌数分钟。向此反应溶液中逐滴加入200ml含有78g上述化合物(10)的乙腈溶液，并将此混合物在冷却中(15℃)搅拌过夜。经过滤分离不溶性物质，并且在减压下蒸馏此溶剂。将残余物经硅胶柱层析加以纯化以获得无色固体的中间体化合物(12)(硅胶=4kg,CHCl3∶MeOH=20∶1到10∶1)。经FAB-MS(m/z(M+H)+1870.9)鉴定化合物(12)的结构。
将含有15.3g制备的化合物(12)的二氯甲烷(65ml)溶液于冰水浴中冷却，并且向其中加入65ml三氟乙酸(TFA)。随后，将该溶液于室温搅拌1小时。在减压下蒸馏该溶剂。为了去除残余的TFA，将此残余物溶解于50ml EtOH中，并将该溶液在减压下蒸发至干。重复三次该步骤。然后，将此残余物溶解于70ml二氯甲烷中。该混合物以加入28-％NaOMe/MeOH溶液同时在冰水浴中冷却加以中和。在减压下蒸馏此溶剂，并且此残余物经硅胶柱层析加以纯化以获得11.2g为中间体的化合物(13)(硅胶=460g,CH2Cl2∶MeOH=10∶1至3∶1)。经1HNMR和电喷射离子化四极质谱(ESI+QIMS)鉴定化合物的结构。
1H NMR(600MHz,CDCL3):δ
2.01(s,Ac,9H),2.02(s,Ac,9H),
2.05(s,Ac,9H),2.15(s,Ac,9H),
3.05-3.16(br,-CH2-NH2,2H)
ESI+QIMS:m/z(M+H)+1770.4
将上述化合物(13)(6.64g)溶解于184ml MeOH中，并将0.83毫升28-％的NaOMe/MeOH溶液在冰水浴中冷却的同时加入其中。将此混合物于室温搅拌5小时，并且将该反应溶液然后在冰水浴中冷却，并且以添加已用MeOH很好洗过的Dowex 50W加以中和。冲洗液经过滤分离，并将此溶剂然后于减压下蒸馏。将残余物于50℃减压下干燥过夜以获得3.4g的(GalNAc)3(化合物(14))。
1H NMR(600MHz,D2O):δ
1.48-1.55(m,2H),1.70-1.83(m,4H),
2.04-2.12(m,2H),2.17(5,9H),
2.16-2.24(m,2H),2.47(t,4H),
2.55(t,2H),3.14(t,2H),
3.45-3.58(m,6H),3.70-3.95(m,41H)
4.02-4.08(m,6H),4.12-4.18(br,2H),
4.32-4.42(m,2H),4.63(d,2H)
13C NMR(150MHz,D2O):δ
23.0,25.4,25.9,27.2,27.6,27.9,
32.2,32.6,35.8,39.7,40.0,49.6,
53.1,54.0,54.2,61.7,68.6,69.5
69.6,70.2,70.4,71.8,75.9,102.3,
174.3,174.3,175.4,175.6,176.6,
177.5
ESI+QIMS:m/z(M+H)+1393.1实施例4
(GalNAc)3-IL-2的制备
将溶解于含有0.25M NaCl的50mM醋酸缓冲液(pH5.0)中的rhIL-2溶液(11ml)应用至以200mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的Sephadex G-25柱(由发玛西亚提供)中，并以相同的缓冲液洗脱。于280nm的吸收处监测洗脱液以获得蛋白的洗脱级份(200ml,6.8μM)。将此洗脱级份中该蛋白的浓度调至5μM(26ml)。
向13ml此洗脱级份中加入3.47mg由上述实施例3中所述方法形成的分支N-乙酰半乳糖胺配体(GalNAc)3。向此反应溶液中加入约32.5U来源于微生物的转谷氨酰胺酶，并将此混合物于室温孵育过夜。
将此反应溶液以“Sep-pak C8 Catridge”(由Waters提供)预处理，并且然后用“YMC-Pack C8-AP”柱(4.6×250mm，由Yamamura Kagaku K.K提供)经反相HPLC纯化数次以去除未反应的IL-2级份和(GalNAc)3。
该纯化产物的纯度用“Phast system”(由发玛西亚提供)经SDS-PAGE加以检测(用“Homogenious 20”胶)。结果，对于以(GalNAc)3修饰的产物((GalNAc)3-rhIL-2)，仅在分子量增加约2KDa的位置鉴定到该蛋白衍生的带可能是因为一分子(GalNAc)3结合到此未修饰产物上的缘故。该修饰产物的量为401μg(产率40％)。
通过用以PBS(pH7.4)平衡的Molcut L(LGC，由Millipore提供)反复进行浓缩将获得的一部分该级份进行缓冲液交换。实施例5
(GalNAc)3-INF-α的制备
将200mg冻干的人INF-α(2b)(生化学工业社制)溶解于1.465μl200mM的Tris-盐酸缓冲液中，并且将合成的分支半乳糖配体((Gal)3,6.5mg)加入其中。将此反应溶液中加入约0.7U来源于微生物的转谷氨酰胺酶，并将此混合物于室温孵育4小时。
该反应溶液用“YMC-Pack C8-AP”柱(4.6×250mm)由Yamamura Kagaka K.K提供)经反相HPLC纯化数次以去除未反应的INF-α(2b)级份和(Gal)3。通过用以PBS(pH7.4)平衡的Mocut L(LGC，由Millipore提供)反复进行浓缩将该获得的级份进行缓冲液交换。
该纯化产物的纯度用“Phast system”(由发玛西亚提供)经SDS-PAGE加以检测(用“Homogenious 20”胶)。结果，对于以(Gal)3修饰的产物((Gal)3-INF-α)，该蛋白衍生的带仅在分子量增加约2KDa的位置鉴定到可能因为一分子(Gal)3结合到此未修饰产物上的缘故。该修饰产物的量为150μg(产率75％)。实施例6
(Gal)3-Tyr-Boc,(GalNAc)3-Tyr-Boc的制备
用碘标记的Tyr衍生物的合成通过田林等方法(T.Tamura等.，生化年鉴.216,335-344(1994))进行(参考图4)。即，将30μmols(Gal)3或(GalNAc)3溶解于3.6ml二甲基甲酰胺中，并且向其中加入1.13g Boc-Tyr-NHS(由Sigma提供)。将此溶液于50℃搅拌5小时。此反应溶液冷却后，向其中加入1N NaOH，并且经离心去除沉淀物。将上清加到以1％(W)吡啶和乙酸平衡的Sephadex G-25柱(由发玛西亚提供)中以获得在280nm处监测到的Tyr-Boc衍生物级份。将获得的级份冷冻干燥，并且然后再次溶解于0.1％的TFA溶液中。该溶液用“Inertsil ODS-2”柱(4.6×150mm，由GL科学公司提供)经反相HPLC纯化以形成具有90％或更高峰值纯度的14.7mg Try-Boc衍生物〔(Gal)3-Tyr-Boc〕和28.9mg Tyr-Boc衍生物〔(GalNAc)3-Tyr-Boc〕。经电喷射离子化质谱(ESI-MS)鉴定该产物的结构。
ESI-MS:
(Gal)3-Tyr-Boc；m/z(M+H)+1532.8,
(GalNAc)3-Tyr-Boc；m/z(M+H)+1655.6实施例7
修饰位置的鉴定
根据Tsuji等方法(生物化学，(1987),26,3129-3134)将经上述实施例1中反相HPLC取样级份的冻干产物(计为IL-2)和rhIL-2各100微克进行还原羧甲基化。将该还原羧甲基化产物的50微克冻干粉溶解于50微升碳酸氢铵缓冲液(pH7.9)中，并且以添加2μg“V8蛋白酶”消化该混合物，且然后进行冷冻干燥。随后，将2μg“TPCK-胰蛋白酶”溶解于50ml 50mM碳酸氢铵(pH7.9)中以在37℃酶解4小时。将该溶液如同经LC/MS分析以制备肽图谱用于比较。结果，观察到在(Gal)3-rhIL-2中相应于含有Gln-74氨基酸序列的峰消失。因此，鉴定本发明的分支链配体(Gal)3经B-TG位置选择性地结合到rhIL-2的Gln-74上。实施例8
修饰产物的IL-2活性
用从ATCC获得的IL-2依赖性小鼠细胞“CTLL-2”(ATCCT1B 214)通过Gills等方法(J.Immund.,120,2027(1978))测定(Gal)3-rhIL-2、(GalNAc)3-rhIL-2、PEG12、(Gal)3-rX2-IL-2和rhIL-2的IL-2生物学活性。
因此，(Gal)3-rhIL-2对rhIL-2的比活性为102％，并且证实修饰产物维持IL-2的生物学活性。此外，(GalNAc)3-rhIL-2对rhIL-2的比活性为110％，并且证实(GalNAc)3-修饰的产物维持IL-2的生物学活性。此外，PEG12、(Gal)3-rX2-IL-2对rX2-IL-2的比活性为126％，并且证实此双-分子-修饰的产物维持rX2-IL-2的生物学活性。实施例9
修饰INF的活性
根据用FL细胞通过病毒对细胞变性效应的抑制通过Watabe等方法(淋巴细胞因子和干扰素；实践方法，IRL出版社、牛津，1987)对人IFN进行生物测定。即，当病毒以诱导100％细胞变性的量使用时，细胞预先用IFN样品稀释液处理。当病毒细胞变性受到50％抑制得到此样品稀释液的IFN效价计为1个单位(IU).(Gal)3-INF-α和INF-α的IFN生物学活性根据人INF-α标准品(由The Green CrossCorporation提供)的效价计算。
因此，(Gal)3-INF-α和INF-α的生物学活性分别为1.17×108IU/mg和1.42×108IU/mg。结果，(Gal)3-INF-α对未修饰INF-α的比活性为82％，并且证实该修饰产物维持INF-α(2b)的生物学活性。实施例10
修饰产物的肝脏积累特性
将(Gal)3-rhIL-2、(GalNAc)3-rhIL-2、脱唾液酸血清类粘蛋白[ASOR、用Sigma提供的人血清类粘蛋白(OR)或al-酸通过Bider等方法(欧洲生物化学杂志.，(1995),230,207-212)制备]或rhIL-2以3.2nmols/kg的剂量静脉内施用至小鼠(C57BL/6,CRJ,6W，雄性)。经固定的时间段(2分钟，15分钟，30分钟和60分钟)后，取样其血液，并且提取肝脏。以常规方式取样血浆，并且经ELISA测定样品的浓度。通过加入9倍量0.1％含有BSA的PBS(-)将肝脏匀浆，并以3,000rpm离心5分钟。随后，以ELISA缓冲液(含有0.05M Tris HCl,1mM MgCl2,0.15M NaCl,0.05％(v/v),Tween20,0.02％(w/v)NaN3和1％(w/v)BSA,pH8.1)稀释该上清，并且在肝脏中的浓度经ELISA加以检测。
用抗-人IL-2的小鼠单克隆抗体(由宝灵曼提供)作为一级抗体，用抗-人IL-2的兔多克隆抗体作为二级抗体并且用碱性磷酸酶标记的抗-兔IgG(γ+L)多克隆抗体(山羊)(由Tago提供)作为三级抗体对IL-2进行ELISA。另一方面，用纯化的人α1-酸糖蛋白绵羊多克隆抗体(由Binding Site提供)作为一级抗体，纯化的抗-人α1-酸糖蛋白兔多克隆抗体作为二级抗体并且用碱性磷酸酶-标记的抗-兔IgG(γ+L)多克隆抗体(山羊)(Tago提供)作为三级抗体对ASOR进行ELISA。
因此，如图5中所示，与rhIL-2相比，血浆中(Gal)3-rhIL-2和(GalNAc)3-rhIL-2的浓度变成更低的水平。同时，在肝脏中(Gal)3-rhIL-2和(GalNAc)3-rhIL-2的浓度变为更高的水平，并且证实通过以(Gal)3和(GalNAc)3的修饰，IL-2可积累于肝脏中。(Gal)3-rhIL-2和(GalNAc)3-rhIL-2在肝脏中的AUCs(浓度时间曲线面积)分别为rhIL-2的3.5倍和6.2倍。此外，施用后，血浆中ASOR浓度立即增高，但其立即消失。同时，其在肝脏中的浓度变成较(Gal)3-rhIL-2和(GalNAc)3-rhIL-2更高的水平。
此外，为了证实(Gal)3-rhIL-2在肝脏中积累的发生是由于该合成的配体(Gal)3与存在于肝实质细胞表面的脱唾液酸糖蛋白受体之间的结合，经同时施用由Bider等方法(欧洲生物化学杂志.，(1995),230,207-212)制备的脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)进行积累抑制的检测。
即，同时将50μg/kg(计为IL-2)(Gal)3-rhIL-2和1,322μg/kg(10等份IL-2)的ASOR施用至小鼠(C57BL/6,CRJ,6W，雄性)。2分钟后，取样血液，并且提取主要的器官(肝脏、肾脏和肺)。经ELISA检测样品的浓度，并且与同时rhIL-2和(Gal)3-rhIL-2的浓度作比较。
因此，如图6中所示，经同时施用ASOR而在肝脏中积累的(Gal)3-rhIL-2的量以与rhIL-2相同的水平下降。因此鉴定上述(Gal)3-rhIL-2的积累经ASGR进行。
此外，对于(Gal)3-INF-α，以相同的方式进行经同时施用ASOR后肝脏中积累抑制的检测。即，同时将50μg/kg(计为INF)的(Gal)3-INF-α和1.051μg/kg(10等份)的ASOR施用至小鼠(C57BL/6)。2分钟后，取样血液，并且提取主要的器官(肝脏和肾脏)。经ELISA测定标本的浓度，并且与INF-α和(Gal)3-INF-α的浓度作比较。
因此，如图7中所示，肝脏中(Gal)3-INF-α的量与(Gal)3-rhIL-2一样，较未修饰的INF-α的量增加约6倍。此外，肝脏中积累的(Gal)3-INF-α的量以与经同时施用ASOR的未修饰INF-α的量以相同的水平下降。因此，鉴定上述的积累经ASGR进行。
同时，对于PEG12的化疗命运，将PEG12、(Gal)3-rX2-IL-2以及33μg/kg(计为IL-2)样品静脉内施用至小鼠(C57BL/6,CRJ,6W，雄性)中。经固定的时间段(2分钟，15分钟和60分钟)后，取样血液，并且提取肝脏。用常规方式取样血浆。经ELISA测定样品的浓度。通过加入9倍量的PBS(-)对肝脏匀浆，并且以3,000rpm离心5分钟。随后，以ELISA缓冲液稀释上清，并且经ELISA测定组织中样品的浓度。以施用量的百分比进行比较。
结果，血浆中PEG12、(Gal)3-rX2-IL-2的浓度比rhIL-2的浓度变成更高的水平。肝脏中PEG12、(Gal)3-rX2-IL-2的浓度较(Gal)3-rhIL-2变为更高的水平，并且其肝脏中的AUC(浓度时间曲线面积)约为rhIL-2的12倍。实施例11
测定修饰产物对肝细胞的结合
用胶原酶回流方法(Berry等方法(M.N.Berry等.，细胞生物学杂志.，43,506-520(1969)的修饰)制备的小鼠分离的肝细胞测定修饰产物对肝细胞的结合。即，以胶原酶(Ⅰ型，由Wako纯化学有限公司提供)回流7只小鼠(C57BL/6,7W，雄性)并且然后切下每只小鼠的肝脏。用细胞滤器过滤每只肝脏。然后经低速(50g×1分钟)离心收集肝细胞，并且用150mm组织培养碟(由Iwaki Garasu K.K提供)于含有10％FBS(由Gibco提供，含有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和50μg/ml庆大霉素)的D-MEM培养基中孵育1到4小时。仅仅粘附到组织表面的细胞以胶原酶处理，并且以低速共同离心三次(50G×1分钟)以纯化肝细胞(总共1.1×108个细胞，生物利用率93％)。在6孔胶原酶包被的平板上，将8×105个细胞/孔浓度的肝细胞在上述10％含有D-MEM培养基的FBS中于37℃孵育过夜，并用于结合测定中。
通过Chang等方示(T.Cheng等.，BBA 942,57-64(1988))进行肝细胞结合测定。将大约处于汇合状态的细胞以含有D-PBS的10mMCaCl2洗2次，并且向其中加入0.1％的含有BSA的缓冲液。于4℃孵育30分钟。向其中加入1毫升不同浓度(溶解于0.1％含有13SA的缓冲液中)并用氨胺方法以125I-标记的(Gal)3-Tyr-Boc(1.80×105cpm/mg),(GalNAc)3-Tyr-Boc(1.49×105cpm/mg)或ASOR(3.16×106cpm/μg)，并将混合物于4℃孵育2小时。同时，通过加入87.5mM N-乙酰半乳糖胺(由Sigma提供)至上述标记的溶液中进行非特异性结合。将细胞用4℃冷却的D-PBS洗2次。随后，让平板于-20℃静置30分钟或更长时间。之后，非特异性结合的放射活性从1ml0.1N含有0.5％SDS NaOH溶液的0.8ml放射活性中扣除，并且根据上述值计算其总量的放射活性。这样计算的值定义为结合级份的量。于n=2的每个点进行结合测定。细胞总蛋白的量用0.1ml该溶液通过Lorry方法计算。
[结合的量/未结合的量](升/mg细胞蛋白)对[结合的量](pmol/mg细胞蛋白)进行Scatchard作图。结果，在所有样品中该图为双曲线状态，并且发现有2种类型的结合。认为有2种彼此互不作用的结合位点，进行Scatchard分析，其为用Gauss-Mewton方法对最小平方方法的应用，并且比较样品间高亲和力的解离常数(Kd1)。因此，ASOR的Kd约为0.8nM，而(Gal)3-Tyr-Boc和(GalNAc)3-Tyr-Boc的Kd这数十nM的数量级水平，并且(GalNAc)3-Tyr-Boc的Kd低于(Gal)3-Tyr-Boc的Kd。因此，与具有天然糖链型配体的ASOR相比，2种类型制备的合成配体对ASGR显示出低约2个数量级的结合亲和力。发现其强度为ASOR＞＞(GalNAc)3＞(Gal)3的顺序。实施例12
修饰产物向肝细胞中的摄入
用通过在胶原酶包被平板上以6×105个细胞/孔的量在10％含有FBS的D-MEM培养基(由Gibco提供，含有100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和50μg/ml庆大霉素)中37℃于5％CO2中孵育过夜肝实质细胞(总共6.0×107个细胞，生物利用率92％)(通过以胶原酶回流3只小鼠(C57BL/6.9W雄性)并经低速离心纯化它们而形成)而获得的细胞，与结合测定一样，进行修饰产物向肝细胞结合的测定。
也根据Chang等方法(T.Chang等.，BBA 942,57-64(1988))进行摄入到肝细胞中的测定。以含有0.1％BSA和10mM Hepes的D-MEM培养基(pH7.4)洗一次大约处于汇合状态的细胞，并将该缓冲液加入其中。将混合物于5％CO2中37℃孵育30分钟。向其中加入1毫升24nM通过氯胺T方法以125I-标记的(Gal)3-rhIL-2(1.14×107cpm/μg(计为IL-2))、(GalNAc)3-rhIL-2(1.09×107cpm/μg(计为IL-2))或ASOR(3.16×106cpm/μg)(溶解于缓冲液中)，并于37℃孵育固定的时间段(0分钟，30分钟，1小时，2小时和4小时)。另一方面，通过在每种标记溶液中加入100mM N-乙酰半乳糖胺进行非-特异性摄入。反应后将每张孵育过的平板转移至冰浴中。取样一部分培养基，并向其中加入含有20mM EGTA并于4℃冷却的D-PBS溶液(无Ca2+和Mg2+)。让该混合物静置5分钟。重复2次该清洗步骤。此外，将该平板以冷却的D-PBS溶液(Ca2+和Mg2+)洗一次，并且然后让其于-20℃静置30分钟或更多。从1ml 0.1N含有0.5％SDS的每孔中NaOH溶液中的0.8ml的放射性活性中扣除非特异性结合的放射性活性，并且根据上面获得的值计算其总量的放射性活性。这样计算出的值定义为摄入部分的量。同时，通过从培养基中总三氯乙酸可溶性部分的放射性活性中扣除非特异性降解的放射性活性而获得的值定义为降解部分的量。在每个n=3的点进行摄入测定。通过Lorry方法相对于0.1ml溶液计算细胞的蛋白总量。
因此，对于ASOR，如图9(A)中所示，孵育后30分钟观察到摄入的成分，并且于1小时达到饱和。随着时间的流逝，降解成分逐渐增加，并且4小时后量为最高。
同时，对于(Gal)3-rhIL-2，如图9(C)中所示，很少观察到摄入和降解成分，并且鉴定与ASOR相比，(Gal)3-rhIL-2几乎不摄入肝实质细胞中。结果，证实该配体对特异性存在于肝实质细胞中ASGR的结合亲和力降低约2个数量级，因此使赋予下面的特性成为可能，即其修饰产物可经静脉内施用根据识别此受体而积累于肝脏中但几乎不摄入肝实质细胞中。
发现(GalNAc)3-rhIL-2以相对短的时间段摄入，如图9(B)中所示。从上述检测中已知这已很清楚，因为(GalNAc)3-rhIL-2对ASOR显示出低的亲和力，发现其优选用作需要选择性到达肝脏并在相对较早期代谢的DDS药物制品。实施例13
修饰产物的抗肿瘤效应
其肝脏中移值有纤维肉瘤(S908、D2、VP2)的小鼠(B10D2、6W、雌性)(7.5×104个细胞/小鼠)用于本测定中。移植后第7天，总共静脉内施用(0.5μg/次(Shot))(Gal)3-rhIL-2和rhIL-2(n=4)。因此，如图10中所示，与rhIL-2施用组相比，(Gal)3-rhIL-2施用组显著地以最大程度减小了肿瘤。因此，与rhIL-2相比，(Gal)3-rhIL-2的抗肿瘤效应增强。实施例14
修饰产物的毒性
在该实验中，以-天2次连续5天分别将(Gal)3-rhIL-2和rhIL-2静脉内施用至小鼠(B10D2,6W，雌性)(n=3)(1.5μg/天，4.4μg/天，13.3μg/天，40μg/天；浓度均计为IL-2)。最后一次施用2小时后，进行解剖学检查。作为评价项目，测定肝脏、肺和肾脏的器官重量(湿重)，并收集血清。然后，用Fuji Dry Chem进行血液生化检测。
因此，如图11中所示，肺中(Gal)3-rhIL-2的器官重量(％(w/w))较相同剂量的rhIL-2趋于以更低的速度增加。在40μg/天施用组，与作为对照的生理盐水施用组相比，rhIL-2显示出显著的增加。相反，在(Gal)3-rhIL-2中没有观察到显著的增加。另一方面，在肝脏中，观察到器官重量％随着(Gal)3-rhIL-2和rhIL-2的剂量增加而增加。在40μg/天施用组，与作为对照的生理盐水施用组相比，rhIL-2和(Gal)3-rhIL-2显示出的增加。然而，它们之间没有发现大的差异。此外，在肾脏中，即使(Gal)3-rhIL-2和rhIL-2的剂量增加，但仍没有观察到器官重量的增加。
另一方面，如图12中所示，作为GOT(谷草转氨酶)、GPT(谷丙转氨酶)和TBIL-S(总胆红素)的血液生化检测结果，观察到在(Gal)3-rhIL-2和rhIL-2中的测定值随着其剂量的增加而增加，并且rhIL-2趋于显示出更高的值。同时，在TP-S(总蛋白)、AlB-S(清蛋白)和BUN-S(血尿素氮)中，没有观察到测定值随其剂量的增加而增加。
根据上述结果，发现在肺中(Gal)3-rhIL-2的毒性低于rhIL-2的毒性并且在肝脏和肾脏中没有观察到增加，结果为本发明修饰的产物积累于肝脏中而没有对其它器官造成毒性。