除草剂抗性水稻 发明所属技术领域
本发明涉及除草剂抗性水稻，尤其涉及具有以下除草剂抗性的水稻：普杀特、灭草喹、烟嘧黄隆、氟嘧黄隆、嘧黄隆、灭草烟、imazameth、imazamox、这些除草剂的衍生物或干扰植物乙酰羟酸合成酶的其它除草剂。
背景技术
植物中新的除草剂抗性地形成，可以大大提高产量和经济利益。水稻的产量经常由于与茂盛生长在商品稻田中的水稻有亲缘关系的杂草的大量生长而受到限制。这种杂草通常称作“红稻”。它和栽培水稻(Oryzasativa L.)属于同一个种。红稻和商品水稻在遗传上的相似性使除草剂对红稻生长的控制变得困难。除草剂禾大壮(草达灭：S-乙基六氢-1-H-吖庚因-1-硫代羧酸酯)和Bolero(杀草丹：S-[(4-氯苯基)甲基]二乙基硫代氨基甲酸酯)对红稻有部分抑制性，但目前真正能控制红稻的除草剂都不能用于稻田，因为商品水稻同时对这类除草剂具有敏感性。因此培育抗有效控制红稻的除草剂的突变型商品水稻将会大大增强控制红稻侵染的能力。
美国南部的水稻种植者将水稻作物和大豆轮作，从而有助于控制红稻侵染。虽然这种轮作从经济上说通常并不是所希望的，但经常是必需的，这是因为目前在商品水稻作物中没有一种除草剂可用于选择性地控制红稻侵染。在大豆轮作期间，种植者使用一系列可作用于红稻的除草剂，因此第二年又可以种水稻。种大豆代替水稻，会使美国水稻种植者每年每英亩损失$200-$300，这是一种每年影响到大约250万英亩的潜在损失。美国的另一项损失(据估计每年约$50百万)为磨坊对掺杂有红稻的水稻付价较低所致。美国南部的水稻生产由于红稻所致的全部经济损失据估计每年达$500至$750百万。
水稻生产中，水稻种植者一般使用除草剂敌稗(商品名Stam)或草达灭(商品名禾大壮)控制杂草生长。敌稗没有残余活性。草达灭对鱼有毒。这两种除草剂都不能用于控制红稻。普杀特((±)-2-[4，5-二氢-4-甲基-(1-甲基乙基)-5-氧-1-H-咪唑-2-基]-5-乙基-3-吡啶羧酸)是环境上可接受的草达灭替代物，它有敌稗所缺乏的残余的杂草控制活性，是对红稻非常有效的除草剂。普杀特还对水稻生产中重要的其它杂草(包括稗草)有很好的抑制作用。稗草是水稻生产中的主要杂草，目前常利用敌稗和草达灭来控制。然而已有报道表明稗草正对敌稗产生抗性。
在美国，抗能够控制红稻的除草剂的水稻变体的潜在市场约有5.3百万英亩，美国之外的市场可能更大。世界上水稻生产约有350百万英亩。在美国、巴西、澳大利亚、西班牙以及其它大多数水稻生产国的水稻生产中，红稻是一种严重的草害。如果抑制乙酰羟酸合成酶的除草剂用于商品水稻生产中，那么它们将具有许多目前所用除草剂所没有的优点。潜在的优点包括抗杂草的长时间残余活性、对水稻生产中更主要的杂草(包括红稻)的有效控制和相对的环境可容纳性。
美国专利4,761,373描述了通过将组织培养物暴露于除草剂中培育抗除草剂的突变型玉米。据报道，突变型玉米植株含有一个发生改变的酶(即乙酰羟酸合成酶)，该酶提供了抗一些咪唑啉酮类和磺酰胺类除草剂的抗性。
Lee等，“烟草抗磺酰脲类除草剂的分子基础”欧洲分子生物学(TheEMBO J.,7卷，5期，1241-1248页(1988))描述了规定乙酰乳酸合成酶(也称乙酰羟酸合成酶)的除草剂抗性形式的突变基因的烟草(Nicotianatabacum)的分离和鉴定，以及这些基因往烟草敏感品系中的重新导入。
Saxena等，“曼陀罗(Datura innoxia)的除草剂抗性”，(植物生理，86卷，863-867页(1988))描述了几个抗磺酰脲类除草剂的曼陀罗品系，还发现其中的一些对咪唑啉酮类除草剂有交叉抗性。
Mazur等，“编码乙酰乳酸合成酶一两类除草剂靶酶的植物基因的分离与鉴定”，(植物生理，85卷：1110-1117页(1987))讨论了不同种的乙酰乳酸合成酶的同源程度的调查结果。
也参考共同转让的美国专利申请系列号07/657,429(1991年2月19日申请)，该申请公开了具有基因工程的咪唑啉酮抗性的转化的植株，该抗性通过从如突变型拟南芥的植物克隆的基因来获得。也可参考有关文献：Sathasivan等，“抗咪唑啉酮的拟南芥哥伦比亚变种中突变型乙酰乳酸合成酶基因的核苷酸序列”(核酸研究，18卷，8期，2188页(1990))。
在下列文献中也公开了在除稻外的其它植物中的除草剂抗性的AHAS酶的例子：美国专利5,013,659；K.Newhouse等，“玉米(zea maysL.)的突变提供抗咪唑啉酮类除草剂的抗性”，应用遗传学理论(Theor.Appl.Genet.)，83卷，65-70页(1991)；K.Sathasivan等，“拟南芥哥伦比亚变种抗咪唑啉酮类除草剂的分子基础”，植物生理，97卷，1044-1050页(1991)；B.Miki等，“利用拟南芥乙酰羟酸合成酶基因的Brassicanapus canola栽培品种的转化及除草剂抗性的分析”，应用遗传学理论，80卷，449-458页(1990)；P.Wiersma等“Brassica napus乙酰乳酸合成酶基因的分离、表达和系统发育的遗传特征”，分子基因遗传学(Mol.Gen.Genet.),219卷，413-420页(1989)；和J.Odell等，“转基因植物中野生型和除草剂抗性的乙酰乳酸合成酶基因的增强表达的比较以及对该酶活性的转录后限制的表示”，植物生理，94卷，1647-1654页(1990)。
S.Sebastian等，“具有磺酰脲类除草剂的增强抗性的大豆突变株”(作物科学，27卷，948-952(1987))公开了通过除改变形式的AHAS酶之外的其它机制来抗磺酰脲类除草剂的大豆突变株。
K.Shimamoto等，“由转化的原生质体再生得到的能育转基因水稻株”(自然，338卷，274-276页(1989))公开了一种基因转化方法，在该方法中，利用原生质体的电穿孔法来转化编码β-葡糖醛酸酶的基因到水稻中。
T.Terakawa等，“通过体外筛选获得抗除草剂苄嘧黄隆(BSM)的水稻突变株”(日本育种杂志(Japan.J.Breed),42卷，267-275页(1992))公开了一种抗磺酰脲类除草剂的水稻突变株，该突变株通过对愈伤组织培养物施加选择压力来得到。该抗性是由于突变的AHAS酶所致。
以下是从事抗除草剂水稻品种研究的本发明人(或本发明人和其他作者)所发表的文献。这些文献是：T.Croughan等，“通过生物技术的水稻和小麦改良”，每年研究报告第84期，水稻研究站，1992,100-103页(1993)；T.Croughan等，“通过生物技术的水稻和小麦改良”，每年研究报告第85期，水稻研究站，1993,116-156页(1994)；T.Croughan，“组织培养技术在抗除草剂水稻培育中的应用”，路易斯安那农业，37卷，3期，25-26页(1994)；以及T.Croughan等，“通过生物技术的水稻改良”，每年研究报告第86期，水稻研究站，1994,461-482页(1995年9月)。(注意，水稻研究站的每年研究报告于历年之后出版，报告上一年的活动。如每年研究报告第84期，水稻研究站，1992，于1993年发表，总结1992所进行的研究。)
以下是有关抗除草剂水稻的两项共同转让的美国专利申请(也由本发明人所申请)：系列号08/345,213，申请于1994年月11月28日，现为美国专利5,545,822；系列号08/628,031，申请于1996年4月4月。
发明的公开
在本发明中，已在水稻植株中形成和表达了一种新的除草剂抗性。认为该水稻新品种是同时具有在出苗前和出苗后有效地抗红稻的除草剂抗性的开始。该新品种显示出或者可望显示出对以下除草剂的抗性：普杀特、灭草喹、烟嘧黄隆、氟嘧黄隆、嘧黄隆、灭草烟、imazameth、imazanox。也可望该水稻新品种对这些除草剂的衍生物有抗性，以及对其它正常抑制乙酰羟酸合成酶(AHAS)的除草剂的至少一些有抗性，尤其是对咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂有抗性。已知上述每种除草剂的除草活性是由于它们对乙酰羟酸合成酶(AHAS)的影响所致。该酶催化亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等氨基酸合成过程中的第一个步骤。AHAS酶的抑制对植物来说通常是致命的。
该发明中的水稻植株有两种独立的抗正常抑制AHAS的除草剂的机制。出人意料地发现：两种抗除草剂机制在一种植物中是协同作用的，即两种抗性机制都存在的植株的除草剂抗性远大于两种类型的简单组合所形成的抗性。
两种抗性机制之中，第一种是代谢性途径，该途径还不十分清楚，但它本身并没有包含突变的AHAS酶。第一种抗性机制使甚至具有野生型、无抗性AHAS酶的植株也具有除草剂抗性。第二种抗性机制是一个突变的AHAS酶，该酶在体内和体外试验中都显示出对正常抑制上述酶的除草剂水平的直接抗性。
结合两种抗性机制的协同作用是很显著的。喷洒相当于每英亩0.063磅活性成分普杀特(控制杂草所需的推荐用量)的除草剂时，将彻底杀死阳性对照(无抗性的水稻植株)。相反，处理后36天，甚至施以5倍水平的普杀特(每英亩0.313磅活性成分)时，同时具有两种抗性机制的植株都无可见的受害症状。处理后36天，杂交种在0-10的标尺上的等级为10，其中“0”表示死亡植株，“10”表示无可见受害症状(等同于不施除草剂的阴性对照植株)。相比之下，在同样的处理水平下(0.313磅活性成分/英亩)，只具有两种抗性机制之一的植株在处理后第36天表现出严重受害症状。只有第一种抗性机制的植株在同样的10点标尺上，有约0.6的等级。只有第二种抗性机制的植株有约4.0的等级。完全出人意外的是：在只有一种抗性机制的植株受到严重伤害的条件下，具有两种抗性机制的植株根本不表现出受除草剂伤害症状。
除了控制红稻外，许多抑制AHAS的除草剂还有效地抑制稻田中常见的其它杂草。这些除草剂有的有残余活性，因此一次施用既可抑制现有的杂草，也可抑制以后长出的杂草，这一点对于水稻生产来说是至关重要的。目前用于水稻的除草剂都没有抗包括红稻在内的广谱杂草的残余活性。一旦具有控制红稻和其它杂草的有效残余活性，那么水稻生产者就有了一个比目前所用的更优越的杂草控制系统。
在水稻生产中，水的作用之一是控制杂草，即稻田里的一层死水抑制杂草的生长。一旦有具有后效控制杂草特性的除草剂，生产者在水的管理上就会有更大的灵活性。现在稻田的淹水时间可以推迟，其反过来又有助于控制水稻象鼻虫(水稻的主要害虫)。此外，或二者可能是相协调的，通过推迟淹水时间直到有足够的雨水灌田而无需生产者支出任何花费，可减少抽排费用。
实施本发明的方式
抗性机制Ⅰ
相协同的第一种抗性机制是以代谢为基础的抗性，该机制还不十分清楚，但其作用不依赖于AHAS酶。这种除草剂抗性机制是由ATCC登记号为75295的水稻株所表达的除草剂抗性机制。
具有第一种抗性机制的水稻株是通过花药培养获得的。花药培养是能在克隆中引起遗传变异的一项技术。细胞在培养物中时并不暴露于除草剂。相反，在大田条件下使从培养物中长出的子代暴露于除草剂。虽然，在细胞水平上筛选除草剂抗性有一种优势，即可获得更多的个体基因组，但是正如本文中所做的，在大田中进行初检验也有其优势。尤其是，生长于培养物中的植物细胞表现出的特征和种植于大田条件下的整株植物的特征之间并不总是一致的。
通过在回交株(该回交株通过用“Mercury”水稻品种的花粉给“Lemont”品种的水稻植株授粉来得到)的F2子代上进行花药培养获得该抗性品系，而后利用该杂交种的花粉给“Mercury”品种的植株授粉而得到一个回交株。所获得的回交株描述为Mercury//Lemont/Mercury。将从由该回交株产生的植株上收集的花药平铺在愈伤组织诱导培养基上，并将获得的愈伤组织转移到植株再生培养基上。所用过程基本上如Croughan和Chu(“水稻(Oryza sativa L.)：愈伤组织培养物的形成和植株的再生”，Bajaj(编辑)，农业和林业生物技术，19-37页(1991年))所述的一样。产生几株再生植株并使之在温室中生长至成熟，以结出种子。将子代种子播在大田里，用园艺上用的牵引式喷雾器喷洒除草剂。
将由此花药培养过程获得的一组子代(4,193行)播种于大田里，并在幼苗发育的四叶期每英亩喷洒4英两Pursuit(每英亩1.00英两活性成分普杀特)。除一行外的其余所有行都受伤或死亡。但有一行未显示出明显的症状。第一次处理后四周，从试验点移去具有抗性的行的部分作为预防，然后在整个试验点喷洒以8英两/英亩的Pursuit(每英亩2.00英两活性成分普杀特)。这种处理使所有第一次喷洒处理中存活(但处于受伤状态)的行株死亡，但是在抗性品系中仍未诱导出明显症状。
为了获得最高的种子产量，将抗性行中的个体植株以大的间隔分开并移植。所有的植株都表现为可育。抗性植株成熟时，收集得到大约7磅的可育种子。
这些植株对几种其它AHAS抑制性除草剂的抗性也进行了试验。在9英尺长的小田块中，每块种植7行水稻。该试验包括九种对照水稻品种，以及ATCC75295水稻品系。用带有遮护罩的喷雾器喷洒除草剂，每块田中喷洒6行。所用的四种除草剂为Pursuit(普杀特：(±)-2-[4,5-二氢-4-甲基-(1-甲基乙基)-5-氧-1H-咪唑-2-基]-5-乙基-3-吡啶羧酸)、Scepter(灭草喹：2-[4,5-二氢-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧-1H-咪唑-2-基]-3-喹啉羧酸)、Accent(烟嘧黄隆：2-(((((4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)氨基碳酰))氨基磺酰))-N,N-二甲基-3-吡啶甲酰胺)和Beacon(氟嘧黄隆：3-[4,6-(二氟甲氧基)-嘧啶-2-基]-1-(2-甲氧碳酰苯磺酰)脲)。当水稻处于成熟的三叶期时，每种除草剂喷洒两块重复田。每个对照品种和抗性品系的两块田，左边都不喷洒而作为对照。进行Accent处理时，每英亩使用0.67英两药品(0.50英两活性成分)，其中含有0.25％的非离子型表面活性剂。进行Pursuit处理时，每英亩使用4英两药品(1.00英两活性成分)，其中含有0.25％的非离子型表面活性剂。进行Scepter处理时，每英亩施1品拖药品(3英两活性成分)，其中含有0.25％的非离子型表面活性剂。进行Beacon处理时，每英亩使用0.76英两药品(0.57英两活性成分)，其中含有0.25％的非离子型表面活性剂。对照田里的所有植株都显示出由于除草剂处理而致的严重伤害或彻底死亡。而除草剂抗性品系对Accent表现出极好的抗性，对Scepter和Pursuit表现出良好的抗性。对Beacon的抗性差一些，但还是大于对照水稻品种的抗性。利用与上述同样施用量的Accent、Scepter和Pursuit，在发育的5叶期(即比上述试验多生长15天的植株)用同样的水稻品种和ATCC75295品系进行同样的试验。对照田里的植株还是由于除草剂处理而严重受伤或彻底死亡。ATCC75295品系仍对Accent表现出极好的抗性，对Scepter和Pursuit表现出良好的抗性。在以后的试验中，该品系还对Arsenal(灭草烟)和Cadre(imazameth)表现出抗性。只有出苗后施用除草剂，ATCC75295品系才会有抗性。
ATCC75295水稻品系所表达的AHAS酶的分析表明，第一种抗性机制不依赖于AHAS酶起作用；并且表明，即使在AHAS酶本身对除草剂敏感并不被超表达的情况下，该机制也有保护作用。
ATCC75295水稻品系的AHAS酶的除草剂抗性和“Lemont”和“Mercury”(该水稻品系的两个祖代的品种)的AHAS酶抗性作了比较。用于检测乙酰羟酸合成酶活性的方法基本上如B.K.Singh等(“乙酰羟酸合成酶分析”，分析生物化学，171卷，173-179页(1988))所描述的一样，不同之处如下：在Singh的“材料和方法”第一段中，所用的不是玉米的悬浮培养细胞，而是在温室中生长的处于发育的4叶期的水稻幼苗的茎组织。对于三个栽培品种，去除叶片后，按同样的方法提取40.0克(鲜重)组织。按照第一作者B.K.Singh的建议(私人通信)，删除“材料和方法”下的Singh第一栏底部所提到的脱盐步骤。用于AHAS分析的“标准反应混合物”中含有如下表1所示浓度的除草剂Pursuit(普杀特)。在酶分析过程中，以直接的3-羟基-2-丁酮形式作为对照。每次处理重复两次。
如表1(酶活性以占对照的百分数表示)所示，Lemont的AHAS酶对普杀特显示出最强的抗性，Mercury次之，ATCC75295水稻品系的AHAS对普杀特处理最敏感，至少在施以最高浓度的所测除草剂时是这样的。无除草剂时，520nm处的比色法吸光度表明Lemont和保藏的水稻品系有大致相同的未受抑制的AHAS活性，而Mercury有稍小的活性(该数据没有列出)。该发现表明：ATCC75295品系的抗性不是由于AHAS酶的表达的高水平所致，而是由于一些其它因素所致。这种其它因素目前还不清楚，人们认为它可能涉及一个不依赖于AHAS的除草剂代谢途径。
表1
咪草烟对正常水稻(品种Lemont和Mercury)和ATCC 75295水稻品系的酶提取物中的AHAS活性的影响。酶活性用占对照的百分比表示。 咪草烟浓度 [μM] 品种Lemont Mercury ATCC75295 0 100a 100a 100a 0.1 102a 100a 102a 1 102a 89b 89b 10 87b 64d 64d 100 81c 62d 48c
表1中带有同一个字母的值之间没有明显差异(P＜0.05)(DMRT)
具有第一种抗性机制的水稻种子样品于1992年8月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD20852)，并指定ATCC登记号为75295。这次保藏是按照ATCC和本专利申请的受让人(路易斯安那州大学和农业机械学院的管理部门)之间的合同进行的。该合同要求ATCC：在描述和鉴定保藏物的美国专利颁布后或者在任何美国或外国专利申请公布或向公众公开后，向公众提供这些种子及其子代的永远的、无限制的使用权，以及向由在适当法令和法规准许下授权的美国专利与商标委员会决定的个人提供这些种子的使用权。本申请的受让人已经同意：如果保藏的种子死亡或丢失，或者在合适条件下栽培时损坏，那么在接到通知后，会立即换以同样种子的活样本。
抗性机制2
第二种抗性机制是由于有除草剂抗性的AHAS酶引起的。优选的有抗性的AHAS酶是由ATCC登记号97523的水稻株表达的AHAS酶。表达这种突变酶的水稻株在温室和大田试验中都显示出具有所需的除草剂抗性特征。
第二种抗性机制通过在10个水稻品种之每一个的种子中诱发突变而获得。通过暴露于γ-射线或化学诱变剂甲磺酸乙酯(EMS)中来诱导突变。每个品种的10磅种子在播种前接受钴-60源(在路易斯安那，BatonRouge，路易斯安那州大学的核科学中心)的25,000拉德的γ照射。每个品种的另外10磅种子分成三等分，每一份在播种前在0.1％、0.5％或1％的EMS中浸泡16小时。从接受这些诱变处理的种子长出的植株上收获几百磅种子。
第二年春天将收获的种子条播在总种植面积为大约三英亩的大田中。在幼苗发育阶段的3-4叶期，喷洒除草剂以筛选具有除草剂抗性的突变株。每个品种的半数幼苗喷洒2X烟嘧黄隆，半数幼苗喷洒2X普杀特，在这两种情况下都利用牵引式喷雾器。烟嘧黄隆以每英亩0.063 lb活性成分(a.i.)的比例施用，普杀特以每英亩0.125lb活性成分的比例施用。在每种喷洒溶液中加入非离子型表面活性剂(0.25％)。以这种方式喷洒大约三千五百万株幼苗。大约四星期后，鉴定存活的单株。存活的植株位于已喷洒普杀特的条带中，并且来源于“亲本”水稻品种“AS3510”(通过暴露于0.5％EMS而处理过的)。在除草剂处理的伤害症状已出现时，在该植株上没有发现有伤害症状，而其它植株受到了严重伤害或死亡。将该植株转移至温室中以便种子增加和作进一步检验。
而后在温室和大田中进行的检验表明，该水稻植株的子代具有抗几种抑制AHAS的除草剂的抗性，这些除草剂至少包括：普杀特、烟嘧黄隆、灭草喹、imazameth、灭草烟以及imazamox。(imazamox由美国Cyanamid以Captor商品名出售，并且有作为活性成分的(+)-5-甲氧基甲基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)烟酸。imazameth由美国Cyanamid以Cadre商品名出售，并且有作为活性成分的(±)-2-[4,5-二氢-4-甲基-4-(1-甲基-乙基)-5-氧代-1H-咪唑-2-基]-5-甲基-3-吡啶羧酸；或者化学名(±)-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-甲基烟酸)。灭草烟由美国Cyanamid以Arsenal商品名出售，并且有作为活性成分的2-[4,5-二氢-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧代-1H-咪唑-2-基]-3-吡啶羧酸)。该品系有抗除草剂(在出苗之前或之后施用)的抗性。AHAS酶分析表明，与第一种除草剂的抗性机制的情况不一样，该水稻品系具有决定着抑制AHAS的除草剂抗性的突变AHAS酶。
具有优选的第二种抗性机制的水稻种子的样品于1996年4月25日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852)，并指定ATCC登记号为97523。这次保藏是按照ATCC和本专利申请的受让人(路易斯安那州大学和农业机械学院的管理部门)之间的合同进行的。该合同要求ATCC：在描述和鉴定保藏物的美国专利颁布后或者在任何美国或外国专利申请公布或向公众公开后，向公众提供这些种子及其子代的永远的、无限制的使用权，以及向由在适当法令和法规准许下授权的美国专利与商标委员会决定的个人提供这些种子的使用权。本申请的受让人已经同意：如果保存的种子死亡或丢失，或者在合适条件下栽培时损坏，那么在接到通知后，会立即换以同样种子的活样本。
虽然如以下部分所讨论的两种抗性机制的协同作用是优选的，但是即使单独作用，这第二种抗性机制也优越于以前所了解的在水稻中的除草剂抗性机制，因此它可在商品稻种中用作为除草剂抗性的唯一机制。
协同作用的组合
通过交叉授粉产生水稻品系ATCC 97523和ATCC 75295的杂交种。温室试验显示出对除草剂抗性的协同效应。杂交种的抗性本质上高于单个抗性水平的简单组合所希望获得的抗性。
在温室试验中，在盆中播种在两种品系之间杂交得到的F3代种子。每个盆中都播以来自同一植株的同一圆锥花序的种子，因此每盆的完整行是等同的。以这种方法共播了140盆，同时还有40盆不同的无抗性基因型作为对照。播种后2周，2叶期时施以咪草烟，用量为0.063磅活性成分(a.i.)/英亩、0.125磅a.i./英亩、0.313磅a.i./英亩。
由于供试材料为基因仍在分离的F3群体，因此不同的植株具有不同程度的抗性。在本专利申请提交时，没有足够的时间培育在两种抗性机制上表现纯合的水稻品系。培育这种表现纯合的品系对于本领域的普通技术人员来说是常规的，但需要额外的时间。
有些F3株没有获得抗性基因，并且如对照品种一样敏感，在所有的处理中都100％死亡。谱系的另一个极端是获得两种抗性机制并对所有测试水平的除草剂(包括0.313 lb.a.i./英亩的最高浓度处理)都显示出耐受力的植株。这些植株的抗性本质上大于任一亲本植株的抗性，也本质上大于两种抗性水平的简单组合所希望形成的抗性。
结合两种抗性机制的协同作用是很显著的。喷洒相当于每英亩0.063磅活性成分普杀特的除草剂时，将彻底杀死阳性对照(无抗性的水稻植株)。相反，处理后36天，甚至施以最高水平的普杀特(每英亩0.313 lb活性成分)时，具有两种抗性机制的植株都无可见的受害症状。处理后36天，这些杂交种在0-10的标尺上的等级为10，其中“0”表示死亡植株，“10”表示无可见受害症状(等同于不施除草剂的阴性对照植株)。相比之下，在同样的处理水平(0.313 lb a.i./英亩)下，只具有两种抗性机制之一的植株在处理后第36天表现出严重受害症状。只有第一种抗性机制的植株在同样的10点标尺上，有约0.6的等级。只有第二种抗性机制的植株有约4.0的等级(参见下表2的最右列)。完全出人意外的是：在只有一种抗性机制的植株受到严重伤害的条件下，具有两种抗性机制的植株根本不表现出受除草剂伤害症状。
表2总结了处于发育的2-3叶期的水稻在喷洒除草剂后第36天的等级测定结果。
表2
在10等级标尺上，在用不同水平的普杀特处理之后第36天的水稻植株的活力等级水稻品系 普杀特浓度0(对照)0.063 lb活性成分/英亩0.125 lb活性成分/英亩0.313 lb活性成分/英亩无抗性的对照*100.33±0.180.12±0.060.15±0.15ATCC 75295100.61±0.030.81±0.450.55±0.55ATCC 97523109.01±0.595.71±0.934.00±0.32ATCC 75295和 ATCC97523的抗性F3杂交种10101010
*注：列在表1中任一非零水平的普杀特处理都使所有无抗性对照致死。普杀特是一种慢性除草剂，当处理后第36天确定上述等级时，还会有少量无抗性对照植株处于垂死状态，随后死亡。
还发现抗性F3株能更快地从除草剂施用中恢复过来，并更快地继续生长。抗性F3株大约在施用除草剂1周内就开始恢复可见的生长，而ATCC 97523株大约需要2周，ATCC 75295株要恢复可见的生长大约需要3周。
两个亲本品系及F3杂交种的大田试验证实了温室里的研究结果。每块含1000行的田中播以数千完整行。点播对照品种，包括两个亲本品种ATCC 97523和TACC 75295以及几个无抗性栽培品种。在不同发育阶段以不同强度喷洒不同的抑制AHAS的除草剂于田块中。
一旦鉴定出对两种抗性机制都表现纯合的子代，那么就用这些子代来培育商品稻种。使纯合抗性水稻与用常规方法培育的栽培品种杂交，这将产生具有高产和其它所需商业特性的除草剂抗性水稻品种和杂交种。
在协同作用的组合中，编码除草剂抗性AHAS酶的其它基因也可用于代替水稻品系ATCC 97523的优选的具抗性的AHAS酶。这些基因之任一都可通过本领域所熟知的植株基因转化方法转化到水稻株中。本领域已知数个这样的基因，包括那些例如在以下文献中公开的基因：美国专利4,761,373；Lee等，“番茄中的磺酰脲类除草剂抗性的分子基础”，TheEMBO J.,7卷，5期，1241-1248页(1988)；Saxena等，“曼陀罗(Datura innoxia)的除草剂抗性”，植物生理，86卷，863-867页(1988)；美国专利申请系列号07/657,429；Sathasivan等“抗咪唑啉酮的拟南芥哥伦比亚变种中的突变乙酰乳酸合成酶基因的核酸序列”，核酸研究，18卷，8期，2188页(1990)；美国专利5,013,659；K.Newhouse等“玉米(Zea mgys L.)中的突变产生对咪唑啉酮类除草剂的抗性”，应用遗传学理论，83卷，65-70页(1991)；K.Sathasivan等，“拟南芥哥伦比亚变种中的咪唑啉酮类除草剂抗性的分子基础”，植物生理，97卷，1044-1050页(199l)；B.Miki等，“利用拟南芥乙酰羟酸合成酶基因的Brassicanapus canola栽培品种的转化以及除草剂抗性分析”，应用遗传学理论，80卷，449-458页(1990)；P.Wiersma等，“Brassica napus的乙酰乳酸合成酶的分离、表达和系统发育的遗传特征”，分子基因遗传学，219卷，413-420页(1989)；J.Odell等，“转基因植物中的野生型和除草剂抗性乙酰乳酸合成酶基因的增强表达的比较，以及对该酶活性的转录后限制的表示”，植物生理，94卷，1647-1654页(1990)；T.Terakawa等，“通过体外筛选获得的抗除草剂Bensulfuron Methyl(BSM)的水稻突变株”，日本育种杂志，42卷，267-275页(1992)。
混杂的
由于红稻和商品稻属于同一个种，因此除草剂抗性商品稻作物的种植有将除草剂抗性传递给红稻的一定危险性。然而，稻是自花传粉的，异型杂交的频度很低，即使在两个同时开花的直接相邻的植株间也是如此。通过培育开花远早于红稻的抗性品种可大大降低向红稻传递抗性的可能性(如用传统育种的方法或进一步的花药培养方法)。幸运的是，亲本品系ATCC 97523成熟非常早；事实上，在红稻开花之前就可收获它的种子。保持来自杂交水稻品系的这种早熟表型，可降低与红稻异型杂交的可能性至所需程度。
如果红稻植株没有形成与抗性商品稻一样的除草剂抗性，那么该植株就总能用广谱的其它有用除草剂处理，尤其是如果抗性红稻在有机会繁殖之前就被提早发现。
因为普杀特、imazquin、烟嘧黄隆、氟嘧黄隆、imazameth、imazamox和灭草烟等都抑制乙酰羟酸合成酶的活性，并且ATCC75295、ATCC 97523或它们新的除草剂抗性杂交种都显示出抗这些除草剂的抗性，因此希望上述新的除草剂抗性水稻显示抗正常抑制该酶的其它除草剂的抗性。除以上所讨论的除草剂外，这样的除草剂至少还包括以下除草剂：嘧黄隆(商品名Oust，化学名2-[[[[(4,6-二甲基-2-嘧啶基)氨基]碳酰]氨基]磺酰]苯甲酸甲酯)；甲黄隆(商品名Ally，化学名2-[[[[(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]碳酰]氨基]磺酰]苯甲酸甲酯)；thifensulfuron methyl和阔叶净的混合物(商品名Harmony Extra，甲基-3-[[[[(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]碳酰]氨基]磺酰]-2-噻吩羧酸酯和甲基-2[[[[(N-4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)甲氨基]碳酰]氨基]磺酰]苯甲酸酯的混合物)；thifensulfuron methyl(商品名Pinnacle，化学名甲基-3-[[[[(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]碳酰]氨基]磺酰]-2-噻吩羧酸酯)；氯黄隆(商品名Glean或Telar，化学名2-氯-N-[(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基碳酰]苯磺酰胺)；氯嘧黄隆(商品名Classic，化学名2-[[[[(4-氯-6-甲氧嘧啶-2yl)氨基]碳酰]氨基]磺酰苯甲酸乙酯]；阔叶净(商品名Express，化学名2-[[[[N-(4-甲氧基-6-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)甲氨基]碳酰]氨基]磺酰苯甲酸甲酯]；咪草酯(商品名Assert，化学名间甲苯甲酸，6-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-，甲酯；以及对甲苯甲酸，2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-，甲酯)；和醚苯黄隆(商品名Amber，化学名3-(6-甲氧基-4-甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-1-[2-(2-氯乙氧基)-苯基磺酰]-脲。
从在提交本申请前所进行的试验中得到的初试结果表明：新的水稻株显示出抗下列除草剂的至少部分抗性：Oust、Ally、Pinnacle、Glean、Express和Amber。
除非文中明确指出，正如在下面权利说明书中使用的一样，术语“水稻株”旨在包括发育期任何生长阶段的水稻株，以及包括取自或得自任一这样植株的任何细胞、组织或器官(包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单个细胞、配子、花药培养物、组织培养物或原生质体)。
本说明书中所引用的所有文献的全部公开内容与本文一并参考。然而，如有它不可协调的矛盾发生，那么以本说明书为准。