1，6-二磷酸果糖镁盐的制备方法 本发明涉及1，6-二磷酸果糖镁盐的制备方法。
早在1909年，Harden和Young(Harden A，Young W.Proc Roy Soc，1908，80：20)就首先分离出1，6-二磷酸果糖(FDP)，其1，6-二磷酸果糖钠盐已广泛用作治疗许多病理疾病的药物，如心血管疾病、代谢性疾病等(Markov AK，Ann EmeryMed，1986，15：147；Webb WR，J Thorac Cardiovasc Surg，1984，88：863；Sernov LN，Circ Shock，1983，1：262)。但是由于大剂量的1，6-二磷酸果糖钠盐(一次人体注射剂量为5-10g)才能对以上疾病起治疗或辅助治疗效果，而用如此大剂量的1，6-二磷酸果糖钠盐，钠离子含量高达0.85-1.7g，影响Na+、K+-ATP酶活性，会发生Na+外流和K+内流明显受阻的现象，从而影响药效；另外，由于FDP钠盐在体内代谢时产生大量的无机磷，使高磷血病人中毒。因此，许多科学家都努力改善这种状况，Lauro Galxigna(USP4，916，220)用棕榈酸与1，6-二磷酸果糖反应，合成棕榈酰-1，6-二磷酸果糖(DPF)，结果发现DPF对膜的亲和性比FDP高30％，而且ED50也从FDP的0.1mM下降到0.04mM。
我们的研究发现1，6-二磷酸果糖镁盐对大鼠心肌缺血和大狗心肌梗塞的有效剂量分别为20mg/kg体重和30mg/kg体重，远远小于1，6-二磷酸果糖对大鼠心肌缺血的1000mg/kg体重。
本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种1，6-二磷酸果糖镁盐的制备方法。
本发明的目的可以通过以下措施来达到：
1.FDP的其它金属盐如FDP钠盐、钙盐或钡盐为原料，用阳离子交换树脂吸附金属离子如钠离子、钙离子或钡离子，使FDP的金属盐成为游离的酸，加入适量的镁离子，经真空浓缩，脱色，加2-8倍酒精0-30℃搅拌结晶或冻干而成。上述方法的生产步骤中FDP的金属盐浓度为1-30％，加入过量的阳离子交换树脂如732、HK-3，加入的镁离子可以是Mg(OH)2、MgO、MgAc中的一种或它们的混合物。加入地镁离子的量是FDP摩尔量的1∶1、1∶1.5、1∶2，可分别制得C6H12O12P2Mg、C6H11O12P2Mg1.5.5H2O、C6H10O12P2Mg2.5H2O。使用的溶剂可以是低级醇类如甲醇和乙醇等，也可以是丙酮，加入的量是FDP镁盐溶液的2-8倍，结晶温度是0-35℃。也可将FDP镁盐溶液直接冷冻干燥。
2.以磷酸盐和葡萄糖为原料，用啤酒酵母发酵，经阴离子交换树脂吸附、洗杂、洗脱、纳滤、加镁、浓缩、脱色、结晶或冻干而成。上述方法的生产过程中，发酵混悬液的组分比例如下：葡萄糖0.5-0.7mol/l，磷酸二氢钠0.25-0.35mol/l，磷酸氢二钠0.25-0.35mol/l，氯化镁0.01-0.1mol/l，甲苯3-6％，酵母5-15％，在37±2℃搅拌反应3-5小时，用盐酸灭酶或在80-100℃加热灭酶，过滤，滤液用蒸馏水稀释1-5倍，上阴离子离交树脂如717、HD-30等，用0.01-0.05N盐酸洗杂，用0.5-1.0N盐酸洗脱，用截留分子量为200的纳滤膜过滤，收集大分子溶液。在收集的FDP溶液中加入的镁离子可以是Mg(OH)2、MgO、MgAc中的一种或它们的混合物。加入的镁离子的量是FDP摩尔量的1∶1、1∶1 5、1∶2，可分别制得C6H12O12P2Mg、C6H11O12P2Mg1.5.5H2O、C6H10O12P2Mg2.5H2O。使用的溶剂可以是低级醇类如甲醇和乙醇等，也可以是丙酮，加入的量是FDP镁盐溶液的2-8倍，结晶温度是0-35℃。也可将FDP镁盐溶液直接冷冻干燥。
本发明法所制备的化合物可作用于细胞膜，通过刺激磷酸果糖激酶(PFK)的活性，剧增细胞内高能磷酸池，细胞内ATP浓度，促进钾离子内流，回复细胞极化状态，从而有益于休克、缺氧、缺血、损伤、体外循环、输血等状态下的细胞能量代谢及对葡萄糖的利用，以促进修复、改善功能，对心肌缺血、心肌梗塞、休克等有明显效果，因此，可用于人和动物的疾病。此外，本发明法制备的化合物能在应激状态下，促进脂肪分解，所形成的游离脂肪酸可与Mg2+螯合形成不易解离的盐类，因此可用于烧伤感染、低温创伤和外科手术甚至酒精中毒的治疗和辅助治疗。
本发明法所制备的化合物还具有抑制血小板聚集、阻止血栓形成、降低血中三酰甘油和低密度脂蛋白、防止动脉硬化的作用；同时也有抑制血管痉挛、防止高血压和心肌坏死的作用，因此本发明法所制备的化合物也能应用于以上疾病的治疗或由于以上病理引起的疾病的治疗。另外，本发明法所制备的化合物能对糖代谢、脑代谢等产生积极影响，因此，本发明法所制备的化合物还能用于糖代谢、脑代谢紊乱引起的疾病如糖尿病、改善记忆等疾病的治疗和辅助治疗。
本发明还涉及药用制剂，它除了含有惰性无毒的药用添加剂和赋形剂外，还含有本发明法所制备的化合物。此外，本发明还涉及制备所述制剂的方法。在所述制剂中本发明法所制备的化合物的量占混合物重量的0.1-100％。
除上述之外，药用制剂还可以含有其它药用有效成分可以按照已有的方法，用一般的方式，例如用添加剂或赋形剂制备上述药用制剂。
现已证明按以下剂量给药是有益的，每天给本发明法所制备的化合物总量为1-100mg/kg体重，总量以2-30mg/kg体重任意地多次独立剂量的形式给药较好。但是如果需要，改变上述剂量也是有益的，尤其需要根据病体的类型和体重、对于药物的个体反应、疾病的类型和严重程度、制剂和应用的形式以及给药及时程度和间隔的时间等因素来决定。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1.利用本发明可以制得不同摩尔比例的FDP镁盐，如C6H12O12P2Mg，C6H11O12P2Mg1.5.5H2O，C6H10O12P2Mg2.5H2O。
2.利用本发明可以制得含结晶水的FDP镁盐，此化合物与不含结晶水的FDP镁盐相比在空气中不易吸水，因此具有更好的稳定性。
3.利用本发明制得的冻干粉可在医药上用作冻干粉针剂，利用本发明制得的含结晶水的化合物既可用作粉针剂，也可用作其它制剂。
图1FDP镁盐的核磁共振谱图。
图2是FDP镁盐的红外光谱图。
以下实施例将对本发明作进一步说明，但对本发明没有限制。
实例1
将300gFDPNa3.8H2O溶解于1l水中，加入4kg732树脂在25℃搅拌2小时，抽滤，收集滤液0.9l，FDPH4的浓度165g/l，加入25.5g氢氧化镁和46.86g醋酸镁4H2O，搅拌反应4小时，真空浓缩，用0.5％的药用活性炭脱色，加入2倍酒精充分搅拌15分钟，倒去上清液，用200ml蒸馏水溶解，在3倍酒精中结晶，抽滤，真空干燥的镁盐164.5g，纯度98.5％，收率为理论值的65％。产品的分析结果：C6H11O12P2Mg1.5.5H2O分子量4641.含量测定
检测项目 测定值(％)
FDPH4 70.4
Mg 7.9
H2O 20.52.产品的核磁共振谱
FDP镁盐的核磁共振谱见图1。核磁共振谱中有12个峰，对应于FDP分子结构中的碳，说明FDP镁盐分子存在两种结构即α型和β型，其位移与碳原子位置的对应见表1。图谱中吸收峰的归属与FDP镁盐的理论结构相一致。
表1 13C-NMR的测定的化学位移与碳原子位置的关系 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 α 68.4 107.0 84.3 82.0 83.6 60.1 β 67.7 103.5 78.5 76.8 78.6 67.0
实例2
将300gFDPNa3.8H2O溶解于1l水中，加入4kg732树脂在25℃搅拌2小时，抽滤，收集滤液0.9l，FDPH4的浓度165g/l，加入25.5g氢氧化镁和93.7g醋酸镁4H2O，搅拌反应4小时，真空浓缩，用0.5％的药用活性炭脱色，加入2倍酒精充分搅拌15分钟，倒去上清液，用200ml蒸馏水溶解，在3倍酒精中结晶，抽滤，真空于燥的镁盐168.5g，纯度97.7％，收率为理论值的63.4％。产品的分析结果：C6H10O12P2Mg2.5H2O分子量487含量测定
检测项目 测定值(％)
FDPH4 68.2
Mg 9.95
H2O 19.5
实例3
将300gFDPNa3.8H2O溶解于1l水中，加入4kg732树脂在25℃搅拌2小时，抽滤，收集滤液0.9l，FDPH4的浓度165g/l，加入25.5g氢氧化镁，用0.5％的药用活性炭脱色，过滤，真空冷冻干燥得FDP镁盐148.5g，纯度98.5％，收率为理论值的75％。产品的分析结果：C6H12O12P2Mg分子量3633.含量测定
检测项目 测定值(％)
FDPH4 83.8
Mg 6.7
H2O 7.5
实例4
将葡萄糖120g，磷酸二氢钠40g，磷酸氢二钠90g，氯化镁10g，溶解于1升水中，加热至37℃，加入100g啤酒酵母和60ml甲苯，在37℃搅拌3.5小时，用6N盐酸调pH至2.0-2.5中止反应，过滤，滤液用蒸馏水稀释5倍，阴离子交换树脂HD-30吸附，用0.02N盐酸洗至磷酸根含量小于0.05g/l，改用0.5N盐酸洗脱至FDP含量小于1g/l，洗脱液用截留分子量200的钠滤膜过滤，收集大分子溶液，测定滤液中FDP的含量，等摩尔加入Mg(OH)210.2g，待反应完全后，真空浓缩，用1％的药用活性炭脱色，过滤，冻干得白色粉末FDP镁盐61.8g，纯度98.2％，产率为理论值的52.4％。产品的分析结果：1.含量测定
检测项目 测定值(％)
FDPH4 84
Mg 6.7
H2O 7.62.结构测定
FDP镁盐的红外光谱见图2。图谱中各吸收峰的归属如下：a〕、3401cm-1为OH的伸展振动，1186cm-1为醇基C-OH的伸展振动，证明结构中有C-OH基团存在；b〕。2964cm-1和2905cm-1为饱和C-H振动，1459cm-1为-CH2-的弯曲振动，证明结构中有饱和的C-H及C-H2基团存在。c)、1651cm-1为P-O的弯曲振动，1082cm-1为P＝O的伸展振动，证明结构中有P-O和P＝O基团存在；d〕998cm-1和939cm-1为C-O-C的弯曲振动，证明结构中有C-O-C基团存在；e)828cm-1为P-O-C的伸展振动，证明结构中有P-O-C基团存在。由红外光谱分析可知，图中主要吸收峰的结构归属于FDP镁盐的理论相一致。
实例5
将葡萄糖120g，磷酸二氢钠40g，磷酸氢二钠90g，氯化镁10g，溶解于1升水中，加热至37℃，加入100g啤酒酵母和60ml甲苯，在37℃搅拌3.5小时，用6N盐酸调pH至2.0-2.5中止反应，过滤，滤液用蒸馏水稀释5倍，阴离子交换树脂HD-30吸附，用0.02N盐酸洗至磷酸根含量小于0.05g/l，改用0.5N盐酸洗脱至FDP含量小于1g/l，洗脱液用截留分子量200的钠滤膜过滤，收集大分子溶液，测定滤液中FDP的含量，加入10.2g氢氧化镁和18.7g醋酸镁4H2O，搅拌反应4小时，真空浓缩，用0.5％的约用活性炭脱色，加入2倍酒精充分搅拌15分钟，倒去上清液，用200ml蒸馏水溶解，在3倍酒精中结晶，抽滤，真空干燥的镁盐68.8g，纯度98.7％，收率为理论值的49.4％。产品的分析结果：C6H11O12P2Mg1.5.5H2O分子量464含量测定
检测项目 测定值(％)
FDPH4 70.4
Mg 7.8
H2O 20.5
实例6
将葡萄糖120g，磷酸二氢钠40g，磷酸氢二钠90g，氯化镁10g，溶解于1升水中，加热至37℃，加入100g啤酒酵母和60ml甲苯，在37℃搅拌3.5小时，用6N盐酸调pH至2.0-2.5中止反应，过滤，滤液用蒸馏水稀释5倍，阴离子交换树脂HD-30吸附，用0.02N盐酸洗至磷酸根含量小于0.05g/l，改用0.5N盐酸洗脱至FDP含量小于1g/l，洗脱液用截留分子量200的钠滤膜过滤，收集大分子溶液，测定滤液中FDP的含量，加入10.2g氢氧化镁和37.4g醋酸镁4H2O，搅拌反应4小时，真空浓缩，用0.5％的药用活性炭脱色，加入2倍酒精充分搅拌15分钟，倒去上清液，用200ml蒸馏水溶解，在3倍酒精中结晶，抽滤，真空干燥的镁盐75.3g，纯度97.2％，收率为理论值的51.5％。产品的分析结果：C6H10O12P2Mg2.5H2O分子量487含量测定
检测项目 测定值(％)
FDPH4 67.5
Mg 10.2
H2O 19.5
实例7
取实例1所制得的样品20g，采用静脉注射垂体后叶素致大鼠心肌缺血模型，观察1，6-二磷酸果糖镁盐对心肌缺血的改善作用。实验结果表明：20mg/kg体重以上剂量的1，6-二磷酸果糖对静脉注射垂体后叶素致大鼠心肌缺血具有显著的改善作用。
实验方法：取健康大鼠80只，用乙醚将其麻醉后，以II导联方式联二道生理记录仪，测定其体表心电图，取心电图正常鼠60只，随机分成6组，10、20、40mg/kg剂量1，6-二磷酸果糖镁盐、1000mg/kg剂量1，6-二磷酸果糖钠盐、0.1mg/kg剂量的硝酸甘油及空白对照组，每组10只，在记录其正常心电图后，由腿静脉注射1u/kg剂量的垂体后叶素，20s推注完毕，各给药组大鼠在静脉注射垂体后叶素2min后，按剂量及体重由腿静脉注射给药，空白对照组注射等量生理盐水，分别在给药后5、15、30、60min记录各鼠的心电图，观察各鼠给药前后心率、T-波、ST段的变化。实验结果见表2。大鼠在静脉注射1u/kg剂量的垂体后叶素后，立即出现心肌缺血症状，心率减慢、ST-段抬高、T-波高耸或倒置。静脉注射20mg/kg以上剂量的1，6-二磷酸果糖镁盐明显改善以上症状，在给药后15-30min，作用最明显，给药60min后，改善心肌功能的作用减弱。空白对照组大鼠在静脉注射垂体后叶素后30min，出现部分动物死亡。
表2 1，6-二磷酸果糖镁盐对垂体后叶素引起大鼠心肌缺血的影响 组别 剂量 (mg/kg) 给药后时间(min) 心率 (次/min) T-波 (mv) ST段 (mv) FDP镁盐 20 0 198.0±8.4 0.45±0.190.23±0.09 iv垂体后叶素后 112.0±16.4## 0.92±0.24##0.45±0.14# 5 162.0±13.0** 0.54±0.20*0.26±0.04* 15 156.0±15.2** 0.57±0.17*0.22±0.10* 30 148.0±17.9* 0.62±0.220.32±0.17 60 148.0±27.7* 0.60±0.230.28±0.15 FDP镁盐 40 0 200.0±16.7 0.28±0.150.07±0.04 iv垂体后叶素后 131.7±19.4** 0.99±0.36**0.39±0.18## 5 168.3±19.4** 0.46±0.26*0.11±0.05* 15 161.7±16.0** 0.35±0.07**0.16±0.08* 30 154.2±12.0* 0.45±0.18**0.16±0.10* 60 146.7±20.7 0.60±0.23*0.23±0.12 FDP钠盐 1000 0 210.0±10.2 0.30±0.110.12±0.07 iv垂体后叶素后 142.2±14.2## 0.90±0.34**0.50±0.22# 5 183.3±16.4** 0.44±0.22*0.20±0.14* 15 188.2±10.4** 0.47±0.12*0.25±0.12* 30 172.0±18.3* 0.56±0.220.34±0.15 60 162.0±27.9 0.66±0.240.38±0.25 对照组 — 0 204.3±27.6 0.44±0.160.20±0.18 iv垂体后叶素后 122.8±25.0## 0.93±0.37#0.57±0.35# 5 121.4±30.8## 1.04±0.37##0.66±0.21## 15 115.0±42.3## 1.11±0.31##0.48±0.23# 30 126.7±32.7## 1.08±0.38##0.62±0.20## 60 126.0±31.3## 1.28±0.36##0.55±0.24##注：静脉注射垂体后叶素后数值与正常值比较，#P＜0.05，##P＜0.01
给药后数值与静脉注射垂体后叶素后数值比较*P＜0.05，**P＜0.01
实例8
取实例1所制得的样品20g，采用结扎冠状动脉致家犬心肌缺血梗塞模型，观察1，6-二磷酸果糖镁盐对心肌梗塞的治疗作用。实验结果表明：30mg/kg体重以上剂量的1，6-二磷酸果糖镁盐对结扎冠状动脉致家犬心肌缺血梗塞模型具有改善作用，能提高左室内压(LVP)，降低左室舒张末期压(LVEDP)，增大心输出量(CO)，改善缺血心肌的心电图。
实验方法：取健康杂种犬10只，静脉注射30mg/kg戊巴比妥钠麻醉，麻醉后测其体表心电图，取心电图正常犬6只，，每组6只，以30mg/kg体重剂量注射1，6-二磷酸果糖镁盐。家犬颈动脉插管接压力换能器，在八道生理记录仪上记录血压，以II导联方式记录心电图，气管插管进行人工呼吸后，行开胸术，暴露家犬心脏，于心尖插管进左心室，接压力换能器，在八道生理记录仪上记录左心室压。手术完毕后，待家犬平稳30min，记录家犬正常心电图、血压、左心室压、心外膜电图。将电磁流量计放置于主动脉弓，记录心输出量。之后，于冠状动脉前降支较上部位结扎冠状动脉，记录家犬在结扎冠状动脉后各项指标的变化，于结扎冠状动脉后45min，由腿静脉按剂量体重给药，10min推注完毕，记录给药后15、30、60min时家犬各项指标，并于结扎前、结扎后45min、给药后15、30、60min由腿静脉采血，测定血中SOD、CPK、LDH含量。结扎4h后，将犬心脏取出，洗净污血后称重，切片，进行N-BT染色，将未染色部位取出称重，计算心肌梗塞面积。
实验结果见表3。家犬在结扎冠状动脉后，立即出现心电图改变，在结扎冠脉45min后，家犬ST-段抬高，左心室内压降低、左室舒张末期压升高，dp/dt降低，与结扎前比较，有显著差异。静脉注射30mg/kg以上剂量的1，6-二磷酸果糖镁盐后15min，即已明显改善以上症状，左心室内压升高、左室舒张末期压降低，dp/dt升高，与给药前比较有明显差异。
表3. 1，6-二磷酸果糖镁盐对结扎冠脉引起家犬心肌缺血的影响给药后时间(min)0 结扎后 15 30 60心率(次/min)144.6±33.0 142.0±33.5 146.2±30.6 146.3±31.1 145.7±32.8血压(mmHg)112.5±24.0 120.1±21.5 115.8±17.3 115.8±16.6 113.1±25.3LVP(mmHg)153.1±30.3 99.2±18.5## 141.6±28.2* 144.3±19.3** 131.1±41.0LVEDP(mmHg)37.7±13.6 82.7±14.03## 54.8±7.9* 45.8±11.9** 47.52±6.08**dp/dt1945.9±516.0 814.1±493.7# 1701.8±399.6* 1577.0±290.7* 1454.5±324.5T-波(mv)3.69±0.20 3.69±0.167 3.64±0.09 3.66±0.14 3.68±0.07ST-段(mv)18.00±11.37 62.27±18.97## 40.90±18.34 30.98±15.55* 38.53±16.20注：结扎前后比较#P＜0.05，##P＜0.01
给药前后比较*P＜0.05，**P＜0.01