具有抗肿瘤活性的甘露-葡萄多糖的四糖重复单元的合成 本发明是关于有生物活性的、特别是涉及可用作抗肿瘤药的、甘露-葡萄多糖的四糖重复单元的合成。
由微生物Microellobosporia grisea中分离到一个甘露-葡萄多糖，这个多糖具有强的抗肿瘤活性，是由一个四糖重复单元组成的多糖(见K.Inoue等CarbohydrateResearch 114(1983)245-256；115(1983)199-208；123(1983)305-314)。此四糖由两个甘露糖和两个葡萄糖构成，其结构为：
这个四糖至今尚未有人合成。我们认为，合成这个四糖不仅对研究寡糖结构活性的关系很重要，而且这个四糖有可能作为新的抗肿瘤药物。
本发明的目的在于采用新的思路，提供一种步骤简单、省时、省力的，可用作抗肿瘤药物的甘露-葡萄多糖的四糖重复单元的合成方法。
本发明的目地是这样实现的：将四糖分成两部分，即上图中左方的三糖供体及右方的单糖受体。如下图所示：R=酰基或烷基保护基 X=离去基团 R’=氢原子或烷基
本发明的合成方法在于：1．以苯甲酰化的甘露糖三氯乙酰亚胺酯1为糖基供体，以4,6-O-苄叉基-1,2-O-乙叉基保护的葡萄糖2为糖基受体，将糖基供体与糖基受体分别溶于二氯甲烷中，然后将二者混合，加入催化剂量的路易斯酸，在搅拌、室温下反应2-4小时，制备出双糖3；将双糖3的苄叉基经酸水解移除，得到双糖4；然后以苯甲酰基甘露糖三氯乙酰亚胺酯1为糖基供体，以等摩尔比的双糖4为糖基受体，将糖基供体与糖基受体分别溶于二氯甲烷中，然后将二者混合，加入催化剂量的路易斯酸，在搅拌、室温下反应2-4小时，制备出三糖5；将三糖5乙酰化、酸水解移除乙叉基、再乙酰化得到三糖7；将三糖7选择性地移除1位乙酰基，然后按标准方法制成三糖的三氯乙酰亚胺酯8；
或用另一种方法合成三糖的三氯乙酰亚胺酯8，即以1,2:5,6-二-O-异丙叉基葡萄糖为起始物，首先与苯甲酰基甘露糖三氯乙酰亚胺酯1偶联得到双糖，然后选择性地水解移除5,6-异丙叉基得到10，再与1偶联得到三糖11，接着酸水解移除1,2-异丙叉基，再乙酰化得到三糖，按标准方法制成三糖的三氯乙酰亚胺酯8；以上图中 Bz=苯甲酰基 Ac=乙酰基2．2,3,6酰基保护的单糖烷基苷受体由4,6苄叉化的葡萄糖烷基苷12经2,3位苯甲酰化得到全保护的葡萄糖苷13，酸水解移除苄叉基得到14，然后选择性6位苯甲酰化得到单糖受体15；式中 R=烷基或芳基 R’=酰基3．将三糖供体8与单糖受体15溶于二氯甲烷中，在路易斯酸催化下进行偶联反应，得到保护的四糖16，按常规方法脱掉保护，得到四糖17；式中 R=氢原子或烷基或芳基 R’=酰基 Bz=苯甲酰基 Ac=乙酰基
所述的路易斯酸为三甲基硅三氟甲磺酸酯(TMSOTf)或三氟化硼-乙醚络和物(BF3.Et2O)。
以下结合实施例进行说明。
实施例：三糖供体8的制备方法一
1．双糖3(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-4,6-O-benzylidene-1,2-O-(R,S)-ethylidene-α-D-glucopyranose)的制备：
苯甲酰化的甘露糖三氯乙酰亚胺酯1(741毫克，1毫摩尔)溶于20毫升二氯甲烷中，得溶液A,4,6-O-苄叉基-1,2-O-乙叉基葡萄糖2(293毫克，1毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中，得溶液B，将B与A混合得溶液C，向C中加入TMSOTf(20微升，0.23毫摩尔)，在室温反应二小时后，薄层色谱分析表明反应完成。将反应液以10毫升二氯甲烷稀释，用三乙胺中和，用水洗溶液，弃去水相，有机相在真空下抽干，得到的粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的双糖3 785毫克，产率：90％；熔点：140-145℃，比旋光度[α]D+13°；
2·双糖4(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-1,2-O-(R,S)-ethylidene-α-D-glucopyranose)的制备：
将3(872毫克，1毫摩尔)溶于10毫升乙酸中，加入80％的二氯乙酸1毫升，在搅拌下室温反应六小时后，薄层色谱分析表明反应完成。将反应液以水稀释，用30毫升二氯甲烷萃取，有机相先后用饱和碳酸氢钠及水洗涤，然后在真空下抽干，得到结晶的粗产品731毫克，产率：91％；熔点：150-152℃，比旋光度[α]D-24°；
3·三糖5(2,3,4,6-Tetra-O-henzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→6)]-1,2-O-(R,S)-ethylidene-α-D-glucopyranose)的制备：
苯甲酰化的甘露糖三氯乙酰亚胺酯1(741毫克，1毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中，得溶液A，双糖4(784毫克，1毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中，得溶液B，将B与A混合得溶液C，向C中加入TMSOTf(20微升，0.23毫摩尔)，在室温反应三小时后，薄层色谱分析表明反应完成。将反应液以10毫升二氯甲烷稀释，用三乙胺中和，用水洗溶液，弃去水相，有机相在真空下抽干，得到的粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的三糖5 1158毫克，产率：85％；熔点：131-134℃，比旋光度[α]D-1.5°；
4·三糖6(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→6)]-4-O-acetyl-1,2-O-(R,S)-ethylidene-α-D-glucopyranose)的制备：
将三糖5(1362毫克，1毫摩尔)按常规方法用乙酸酐-吡啶定量乙酰化，得到全保护的三糖6,1376毫克，产率98％；熔点：131-134℃，比旋光度[α]D-2.5°；
5·三糖7(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→6)]-1,2,4-tri-O-acetyl-α,β-D-glucopyranose)的制备：
将三糖6(1404毫克，1亳摩尔)溶于10毫升90％三氟乙酸中，在搅拌下、室温反应一小时，将溶液在真空下抽干，将所得浆状物按常规方法用乙酸酐-吡啶定量乙酰化，得到三糖7,1023毫克，主要由α异构体组成，产率：70％。熔点：137-140℃，比旋光度[α]D-5.1°；
6·三糖供体8(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→6)]-2,4-di-O-acetyl-α-D-glucopyranosyltrichloroacetimidate)的制备：
将三糖7(731毫克，0.5毫摩尔)与碳酸钾(69毫克，0.5毫摩尔)溶于10毫升DMF中，在搅拌下、室温反应十二小时，反应物用水稀释，然后用二氯甲烷萃取，先后用1N盐酸、水、碳酸氢钠溶液洗涤有机相，干燥并浓缩有机相，得到的浆状物溶于20毫升二氯甲烷，然后加三氯乙睛(0.1毫升，1毫克分子)，再加DBU 14微升，反应混合物在搅拌下、室温反应二小时后，将反应混合物在真空下抽干，用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/2)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到三糖8,669毫克，产率：90％。熔点：123-126，比旋光度[α]D+1.5°；
实施例：三糖供体8的制备方法二
1．双糖10(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-1,2:5,6-di-O-isopropylidene-α-D-glucofuranose)的制备：
苯甲酰化的甘露糖三氯乙酰亚胺酯1(741毫克，1毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中,得溶液A,1,2:5,6-二-O-异丙叉基葡萄糖9(260毫克，1毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中，得溶液B，将B与A混合得溶液C，向C中加入BF3.OEt2(20微升，0.16毫摩尔)，在室温反应四小时后，薄层色谱分析表明反应完成。将反应液以10毫升二氯甲烷稀释，用1N盐酸洗涤，弃去水相，有机相在真空下抽干，得到的粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的双糖10 720毫克，产率：90％；熔点：110-113℃，比旋光度[α]D+18°；
2．三糖11(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→6)]-1,2-O-isopropylidene-α-D-glucofuranose)的制备：
苯甲酰化的甘露糖三氯乙酰亚胺酯1(741毫克，1毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中，得溶液A，双糖10(798毫克，1毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中，得溶液B，将B与A混合得溶液C，向C中加入BF3.OEt2(20微升，0.16毫摩尔)，在室温反应四小时后，薄层色谱分析表明反应完成。用三乙胺将反应物中和至中性，然后在真空下抽干，得到的粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的三糖11 970毫克，产率：80％；熔点：120-123℃，比旋光度[α]D+28°；
3．三糖7(2,3,4,6-Tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→6)]-1,2,4-tri-O-acetyl-α,β-D-glucopyranose)的制备：
将三糖11(1216毫克，1毫摩尔)溶于10毫升90％三氟乙酸中，在搅拌下、室温反应一小时，将溶液在真空下抽干，将所得浆状物按常规方法用乙酸酐-吡啶定量乙酰化，得到三糖7,1042毫克，主要由α异构体组成，产率：71％。产物性质与由制备方法一，5中所述的性质相同；
实施例：单糖受体15(Allyl 2,3,6-tri-O-benzoyl-α-D-glucopyranoside)的制备：
将4,6-O-苄叉基-α-D-葡萄吡喃糖烯丙基苷12(313毫克，1毫摩尔)，溶于10毫升吡啶中，向此溶液中滴加苯甲酰氯(0.34毫升，3毫摩尔)，反应在室温、搅拌下进行三小时，定量得到双糖13，用常规方法处理反应液，得到的粗产物溶于四氧呋喃(20毫升)中，向此溶液中滴加1M硫酸3毫升，然后将反应物在搅拌下加热到70℃，二小时后反应完成，冷至室温后用碳酸氢钠溶液中和，用二氯甲烷萃取，有机相在真空下抽干，得到的粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到双糖14 381毫克，产率89％。将得到的14溶于15毫升吡啶中，在室温、搅拌下滴加苯甲酰氯(0.125毫升，1毫摩尔)，三小时后反应完成，用常规方法处理反应液，得到的粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/2)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的单糖受体9 464毫克，产率：98％；熔点：148-151℃，比旋光度[α]D+28°；
实施例：四糖16(Allyl 2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-[2,3,4,6-tetra-O-benzoyl-α-D-mannopyranosyl-(1→6)]-2,4-di-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2,3,6-tri-O-benzoyl-α-D-glucopyranoside)的制备：
用8为糖基供体(782毫克，0.5毫摩尔)，15为糖基受体(266毫克，0.5毫摩尔)，将它们溶于10毫升二氯甲烷中，在搅拌下，向此溶液中加入TMSOTf(10微升，0.11毫摩尔)，在室温反应四小时后，薄层色谱分析表明反应完成。用三乙胺将反应物中和至中性，然后在真空下抽干，得到的粗产物用硅胶柱层析法精制，用乙酸乙酯/石油醚(1/3)作为淋洗液淋洗，收集相应组分，得到纯的四糖16 870毫克，产率：90％；熔点：133-136℃，比旋光度[α]D+38°；
实施例：四糖烯丙基苷17a(Allyl α-D-mannopyranosyl-(1→3)-α-D-mannopyranosyl-(1→6)--β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-D-glucopyranoside)的制备：
将四糖16(154毫克，0.08毫摩尔)悬浮于10毫升甲醇中，向此溶液中加入2M0.1毫升的溶液，此溶液在室温、搅拌下过夜，得到的溶液用阳离子交换树脂中和，过滤后浓缩得到四糖烯丙基苷17a 48毫克，产率：85％；熔点：154-156℃，比旋光度[α]D-7°；
实施例：游离四糖17b(α-D-mannopyranosyl-(1→3)-α-D-mannopyranosyl-(1→6)--β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α,β-D-glucopyranose)的制备：
将四糖16(307毫克，0.16毫摩尔)溶于10毫升二氯甲烷中，加入10毫升甲醇，在搅拌下加入二氯化钯(30毫克，0.17毫摩尔)，反应在室温下6小时后完成，过滤并用二氯甲烷洗涤滤饼，将洗涤液与反应液合并，真空下抽干，然后将其悬浮于10毫升甲醇中，向此溶液中加入2M 0.18毫升的溶液，此溶液在室温、搅拌下过夜，得到的溶液用阳离子交换树脂中和，过滤后浓缩得到游离的四糖17b 90毫克，产率：82％；比旋光度[α]D-2°。