一种细胞定位单元、阵列、器件及其形成方法.pdf

本发明提供了一种细胞定位单元、阵列、器件及其形成方法，其中细胞定位单元包括：衬底；衬底上的至少一对微电极，微电极之间相间隔且每对微电极相对同一点呈对称分布，以在微电极的端部聚集区域产生正向介电力区域，相邻的微电极连接的电压信号具有相反的相位；细胞定位孔，位于微电极之上，其容纳空间暴露出正向介电力区域，且其容纳空间容纳单个细胞。通过对微电极上施加具有特定幅值、频率及相位交流电信号，使细胞向电极表面移动，由细胞定位微孔配合微电极，使单个细胞精确定位在特定位置。

1.  一种细胞定位单元，其特征在于，包括：
衬底；
衬底上的至少一对微电极，微电极之间相间隔且每对微电极相对同一点呈对称分布，以在微电极的端部聚集区域产生正向介电力区域，相邻的微电极连接的电压信号具有相反的相位；
细胞定位孔，位于微电极之上，其容纳空间暴露出正向介电力区域，且其容纳空间容纳单个细胞。

2.  根据权利要求1所述的细胞定位单元，其特征在于，所述微电极为条带形，每对微电极的端部相对设置；该细胞定位孔的容纳空间暴露出微电极相对的端部。

3.  根据权利要求1所述的细胞定位单元，其特征在于，所述微电极为圆环形，每对微电极同心设置；细胞定位孔与微电极同心设置。

4.  根据权利要求2或3所述的细胞定位单元，其特征在于，所述细胞定位孔为圆环孔或方形孔，圆环孔的直径或者方形孔的边长的范围为待测细胞的一倍直径和两倍直径之间。

5.  一种细胞定位阵列，其特征在于，为多个由如权利要求1-4中任一项所述细胞定位单元形成的阵列。

6.  一种细胞定位器件，其特征在于，包括：
如权利要求6所述的细胞定位阵列；
位于衬底之上的容纳细胞定位阵列的流体腔，流体腔开口上具有微流控芯片。

7.  一种细胞定位单元/阵列的形成方法，其特征在于，包括步骤：
提供衬底；
在所述衬底之上形成至少一对微电极，微电极之间相间隔且每对微电极相对同一点呈对称分布，以在微电极的端部聚集区域产生正向介电力区域，相邻的微电极连接的电压信号具有相反的相位；
在微电极之上形成细胞定位孔，细胞定位孔的容纳空间暴露出正向介 电力区域，且其容纳空间容纳单个细胞。

8.  根据权利要求7所述的形成方法，其特征在于，所述微电极为条带形，每对微电极的端部相对设置；该细胞定位孔的容纳空间暴露出微电极相对的端部。

9.  根据权利要求7所述的形成方法，其特征在于，所述微电极为圆环形，每对微电极同心设置；细胞定位孔与微电极同心设置。

10.  根据权利要求8或9所述的形成方法，其特征在于，所述细胞定位孔为圆环孔或方形孔，圆环孔的直径或者方形孔的边长的范围为待测细胞的一倍直径和两倍直径之间。

11.  一种细胞定位器件的形成方法，其特征在于，包括：
如权利要求7-10中任一项所述的形成方法；
在衬底上形成容纳细胞定位阵列的流体腔，流体腔开口上具有微流控芯片。

12.  根据权利要求11所述的细胞定位器件的形成方法，其特征在于，所述流体腔为聚合物材料，在外压力作用下一端与衬底键合，另一端与微流控芯片键合。

一种细胞定位单元、阵列、器件及其形成方法
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，特别涉及一种细胞定位单元、阵列、器件及其形成方法。 
背景技术
细胞是生命活动的基本单元，在生命科学和医学领域，需要对细胞进行分析和研究，对单细胞的操控和分析是目前关注的研究方向之一。 
以微电子机械系统(Micro-Electro-Mechanical Systems,MEMS)技术为基础发展起来的微流控芯片(Microfluidic chip)，由于其体积小、集成度高以及反应速度快等优势，在细胞操控和检测领域得到了广泛的应用，可用于对细胞群体或单个细胞进行操控、运输和反应。 
此外，将介电电泳技术(Dielectrophoresis,DEP)应用于细胞的操控、分离、检测等方面也为研究热点之一。介电电泳技术是指，在非均匀电场中，悬浮在一定液体介质中的粒子，如生物细胞或其他颗粒，因极化作用在与介质接触的表面诱导出电荷，这些电荷与非均匀电场相互作用，从而导致粒子发生定向迁移的现象，根据细胞定向迁移的方向不同，可具体分为正向介电电泳(positive DEP或pDEP)或负向介电电泳(negative DEP或nDEP)。利用细胞介电电泳技术，可以实现对细胞群体的操控、选择性分离，更进一步如何实现对单细胞的定位及检测等功能。 
在现有的文献及公开专利中，有关利用pDEP或nDEP技术定位细胞的研究有所报道。一般地，nDEP定位细胞，是在一组定位微电极的对称中心产生一个“介电陷阱”，位于该处的细胞，受到的介电力正好达到平衡。但是由于nDEP是将细胞推向电场最弱的地方，所以细胞随着离电极的距离越来越远，受到的介电力作用也越来越弱，因而用于细胞定位的力比较弱，定位效果受到很大局限。 
利用pDEP定位细胞，将细胞吸引向微电极，具有较强的定位效果，但是，由于pDEP会同时施加在距离电极较近的所有细胞上，将它们均吸引到电极表面，无法保证每个定位电极或电极组上只有一个单细胞，因而也具有一定的局限性。 
发明内容
本发明的目的旨在解决上述技术缺陷，提供一种实现单细胞精确定位的细胞定位单元、阵列及器件。 
本发明提供了一种细胞定位单元，包括： 
衬底； 
衬底上的至少一对微电极，微电极之间相间隔且每对微电极相对同一点呈对称分布，以在微电极的端部聚集区域产生正向介电力区域，相邻的微电极连接的电压信号具有相反的相位； 
细胞定位孔，位于微电极之上，其容纳空间暴露出正向介电力区域，且其容纳空间容纳单个细胞。 
可选的，所述微电极为条带形，每对微电极的端部相对设置；该细胞定位孔的容纳空间暴露出微电极相对的端部。 
可选的，所述微电极为圆环形，每对微电极同心设置；细胞定位孔与微电极同心设置。 
可选的，所述细胞定位孔为圆环孔或方形孔，圆环孔的直径或者方形孔的边长的范围为待测细胞的一倍直径和两倍直径之间。 
此外，本发明还提供了包含上述细胞定位单元的细胞定位阵列。 
此外，本发明有提供了一种细胞定位器件，包括上述的细胞定位阵列；以及，位于衬底之上的容纳细胞定位阵列的流体腔，流体腔开口上具有微流控芯片。 
此外，本发明还提供了一种细胞定位单元/阵列的形成方法，包括步骤： 
提供衬底； 
在所述衬底之上形成至少一对微电极，微电极之间相间隔且每对微电极相对同一点呈对称分布，以在微电极的端部聚集区域产生正向介电力区 域，相邻的微电极连接的电压信号具有相反的相位； 
在微电极之上形成细胞定位孔，细胞定位孔的容纳空间暴露出正向介电力区域，且其容纳空间容纳单个细胞。 
可选的，所述微电极为条带形，每对微电极的端部相对设置；该细胞定位孔的容纳空间暴露出微电极相对的端部。 
可选的，所述微电极为圆环形，每对微电极同心设置；细胞定位孔与微电极同心设置。 
可选的，所述细胞定位孔为圆环孔或方形孔，圆环孔的直径或者方形孔的边长的范围为待测细胞的一倍直径和两倍直径之间。 
此外，本发明又提供了一种细胞定位器件的形成方法，包括： 
上述形成细胞定位单元/阵列的形成方法；以及 
在衬底上形成容纳细胞定位阵列的流体腔，流体腔开口上具有微流控芯片。 
可选的，所述流体腔为聚合物材料，在外压力作用下一端与衬底键合，另一端与微流控芯片键合。 
本发明实施例提供的细胞定位单元、阵列、器件及其形成方法，利用正向介电电泳定位技术，并在微电极之上还形成了细胞定位孔，使得单个细胞定位于微电极之上的定位孔中，实现对单个细胞的高精度，高灵敏度定位，从而形成单细胞阵列结构，能够有效的提高单细胞的定位精度和通量，定位后的单细胞，或细胞阵列可广泛应用于单细胞分析、高通量药物筛选等领域。 
附图说明
本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： 
图1为根据本发明实施例一的细胞定位单元的俯视结构示意图； 
图2为根据本发明实施例一的细胞定位单元的剖面结构示意图； 
图3、图4分别为根据本发明实施例一的细胞定位单元建模的微电极 电场分布(E)、介电力因子(|E|²)分布示意图； 
图5为根据本发明实施例的细胞定位器件的剖面结构示意图； 
图6为根据本发明实施例二的细胞定位单元的俯视结构示意图。 
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。 
本发明提出了一种细胞定位单元，利用介电电泳技术来实现单个细胞定位，该细胞定位单元包括：衬底；衬底上的至少一对微电极，微电极之间相间隔且每对微电极相对同一点呈对称分布，以在微电极的端部聚集区域产生正向介电力区域，相邻的微电极连接的电压信号具有相反的相位；细胞定位孔，位于微电极之上，其容纳空间暴露出正向介电力区域，且其容纳空间容纳单个细胞。 
本发明通过形成了成对称间隔分布的微电极，在每对电极上施加一定幅值、频率的交流电压信号，且每对微电极的电压相位相反，使得在微电极的端部边沿处具有最大的电场强度，这样，在正向介电电泳的作用下，使得细胞定位，由于在微电极之上还形成了细胞定位孔，使得单个细胞定位于微电极之上的定位孔中，实现对单个细胞的高精度，高灵敏度定位。 
将上述的细胞定位单元进行阵列排布，形成细胞定位阵列。 
在本发明中，微电极是指电极的尺寸为微米级别，通常地，微电极的尺寸在几个微米或几十微米。 
为了更好的理解本发明的技术方案和技术效果，以下将结合具体的实施例进行详细的说明。 
实施例一 
参考图1所示，在本实施例中，采用条带形的微电极，条带的微电极的端部相对设置，在端部围成的区域形成最大的电场强度，使得细胞在此处定位。 
在具体的实施例中，微电极形成在衬底110之上，微电极为两对，即四条，第一微电极120-1、第二微电极120-2、第三微电极130-1和第四微电极130-2，这些微电极为条带形，均匀分布在一圆周上，每一对微电极120-1、120-2的端部都相对设置，相对的端部之间的间隔可以小于待测细胞的尺寸，以对细胞进行更好的定位。在本实施例中，微电极的数量为两对，此处仅为示例，在其他实施例中，可以根据需要设置微电极的数量。 
相邻的微电极之间间隔设置，相邻的微电极电连接相反相位的电压，如图1所示，相对的第一微电极120-1和第二微电极120-2、第三微电极130-1和第四微电极130-2施加相同的交流电压信号，相邻的两个微电极施加的交流电压信号的幅值、频率相同，但相位相反。 
在本实施例中，在微电极上施加交流电压后，会在微电极的端部的边沿处形成最大的电场强度，由于正向介电电泳的效应，会吸引细胞向该端部边沿处运动，最终将细胞定位在此处。 
进一步地，在微电极上形成了细胞定位孔140，该细胞定位孔形成在定位细胞的区域之上，其容纳空间的尺寸仅供容纳单个细胞，以限定单个细胞定位至该定位孔中。在本实施例中，该细胞定位孔位于微电极的相对的端部围成的区域之上，该细胞定位孔140的容纳空间暴露出相对的微电极的端部。更具体的，该细胞定位孔140为圆环孔，该圆环孔的直径大于细胞150直径且小于两倍的细胞直径，以使得在介电力吸引下仅单个细胞定位至该定位孔中，实现单细胞的定位。在本实施例中，细胞定位孔为圆环孔，可以理解的是，此定位孔的形状并不局限于此，其还可以是方形、多边形或其他外围连续或不连续的孔，在为方形孔时，其边长大于细胞150直径且小于两倍的细胞直径。 
对上述的细胞单元构建有限元三维模型，其中，微电极宽度为4um，微电极的厚度为100nm，相邻微电极的间距为5um，相对电极的距离为15um，外加交流电压幅值为2V，利用有限元数值模拟软件COMSOL对该细胞定位单元进行模拟分析，如图3、4所示，分别为该实施例细胞定位单元建模的微电极电场(E)分布、介电力因子(|E|²)分布情况示意图，在相对的微电极的端部，电极表面边沿处，电场强度达到最大值，且介电力 因子也最高，于是在四个微电极的相对的端部，形成了定位细胞的定位区域，细胞在介电吸引力(pDEP)作用下，会定位到该区域，进一步在该区域上设置细胞定位孔，有利于单细胞的定位。 
以上为本实施例的细胞定位单元，将上述细胞定位单元进行阵列排布，形成细胞定位阵列。 
对于本实施例的细胞定位单元或阵列，可以采用如下方法形成： 
首先，提供衬底110，参考图1。 
所述衬底为绝缘基底，主要为支撑作用，例如可以为形成有介质层的硅衬底。 
而后，形成微电极120、130，参考图1。 
可以通过淀积金属层，而后进行图案化来形成微电极，本实施例中，如图1所示，所述微电极为条带形，两对微电极的端部相对设置，微电极的宽度为4μm，微电极的厚度为100nm，相邻微电极的间距为5μm，相对电极的距离为15μm。 
接着，在微电极之上形成细胞定位孔140，参考图1所示。 
该细胞定位孔为绝缘材料形成，本实施例中，可以通过在衬底上旋涂厚的光刻胶经光刻后来形成，该细胞定位孔的容纳空间暴露出微电极相对的端部，该定位孔的容纳空间容纳单个细胞。 
其他实施例中，还可以采用聚合物材料来形成，例如PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)，可以通过传统的PDMS软光刻工艺制备细胞定位孔，而后，与上述微电极的衬底进行键合，从而在微电极上形成细胞定位孔。 
至此，形成了本实施例的细胞定位单元或阵列。 
实施例二 
参考图6所示，在本实施例中，采用圆环形的微电极，圆环形微电极同心设置，在圆环形的微电极内形成最大的电场强度，使得细胞在此处定位。 
在具体的实施例中，微电极形成在衬底210之上，微电极为一对同心 设置的圆环形微电极220-1、220-2，其中，内环微电极220-1直径为2-50um，宽度为2～20um，外环微电极220-2的直径为5～100um，宽度为2～20um，内外微电极之间的间距为2～20um。内环微电极220-1的引出端位于外环微电极220-2之上，在他们之间由隔离层230间隔开。 
同实施例一，在微电极之上还形成了细胞定位孔(图未示出)，该定位孔与微电极同心设置且其容纳空间容纳单个细胞，定位孔的容纳空间暴露内环和外环微电极，以使得在介电力吸引下仅单个细胞定位至该定位孔中，实现单细胞的定位。 
以上为本实施例的细胞定位单元，将上述细胞定位单元进行阵列排布，形成细胞定位阵列。 
对于本实施例的细胞定位单元或阵列，可以采用如下方法形成： 
首先，提供衬底210，参考图6。 
所述衬底为绝缘基底，主要为支撑作用，例如可以为形成有介质层的硅衬底。 
而后，形成微电极220-1、220-2，参考图6。 
可以通过淀积金属层，而后进行图案化来形成圆环形的微电极，本实施例中，微电极为一对同心设置的圆环形微电极220-1、220-2；接着在外环微电极220-2的部分圆环上形成隔离层230；而后，在隔离层上形成内环微电极220-1的引出端。 
接着，在微电极上形成细胞定位孔，该定位孔与微电极同心设置且其容纳空间容纳单个细胞。 
该细胞定位孔为绝缘材料形成，本实施例中，可以通过在衬底上旋涂厚的光刻胶经光刻后来形成，该细胞定位孔的容纳空间暴露出微电极相对的端部，该定位孔的容纳空间容纳单个细胞。 
其他实施例中，还可以采用聚合物材料来形成，例如PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)，可以通过PDMS软光刻工艺制备细胞定位孔，而后，与上述微电极的衬底进行键合，从而在微电极上形成细胞定位孔。 
至此，形成了本实施例的细胞定位单元或阵列。 
以上对本发明实施例的细胞定位单元、细胞定位阵列及其形成方法进行了详细的描述。 
此外，本发明还提供了采用上述的细胞定位单元形成细胞定位器件，以用于细胞的定位和进一步分析。参考图5所示，该细胞定位器件包括细胞定位单元100，衬底110上的流体腔120，流体腔120开口上具有微流控芯片130。微流控芯片130上具有入口130-1和出口130-2以及盖片140，微流控芯片通常包含一个开放式的管道及一个或多个样品的入口、样品的出口，用于液体样品的运输，盖片将微流控芯片封盖上并露出进口、出口部分，含有细胞的生物样品经过微流控芯片的进行传输，在微电极施加一定频率、幅值的交流电压信号时，微流控芯片内的细胞会受到介电吸引力的作用，这样，在流体力和介电吸引力的共同作用下，沿如图5中的虚线所示路径，被吸附到微电极上。 
此外，本发明还提供了上述细胞定位器件的形成方法。 
在形成细胞定位单元或阵列之后，接着，可以进一步的与流体腔、微流控芯片结合，以形成细胞定位器件。 
本实施例中，可以通过柔性材料，例如PDMS形成流体腔，微流控芯片可以通过软刻蚀PDMS来得到，盖片可以通过玻璃等透明材料形成，盖片经外部压力微流控芯片与流体腔结合，形成闭合的流控腔。流体腔进一步与衬底经外压力贴合在一起，或键合在一起，从而形成了密闭的、具有“三明治”结构的用于细胞定位的流体腔。 
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。 
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。