伯克霍尔德氏菌及其培养方法和菌剂以及它们的应用技术领域
本发明涉及一株伯克霍尔德氏菌，具体地，涉及一株具有降解百菌清功
能的伯克霍尔德氏菌，所述伯克霍尔德氏菌的培养方法，含有所述伯克霍尔
德氏菌作为活性成分的菌剂，以及它们在降解百菌清中的应用。
背景技术
百菌清(四氯间苯二腈)是一种取代苯类的保护性茎叶喷洒杀真菌剂,
具有保护和治疗作用，由美国钻石制碱公司于1963年开发，有多种剂型，
广泛用于蔬菜、果树以及豆类、水稻、小麦等多种作物上，以防治霜霉病、
白斑病、黑斑病和软腐病等病害。百菌清在植物表面有良好的黏着性，不易
受雨水冲刷，药效稳定。然而，在大棚土中经多次大量喷洒后其含量会较高，
通过土壤自身很难降解。
百菌清纯品为白色结晶，无臭味，不溶于水，微溶于丙酮等有机溶剂，
对高等动物低毒，但对鱼类及甲壳类动物毒性较大，对大鼠肾脏有致癌作用，
致突变性较强，在防治农作物病虫草害中发挥了重要作用，但也对环境造成
了污染。并且，百菌清农药在生产过程中会产生大量含农药废水，且农药不
论以何种方式施用，均会不可避免地通过多种途径进入水体，造成水环境污
染。
百菌清在水土环境中的降解受到很多研究人员的关注，微生物法有着方
便，易处理，无二次污染等优点。因此，发现新高效降解菌株对水土环境中
百菌清修复具有重大意义和广泛应用前景。
发明内容
本发明的目的在于开发一种对水土中的百菌清具有高效降解性能的微
生物菌株，从而能够简单快捷的对环境中的百菌清进行有效的降解。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一株伯克霍尔德氏菌
(Burkholderia zhejiangensis)，其中，所述伯克霍尔德氏菌的保藏编号为
CGMCC No.10848。
第二方面，本发明提供了一种伯克霍尔德氏菌的培养方法：其中，将如
上所述的伯克霍尔德氏菌CGMCC No.10848接种至以下培养基中进行培
养：
相对于1000重量份的培养基，所述培养基含有45-55重量份的葡萄糖，
10-20重量份的七水合硫酸镁，10-20重量份的硫酸铵，25-35重量份的碳酸
钙，0.4-0.8重量份的磷酸二氢钾，5-15重量份的蛋白胨，5-15重量份的氯化
钠，3-7重量份的酵母粉。
第三方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的伯克
霍尔德氏菌CGMCC No.10848的菌体作为活性成分。
优选的，所述菌体为活菌体。
第四方面，本发明提供了如上所述的伯克霍尔德氏菌、如上所述的培养
方法、如上所述的菌剂在降解百菌清中的应用。
第五方面，本发明提供了一种降解百菌清的方法，其中，该方法包括：
将如上所述的伯克霍尔德氏菌CGMCC No.10848和/或如上所述的菌剂与含
有百菌清的环境接触，以对环境中的百菌清进行降解。
将本发明的伯克霍尔德氏菌CGMCC No.10848用于降解百菌清的效果
评估，结果显示，该菌株能够高效降解水土中的百菌清，如实施例2所示的，
2天内，在模拟水相中，该菌株对百菌清的降解率可高达71.99％，在模拟土
相中，该菌株对百菌清的降解率可高达98.97％，在实际的土壤环境中，该
菌株对百菌清的降解率可高达99.05％。由此可以看出，本发明提供的伯克
霍尔德氏菌CGMCC No.10848能够对土壤中的百菌清进行有效地修复，具
有较高的经济效益和社会效益。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的菌株为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，于2015
年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地
址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编
码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10848。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描
述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一株伯克霍尔德氏菌(Burkholderia
zhejiangensis)，其中，所述伯克霍尔德氏菌的保藏编号为CGMCC No.10848。
本发明的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)分离自安徽土壤。
本发明提供的伯克霍尔德氏菌经过培养能够产生大量的伯克霍尔德氏
菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述伯克霍尔德
氏菌增殖即可，例如可以按照107CFU/mL的接种量将伯克霍尔德氏菌的活
菌体接种于细菌培养基中，并且在好氧条件下，在20-38℃的温度下培养8-72
小时后，得到培养液。
本发明可以进一步分离上述培养液中的伯克霍尔德氏菌的活菌体，所述
分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以
通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条
件，本发明在此不再赘述。
本发明提供的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)的16s rDNA
的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
根据本发明，用于培养伯克霍尔德氏菌的培养基可以为本领域常规的细
菌培养基，例如，LB培养基，但本发明的发明人发现，在含有如下成分的
培养基中对伯克霍尔德氏菌进行培养，能够进一步促进菌体的生长：相对于
1000重量份的培养基，所述培养基含有45-55重量份的葡萄糖，10-20重量
份的七水合硫酸镁，10-20重量份的硫酸铵，25-35重量份的碳酸钙，0.4-0.8
重量份的磷酸二氢钾，5-15重量份的蛋白胨，5-15重量份的氯化钠，3-7重
量份的酵母粉。
本发明的发明人在研究的过程中发现，如上所述的伯克霍尔德氏菌能够
对百菌清农药进行有效的降解，且能够以百菌清为唯一碳源进行生长。
基于此，第二方面，本发明提供了一种伯克霍尔德氏菌的培养方法：其
中，将如上所述的伯克霍尔德氏菌接种至以下培养基中进行培养：
相对于1kg的培养基，所述培养基含有45-55g的葡萄糖，10-20g的七
水合硫酸镁，10-20g的硫酸铵，25-35g的碳酸钙，0.4-0.8g的磷酸二氢钾，
5-15g的蛋白胨，5-15g的氯化钠，3-7g的酵母粉。
另外，如需在固体平板上对所述伯克霍尔德氏菌进行培养，还可以在如
上所述的培养基中添加适量的琼脂粉，从而制备成固体培养基。
根据本发明，对所述伯克霍尔德氏菌进行培养的条件可以为本领域常规
对细菌进行培养的条件，例如，在有氧条件下，培养的温度可以为20-38℃。
第三方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的伯克
霍尔德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)的菌体作为活性成分。
本发明的发明人在研究的过程中意外的发现，本发明的伯克霍尔德氏菌
的死菌体和活菌体均能够有效的环境中的百菌清进行降解。因此，如上所述
的伯克霍尔德氏菌的菌体可以为活菌体，也可为死菌体，还可以为活菌体和
死菌体的混合菌体，但优选为活菌体。
根据本发明，所述菌剂中所述伯克霍尔德氏菌的浓度没有特别的限制，
可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。
另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，
并添加相应的辅料等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领
域技术人员所公知，在此不再详细赘述。
根据本发明一种具体的实施方式，所述菌剂含有本发明如上提供的伯克
霍尔德氏菌CGMCC No.10848和10重量％的蛋白胨，10重量％的氯化钠，
15重量％的葡萄糖以及5重量％的酵母粉。
另外，本发明提供的伯克霍尔德氏菌CGMCC No.10848还可以和其他
菌体进行复配制备成混合菌剂，以进一步提高其效率。
根据本发明，所述菌剂可以为菌液的形式，也可以为干粉的形式，本领
域技术人员可以根据实际的需要自行选择。
第四方面，本发明提供了如上所述的伯克霍尔德氏菌、如上所述的培养
方法、如上所述的菌剂在降解百菌清中的应用。
第五方面，本发明提供了一种降解百菌清的方法，其中，该方法包括：
将如上所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)和/或如上所述的
菌剂与含有百菌清的环境接触，以对环境中的百菌清进行降解。
本发明优选在所述伯克霍尔德氏菌能够存活的条件下对环境中的百菌
清进行降解。其中，术语“伯克霍尔德氏菌能够存活”是指在含有百菌清的
环境中，至少大于5％，优选至少大于10％，更优选至少大于60％的菌体
能够存活。术语“伯克霍尔德氏菌能够存活的条件”是指环境中至少包括伯
克霍尔德氏菌能够存活的最基本条件，例如，温度、营养源等，此为本领域
技术人员所公知，在此不再赘述。
根据本发明，优选的，为了进一步提高所述伯克霍尔德氏菌在环境中的
生存能力，还可以向需要修复的环境中加入适宜所述伯克霍尔德氏菌生长的
营养源，例如，在本发明的第二方面所提及的培养基。
根据本发明，含有百菌清的环境可以包括任何含有百菌清的环境，例如，
所述含有百菌清的环境可以包括含有百菌清的土壤或水体。
根据本发明，加入至所述含有百菌清的环境中的伯克霍尔德氏菌的形式
并没有特别的限定，只要保证加入后所述伯克霍尔德氏菌能够在所述含有百
菌清的环境中起作用并且对所述百菌清进行有效降解即可，加入的所述伯克
霍尔德氏菌的形式，例如，可以为菌液的形式，也可以为菌体沉淀的形式，
还也可以为干粉的形式。
本发明的发明人发现，本发明提供的伯克霍尔德氏菌对百菌清的降解具
有剂量和时间效应，例如，在一定的范围内，对百菌清的降解率会随着所述
伯克霍尔德氏菌浓度的升高或者时间的延长而提高。
因此，本发明对加入的伯克霍尔德氏菌的数量没有特别的限制，这可以
根据所述含有百菌清的环境中的百菌清的含量来决定，例如，当所述环境中
的百菌清含量较高或所述环境对于所述伯克霍尔德氏菌的生存较不利时，可
以提高所述伯克霍尔德氏菌的接种量；当所述环境中的百菌清含量较低或所
述环境对所述伯克霍尔德氏菌的生存的影响较小时，可以减少所述伯克霍尔
德氏菌的接种量。
根据本发明，当所述含有百菌清的环境为土壤时，为了进一步促进本发
明提供的伯克霍尔德氏菌对百菌清的降解效率，优选的，将土壤中的水含量
控制在至少15重量％，更优选为18-30重量％。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中：
发酵培养基：以1L的培养基为基准，所述培养基含有50g的葡萄糖，
15g的七水合硫酸镁，15g的硫酸铵，30g的碳酸钙，0.6g的磷酸二氢钾，10g
的蛋白胨，10g的氯化钠，5g的酵母粉。
无机盐液体培养基：1.5g的NH4NO3，0.5g的KH2PO4，1.5g的K2HPO4，
1.0g的NaCl，0.2g的MgSO4·7H2O，PH＝7，去离子水补齐至1000ml。
无机盐固体培养基：在如上的无机盐液体培养基中添加适量的琼脂后形
成的固体培养基。
本发明的菌株为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia zhejiangensis)，并于2015
年5月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地
址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编
码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.10848，
简称P-6。
本菌剂：含有10体积％的本发明的菌株以及10ml上述无机盐液体培养
基。
参比菌株为假鼻疽伯克霍尔德氏菌：分离自农残土。
参比菌剂：含有10体积的％的参比菌株以及10ml上述无机盐液体培养
基。
百菌清的测定方法：
水相中，将含有百菌清的液体倒入50ml离心管中，加入10ml石油醚振
荡萃取5分，再加入10ml石油醚振荡萃取5分，静置后取上清液10ml向其
中加入无水硫酸钠0.4g，脱水振荡1分，之后取4ml于40℃旋转蒸发仪旋
转至干，再用2ml色谱纯丙酮溶解再稀释10倍，使用气相色谱进行检测
土相中，称量5g烘干土，加入体积比例为1:1的丙酮和水10ml，静置
30分钟，振荡5分后离心取上清液，加入5ml石油醚振荡萃取5分，如此
重复三次，静置后取上清液10ml向其中加入无水硫酸钠0.4g，脱水振荡1
分，之后取4ml于40℃旋转蒸发仪旋转至干，再用2ml色谱纯丙酮溶解再
稀释10倍，使用气相色谱进行检测。
水相中和土相中的用于检测的气相色谱条件为：
柱子：HT-Pesticides 1；检测器：ECD检测器；进样口温度：260℃；柱
温：240℃；检测器温度：280℃；分流比：60；进样量：1μL；尾吹60mL/min；
柱压：60kpa；载气流量：1.25mL/min。
百菌清降解率＝(未处理的样本中百菌清的含量-处理后样本中百菌清的
含量)/未处理的样本中百菌清的含量×100％
制备例
将保存的本发明的菌种以及参比菌种至如上的经灭菌的发酵培养基中，
并于37℃下活化两次。活化后的本菌株以及参比菌株的浓度均为
109CFU/mL。
实施例1
本实施例用于说明本发明的伯克霍尔德氏菌的形态学、生理生化特性
(1)形态学特性
将活化好的本发明的菌株用生理盐水进行梯度稀释，并选择合适的浓度
涂布于平板固体LB培养基上，浓度的选择以在LB固体培养基上能够形成
分散开的单菌落为准。然后将平板倒置于37℃温箱中进行培养，待单菌落形
成后观察菌落形态。
经观察，该菌株在LB固体培养基上培养24小时后能够形成直径1-2mm
的菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘完整，凸状，且不透明。
(2)过氧化氢酶试验
取以上经活化的培养液，直接滴加3％过氧化氢，立即观察，有大量气
泡产生，为阳性反应“+”。
(3)氧化酶试验
在LB培养物上分别滴加Kovacs氏试剂和Ewing氏试剂1-2滴，在数分
钟内观察结果，有颜色改变，为阳性反应“+”。
(4)革兰氏染色
涂菌：取干净载玻片一块，在载玻片上加一滴生理盐水，按无菌操作法
将活化的菌液涂在载玻片上，注意取菌不要太多。
干燥：让涂片自然晾干或用酒精灯烘干。
固定：手执载玻片一端，菌膜朝上，在火焰上固定2-3次。
初染：滴加结晶紫(刚好覆盖菌膜为宜)，染色1-2min，水洗。
媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
脱色：用滤纸吸去载玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴
流管滴加95％乙醇脱色，直至流下的乙醇无紫色时，立即水洗。
复染：用番红液复染约2min，水洗。
镜检：干燥后，用油镜观察，菌体被染成紫色，为革兰氏阴性菌。
实施例2
本实施例用于说明本发明的伯克霍尔德氏菌对百菌清的降解性能
(1)在水体中对百菌清的降解性
在无机盐液体培养基中添加百菌清农药，添加量使得在每升培养基中，
百菌清的含量为20mg，然后接入10体积％的如上活化两次的本发明的伯克
霍尔德氏菌CGMCC No.10848，于37℃下培养2天后测定培养液中百菌清
的浓度，并计算降解率，结果见表1。
(2)在土相中对百菌清的降解性
在没有受百菌清污染的土壤中加入百菌清，并使得相对于1kg的土壤，
百菌清的含量为10mg，然后分别加入5ml、10ml、15ml和20ml的上述经活
化2次的本发明的伯克霍尔德氏菌CGMCC No.10848培养液，在37℃下进
行降解，并分别在第2天、第4天和第6天测定土壤中的百菌清浓度，并计
算降解率，结果见表1。
同时，采用相同的方法向如上相同含量的百菌清土壤中加入0.05g、
0.15g、0.25g和0.5g的菌剂，在相同的条件下对土壤中的百菌清进行降解，
并分别在第2天、第4天和第6天测定土壤中的百菌清浓度，并计算降解率，
结果见表1。
对比例2-1
本对比例用于说明自然状态下百菌清的降解性能
按照实施例2的步骤(1)和(2)的方法配置相同百菌清浓度的水相和
土相，并按照相同的条件进行处理，不同的是，接入相同量的不含任何菌体
的发酵培养基(空白对照)。测定的百菌清的浓度，并计算降解率，结果见
表1。
对比例2-2
本对比例用于说明参比菌株的百菌清的降解性能
按照实施例2的步骤(1)和(2)的方法配置相同百菌清浓度的水相和
土相介质，并按照相同的条件进行处理，不同的是，分别接入相同量的如上
活化2次的假鼻疽伯克霍尔德菌以及参比菌剂。测定的百菌清的浓度，并计
算降解率，结果见表1。
由表1可以看出，伯克霍尔德氏菌和菌剂对土壤和水体中的百菌清有明
显的去除效果，可广泛应用于修复含有百菌清污染的环境，对修复土壤和生
态环境问题有着重大的意义。
表1
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实施例3
本实施例用于说明本发明的伯克霍尔德氏菌对烟植土壤的修复能力
在移栽烟苗和未移栽烟苗的土壤中喷洒百菌清农药，并测定土壤中的百
菌清浓度，然后向穴内喷散本发明的经活化的伯克霍尔德氏菌培养液，喷洒
量为每穴20ml。30天后测定穴内百菌清的浓度，并计算百菌清的降解率。
每种情况取3穴，然后取均值，结果见表2。
对比例3-1
本对比例用于说明自然状态下烟植土壤的修复能力
在移栽烟苗和未移栽烟苗的土壤中喷洒百菌清农药，并测定土壤中的百
菌清浓度，同时向穴内喷散不含任何菌体的培养液(空白对照)，喷洒量为
每穴20ml。30天后测定穴内百菌清的浓度，并计算百菌清的降解率。每种
情况取3穴，然后取均值，结果见表2。
对比例3-2
本对比例用于说明参比的菌株对烟植土壤的修复能力
在移栽烟苗和未移栽烟苗的土壤中喷洒百菌清农药，并测定土壤中的百
菌清浓度浓度，然后向穴内喷散如上的参比菌株，喷洒量为每穴20ml。30
天后测定穴内百菌清的浓度，并计算百菌清的降解率。每种情况取3穴，然
后取均值，结果见表2。
表2
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由以上结果可以看出，本发明提供的菌株对水土中的百菌清具有高效地
降解性能，并且方便快捷，简单易行，较同属的菌株具有突出的降解效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实
施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方
案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特
征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必
要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其
不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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