人工湿地大颗粒基质表面微生物DNA的定性和/或定量提取
方法技术领域
本发明涉及微生物分子生态学技术领域，更具体地，涉及一种人工湿地砾石表面
微生物DNA的定性和/或定量提取方法。
背景技术
生物量和群落结构作为人工湿地的两大重要特性，它们在湿地内部的分布特征与
污染物在湿地内部的降解行为息息相关。随着分子生物学的发展及其在生态学中的应用，
特别是生态学方向宏基因组学方法的建立及发展，培养手段已远远不能满足对人工湿地大
通量的物种信息需要。由此，研究便指向了包括培养及非培养微生物在内的整个环境基因
组DNA上，通过高通量测序及qPCR等分子生物学技术手段，以这些更为准确的方式获得涵盖
整个微生物群落的信息。而这些信息获得的前提，是需要提供足够质量、纯度和完整的基因
组DNA，如华大基因有限公司的宏基因组测序送样要求为：总量≥1.5μg，OD260/280在1.8至
2.0之间，OD260/280＞1.5，且电泳检测条带无明显降解。当需要使用qPCR对细菌、古菌或氨氧
化细菌等进行定量时，需要基因组DNA能够进行PCR反应，而且需要定量提取基因组DNA，数
据重复性要好，以便准确定量基质中微生物的含量。
土壤、沉积物、淤泥等环境样品中含有大量的腐殖质，这是导致样品DNA提取效率
及品质降低的主要因素之一，因此国内逐渐出现了各种可有效脱腐的DNA提取技术，以期从
富含腐殖质的样品中有效的获得高品质的DNA。申请号为201010573017.8的中国专利申请
公开了一种淡水沉积物总DNA的提取方法，申请号为201110090363.5的中国专利申请公开
了一种土壤和沉积物总DNA提取方法及提取试剂盒，申请号为201110178774.X的中国专利
申请公开了一种高效去除腐殖质的环境样品总DNA提取方法，申请号为201210137580.X的
中国专利申请公开了一种从湖泊沉积物样品中提取纯化总DNA的高效方法，申请号为
201410581883.X的中国专利申请公开了基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法等
等。以上专利所公开的方法仅限于直接提取颗粒极细的环境样品，并未提及粗糙且表面不
均一的大颗粒基质样品，尤其是如何对大颗粒基质样品表面微生物DNA进行定量的提取。人
工湿地中为了防止系统堵塞，常会使用大颗粒砾石、火山石、沸石等基质作为床体填料，这
些大颗粒基质的单粒重往往超过0.5g，无法像土壤、沉积物和淤泥那样使用微量土壤DNA提
取试剂盒提取DNA，而且试剂盒价格昂贵，对于大批量样品的提取并非经济可行。
因此，需要研制适用于大颗粒基质表面微生物DNA提取的高效、快速、经济而且可
批量化进行的方法，解决常规方法难以直接提取大颗粒基质样品表面微生物DNA、提取的
DNA存在腐殖质等PCR抑制物以及定量不准确、DNA产量低的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有DNA提取技术难以直接获取大颗粒基质表面微生物
DNA的不足之处，建立一种成本低、快速化并定量的提取人工湿地大颗粒基质表面微生物
DNA的方法，不仅可以实现定性还可以定量检测分析。该方法所获得的DNA可直接作为PCR的
模板，用于基因定量检测和高通量测序，开展人工湿地基质生物膜生物量和群落结构分析。
本发明目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取方法，该方
法以人工湿地填充的大颗粒基质为材料，采用摇床震荡的方法洗脱砾石表面生物膜并离心
获得沉淀，将沉淀用脱腐缓冲液和氯化钙溶液进行脱腐处理，再经SDS-溶菌酶法裂解细胞，
氯仿抽提，异丙醇沉淀获得DNA。使用该方法获得的DNA，其OD260/280和OD260/280都在1.8左右。
经本发明方法获得的DNA不需要稀释和纯化即可直接用于PCR反应。
所述大颗粒基质为材料包括砾石、火山石或沸石。
本发明方法所述提取方法包括基质生物膜洗脱和脱腐预处理和DNA抽提步骤。
具体地，其具体步骤如下：
S1.基质生物膜洗脱和脱腐预处理：
S11.采集大颗粒基质，加入无菌生理盐水，振荡洗脱大颗粒基质表面生物膜，得到
悬浊液；
S12.吸取步骤S11所得悬浊液于适宜体积的无菌离心管中，离心处理后，弃净上
清，继续加入悬浊液，再次离心处理后，待管内所得沉淀达到检测所设定的沉淀质量后，将
含沉淀的离心管保存于-20℃冰箱备用；
S13.取出保存有沉淀的无菌离心管，在常温下放置解冻，将无菌石英砂加入沉淀
中，向沉淀中加入脱腐缓冲液并涡旋混匀，离心处理后弃上清，所得沉淀进行下一步骤DNA
提取操作。所述脱腐缓冲液的组成为100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、100mmol/L Na2P2O7、
100mmol/L Na2EDTA(pH8.0)，1％PVP，100mmol/L NaCl，0.05％Triton X-100；所述脱腐缓
冲液的pH值为8.0。
S2.DNA提取：
S21.向步骤S13所得沉淀中加入0.5mol/L的氯化钙，涡旋混匀，离心处理后弃上
清，得沉淀；
S22.向步骤S21所得沉淀中加入0.05mol/L的草酸钠，涡旋混匀，离心处理后弃上
清，得沉淀；
S23.向步骤S22所得沉淀中加入DNA提取液和溶菌酶，涡旋混匀，摇床处理；
所述DNA提取液的组成为100mM Tris-HCl、1.5mol/L NaCl和1％CTAB，pH值为8.0；
所述溶菌酶的浓度为100mg/mL；
S24.短暂离心后加入100uL 20％SDS，涡旋混匀，水浴处理，间隔颠倒摇匀数次；
S25.离心处理后收集中间液相层并重复洗涤沉淀一次；
S26.向收集的上清液体中加入等体积氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心处理后收
集上部的液相层；所述氯仿与异戊醇的混合体积比例为24:1；
S27.向收集的液相层中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠和0.6倍体积的异丙醇，-
20℃放20min；
S28.离心处理后弃上清；向沉淀中加入1mL70％乙醇洗涤，再次离心处理，弃上清，
重复洗一次，得沉淀；
S29.将步骤S28中所得沉淀，烘干并溶解即获得DNA溶液。
优选地，步骤S11所述的生理盐水的浓度为0.85％。
优选地，步骤S11所述大颗粒基质和无菌生理盐水的质量体积比为1g：1mL。
优选地，步骤S11所述振荡洗脱是在无菌聚乙烯瓶中进行操作。
优选地，步骤S11所述振荡是于15℃、置于摇床后以225rpm的转速摇匀3h，可以充
分地洗脱大颗粒基质(砾石)的表面生物膜。
优选地，步骤S12所述离心处理是在4℃、12000rp条件下离心处理10min。
优选地，步骤S13所述无菌石英砂的粒径约为1mm。
优选地，步骤S13所述离心处理是在室温、12000rp条件下离心处理5min。
优选地，步骤S13所述脱腐缓冲液按以下步骤制备：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、
100mmol/L Na2P2O7、100mmol/L Na2EDTA(pH8.0)、1％PVP、100mmol/L NaCl、0.05％Triton
X-100、4％脱脂奶粉，pH8.0，用0.44μm纤维素膜抽滤，再用0.22μm无菌滤头抽滤。
优选地，步骤S21所述离心处理是在室温、12000rpm条件下离心5min。
优选地，步骤S22所述离心处理是在室温、12000rpm条件下离心5min。
优选地，步骤S23所述摇床处理的条件是在37℃、225rpm下处理30min；
优选地，步骤S24所述水浴处理的温度为65℃，水浴处理时间为1h。
优选地，步骤S25所述离心处理是在室温、12000rpm条件下离心5min。
优选地，步骤S26所述离心处理是在室温、12000rpm条件下离心10min。
优选地，步骤S26所述抽提的时间为10min。
优选地，步骤S27所述乙酸钠的pH值为5.2。
优选地，步骤S28所述离心处理是在室温、12000rpm条件下离心10min；所述再次离
心处理是在室温、12000rpm条件下离心5min；
优选地，步骤S26所述收集中间液相层并重复洗涤一次按以下步骤进行：移液器吸
取900μL中间液相层至一新离心管(2mL)后；沉淀重新加入800μL DNA提取液，100μL 20％
SDS，涡旋混匀后65℃温浴10min，间隔颠倒摇匀数次，12000rpm室温离心5min，收集中间液
相层800μL至一新离心管(2mL)。
优选地，步骤S29所述烘干并溶解DNA是按以下步骤进行：60℃烘干5min，加入50μL
10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，手指轻弹溶解沉淀，将两管相同的样品DNA合并为100μL。
本发明所述方法所得DNA溶液，其OD260/280和OD260/280都在1.8左右，不需要稀释和纯
化即可直接用于PCR反应，经电泳和质量计算，可实现定性和/或定量检测。
如果需要实现定量检测，在上述步骤的基础上，还包括以下步骤：
步骤S11还包括记录大颗粒基质的质量M和无菌生理盐水的体积V的步骤；在步骤
S12包括记录所加悬浊液总体积V1步骤；计算沉淀所对应的大颗粒基质的质量M1为![]()
另
称取30g所述相同的大颗粒基质，干燥后称重，质量记为m2。如此，m2/(30m1-30m0)即为沉淀
的基质干重，从达到检测所设定的沉淀质量的管内沉淀中提取的总DNA标记为mgDNA。
计算公式：基质DNA含量(ng/g)＝30mgDNA(m1-m0)/m2。
所述干燥后称重是将大颗粒基质置于烘箱70℃烘干48h。
所述提取方法与PCR和电泳方法结合应用于人工湿地大颗粒基质表面微生物总
DNA的定性和/或定量检测方面。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种人工湿地大颗粒基质表面微生物总DNA的定性和/或定量提取
方法，本发明针对人工湿地填充的大颗粒基质，采用摇床震荡的方法成功洗脱砾石表面生
物膜并离心获得沉淀，将沉淀用脱腐缓冲液和氯化钙溶液进行合理的脱腐处理，再经SDS-
溶菌酶法裂解细胞，氯仿抽提，异丙醇沉淀获得DNA。使用该方法获得的DNA，其OD260/280和
OD260/280都在1.8左右。经本发明方法获得的DNA不需要稀释和纯化即可直接用于PCR反应。
建立一种成本低、快速化并定量的提取人工湿地大颗粒基质表面微生物DNA的方法，该方法
所获得的DNA可直接作为PCR的模板，不需要稀释和纯化，可很好地用于基因定量检测和高
通量测序，开展人工湿地基质生物膜生物量和群落结构分析。
基于本发明方法，通过分步记录相关质量，可以成功定量检测人工湿地大颗粒基
质表面微生物总DNA。
附图说明
图1为未经脱腐处理直接提取的DNA电泳检测图。图中编号1～6依次为S-HF+UP、B-
HF+UP、S-HF+TD、B-HF+TD、S-HF+CI、B-HF+CI，点样量均为2uL。λDNA作为定量标准(北京鼎国
昌盛生物技术有限公司)上样量从左至右依次为10ng、30ng和50ng。
图2为试剂盒法提取的DNA电泳检测图。图中编号1～6样品与图1相同，点样量均为
2uL，各提取三次作为平行。λDNA作为定量标准上样量从左至右依次为10ng、30ng、50ng和
100ng。
图3为本发明的方法提取的DNA电泳检测图。图中编号1～6样品及上样量与图1相
同。λDNA作为定量标准上样量从左至右依次为10ng、30ng、50ng和100ng。
图4为以本发明的方法提取的DNA直接作为模板扩增16S rRNA基因全长电泳检测
图。图中编号0表示模板为10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，编号1～6依次表示模板来自S-HF
+UP、B-HF+UP、S-HF+TD、B-HF+TD、S-HF+CI、B-HF+CI，PCR上样量为2uL，重复编号为同一样品
提取三次。M为DNA分子量标准(TaKaRa,Dalian,China)从上至下依次为2000bp、1000bp、
750bp、500bp、250bp、100bp(bp：碱基对)。
图5为以试剂盒法提取的DNA直接作为模板扩增16S rRNA基因全长电泳检测图。图
中编号、上样量及DNA分子量标准与图4相同。
图6为荧光定量PCR检测的细菌16S rRNA基因拷贝数。
图7为以试剂盒法和本发明的方法提取的DNA为模板扩增16S rRNAV3区的DGGE检
测图，左边编号1～6依次表示采用某试剂盒方法，其模板来自S-HF+UP、B-HF+UP、S-HF+TD、
B-HF+TD、S-HF+CI、B-HF+CI，DGGE上样量为2μg；右边编号1～6依次表示采用本发明方法，其
模板来自S-HF+UP、B-HF+UP、S-HF+TD、B-HF+TD、S-HF+CI、B-HF+CI，DGGE上样量为2μg。
具体实施方式
下面结合附图和实施过程对本发明作进一步说明，除非特别说明，本发明采用的
试剂及仪器为本技术领域常规的试剂及仪器。
实施例1：从人工湿地砾石表面提取微生物DNA
人工湿地砾石样品采集：
本实施例从一组处理生活污水的水平潜流人工湿地采集砾石样品，湿地装置长
80cm、宽60cm、高80cm。湿地基质为砾石(粒径1～2cm)，填充高度为60cm，分别设置无植物
组，美人蕉组和再力花组。装置水力负荷为2.5m/d，全天连续运行，分别于近进水端及近出
水端采集基质样品，表层0～10cm处基质混合为表层样品，底层30～40cm处基质混合为底层
样品，三个装置共6个样品，其中3个为表层样品，3个为底层样品，各采集约200g基质装入无
菌密封袋备用，各样品分别命名为：S-HF+UP(水平潜流无植物组表层基质)、B-HF+UP(水平
潜流无植物组底层基质)、S-HF+TD(水平潜流再力花组表层样品)、B-HF+TD(水平潜流再力
花组底层样品)、S-HF+CI(水平潜流美人蕉组表层样品)、B-HF+CI(水平潜流美人蕉组底层
样品)。
基于前述采集的样品，本实施例提供一种人工湿地(用于处理城镇居民每日排放
的污水)砾石表面微生物DNA的定量提取方法，包括以下步骤：
S1.样品预处理
S11.采集人工湿地砾石装入无菌密封袋，将密封袋中砾石缓慢倒入500mL的无菌
聚乙烯瓶，至砾石重量为100g为止，再往瓶中加入100mL无菌生理盐水(0.85％)，置于摇床
15℃以225rpm的转速摇匀3h，以充分洗脱砾石表面生物膜。
S12.吸取悬浊液于适宜体积的无菌离心管中，12000rpm 4℃离心10min，弃净上
清，继续加入悬浊液，同上离心后，管内所得沉淀达到检测所设定的沉淀质量后(0.5g)，将
含沉淀离心管保存于-20℃冰箱备用。
S13.取出保存有0.5g沉淀的离心管，在常温下放置3min解冻，将0.4g无菌石英砂
(粒径约1mm)加入沉淀中，向沉淀中加入1.5mL脱腐缓冲液[100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，
100mmol/L Na2P2O7，100mmol/L Na2EDTA(pH8.0)，1％PVP，100mmol/L NaCl，0.05％Triton
X-100，pH 8.0]，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃上清，得沉淀备DNA提取用。
S2.DNA提取
S21.向沉淀中加入1mL 0.5mol/L氯化钙，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃上
清。
S22.向沉淀中加入1mL 0.05mol/L草酸钠，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃
上清。
S23.向沉淀中加入800μL DNA提取液(100mM Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，
pH8.0)和100μL溶菌酶(100mg/mL)，涡旋混匀，置于摇床37℃225rpm30min。
S24.短暂离心，加入100uL 20％SDS，涡旋混匀，65℃水浴1h，间隔颠倒摇匀数次。
S25.12000rpm室温离心5min，收集中间液相层900μL至一新2mL离心管；沉淀加入
800μL DNA提取液，90μL 20％SDS，涡旋混匀后65℃温浴10min，间隔颠倒摇匀数次，同上离
心，收集中间液相层800μL至一新2mL离心管。
S26.向收集的上清液体中加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提10min，然后
12000rpm离心10min，收集上部液相层。
S27.向收集液相层中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和0.6倍体积的异丙
醇，-20℃放20min。
S28.12000rpm离心10min，弃上清；向沉淀中加入1mL70％乙醇洗涤，12000rpm离心
5min，弃上清，重复洗一次。
S29.60℃烘干5min，加入50μL 10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，手指轻弹溶解沉
淀，将两管相同样品合并成100μL。
使用16S rDNA引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)和1492R(5’
GGTTACCTTGTTACGACTT3’)，检测gDNA的16S rDNA基因全长PCR扩增效果。PCR扩增体系具体
组成如下：5μL 10×buffer，5μL dNTP(2mmol/L)，1.5μL正向引物27F(10μmol/L)，1.5μL反
向引1492R(10μmol/L)，0.5μLTaq DNA pol-ymerase(TaKaRa,Dalian,China)，4μL MgCl2
(25mmol/L)，1μL的DNA模板，加灭菌的双蒸水至50μL。用PCR热循环仪(Bio-rad S1000,US)
进行热循环，具体热循环条件如下：采用降落PCR扩增，94℃预变性5min，94℃变性1min，
63.5℃退火1min，每个循环退火温度降1℃，72℃延伸3min，共10个循环，94℃变性1min，
53.5℃退火1min，72℃延伸3min，共20个循环，72℃延伸15min。PCR反应产物2μL用2％琼脂
糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳检测。
电泳方法：基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳取2μL DNA溶解液与0.5μL 6×上样缓冲
液混匀，点样于1％琼脂糖凝胶(含1×Gelred)上，置于TAE缓冲液(pH8.0)进行电泳95V
18min后，使用凝胶成像系统(Bio-rad,US)拍照分析。
表1本实施例提取基质微生物DNA纯度
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实施例2：从人工湿地砾石表面提取微生物DNA
人工湿地砾石样品采集：
本实施例从一组处理生活污水的水平潜流人工湿地采集砾石样品，湿地装置长
80cm、宽60cm、高80cm，湿地基质为砾石(粒径1～2cm)，填充高度为60cm，分别设置无植物
组，美人蕉组和再力花组。装置水力负荷为2.5m/d，全天连续运行，分别于近进水端及近出
水端采集基质样品，表层0～10cm处基质混合为表层样品，底层30～40cm处基质混合为底层
样品，三个装置共6个样品，其中3个为表层样品，3个为底层样品，各采集约200g基质装入无
菌密封袋备用，各样品分别命名为：S-HF+UP(水平潜流无植物组表层基质)、B-HF+UP(水平
潜流无植物组底层基质)、S-HF+TD(水平潜流再力花组表层样品)、B-HF+TD(水平潜流再力
花组底层样品)、S-HF+CI(水平潜流美人蕉组表层样品)、B-HF+CI(水平潜流美人蕉组底层
样品)。
基于前述采集的样品，本实施例提供一种人工湿地(用于处理城镇居民每日排放
的污水)砾石表面微生物DNA的定量提取方法，包括以下步骤：
S1.样品预处理
S11.采集人工湿地砾石装入无菌密封袋，将密封袋中砾石缓慢倒入500mL的无菌
聚乙烯瓶，至砾石重量为100g为止，再往瓶中加入100mL无菌生理盐水(0.85％)，置于摇床
15℃以225rpm的转速摇匀3h，以充分洗脱砾石表面生物膜。
S12.吸取悬浊液2mL于2mL无菌离心管中(空管称重记为m0)，12000rpm 4℃离心
10min，弃净上清，将含有沉淀的管称重并记为m1，沉淀质量即为m1-m0，继续加入悬浊液体积
为1/(m1-m0)-2，同上离心后，管内即得0.5g沉淀，相当于1/(m1-m0)的砾石加入量，将含沉淀
离心管保存于-20℃冰箱备用。
另称取30g砾石，置于烘箱70℃烘干48h，干燥后的砾石称重，重量记为m2。如此，m2/
(30m1-30m0)即为0.5g沉淀的基质干重，从该0.5g沉淀中提取的总DNA标记为mgDNA。计算公
式：基质DNA含量(ng/g)＝30mgDNA(m1-m0)/m2。
S13.取出保存有0.5g沉淀的离心管，在常温下放置3min解冻，将0.4g无菌石英砂
(粒径约1mm)加入沉淀中，向沉淀中加入1.5mL脱腐缓冲液[100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，
100mmol/L Na2P2O7，100mmol/L Na2EDTA(pH8.0)，1％PVP，100mmol/L NaCl，0.05％Triton
X-100，pH 8.0]，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃上清，得沉淀备DNA提取用。
S3.DNA提取
S21.向沉淀中加入1mL 0.5mol/L氯化钙，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃上
清。
S22.向沉淀中加入1mL 0.05mol/L草酸钠，涡旋混匀，12000rpm室温离心5min，弃
上清。
S23.向沉淀中加入800μL DNA提取液(100mM Tris-HCl，1.5mol/L NaCl，1％CTAB，
pH8.0)和100μL溶菌酶(100mg/mL)，涡旋混匀，置于摇床37℃225rpm30min。
S24.短暂离心，加入100uL 20％SDS，涡旋混匀，65℃水浴1h，间隔颠倒摇匀数次。
S25.12000rpm室温离心5min，收集中间液相层900μL至一新2mL离心管；沉淀加入
800μL DNA提取液，90μL 20％SDS，涡旋混匀后65℃温浴10min，间隔颠倒摇匀数次，同上离
心，收集中间液相层800μL至一新2mL离心管。
S26.向收集的上清液体中加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提10min，然后
12000rpm离心10min，收集上部液相层。
S27.向收集液相层中加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和0.6倍体积的异丙
醇，-20℃放20min。
S28.12000rpm离心10min，弃上清；向沉淀中加入1mL70％乙醇洗涤，12000rpm离心
5min，弃上清，重复洗一次。
S29.60℃烘干5min，加入50μL 10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)，手指轻弹溶解沉
淀，将两管相同样品合并成100μL。
使用16S rDNA引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)和1492R(5’
GGTTACCTTGTTACGACTT3’)，检测gDNA的16S rDNA基因全长PCR扩增效果。PCR扩增体系具体
组成如下：5μL 10×buffer，5μL dNTP(2mmol/L)，1.5μL正向引物27F(10μmol/L)，1.5μL反
向引1492R(10μmol/L)，0.5μLTaq DNA pol-ymerase(TaKaRa,Dalian,China)，4μL MgCl2
(25mmol/L)，1μL的DNA模板，加灭菌的双蒸水至50μL。用PCR热循环仪(Bio-rad S1000,US)
进行热循环，具体热循环条件如下：采用降落PCR扩增，94℃预变性5min，94℃变性1min，
63.5℃退火1min，每个循环退火温度降1℃，72℃延伸3min，共10个循环，94℃变性1min，
53.5℃退火1min，72℃延伸3min，共20个循环，72℃延伸15min。PCR反应产物2μL用2％琼脂
糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳检测。
电泳方法：基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳取2μL DNA溶解液与0.5μL 6×上样缓冲
液混匀，点样于1％琼脂糖凝胶(含1×Gelred)上，置于TAE缓冲液(pH8.0)进行电泳95V
18min后，使用凝胶成像系统(Bio-rad,US)拍照分析。
表2本实施例提取基质微生物DNA获得量及纯度
![]()
实施例3对比试验
为了比较本发明(实施例1和实施例2，以下数据和样品中称本发明)与现有的未脱
腐处理法和试剂盒法的提取效果，本申请人同时进行了利用未脱腐处理法和试剂盒法的实
验，具体操作如下：
(1)该方法未进行氯化钙和草酸钠处理，其他步骤与实施例1或实施例2相同，DNA
抽提液的配方为(100mM Tris-HCl，100mM EDTA，200mM NaCl，2％PVPP，3％CTAB，pH8.0)。
(2)使用![]()
DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories Inc.,Carlsbad,
CA,USA)提取基因组DNA，将PowerBead Tubes中的液体及研磨珠全部转移至装有0.5g沉淀
的2mL离心管中，其余步骤根据试剂盒步骤进行操作。
上述两种方法使用的基质样品与本发明相同，即样品处理都用摇床洗脱并离心为
0.5g沉淀，提取的DNA都溶于100μL 10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)中。
DNA浓度和纯度检测
(1)基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳取2μL DNA溶解液与0.5μL 6×上样缓冲液混匀，
点样于1％琼脂糖凝胶(含1×Gelred)上，置于TAE缓冲液(pH8.0)进行电泳95V 18min后，使
用凝胶成像系统(Bio-rad,US)拍照分析。
按照实施例1或实施例2中步骤S1的方法(图3)和试剂盒法(图2)提取的DNA均具有
较高的完整性，而且无明显的RNA条带，电泳定量的结果也显示，本发明所提取的DNA量要高
于试剂盒法；未经脱腐处理(图1)提取的DNA量少条带较弱，有明显的降解，而且有较强的
RNA条带。这表明本发明的提取方法具有较高的DNA获得率，且DNA具有较高完整性，脱腐对
杂质有较好的去除效果。
(2)超微量分光光度计测定DNA产量与纯度直接取1μL提取好的gDNA原液，置于
Nanodrop ND-2000超微量分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE,USA)上，
测定其浓度及OD260/280和OD230/260。
按照实施例1中S1的方法提取获得的DNA，如表1所示，其单次提取DNA总量皆超过
1.5μg，OD260/280和OD260/230都在1.8左右，结果较为稳定，无论在总量还是品质上，都能满足宏
基因组测序的送样要求；而试剂盒方法提取获得的DNA，单次提取DNA总量只有部分样品能
达到宏基因组测序的送样要求，与本发明相比稳定性较差，且试剂盒单次提取DNA总量极显
著小于本发明(p＜0.01)；这说明本发明提取的人工湿地大颗粒基质表面微生物DNA质量和
品质都优于![]()
DNA Isolation Kit。
表3本发明与试剂盒法提取基质微生物DNA获得量及纯度结果比较
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PCR检测：
(1)使用16S rDNA引物27F(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)和1492R(5’
GGTTACCTTGTTACGACTT3’)，检测gDNA的16S rDNA基因全长PCR扩增效果。PCR扩增体系具体
组成如下：5μL 10×buffer，5μL dNTP(2mmol/L)，1.5μL正向引物27F(10μmol/L)，1.5μL反
向引1492R(10μmol/L)，0.5μLTaq DNA pol-ymerase(TaKaRa,Dalian,China)，4μL MgCl2
(25mmol/L)，1μL的DNA模板，加灭菌的双蒸水至50μL。用PCR热循环仪(Bio-rad S1000,US)
进行热循环，具体热循环条件如下：采用降落PCR扩增，94℃预变性5min，94℃变性1min，
63.5℃退火1min，每个循环退火温度降1℃，72℃延伸3min，共10个循环，94℃变性1min，
53.5℃退火1min，72℃延伸3min，共20个循环，72℃延伸15min。PCR反应产物2μL用2％琼脂
糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳检测。
按照实施例1或实施例2的方法和试剂盒法提取获得的DNA，直接作为模板扩增16S
rRNA基因全长。如图4和5，对照为10mmol/L的Tris-HCl(pH 8.0)溶液均未扩增出目的大小
的条带；试剂盒法提取的样品中，标记为6的其中一个样品未能扩增出目的大小的条带；但
本发明的方法提取的全部样品都能扩出大小约1500bp的目的条带，而且没有明显的引物二
聚体。因此，通过本发明的方法能获得纯度较高的DNA，直接用于PCR扩增及细菌16S rRNA基
因信息分析。
(2)使用引物341F(5’CCTACGGGAGGCAGCAG3’)和534R(5’ATTACCGCGGCTGCTGG3’)，
实时定量PCR测定基质的细菌16S rRNA基因拷贝数。实时定量PCR体系具体组成如下：10μL
SYBR Premix Ex TaqTM(Takara,Japan)，引物(10μM)各0.4μL，2μL模板DNA，无菌去离子水
补齐至20μL。使用实时定量PCR仪(Bio-radCFX96,US)测定，具体扩增程序为，95℃预变性
30s；40个循环如下过程：95℃变性15s，62℃退火20s，72℃延伸30s。
按照实施例1或实施例2中S1的方法和试剂盒方法提取获得的DNA，直接作为模板
进行实时定量PCR，结果显示本发明的方法测得的细菌16S rRNA基因拷贝数极显著高于试
剂盒法(p＜0.01，图6)，这表明本发明的提取方法与试剂盒法相比，细胞的裂解程度更高，
更能反映样品的全部细菌生物量，能更准确和全面的描述人工湿地系统中的细菌生物量。
(3)PCR扩增16S rRNAV3区
使用引物与实时定量PCR相同，但需要在341F的5’端添加GC夹子5’
CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGG3’，进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测基
质的细菌群落结构组成。PCR扩增体系具体组成如下：5μL10×buffer，5μL dNTP(2mmol/L)，
1.5μL正向引物27F(10μmol/L)，1.5μL反向引1492R(10μmol/L)，0.5μL Taq DNA
polymerase(TaKaRa,Dalian,China)，4μLMgCl2(25mmol/L)，1μL的DNA模板，加灭菌的双蒸
水至50μL。用PCR热循环仪(Bio-rad S1000,US)进行热循环，具体热循环条件如下：采用降
落PCR扩增，94℃预变性10min，94℃变性30s，65℃退火30s，每个循环退火温度降0.5℃，72
℃延伸1min，共19个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共14个循环，72℃延
伸10min。PCR反应产物2μL用2％琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳检测，并使用定量DNA对
每个PCR产物样品的目的条带进行定量。各PCR产物加入10μL 10×Loading Buffer
(TaKaRa,Dalian,China)并混匀，置于烘箱中60℃过夜浓缩，根据电泳定量结果，向各个产
物样品加入无菌去离子水调节条带浓度至100ng/μL，DGGE上样量为20μL。采用DcodeTM基因
突变检测系统(Bio-rad,US)对PCR反应产物进行分离，制备8％的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂
浓度范围为40～60％(100％的变性剂中含有7mol/L的尿素和40％40的去离子甲酰胺)。
电泳条件为：60℃及110V电压下，电泳12h。电泳结果经Gel Red核酸染料染色后用
凝胶成像系统(Bio-rad,US)观察并用Quantity One软件进行分析。样品的丰富度(S)用条
带数量表示，香浓-威纳指数(H＇)计算公式为：H＇＝-∑(pi)(lnpi)。其中pi值是每条DNA条带
亮度密度与每个电泳泳道中DNA条带亮度总和的比值；lnpi是pi的自然对数。
按照实施例1或实施例2中方法和试剂盒方法提取获得的DNA，直接作为模板扩增
细菌16S rRNA V3区后进行DGGE分析，如图7显示与试剂盒法相比，本发明的样品条带更清
晰且条带之间能明显隔开。由表2可知，本发明所得的细菌丰富度和多样性均高于试剂盒
法，说明本发明提取的DNA含有的微生物多样性信息量要高于试剂盒法，能更有效的反映人
工湿地基质微生物群落的多样性。
表4本发明与试剂盒法的细菌丰富度和多样性结果
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