杏香兔耳风提取物及其活性成分以及它们的质量控制方法 【技术领域】
本发明属中药领域，具体涉及一种杏香兔耳风提取物及其质量控制方法。
背景技术
杏香兔耳风(Ainsliaea fragrans Champ)为一民间常用草药，为菊科植物杏香兔耳风的干燥全草，具有清热利湿，凉血解毒等功效，用于治疗虚劳咳血、湿热黄疽、水肿、痈疽肿毒等病症。可用于治疗湿热下注之带下病，表现为白带过多，色黄稠粘；慢性宫颈炎见以上证候者。分布于江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东等地。在中国江西省分布广泛、自南至北均有，有时在群落中占有一定优势(成片生长)，资源丰富值得开发利用。
临床上慢性宫颈炎有难以完全治愈及治愈后易复发等特点，致病微生物复杂多样，通常有细菌和病毒的双重感染，目前在这方面还没有特效药物。目前市场上有杏香兔耳风颗粒等粗制剂及其复方制剂，临床应用治疗湿热下注型的慢性宫颈炎表现了较好的疗效，对阴道炎、盆腔炎等妇科炎症疾病也有一定的效果。但现有杏香兔耳风中药均为水提醇沉的粗制剂，其中的功效成分不明，限制了该药的应用推广。
杏香兔耳风化学成分的研究始于二十世纪八十年代，有关报道较少。到目前为止，文献报道的化合物包括倍半萜内酯类(例如：中美菊素C，8α-羟基-11α，13-二氢中美菊素C，11α，13-二氢中美菊素C，4β，14-二氢中美菊素C，4β，14，11α，13-四氢中美菊素C)，酚酸类(例如：4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸，3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸，绿原酸等)，黄酮类，三萜类，有机酸类等，据文献报道，这些绿原酸类、倍半萜内酯类成分、黄酮类物质有抗炎、杀菌、抗病毒等广泛的药理活性。
公开号为CN1709417(国别：中国，申请日：2005年6月16日)的专利中，对杏香兔耳风的提取物的化学成分的研究提示其中含有黄酮类和内酯类物质，但未进行具体的化学成分分离和鉴定工作。公开号为CN1899337(国别：中国，申请日：2005年7月22日)的专利从其制备的杏香兔耳风提取物中分离鉴定出绿原酸类似物，并指出提取物含有有机酸类成分的含量在50％以上。上述两专利中提到的杏香兔耳风提取物的制备工艺的关键步骤是药材水煎煮液经非极性(或弱极性)大孔树脂精制，并且都提到大孔树脂精制所得提取物与传统的杏香兔耳风粗制剂相比抗炎等活性增强。但总的看来，截至目前对这种有活性增加现象的杏香兔耳风提取物的化学成分及药理研究还不够透彻，对其在治疗慢性宫颈炎等妇科炎症疾病方面的具体有效成分的研究也不清楚。我们对杏香兔耳风大孔树脂精制物进一步的化学成分研究表明，发现该精制物主要有绿原酸类似物和倍半萜内酯类两大类成分组成，这两类成分都具有明显的治疗慢性宫颈炎等妇科炎症疾病的作用，同时性质稳定，容易检测，适合作为兔儿风提取物质量控制的指标成分。
杏香兔耳风作为一种中草药，对其药材、提取物及相关制剂的质量进行有效控制是必不可少的。目前，已公开的质量控制方法是以紫外法或高效液相法测定有机酸类成分的含量。但是我们对杏香兔耳风的活性提取物的化学成分研究发现，提取物不仅含有绿原酸类似物(总酚酸)，还含有倍半萜内酯类成分，两者都为主要成分，因此有必要对两者同时进行定性或定量测定，以达到有效控制其质量的目的。杏香兔耳风中的倍半萜内酯类成分无明显紫外吸收，先前的研究者可能由于检测方法的限制，仅应用紫外检测，在研究过程中未发现倍半萜内酯类成分的存在，因此仅仅应用紫外法对有机酸类成份进行测定，本发明增加了另一主要成分内酯类成分的测定，使测定更加精准，质量控制更严，更加适合于工业化和中药现代化的需要。
【发明内容】
本发明提供一种杏香兔耳风提取物，该提取物中主要含有两类化学成分。
一种是通式为(1)的倍半萜内酯类成分：
(1)倍半萜内酯类化合物 (2)绿原酸类似物
其中通式(1)中R1为氢或葡萄糖基，R2为氢或羟基，R3为亚甲基或甲基，R1、R2和R3在各自的可选基团范围内可以自由组合。
通式(1)中R1＝葡萄糖基，R2＝羟基，R3＝甲基。其化合物为8α-羟基-11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C；
通式(1)中R1＝葡萄糖基，R2＝氢，R3＝甲基。其化合物为11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C；
通式(1)中R1＝葡萄糖基，R2＝氢，R3＝亚甲基。其化合物为中美菊素C；
通式(1)中R1＝氢，R2＝羟基，R3＝甲基。其化合物为8α-羟基-11α，13-二氢中美菊素C。
另一种是通式(2)的绿原酸类似物，其通式(2)中R1、R2和R3可以是咖啡酰基或氢。具体化合物是3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸，和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸。
其中，8α-羟基-11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C，为一新化合物，称为化合物1。
其中，11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C，为一新化合物。称为化合物3
为此，本发明要求保护以上杏香兔耳风提取物和以上两种新的化合物。
本发明的提取物其制备工艺如下：
选取杏香兔耳风药材，切段。加水煎煮，过滤，合并滤液，减压浓缩后上AB-8型大孔树脂，放置一段时间后首先用水洗脱至近无色，然后改用80-95％乙醇洗脱，收集80-95％乙醇洗脱部分，蒸干即得杏香兔耳风提取物。
上述杏香兔耳风提取物经硅胶、反相硅胶、聚酰胺等多种填料多次柱层析分离后得到化合物1和2，具体方法见实施例。
本发明还包括本发明的杏香兔耳风提取物的质量控制方法，该方法是对其中所含通式(1)倍半萜内酯类成分和通式(2)绿原酸类成分进行定性或定量测定以达到控制提取物产品质量的目的，本发明的质量控制方法如下：
用高效液相法对杏香兔耳风中的通式(1)倍半萜内酯类成分和通式(2)绿原酸类成分进行定性或定量分析，应用蒸发光散射检测器进行检测分析。
其中高效液相所用的流动相为甲醇-水或乙腈-水，色谱柱填充剂为十八烷基键合相硅胶。
高效液相所用的流动相中添加有机酸类改性剂甲酸或乙酸，有机酸用量为流动相的0.1～1％(体积百分比)。
所用对照品为8α-羟基-11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C和11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C中的1至2种。或对照品为中美菊素C和8α-羟基-11α，13-二氢中美菊素C中的1至2种。或对照品为3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸中的1至2种。具体操作方法见实施例。
本发明还提供本发明的提取物在制备治疗急慢性宫颈炎等妇科炎症疾病药物中的应用。
本发明对6种化合物进行了结构鉴定
化合物1：无定形粉末。质谱：ESI(+)-MS，449[M+Na]+，229[M-C6H12O6-OH]+；高分辨质谱：HR-ESI(+)-MS：449.1784(分子式：C21H30O9Na，计算值：449.1788，[M+Na]+)；[α]D20+35.6°(c＝0.56，CH3OH)；IR(KBr)，vmax(cm-1)：3418(sh)，2926(m)，1752(sh)，1636(m)，1456(w)，1384(w)，1267(w)，1226(w)，1160(w)，1072(sh)，903(w)；1HNMR(CD3OD，400MHz)：1.23(3H，d，7.7，H-13)，1.96(1H，m，H-2β)，2.15(1H，dd，12.5，8，H-9α)，2.71(1H，dd，12.8，5，H-9β)，2.30(1H，m，H-2α)，2.36(1H，m，H-7)，2.77(1H，dd，8，8，H-11)，2.83(1H，dd，9.9，9.9，H-5)，3.0(1H，m，H-1)，3.2(1H，与邻近信号交叠，H-17)，3.26(1H，与邻近信号交叠，H-19)，3.24(1H，与邻近信号交叠，H-20)，3.31(1H，与邻近信号交叠，H-18)，3.64(1H，dd，12，6，H-21)，3.72(1H，m，H-8)，3.87(1H，dd，12，2，H-21)，4.38(1H，dd，10.6，10.3，H-6)，4.44(1H，d，7.7，H-16)，4.61(1H，m，H-3)，4.98(1H，s，H-14b)，5.09(1H，s，H-14a)，5.32(1H，d，1.5，H-15b)，5.36(1H，d，1.1，H-15a)；13C NMR(CD3OD，100MHz)：11.84(C-13)，38.44(C-2)，40.47(C-11)，46.01(C-1 or C-9)，46.33(C-1 or C-9)，52.51(C-5)，54.68(C-7)，63.41(C-21)，70.94(C-8)，72.36(C-19)，75.77(C-17)，78.39(C-20)，78.85(C-18)，81.22(C-6)，81.6(C-3)，102.55(C-16)，115.69(C-15)，116.44(C-14)，145.91(C-10)，151.01(C-4)，182.53(C-12).
化合物1的1HNMR和13CNMR与8α-羟基-11α，13-二氢中美菊素C(化合物2)多数信号相似，但比化合物2多出6个碳信号(63～103ppm)，ESI(+)-MS显示化合物1的分子离子峰为449[M+Na]+，分子量比化合物2大162，推测化合物1是由化合物2的3位羟基糖基化后产生的。化合物1与化合物3的NMR多数信号相似，但与化合物3的1HNMR相比，化合物1在高场区(1.0～3.0)少了两个氢信号(化合物3中的1.88(1H，m，H-8α)和1.44(1H，m，H-8β))，在低场区多了一个H信号3.72(1H，m)，同时与化合物3的13CNMR相比，总碳信号个数相同，但化合物1有一碳信号从低场区位移至连羟基碳信号区域，与化合物3相比化合物1在NMR中发生的这些变化符合“化合物1是由化合物2的3位羟基糖基化后产生的”的推测。HSQC和1H-1HCOSY进一步确证碳氢连接关系，验证了上述推测，并就此对碳氢信号进行了归属，可以看到化合物3相对于化合物2在C-3上发生的向低场约8ppm的位移。ROESY中，H-8分别与H-9β、H-13相关，故H-8为β构型，8位羟基应为α取代。H-3与H-2α有相关信号而与H-2β无相关信号，表明H-3为α构型。H-13分别与H-8β、H-11、H-6有相关信号而与H-7无相关信号，表明H-11应为α构型，则CH3-11为β取代。因此化合物1应为8α-羟基-11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C，为一新化合物。
化合物3：无定形粉末。质谱：ESI(+)-MS，433[M+Na]+，231[M-C6H12O6+H]+；高分辨质谱：HR-ESI(+)-MS：433.1828(分子式：C21H30O8Na，计算值：433.1838，[M+Na]+)。[α]D20+41.7°(c＝0.40，CH3OH)；IR(KBr)，vmax(cm-1)：3414(sh)，2932(m)，1767(sh)，1637(m)，1452(w)，1383(w)，1321(w)，1226(m)，1162(w)，1075(sh)，1039(sh)，899(w)；1H NMR(CD3OD，400MHz)：1.12(3H，dd，7.7，1.5，H-13)，1.44(1H，m，H-8β)，1.88(1H，m，H-8α)，1.96(1H，m，H-2β)，2.03(1H，m，H-9α)，2.35(1H，m，H-2α)，2.43(1H，m，H-7)，2.53(1H，m，H-9β)，2.67(1H，m，H-11)，2.79(1H，m，H-5)，2.96(1H，m，H-1)，3.24(1H，m，H-17)，3.28(1H，m，H-19)，3.28(1H，m，H-20)，3.36(1H，m，H-18)，3.66(1H，m，H-21)，3.86(1H，m，H-21’)，4.33(1H，dd，9.9，9.9，H-6)，4.46(1H，d，9.5，H-16)，4.62(1H，m，H-3)，4.91(1H，s，H-14b)，4.99(1H，s，H-14a)，5.31(1H，s，H-15b)，5.40(1H，s，H-15a)；13CNMR(CD3OD，100MHz)：12.2(C-13)，30(C-8)，37(C-9)，38.5(C-2)，41.4(C-7)，45.8(C-1)，47.7(C-11)，52(C-5)，63.3(C-21)，72.2(C-19)，75.7(C-17)，78.4(C-20)，78.7(C-18)，81.7(C-3)，85.7(C-6)，103.3(C-16)，114.17(C-15)，114.22(C-14)，151.4(C-10)，151.5(C-4)，183.1(C-12).
化合物3的1HNMR与11α，13-二氢中美菊素C(Bohlmann F et al.Guaianolidesfrom Ainsliaea fragrans.phytochemistry，1982，21(8)：2120)相似，比较具有特征性的信号(如两个环外双键4.84，5.10，5.07，5.35、一个甲基1.12)的位移都极为接近，13CNMR中也出现了两个环外双键114.17(亚甲基)、114.22(亚甲基)、151.4(C)、151.5(C)、一个甲基12.2和一个羰基183.1等特征信号，但从NMR看化合物3比11α，13-二氢中美菊素C多出了一糖基信号(1HNMR，3.2～3.9，m，多个氢；13CNMR，63～103，6个碳信号)，ESI(+)-MS提示化合物3的分子量比11α，13-二氢中美菊素C大162，因此我们推测化合物3可能是11α，13-二氢中美菊素C的3位羟基糖基化而产生的，1H-1HCOSY、HSQC、HMBC和ROESY证实了上述推测，并就此对碳氢信号进行了归属，HMBC显示H-1′与C-3相关、H-3与C-1′相关，表明糖基确实连接在C-3上。ROESY中H-3与H-2α相关而不与H-2β相关表明H-3为α构型；H-13分别与H-8β、H-11、H-6有相关信号而与H-7无相关信号，表明H-11应为α构型，则CH3-11为β取代；H-14b与H-9β相关，H-14a与H-1、H-2α相关，故可以将C-14上的两个烯氢区分开，空间上靠近H-1一侧的为H-14a(4.99)，靠近H-9β一侧的为H-14b(4.91)；从H-15a与H-1′的弱相关信号和H-15b与H-5、H-6的弱相关信号也可以区分C-15上的两个烯氢，空间上靠近H-1′一侧的为H-15a(5.40)，靠近H-5一侧的为H-15b(5.31)。因此化合物3应为11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C，为一新化合物。
化合物2的ESI(+)-MS分子离子峰为287[M+Na]+，1HNMR(CDCl3，400MHz)数据与文献(Bohlmann F et al.Guaianolides from Ainsliaea fragrans.phytochemistry，1982，21(8)：2120)一致，鉴定为8α-羟基-11α，13-二氢中美菊素C。
化合物4的ESI(+)-MS分子离子峰为431[M+Na]+，1HNMR(C5D5N，400MHz)和13CNMR(C5D5N，100MHz)数据与文献(Adegawa S et al.Sesquiterpene lactonesfrom Diaspananthus uniflorus(SCH.BIP.)KITAM.Chem.Pharm.Bull.，1987，35(4)：1479)一致，鉴定为葡萄糖中美菊素C，为首次从杏香兔耳风中分离得到。
化合物5和化合物6的MS、NMR等数据，经与文献对照，分别确证为3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸。
本发明的提取物具有良好的治疗急慢性宫颈炎等妇科炎症疾病的作用，其中的通式(1)倍半萜内酯类成分和通式(2)绿原酸类成分也具有这方面的作用，新的化合物1和3也具有这方面的作用。
本发明应用高效液相-蒸发光散射法(HPLC-ELSD)，研究了杏香兔耳风提取物的图谱，对其主要峰进行指认。考察了乙腈-水、甲醇-水不同比例的流动相以及水相中加入0.1-1.0％甲酸的浓度对指纹图谱的影响。最后优选的色谱条件为：Agilent 1100HPLC-DAD，Alltech ELSD 2000蒸发光检测器；依利特hypersilODS25μm(4.6mm×250mm)色谱柱；梯度洗脱条件见下表1，流速1ml/min，柱温：室温；ELSD设置：漂移管温度112.8℃，载气(空气)流速3.1L/min。
表1HPLC-ELSD梯度洗脱条件
提取物ELSD的指纹图谱中共显示8个主峰(附图1)，倍半萜内酯类成分和绿原酸类似物各占4个。采用化合物1-6作为对照品，指认出相应峰位依次为：8α-羟基-11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C(峰1，19.1min)、8α-羟基-11α，13-二氢中美菊素C(峰2，20.6min)、4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸(峰3，27.4min)、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸(峰4，28.1min)、11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C(峰5，32.8min)和葡萄糖中美菊素C(峰6，34.0min)。
采用同一条件，测定了其中3个成份的含量(峰1、4、6)，其中峰1(8α-羟基-11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C)的平均含量为3.5％，峰4(3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸)的平均含量为7.5％，峰6(葡萄糖中美菊素C)的平均含量为3.5％。
本发明的突出特点在于通过深入研究分析，首次明确了杏香兔耳风提取物中的活性成分，主要由倍半萜内酯类和绿原酸类成分构成，倍半萜内酯类化合物1-4中有2个为新化合物。本发明并首次确定了采用HPLC-ELSD法对倍半萜内酯类和绿原酸类成分的定性和定量分析方法。
文献报道杏香兔耳风中的倍半萜内酯类和绿原酸类成分一般具有较强的抑菌、抗炎活性。本发明通过对杏香兔耳风提取物中倍半萜内酯类和绿原酸类成分的深入分离鉴定和分析研究，进一步明确了兔儿风提取物中的主要有效成份及其质量控制方法，为安全、有效、可控地进行杏香兔耳风提取物的新药开发奠定了物质基础。
【附图说明】
附图1为本发明所述兔耳风提取物样品的HPLC-ELSD分析图谱
【具体实施方式】
以下所给出的优选实施例，旨在进一步阐明本发明的化合物、制备方法，而并非限定所举例的化合物的范围，即是说通过这些实施例所述的方法可很容易地制得化合物1-6，对本发明的互换或改动，以及使用类似的溶剂，对于本专业的普通技术人员是不需要创造性劳动的。且以下实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。
实施例1：杏香兔耳风提取物的制备
称取杏香兔耳风药材1kg，用20倍水量分3次加热煎煮(8倍、6倍、6倍，第一次煎煮前浸泡半小时)，每次煎煮1小时，过滤，滤液合并，浓缩至每1ml相当于含1g药材的量(浓缩温度65-70℃)。浓缩液上AB-8大孔树脂(柱床体积约5L)，上样后放置4小时使吸附平衡，先用蒸馏水洗脱至洗脱液基本无色，再用95％医用酒精洗脱(约20L)，收集酒精洗脱液，浓缩，干燥，得杏香兔耳风提取物约70g(浸膏)。
实施例2：化合物1-6的分离纯化
实施例1中所得部分杏香兔耳风提取物浸膏(约60g)，按约1∶3加入硅胶拌样，进行减压柱层析(薄层层析硅胶H，化学纯，250g)，依次用氯仿4000ml、氯仿-甲醇(3∶1)1500ml、甲醇1500ml、甲醇-甲酸(95∶5)3000ml洗脱，收集各比例段洗脱部分，蒸干后得氯仿洗脱部分1.9g、氯仿-甲醇(3∶1)洗脱部分16.8g(T3-2)和甲醇及甲醇-甲酸(95∶5)洗脱部分24.6g。T3-2上中压柱层析(49mm×230mm，薄层层2析硅胶H约200g)，依次用不同比例得氯仿-甲醇洗脱(99∶1-65∶35，纯甲醇)，得浸膏T3-2-1～T3-2-10共计10段，其中T3-2-2为1.6g、T3-2-5为2.1g、T3-2-6为1.6g、T3-2-7为2.65g、T3-2-8为0.56g。
T3-2-7(500mg)经反相中压柱层析(富士22-45μm ODS，175g)，用乙腈-水(0.5％甲酸)梯度洗脱得到化合物1(97.8mg，乙腈-水7.5∶92.5可洗脱出来)。
T3-2-2(450mg)经反相中压柱层析(富士22-45μm ODS，175g)，用乙腈-水(5∶95，水中含0.5％甲酸)洗脱得到化合物2(105mg)。
T3-2-5(450mg)经反相中压柱层析，用乙腈-水(12.5∶87.5至15∶85，水中含0.5％甲酸)洗脱得到化合物3(76mg)和化合物4(105mg)。
T3-2-6(500mg)经反相中压柱层析，用乙腈-水(15∶85，水中含0.5％甲酸)洗脱得到化合物5(30mg)。
T3-2-8(560mg)经反相中压柱层析，用乙腈-水梯度洗脱(10∶90至25∶75，水中含0.5％甲酸)得到化合物6(17mg)。
实施例3：杏香兔耳风提取物的质量控制方法
供试品溶液的制备：取实施例1中所得杏香兔耳风提取物(浸膏)50.5mg置10ml容量瓶中，加甲醇定容，并超声10min以上使充分溶解得供试品溶液。放入冰箱待用。
对照品溶液的制备：称取10.80mg化合物5置10ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得对照品溶液C5-h1。精密量取C5-h12.000ml加甲醇定容于5ml容量瓶得对照品溶液C5-h0.4，精密量取C5-h11.000ml加甲醇定容于10ml容量瓶得对照品溶液C5-h0.1。称取12.00mg化合物1和25.99mg化合物8置于同一容量瓶中，加甲醇定容，摇匀得对照品溶液(C1+C8)-h1，精密量取(C1+C8)-h12.000ml置5ml容量瓶得对照品溶液(C1+C8)-h0.4，精密量取(C1+C8)-h0.42.500ml置5ml容量瓶得对照品溶液(C1+C8)-h0.2，精密量取(C1+C8)-h11.000ml置10ml容量瓶得对照品溶液(C1+C8)-h0.1。C1、C5和C8的纯度分别为96.7％、86.0％和97.6％。
色谱条件：Agilent 1100HPLC系统，Alltech ELSD 2000蒸发光检测器；依利特hypersil ODS25μm(4.6mm×250mm)色谱柱；梯度洗脱条件见下表2，流速1ml/min，柱温：室温；ELSD设置：漂移管温度112.8℃，载气(空气)流速3.1L/min，撞击器关。
表2流动相梯度条件表
测定法：分别精密吸取对照品溶液10、20μl和供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：峰1(8α-羟基-11α，13-二氢葡萄糖中美菊素C)的含量为3.822％，峰4(3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸)的含量为7.786％，峰6(葡萄糖中美菊素C)的含量为3.760％。