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本发明涉及泵阿米德衍生物、其制备方法与在治疗癌中的用途。进一步而言，本发明公开微生物变绿粘球菌(Myxococcus virescens)ST200611(DSM 15898)在发酵时生成的泵阿米德衍生物、它们在治疗癌中的用途、含有泵阿米德衍生物的药物、生产式(V)泵阿米德的方法。本发明还涉及微生物变绿粘球菌。

1.  制备下式(V)化合物或式(V)化合物在生理学上可耐受的盐的方法：

式中：
R₁是H或(C₁-C₆)-烷基，
R₂是H或OH，
R₃是H或-C(＝O)-(C₁-C₆)-烷基，且
R₄是甲基或乙基，
该方法包括：
(1).将变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)菌株或其变异株和/或突变株中的一种在培养介质中在合适条件下发酵直到一种或多种式(V)化合物在该培养介质中自然增长，
(2).从该培养介质中分离式(V)化合物，以及
(3).适当时，将式(V)化合物衍化和/或转化为其在生理学上可耐受的盐。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中R₄是乙基。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其中彼此独自地R₁是H或甲基，R₃是H，而R₄是乙基。

4.  根据权利要求1-3中任一项权利要求所述的方法，其中R₂是OH，并且所述培养介质含有羟基赖氨酸。

5.  微生物变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)。

6.  微生物变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)或其突变株和/或变异株在制备下式(V)化合物或它们在生理学上可耐受的盐中的用途：

式中：
R₁是H或(C₁-C₆)-烷基，
R₂是H或OH，
R₃是H或-C(＝O)-(C₁-C₆)-烷基，以及
R₄是甲基或乙基。

泵阿米德衍生物、其制备方法与在治疗癌中的用途
本申请为2004年10月8日提交的、发明名称为“泵阿米德衍生物、其制备方法与在治疗癌中的用途”的PCT申请PCT/EP2004/011244的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2006年4月18日，申请号为200480030646.9。
技术领域
本申请涉及药学领域。更具体而言，本发明涉及泵阿米德衍生物、其制备方法与在治疗癌中的用途。
背景技术
癌是人类和动物所患的疾病之一，这种疾病大部分是致命的，是由内源细胞不可控制生长所引起的。癌是用于描述形成的恶性肿瘤(malignomas)和瘤(肿瘤或癌)或白血球细胞恶性变性和受扰成熟(白血病、血癌)而采用的术语。癌细胞或肿瘤细胞是由内源细胞发生转化产生的。癌细胞的恶性是通过其生长的自主性表现的，即这种细胞以一种不受抑制并且与器官结构不相配的方式生长，并且还以一种浸润方式生长，由此会导致组织破坏。肿瘤细胞通过血液或淋巴传播后，在距肿瘤一定距离的地方形成散布区(转移灶)，这是恶性肿瘤出现的确定信号。癌是引起人死亡的最普遍的原因之一，因此，人类特别需要一些能够消除或治疗恶性变性的方法和手段。
除采用外科手术进行切除的根本性治疗(如果可能的话)外，其它可以用于治疗恶性肿瘤的手段包括使用X-射线、α-射线、β-射线和γ-射线进行放射性治疗，还包括免疫疗法和化疗。目前，免疫疗法的应用非常有限。肿瘤化疗是指通常在局部手术治疗或辐照之后，服用细胞毒药物(细胞生长抑制剂)来治疗仍存在的肿瘤和肿瘤细胞。这些药物可以特异性地干扰细胞分裂的某些过程，也就是说机体内存在高比例分裂细胞的组织，例如快速生长的肿瘤组织，这些组织可以更敏感地作出反应。使用的细胞生长抑制剂是烷基化化合物(例如环磷酰胺)、抗代谢药(例如甲氨蝶呤)、生物碱(例如长春新碱)，以及抗生素(例如柔红霉素和阿霉素)。但是，所有这些药物均具有大量的副作用的严重缺陷，以致它们仅仅能延缓而不能防止患者死亡。另外，变性(癌)细胞对所用药物产生了抗性；导致目前使用的药物不再有任何的细胞生长抑制作用，同时由于它们具有副作用导致对患者产生毒性。此外人们还发现，多种细胞生长抑制剂结合或顺序使用达到的效果超过单个细胞生长抑制剂(单一疗法)使用达到的效果，因此，采用多种化疗药进行治疗时，所产生的严重的副作用可能并不是加成性的。基于所有这些理由，人们迫切需要新的化疗药，也正因为如此在世界范围内人们正在积极寻找这样的化疗药。
泵阿米德类(bengamides)的第一类实例是在己内酰胺环上十二烷酰基-取代的泵阿米德A和B，它们是从海绵(sea sponge)Jaspis cf. Coriacea(Coppatiidae科，Choristida B Astrophorida目)分离得到的(Adamczewski等人，《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)1986，51，4497-4498)，并且据报道它们对真核细胞、线虫和细菌是有生物毒性的。
人们已经证明，下式泵阿米德E

及其N-甲基化衍生物泵阿米德F是具有抗肿瘤活性的泵阿米德衍生物的实例。泵阿米德E是通过在细胞周期的G1/S限制位点和G2/M期使细胞分裂停止而抑制细胞增殖的。泵阿米德B衍生物可以抑制MDA-MB-435乳腺癌细胞增殖(Kinder等人，《J.Med.Chem.》2001，44，3692-3699)。
已知泵阿米德衍生物一个共同特征为它们是从Jaspis sp.或Pachastrissa sp.属的海绵分离得到的(Thale等人，《有机化学杂志》2001，66，1733-1741)。
发明内容
现在已发现，微生物菌株变绿粘球菌(Myxococcus virescens)ST200611(DSM 15898)能生成新的泵阿米德衍生物，它们在低浓度下抑制细胞增殖，因此适用于治疗和/或预防癌疾病。
因此，本发明涉及一种下式(I)化合物或式(I)化合物在生理学上可耐受的盐：

式中：
R₁是H或(C₁-C₆)-烷基，
R₂是H或OH，以及
R₃是H或-C(＝O)-(C₁-C₆)-烷基。
彼此独自地，R₁优选是H或甲基，而R₃优选是H。
优选本发明涉及如下定义的式(I)化合物，其中：
R₁是H或甲基，
R₂是H或OH，以及
R₃是H。
(C₁-C₆)-烷基是指具有至多6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基(Me)、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基或正己基，优选甲基。
此外，本发明还涉及一种式(I)化合物，它可用下式(II)化合物、下式(III)化合物、下式(IV)化合物表征：


本发明还涉及本发明式(I)化合物的所有明显的化学等效物。这些化学等效物仅显示很小的化学差异，并且它们具有相同的药理学作用，或它们在温和条件下可以转化成本发明的化合物。所述的等效物还包括例如式(I)化合物的盐、还原产物、氧化产物、酯、醚、乙缩醛或酰胺以及本技术领域的技术人员采用标准方法可以制备的等效物，除此之外，还包括所有光学对映体和非对映体以及所有立体异构体形式。
本发明还涉及制备下式(V)化合物或式(V)化合物在生理学上可耐受的盐的方法：

式中：
R₁是H或(C₁-C₆)-烷基，
R₂是H或OH，
R₃是H或-C(＝O)-(C₁-C₆)-烷基，以及
R₄是甲基或乙基，
该方法包括：
1.将菌株变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)或其变异株和/或突变株中的一种在培养介质中在合适条件下发酵直到一种或多种式(V)化合物在该培养介质中自然增长，
2.从该培养介质中分离式(V)化合物，以及
3.适当时，将式(V)化合物衍生和/或转化成在生理学上可耐受的盐。
优选本发明涉及制备其中R₄是乙基的式(V)化合物的方法。该方法的产物相应于如前面描述的式(I)化合物。
特别优选本发明涉及制备这样的式(V)化合物的方法，在式中，彼此独自地R₁是H或甲基，R₃是H，而R₄是乙基。
此外，本发明涉及制备式(II)化合物、式(III)化合物和式(IV)化合物以及泵阿米德衍生物E和F的方法。
除非另外指出，式(I)和(V)化合物的手性中心可以为R构型或为S构型。本发明涉及光学纯的化合物和立体异构体混合物，例如对映异构体混合物和非对映异构体混合物。
式(I)和(V)化合物在生理学上可耐受的盐应该理解是它们的有机盐和无机盐，如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》(第17版，第1418页(1985))中所描述的。鉴于较好的物理和化学稳定性以及较高溶解性的原因，所以对于含有酸基团的化合物，优选钠盐、钾盐、钙盐和铵盐；对于含有碱基团的化合物，优选盐酸、硫酸或磷酸的盐，或羧酸或磺酸的盐，例如乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸和对甲苯磺酸的盐。
所述培养介质是一种营养液或一种固体介质，它们含有至少一种通常的碳源和氮源以及通常的无机盐。如果向该培养介质添加羟基赖氨酸，则菌株变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)由于消化了羟基赖氨酸能够产生其中R₂是OH的化合物(V)。
因此，本发明主题的一部分涉及制备如前面所描述的其中R₂是OH的式(V)化合物的方法，并且其中步骤1的培养介质含有羟基赖氨酸。
本发明的方法可以用于实验室规模(毫升至升规模)发酵，也可以用于工业规模(立方米规模)发酵。
所述发酵的合适的碳源是可同化碳水化合物和糖醇，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或D-甘露醇，以及含碳水化合物的天然产品，例如麦芽汁或酵母提取物。含氮营养物的实例是氨基酸、肽和蛋白质，还有其降解产物，例如酪蛋白、蛋白胨或胰蛋白胨；肉膏、酵母提取物、谷蛋白、磨细种籽，例如玉米、小麦、豆、黄豆或棉花植物的种籽；生产醇的蒸馏残留物；肉粉；酵母提取物、铵盐、硝酸盐。优选的氮源是一种或多种肽，它们可采用合成或生物合成方法得到。无机盐的实例是碱金属、碱土金属、铁、锌、钴和锰的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐。微量元素实例是钴和锰。
制备本发明泵阿米德的合适条件如下：优选在一种培养介质中生成本发明的泵阿米德，所述培养介质含有0.05-5％、优选0.1-2.5％酵母提取物；0.2-5.0％、优选0.1-2％酪胨；0.02-1.0％、优选0.05-0.5％CaCl₂·2H₂O；0.02-1.5％、优选0.05-0.7％MgSO₄·7H₂O和0.00001-0.001％氰基维生素B₁₂。在每种情况下给出的百分数值都是以总营养液总重量计。
对所述微生物进行需氧培养，即例如进行深层培养，同时在振荡瓶或发酵器中进行振荡或搅拌，或在固体介质中进行需氧培养，必要时通入空气或氧气。可以在温度约18-35℃下、优选20-32℃、特别优选27-30℃下培养这种微生物。pH范围可以为4-10，优选6.5-7.5。一般而言，在这些条件下培养所述微生物的时间是2-10天，优选72-168小时。最好分几步培养这种微生物，即开始用一种液体营养介质制备一个或多个初步培养物，然后将这些初步培养物接种到实际生产介质中，即主培养物中，例如按体积计以1∶10至1∶100的比例进行接种。例如将呈营养细胞或子实体形式的菌株接种到一种营养液中，再使其生长约20-120小时，优选48-96小时，由此得到初步培养物。例如，使所述菌株在固体或液体营养底物，例如酵母琼脂上生长约1-15天、优选4-10天可以得到营养细胞和/或子实体。
采用已知的方法并考虑到天然物质的化学、物理和生物性质，可以由所述培养介质分离或纯化，从而得到一种式(V)泵阿米德衍生物。采用HPLC测定了在这种培养介质或在各个分离步骤中泵阿米德衍生物的浓度，同时很方便地将生成物质的量与一种校正液进行比较。
分离时，所述培养液或培养物与固体介质一起进行冷冻干燥，此后使用一种有机溶剂，例如甲醇或2-丙醇，从这种冻干物提取泵阿米德衍生物。所述有机溶剂相含有本发明的天然物质；适当时，对其进行真空浓缩，然后再进行进一步纯化。
采用适当材料的层析法，优选例如分子筛、硅胶、氧化铝、离子交换剂或吸附树脂或反相层析(RPs)，对本发明的一种或多种化合物进行进一步纯化。采用这种层析法分离泵阿米德衍生物。使用缓冲水溶液或水溶液和有机溶液的混合物对这些泵阿米德衍生物进行层析分离。
水溶液和有机溶液的混合物应该理解是所有与水混溶的有机溶剂，优选甲醇、2-丙醇或乙腈，有机溶剂的浓度是5-95％，优选5-40％，或与有机溶剂混溶的所有缓冲水溶液。使用的缓冲液与前面指出的相同。
基于它们的极性不同，可以采用反相层析法，例如使用MCl(日本，Mitsubishi的吸附树脂)或Amberlite XAD(TOSOHMS)，或其它疏水材料，例如RP-8或RP-18相，分离这些泵阿米德衍生物。另外，可以采用正相层析法，例如采用硅胶、氧化铝等，进行这种分离。
使用缓冲的碱性或酸化水溶液或水溶液与醇或其它与水混溶的有机溶剂的混合物，对这些泵阿米德衍生物进行层析分离。优选的是使用乙腈和甲醇作为有机溶剂。
缓冲的碱性或酸化水溶液应该理解是例如水、磷酸盐缓冲液、乙酸铵和柠檬酸盐缓冲液，其浓度直到0.5M，以及甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨和三乙胺，或本技术领域的技术人员已知的市售酸和碱，优选其浓度高至1％。在缓冲水溶液的情况下，特别优选的是0.1％乙酸铵。
采用100％水开始、100％溶剂结束的梯度法进行这种层析分离，优选采用5％到95％乙腈的线性梯度法进行这种层析分离。
或者，也可以进行凝胶层析分离或疏水相的层析分离。凝胶层析采用聚丙烯酰胺凝胶或共聚物凝胶进行，例如Biogel-P 2(Biorad)或FractogelTSK HW40(Merck，德国)。上述层析分离步骤的顺序可以颠倒。
如果泵阿米德以非对映异构体存在，那么则可以采用已知的方法，例如采用手性柱分离方法，将它们分离。
采用本身已知的方法(J.March，《高级有机化学》(Advanced OrganicChemistry)，John Wiley&Sons，第4版，1992年)，例如通过与一种酸酐进行反应，可将式(I)和/或(V)化合物(在每种情况下R₃都是H)侧链OH基团衍生得到一种酰基(在每种情况下R₄是-C(＝O)-(C₁-C₆)-烷基)。例如Adamczeski等人在《J.Am.Chem.Soc.》1989，111，647-654中描述了与乙酸酐反应，得到一种式(I)和/或(V)化合物，其中R₃是-C(＝O)-CH₃。
同样地，采用本身已知的方法(J.March，《高级有机化学》，John Wiley&Sons，第4版，1992年)，例如通过与Me₂CO₃或Me₂SO₄反应制备相应的N-甲基化衍生物，或通过在碱存在下与(C₁-C₆)-烷基溴进行反应，使式(I)和/或(V)化合物(在每种情况下R₁是H)的己内酰胺中的NH基团进行烷基化。
根据布达佩斯条约的规定，于2003年9月11日将微生物菌株变绿粘球菌ST200611分离物保藏于德国的德意志微生物保藏中心(DSM)，保藏号为DSM 15898，Mascheroder Weg 1B，38124Braunschweig。
菌株DSM 15898的营养细胞为棒状，这是变绿粘球菌的特征。在固体营养底物上，变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)形成含有圆形粘液孢子的橙黄色子实体。
除菌株变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)外，还可以使用能合成一种或多种本发明化合物的该菌株的突变株和/或变异株。
突变株是这样一种微生物，即其中基因组中的一种或多种基因已被决定着该生物体产生本发明化合物的一种基因或多种基因改性，同时依然保持功能性和可遗传性。
采用物理方法，例如辐照，像使用紫外射线或X-射线，或使用化学诱变剂，例如甲磺酸乙酯(EMS)、2-羟基-4-甲氧基苯甲酮(MOB)或N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，或如Brock等人在《微生物生物学》(Biology ofMicroorganism)，Prentice Hall，第238-247页(1984)中所描述的方法，以已知的方式可以生产这样一些突变株。
变异株是所述微生物的表型。微生物具有适应环境的能力，因此具有高发育的生理可塑性。在这种表型适应过程中涉及到微生物的所有细胞，在改变的条件下，其变化的性质不是遗传调节的，但是是可逆的(H.Stolp，《微生物生态学：有机体、生长环境、活力》(Microbial ecology：organismus，habitats，activities)，剑桥大学出版社，剑桥，GB，第180页，1988年)。
按照下面流程筛选可合成本发明的一种或多种化合物的突变株和/或变异株：
-将发酵介质冷冻干燥；
-用有机溶剂提取所述种冷冻干燥物；
-使用固相从培养物滤液中提取所述化合物；
-采用HPLC、TLC或通过试验生物活性进行分析。
描述的发酵条件可以适用于变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)及其突变株和/或变异株。
本发明还涉及微生物变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)或其突变株和/或变异株在制备如前面所述的式(V)化合物、特别是式(IV)化合物或其在生理学上可接受盐中的用途。
采用基于测定细胞内ATP浓度的试验来检测对细胞增殖的抑制作用。可以使用已知的肿瘤细胞系，例如Hep-G2和Colo205。在这个试验中，代谢活性细胞的ATP含量在荧光素酶反应中用作活细胞数的度量。
在该试验中采用的式(II)-(VI)化合物的单次剂量为0.3-40μM，以TC₅₀值给出剂量相关性，在每种情况下，(IIA)和(IIB)表示式(II)化合物的非对映异构体：

因此，本发明还涉及式(I)化合物或其在生理学上可接受盐作为人或动物药物的用途，特别是在治疗和/或预防癌疾病中的用途。优选本发明涉及式(I)化合物或其在生理学上可接受盐在治疗乳腺癌、肠癌、胃癌、肝癌、脑肿瘤、卵巢肿瘤、食道癌、肾癌和肌肉细胞瘤、特别是头和颈肌肉癌中的用途。
此外，本发明涉及一种含有至少一种式(I)化合物或其在生理学上可耐受的盐的药物，可以将一种或多种式(I)化合物本身给药，但是优选以含有一种或多种通常在药理学上合适的载体物质或辅助物质的混合物形式给药。
本发明化合物在固态下是稳定的，在pH 2-9、特别是在5-7的溶液中也是稳定的，因此可以配制为常规的盖仑制剂。
尽管本发明的药物可以口服或肠胃道外给药，但是直肠给药原则上也是可能的。合适的固体或液体盖仑制剂形式的实例是颗粒剂、粉剂、片剂、糖衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、混悬液、气雾剂或安瓿注射液，以及缓释活性化合物的制剂，制备这些制剂时，可以使用在药理学上合适的载体物质或辅助物质，例如崩解剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂、助流剂、润滑剂、矫味剂、甜味剂或稳定剂，例如碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇和其它糖、滑石粉、乳蛋白、明胶、淀粉、维生素、纤维素及其衍生物、动植物油、聚乙二醇和溶剂，例如无菌水、醇、乙二醇和多元醇。
必要时，可以将口服剂量单位微胶囊化，以便延缓释放或延缓达到一个相对长的时间，例如将颗粒状活性化合物包衣或包埋在适当的聚合物、蜡等中。
优选生产剂量单位的药物制剂并进行给药，每个单位含有确定剂量的一种或多种式(I)泵阿米德衍生物化合物作为活性组分。在固体剂量单位，例如片剂、胶囊和栓剂的情况下，该剂量可以多至每天约500mg，优选0.1-200mg，而在安瓿注射液的情况下，该剂量可以多至每天约200mg，但优选约0.5-100mg。
给药的日剂量取决于哺乳动物个体的体重、年龄、性别和状况。但是，可以理解，更高或更低的日剂量可能也适合。这种日剂量可以是单个剂量单位进行给药，或分为几个更小剂量单位进行给药，以及按照确定间隔将亚剂量分多次进行给药。
可以通过将一种或多种本发明的式(1)化合物加到适当给药形式中，任选加入一种或多种常规载体物质或辅助物质，来生产本发明的药物。
具体实施方式
下面的实施例用于更详细地解释本发明，但是不以任何方式限制本发明的保护范围。
除非另外指出，百分数值系指重量百分数，而在液体情况下混合比系指体积混合比。
实施例1：在-135℃储存变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)
在琼脂板(1％新baker氏酵母、1％CaCl₂·2H₂O、20mM HEPES、0.00005％氰基维生素B₁₂、1.5％琼脂，pH 7.2)上接种菌株变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)，并在30℃培养约7天。使用无菌药刀从琼脂表面刮下在表面培养物中的细胞，将其悬浮于0.5ml酪胨介质(1％酪胨(Difco)、0.15％MgSO₄·7H₂O，pH7.0)中，储存在-135℃下。
实施例2：在锥形瓶中制备变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)初步培养物
在300ml无菌锥形瓶中的100ml营养液(1％新baker氏酵母、1％CaCl₂·2H₂O、20mM HEPES、0.00005％氰基维生素B₁₂，pH7.2)中接种菌株变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)，该培养物在30℃、180rpm旋转振荡器上培养4天。然后使用5ml这种初步培养物制备主培养物。
实施例3：制备变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)的液体主培养物
在装有100ml含有下述营养液(0.5％酵母提取物、0.5％酪胨、0.1％CaCl₂·2H₂O、0.2％MgSO₄·7H₂O、0.00005％氰基维生素B₁₂，pH 7.4)的300ml无菌锥形瓶中，接种5ml初步培养物(见实施例2)或在新琼脂板(1％新baker氏酵母、1％CaCl₂·2H₂O、20mM HEPES、0.00005％氰基维生素B₁₂，pH7.2，1.5％琼脂)上生长的培养物，在30℃、于180rpm振荡器上进行培养。在72-96小时后本发明的泵阿米德达到最大量。如实施例2所述的由同样营养液得到的72-96小时龄深层培养物(接种量约5-10％)足以接种10-200L发酵罐。
实施例4：制备变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)的液体主培养物，同时加入羟基赖氨酸，用于生产泵阿米德衍生物(IV)
在装有100ml含有下述营养液(0.5％酵母提取物、0.5％酪胨、0.1％CaCl₂·2H₂O、0.2％MgSO₄·7H₂O、0.00005％氰基维生素B₁₂、1mM羟基赖氨酸，pH 7.4)的300ml无菌锥形瓶中，接种5ml实施例2的初步培养物或在新琼脂板(1％新baker氏酵母、1％CaCl₂·2H₂O、20mM HEPES、0.00005％氰基维生素B₁₂，pH 7.2，1.5％琼脂)上生长的培养物，在30℃、于180rpm振荡器上进行培养。在72-96小时后泵阿米德衍生物(IV)产生达到最大量。采用HPLC-MS进行分析。如实施例2所述由同样营养液得到的72-96小时龄深层培养物(接种量约5-10％)足以接种10-200L发酵罐。
实施例5：在发酵罐中制备泵阿米德衍生物
按照下述条件操作10L和30L发酵罐：
接种物       约5％             约9％
发酵罐       30L               10L
营养介质     见实施例2         见实施例2
培养温度     30℃              30℃
搅拌速度     112rpm            150rpm
通气         8L/min            4L/min
pH调节       PH 7.8至pH 7.5    PH 8.1至pH 7.5
pO₂调节      无                无
始终分别用10％KOH或10％H₂SO₄调节pH。重复添加Clerol FBA265(Cognis Deutschland GmbH)可以抑制泡沫的形成。在约72-96小时后达到最大的产生量。
实施例6：从振荡的变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)培养物中分离泵阿米德衍生物(II)和(III)以及泵阿米德E和F
在变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)发酵结束后，实施例3(30L培养液)的培养液与菌体一起进行冷冻干燥，冷冻干燥物用甲醇(2×5L)提取。甲醇提取物在真空下浓缩到1.2L，然后上样到制备柱上，该柱装填约1.5升CHP-20P材料(MCI凝胶，75-150μ，Mitsubishi Chemical Corporation)。该柱用95％甲醇洗脱。收集柱流出物(120ml/min)，并在真空下浓缩到1.5L。
实施例7：采用RP-18层析法制备泵阿米德衍生物(II)和(III)以及泵阿米德E和F
将1.5L如实施例6描述所得到的溶液上样于Phenomenex Luna10μC18(2)柱(尺寸：50mm×250mm)上，该柱具有一个Luna10μC18(2)前置柱(尺寸：21.2mm×60mm)，使用从5％到95％乙腈在水中的溶液(0.1％乙酸铵，pH 4.6，用乙酸调节pH)进行梯度洗脱60min。流速是150ml/min，馏分量是200ml。在馏分5-9、10-11和12-14中有泵阿米德。
实施例8：泵阿米德衍生物(II)和(III)以及泵阿米德E和F的纯化
将实施例7的单个馏分进行冷冻干燥，并用Phenomenex Luna10μC18(2)柱(尺寸：21mm×250mm)的HPLC纯化再一次，该柱有一个XTerraPrep MS C1810μm(Waters，尺寸19×10mm)前置柱。该柱在40min内使用5％到40％乙腈在水中的溶液梯度洗脱(加入0.1％乙酸铵，pH 8.8，用三乙胺调节pH)。按馏分收集柱流出物(50ml/min)，每馏分7.5ml。实施例7的馏分5-9含有式(III)化合物，在层析分离与冷冻干燥后得到86mg泵阿米德E(纯度＞95％)。在层析分离后，实施例7的馏分10-11得到145mg泵阿米德(II)(纯度＞95％，70/30非对映异构体混合物)和5mg泵阿米德F(纯度＞95％)。由实施例7的馏分12-14得到35mg泵阿米德(III)(纯度＞95％)，为非对映异构体混合物，其比75∶25。在每种情况下，该非对映异构体是相应的C-16差向异构体。
实施例9：从振荡的变绿粘球菌ST200611(DSM15898)培养物中分离羟基泵阿米德(IV)
在变绿粘球菌ST200611(DSM 15898)发酵结束后，实施例5(10L培养液)的培养液与菌体一起进行冷冻干燥，冷冻干燥物用甲醇(2×3L)提取。甲醇提取物在真空下浓缩到400ml，然后上样于一个制备柱上，该柱装填约0.6升CHP-20P(MCI凝胶，75-150μ，Mitsubishi Chemical Corporation)材料。该柱用5％至95％甲醇水溶液洗脱。在60min内按馏分收集柱流出物(100ml/min)。汇集含有所需衍生物的馏分(馏分45-109)，并在真空下浓缩到700ml。
实施例10：采用RP-18层析法预纯化羟基泵阿米德(IV)
将实施例9的溶液上样到一个Phenomenex Luna10μC 18(2)柱(尺寸：50mm×250mm)中，该柱有一个Phenomenex Luna10μC18(2)前置柱(尺寸：21.2mm×60mm)，在60min内使用从5％至40％梯度乙腈水溶液洗脱(0.1％乙酸铵，pH 8.8，用三乙胺调节其pH)。流速是150ml/min，馏分的量是225ml。馏分22含有所需的泵阿米德衍生物。
实施例11：纯化羟基泵阿米德(IV)
将实施例10的馏分22进行冷冻干燥，再采用PhenomenexLuna10μC18(2)柱(尺寸：21mm×250mm)的HPLC再纯化一次，该柱有一个Waters XTerraPrep MS C1810μm前置柱(尺寸19×10mm)。该柱再使用从5％到95％乙腈在水中的梯度溶液洗脱60分钟(加入0.1％乙酸铵，pH4.6，用乙酸调节pH)。按馏分(每种馏分7.5ml)收集柱流出物(50ml/min)。将含有泵阿米德的馏分(馏分26-28)合并、脱盐并冻干。由此，得到7mg泵阿米德(IV)，为比75∶25的非对映异构体混合物。
实施例12：式(II)化合物的表征：
经验式C₁₈H₃₂N₂O₆
分子量：372.47
非对映异构体混合物：75∶25



实施例13：式(III)化合物的表征：
经验式C₁₉H₃₄N₂O₆
分子量：386.49
非对映异构体混合物：75∶25


实施例14：式(IV)化合物的表征：
经验式C₁₈H₃₂N₂O₇
分子量：388.46
非对映异构体混合物：75∶25


实施例15：泵阿米德E的表征
经验式C₁₇H₃₀N₂O₆
分子量：358.44

实施例16：泵阿米德F的表征
经验式C₁₈H₃₂N₂O₆
分子量：372.47


实施例17：分离化合物(II)非对映异构体
采用一种手性柱(AD/H，Daicel，20×200mm，0.5ml流速，移动相：乙腈∶甲醇4∶1+0.1％NH₄Ac)分离实施例8的式(II)化合物非对映异构体混合物。采用分析AD/H柱(Daicel)(4.6×250mm，30℃，移动相：乙腈∶甲醇4∶1+0.1％NH₄Ac、0.75ml流速，Rt峰1：9.9min，Rt峰2：10.9min)校正光学纯度。


实施例18：对各种肿瘤细胞系进行细胞增殖测定
肿瘤细胞系Hep-G2(ATCC No.HB-8065)和COLO 205(ATCC No.CCL-222)用于测定细胞增殖。该细胞系分别以比率1000个细胞/孔[Hep-G2]和3500个细胞/孔[Colo205]接种到细胞培养介质中，并在37℃、5％CO₂下培养4小时。
Hep-G2的介质：Dulbecco氏改良Eagle氏培养基/Ham氏F12-Mix(Gibco)；NEAA(10％；非必需氨基酸，Gibco)、丙酮酸钠(1％，Gibco)，L-谷氨酰胺(1％，Gibco)、胎牛血清(5％；PAA)]。
COLO 205的介质：RPMI 1640(Gibco)、L-谷氨酰胺(1％，Gibco)、HEPES(1％，Gibco)、胎牛血清(10％；PAA)。
在4小时后，将化合物(II)、(III)和(IV)以及泵阿米德E和F溶于DMSO/细胞培养介质中，再以各种浓度加入，将这些混合物在37℃、5％CO₂下培养72小时。使用检测试剂CellTiterGlo(Promega)测定细胞内ATP的含量。
细胞增殖试验结果列于表1。