丹参中新的化合物、其衍生物及其制备方法和医药用途.pdf

本发明属于医药技术领域，涉及丹参中新的化合物及其衍生物、其制备方法和用途。所述的三个新化合物为丹参新内酯A、丹参新内酯B、丹参新内酯C及其衍生物和有效部位，它们具有式(1)化学结构通式，本发明还涉及该类新骨架化合物及其衍生物和有效部位在制备药物方面的用途，特别是在制备精神类药物、抗癌类药物方面的用途。其中：R1选自氢、烷基、不饱和烃基、羟基、烷氧基、羧基、酯化的羧基、芳香取代基、卤素等；R2、R3、R4选自氢、烷基、不饱和烃基、芳香取代基、低级糖糖苷、多聚糖糖苷、金属离子、有机酸酯基，R2、R3、R4可相同也可不同。

1.  丹参中新的化合物及其衍生物，其特征在于：所述的化合物及其衍生物有如下结构通式：

其中：R₁选自氢、烷基、不饱和烃基、羟基、烷氧基、羧基、酯化的羧基、芳香取代基、卤素等；R₂、R₃、R₄选自氢、烷基、不饱和烃基、芳香取代基、低级糖糖苷、多聚糖糖苷、金属离子、有机酸酯基，R₂、R₃、R₄可相同也可不同。

2.  根据权利要求1所述的丹参中新的化合物及其衍生物，其特征在于：所述化合物及其结构式为：

    丹参新内酯A            丹参新内酯B                   丹参新内酯C

3.  权利要求1或2所述的丹参中新的化合物及其衍生物可以作为活性成分与一种或多种药学上可接受的载体组成的药物组合物。

4.  一种如权利要求1所述的丹参中新的化合物及其衍生物的制备方法，其特征在于所述该化合物的制备方法如下：
选用市售为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)根及根茎制成的丹参饮片，或新鲜采集的丹参或同属其他植物的根及根茎或其他部位为原料，用20倍量的水加热煎煮提取3次，每次两小时，合并提取液并减压浓缩，浓缩液上X-5型大孔树脂，分别用水、30％的乙醇水、50％的乙醇水、95％的乙醇水洗脱，减压浓缩回收溶剂，得到水洗部分400g，30％的乙醇水洗部分100g，50％的乙醇水洗部分50g，95％的乙醇水洗脱部分18g；
95％的乙醇水洗脱部分18g经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇溶剂系统为流动相梯度洗脱，得到18个馏分，其中0.6g馏分12再次经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇溶剂系统为流动相梯度(100∶0到0∶100)洗脱，得到3个馏分，将0.2g馏分2经Sephadex LH-20以甲醇为流动相分离得到60mg化合物1；
取50％的乙醇水洗脱部分50g经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇溶剂系统为流动相梯度(100∶0到0∶100)洗脱，得到25个馏分，将0.7g馏分8经Sephadex LH-20以甲醇为流动相分离得到100mg化合物3。将1.2g馏分18再次上经硅胶柱色谱用氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，得到5个馏分，将0.1g馏分3经Sephadex LH-20以甲醇为流动相分离得到30mg化合物2。

5.  权利要求1或2的所述的丹参中新的化合物及其衍生物在制备治疗精神类疾病药物中的应用。

6.  权利要求1或2的所述的丹参中新的化合物及其衍生物在制备抗癌类药物中的应用。

丹参中新的化合物、其衍生物及其制备方法和医药用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及丹参中新的化合物及其衍生物、其制备方法和医药用途。
背景技术
丹参Salvia miltiorrhiza Bge.是我国传统医药学中广泛使用的药物之一。作为治疗心血管疾病的药物，用药基础广阔，且疗效显著，临床应用历史悠久。现代医学研究和临床实践表明，丹参有扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量、减慢心率，改善心肌缺氧之功效，常用于治疗冠心病、心绞痛、胸闷、心悸等症。可治疗心肌梗塞、心肌炎，可改善急性症状和心电图缺血性改变。丹参可抑制血小板凝集、抑制血小板的释放反应、降低血粘度、降低血脂，可治疗高粘滞血症。丹参能对抗红细胞聚集、减轻动脉粥样硬化、可抑制纤维蛋白元转变成纤维蛋白，因此，具有防止血栓形成和抗凝作用。临床主要用于心绞痛、心肌梗塞和纤维化、肾衰等疾病的治疗。
随着社会经济的迅猛发展，社会压力逐渐增大，一些精神类疾病如抑郁症、老年痴呆、精神分裂症和强迫症等给个人健康和家庭生活带来了严重危害。现在市售的一些治疗精神类疾病的药物多副作用较大，如焦虑、头痛、嗜睡、失眠手脚麻木等。目前还未见丹参或其成分用于抗癌和治疗精神病。本发明涉及的这类新骨架化合物与抗抑郁药有部分相似结构，对研制新型精神类药物有很大启发。
发明内容：
本发明目的之一是提供一种通式(I)的新化合物及其衍生物，本发明的目的之二是提供该类新化合物及其衍生物和有效部位的提取、制备方法，本发明的目的之三还涉及该类新化合物及其衍生物和有效部位在制备药物方面的应用，特别是治疗老年痴呆药物和抗癌类药物方面的应用。
本发明所说的一类新化合物(包括丹参新内酯A、丹参新内酯B、丹参新内酯C)及其衍生物其结构通式如下：

其中：R₁选自氢、烷基、不饱和烃基、羟基、烷氧基、羧基、酯化的羧基、芳香取代基、卤素等；R₂、R₃、R₄选自氢、烷基、不饱和烃基、芳香取代基、低级糖糖苷、多聚糖糖苷、金属离子、有机酸酯基等(R₂、R₃、R₄可相同也可不同)。
本发明中所述的新化合物1丹参新内酯A，其化学结构如下：

新化合物2丹参新内酯B，其化学结构如下：

新化合物3丹参新内酯C，其化学结构如下：

其化合物的制备方法如下：
选用市售为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)根及根茎制成的丹参饮片，或新鲜采集的丹参或同属其他植物的根及根茎或其他部位为原料，用20倍量的水加热煎煮提取3次，每次两小时，合并提取液并减压浓缩，浓缩液上X-5型大孔树脂，分别用水、30％的乙醇水、50％的乙醇水、95％的乙醇水洗脱，减压浓缩回收溶剂，得到水洗部分400g，30％的乙醇水洗部分100g，50％的乙醇水洗部分50g，95％的乙醇水洗脱部分18g。
取95％的乙醇水洗脱部分18g经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇溶剂系统为流动相梯度洗脱，得到18个馏分，其中馏分12(0.6g)再次经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇溶剂系统为流动相梯度洗脱，得到3个馏分，将馏分2(0.2g)经Sephadex LH-20以甲醇为流动相分离得到化合物1(60mg)。
取50％的乙醇水洗脱部分50g经硅胶柱色谱以氯仿-甲醇溶剂系统为流动相梯度洗脱，得到25个馏分，将馏分8(0.7g)经Sephadex LH-20以甲醇为流动相分离得到化合物3(100mg)。将馏分18(1.2g)再次上经硅胶柱色谱用氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，得到5个馏分，将馏分3(0.1)经Sephadex LH-20以甲醇为流动相分离得到化合物2(30mg)。
本发明还可以制备成含有上述结构通式的衍生物和有效部位的药物。
其中该类化合物的衍生物可以是但不限于如下几种：
A.甲基化衍生物：以丹参新内酯A甲基化为例，将丹参新内酯A溶于DMSO中，加入适当NaOH，在80～100温度下反应，待溶液接近中性时反应基本完成，重结晶得到甲基衍生化的丹参新内酯A。
以丹参新内酯A 14-OH甲基化为例，生成丹参新内酯A甲基化衍生物，示例结构式为：

B.卤素取代衍生物：以丹参新内酯A 14-OH卤素取代为例
a.氯代：在氩气保护下将丹参新内酯A溶入干燥二氯甲烷中，然后加入氯化锌，最后加入亚硫酰二氯，一定温度下搅拌。用饱和的碳酸氢钠终止反应，有机层水洗，干燥，蒸干溶剂。柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱得到氯代衍生化的丹参新内酯A。

b.溴代：在氩气保护下将丹参新内酯A搅拌加入四氢呋喃溶解的NBS，之后滴加四氢呋喃溶解的三苯基磷，一定温度下搅拌反应，减压蒸出溶剂，残渣用水和醚洗，蒸出溶剂。柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱得到溴代衍生化的丹参新内酯A。

c.碘代：向容器中加入丹参新内酯A，三苯基磷，咪唑，碘与甲苯，氩气保护下搅拌，一定温度下回流。反应后，除去沉淀，加入Na₂S₂O₃水溶液，除去水层，保留有机层。有机层水洗，无水硫酸钠除水，减压蒸出溶剂。柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱得到碘代衍生化的丹参新内酯A。

B.糖苷类衍生物：以丹参新内酯A为例，将丹参新内酯A与葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖等单糖或由上述单糖聚合形成的双糖、三糖等寡糖在干燥HCl条件下回流加热，反应完成后用乙酸乙酯提取，重结晶即得糖苷类衍生化的丹参新内酯A.
以丹参新内酯A 14-OH与葡萄糖、鼠李糖、木糖、甘露糖等单糖或由上述单糖聚合形成的双糖、三糖等寡糖结合为例，生成苷类化合物，示例结构式为：


D.金属盐衍生物：丹参新内酯A中的酚羟基具有酸性，可与Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等碱金属离子结合生成金属盐衍生物。以丹参新内酯A 14-OH与Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等碱金属离子结合生成金属盐衍生物为例，示例衍生物结构式为：


E.脂类衍生物：以丹参新内酯A为例，如在氩气保护下将丹参新内酯A溶入干燥二氯甲烷中，然后加入R-C(O)-OH，DMAP与DCC，一定温度下搅拌，等反应结束后，过滤出去未反应的DCC和反应后生成的DCU与DMAP等杂质。蒸出溶剂，将反应物研细，用醚溶解搅拌，静置过滤除去杂质，蒸出溶剂。柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱得到酯化衍生的丹参新内酯A。
丹参新内酯A 14-OH与甲酸、乙酸或乙酸酐、丁酸或丁酸酐、丁二酸或丁二酸酐、苯甲酸或苯甲酸酐等小分子有机酸、酸酐或酰卤生成有机酸酯，示例衍生物结构式为


丹参新内酯A 14-OH与棕榈酸、亚油酸、油酸、月桂酸等大分子有机酸生成有机酸酯，示例衍生物结构式为：


F.丹参新内酯A 7-OH、8-OH；丹参新内酯B 7-OH，8-OH，14-OH；丹参新内酯C 7-OH，8-OH，14-OH发生上述A～E所述衍生化反应，生成相应衍生化产物。
G.璜基或硝基衍生物：以丹参新内酯A为例，丹参新内酯A与浓硫酸反应，在较低温度下(15～25℃)生成临位磺酸基衍生化丹参新内酯A，在较高温度下(80～100℃)生成对位磺酸基衍生化丹参新内酯A。丹参新内酯A与稀硝酸在较低温度下即可生成硝基衍生化丹参新内酯A。
生成以丹参新内酯A 8-OH与硫酸、硝酸生成璜基或硝基衍生物为例，示例衍生物结构式为：


H.丹参新内酯A 7-OH、14-OH；丹参新内酯B 7-OH，8-OH，14-OH；丹参新内酯C 7-OH，8-OH，14-OH发生上述G所述衍生化反应，生成相应衍生化产物。
I.以丹参新内酯B 17-COOH具有酸性，可与Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等碱金属离子结合生成金属盐衍生物，以丹参新内酯B17-COOH为例，示例衍生物结构式为：


J.以丹参新内酯B17-COOH与醇类发生酯化反应生成脂类衍生物为例，采用Vesley法，丹参新内酯B17-COOH与醇类(R-OH)发生酯化反应生成脂类衍生化丹参新内酯B，收率可达90％以上。
示例结构如下：

K.以丹参新内酯B17-COOH与氨或胺发生反应生成酰胺类衍生物为例，在氩气保护下将丹参新内酯B溶入干燥二氯甲烷中，然后加入R-NH₂，DMAP与DCC，一定温度下搅拌，等反应结束后，过滤出去未反应的DCC和反应后生成的DCU与DMAP等杂质。蒸出溶剂，将反应物研细，用醚溶解搅拌，静置过滤除去杂质，蒸出溶剂。柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱得到氨基化衍生的丹参新内酯B。
示例结构如下，如

L.以丹参新内酯C 17-COOCH₃发生酯水解反应生成羧酸为例，示例结构式如下：

M.丹参新内酯C 17-COOCH₃在碱性条件下发生酯水解反应生成羧酸后可发生上述I～K反应，生成相应的衍生物。
本发明提供了丹参中一类新的化合物及其衍生物，其制备方法简单易行，制备的化合物具有较好的抗癌和抗抑郁作用。
附图说明：
图1为丹参新内酯A的¹H-NMR(MeOH，300Hz)
图2为丹参新内酯A的¹³C-NMR(MeOH，75Hz)
图3为丹参新内酯A的¹³C-NMR(MeOH，75Hz)
图4为丹参新内酯A的HSQC(MeOH，600Hz)
图5为丹参新内酯A的HBCC(MeOH，600Hz)
图6为丹参新内酯B的¹H-NMR(MeOH，600Hz)
图7为丹参新内酯B的¹³C-NMR(MeOH，125Hz)
图8为丹参新内酯B的DEPT(MeOH，125Hz)
图9为丹参新内酯C的¹H-NMR(MeOH，300Hz)
图10为丹参新内酯C的¹³C-NMR(MeOH，75Hz)
图11为丹参新内酯C的HSQC(DMSO，600Hz)
图12为丹参新内酯C的HBCC(DMSO，600Hz)
图13为化合物1及其衍生物的结构式
具体实施方式：
实施例1：药效学实验：
(一)抗老年痴呆活性研究
抗小胶质细胞活化药物筛选。
小胶质细胞活化介导的慢性炎症反应是神经退行性疾病的发生、发展过程中的的重要环节，抑制小胶质细胞的激活可能成为药物发现的一个新的靶点。LPS激活小胶质细胞释放NO、促炎症细胞因子和活性氧等。本实验通过建立体外LPS激活N9小胶质细胞异常活化的筛选平台，以激活小胶质细胞释放NO为指标，在3种提取分离的化合物中筛选具有小胶质细胞活化抑制作用的化合物。
实验材料：
(1)细胞：N9小胶质细胞
(2)试剂：胎牛血清Fetal bovine serum(Gibco BRL，Grand Island，USA)；IMDM培养基(Gibco BRL，Grand Island，USA)；LPS(E5：055)(Sigma，St.Louis，MO，USA)；MTT(Sino-AmericanBiotechnology，Beijing，China)；咪诺环素(MINO)。
(3)受试样品：丹参新内酯A、丹参新内酯B、丹参新内酯C
实验方法：
(1)小鼠小胶质细胞系N9的培养
细胞培养和模型建立中使用的所有玻璃器皿及金属器械(培养瓶，移液管，溶液瓶等)，均经过121℃高压灭菌30min，以彻底去除污染的LPS。以IMDM培养基作为基础配制成内含5％小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素及50μM 2-巯基乙醇的细胞培养液。小胶质细胞以约4×10⁵cells/mL的浓度在5％CO₂，37℃培养瓶中传代培养，至第三天贴壁细胞约占培养瓶底面积50-60％，以胰酶消化贴壁细胞，传代至另一培养瓶。以-70℃超低温冰箱冻存复苏后的N9作为第一代，选择第3-8代N9细胞进行实验。
(2)药物配置方法
化合物用DMSO配置成100mM储备液，避光保存于-20℃。临用时用含1％血清IMDM培养液稀释到相应浓度进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度小于1‰。
(3)Griess法检测化合物对LPS激活小胶质细胞的抑制作用
取对数生长期的N9小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜IMDM培养基将细胞密度调至5×10⁵cells/mL，接种于96孔扳内，100μl/well，于37℃，5％CO₂的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理。样品设剂量0.3，3，30μM与LPS共同作用。同时设空白对照和阳性对照咪诺环素(MINO，20μM)。各给药组及阳性对照组中LPS终浓度为1μg/mL。细胞加药后继续培养48h后，收集上清液，Griess比色法检测上清液中NO_2-含量。
(4)MTT法检测化合物对小胶质细胞细胞成活率的影响
取对数生长期培养的N9小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜IMDM培养基将细胞密度调至5×10⁵cells/mL，接种于96孔扳内，100μl/well，于37℃，5％CO₂的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成新鲜培养液，同时进行加药处理。样品设剂量0.3，3，30μM与LPS共同作用。同时设空白对照和阳性对照。各给药组及阳性对照组中LPS终浓度为1μg/mL。细胞加药后继续培养48h，然后向细胞液中加入MTT溶液，10μl/well，将细胞与0.25mg/mLMTT于37℃下共同孵育3h，吸除培养液，然后加入等体积的DMSO溶液，测定其光密度OD值。数据处理，利用酶标仪相应软件进行数据处理，计算每一种样品三个孔OD值的平均值，利用平均值按如下公式计算细胞成活率(cell viability，CV％)。
细胞成活率％＝样品组OD值的平均值/空白对照组OD值的平均值×100％
CV％＝ODsample/ODcontrol×100％
统计学处理方法
全部资料采用SPSS(11.5)统计软件包进行检验分析。结果用平均值±标准误表示，组间均数比较进行方差齐性分析，并进行Dunnett’s test分析方法进行组间比较和Student’s test统计学处理。
实验结果：
表1三种样品对LPS激活N9小胶质细胞释放一氧化氮(％)的影响(M+SE)

###：与空白对照组相比，P＜0.001；^*与模型对照组比较，P＜0.05；^**：与模型对照组比较，P＜0.01；^***，与模型对照组比较，P＜0.001。
表2三种化合物对N9小胶质细胞存活率(％)影响(M+SE)

实验结论：
(1)药物丹参新内酯A、丹参新内酯B、丹参新内酯C可以不同程度的抑制激活的小胶质细胞释放NO，见表1。
(2)其中丹参新内酯A、丹参新内酯C活性比阳性药强，对NO释放抑制作用的IC₅₀＜20μM。
(二)抗癌活性研究
抑制HL-60细胞株增殖活性筛选
针对参新内酯A、丹参新内酯B、丹参新内酯C人白血病细胞株HL-60，采用经典的MTT法进行抗肿瘤活性筛选。
实验材料
(1)受试药品：参新内酯A、丹参新内酯B、丹参新内酯C
(2)实验细胞株及来源：HL-60：人急性髓性白血病细胞(购自ATCC)
(3)实验试剂：RMPI 1640培养液(购自Gibco)、胎牛血清(TBD公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma)、二甲基亚砜(DMSO)、NaCl、KCl、KH₂PO3、Na₂HPO3、NaHCO3、酶标仪(奥地利TECAN)、96孔细胞培养板(Costar公司)
实验方法
1、药物处理
(1)药物的溶解
化合物参新内酯A、丹参新内酯B、丹参新内酯C均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mmol/L的母液，储存于-20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为100μmol/L，10μmol/L，1μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。选取YH-21(芫花酯甲)作为阳性对照药，浓度为10μmol/L。
(2)给药处理
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μL/well，培养于37℃，5％CO₂的培养箱内。培养24h后，将药物稀释为100μmol/L，10μmol/L，1μmol/L三个浓度，10μL/well，作用48h。分设空白组、给药组，每组设5个复孔。
2、MTT检验
(1)MTT法的基本原理
细胞成活率测定采用MTT分析法，以活细胞代谢还原四甲基偶氮唑盐(3-(4，5-dimethyl-2thiahiazoyl)-3，5-di-phenyl-tetrazoliumbromide，MTT)为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下四氮唑环开裂，生成蓝色的Formazan结晶，Formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。死细胞中此酶消失，不能将MTT还原。还原成生成的Formazan结晶可在含50％的，N，N-二甲基酰胺和20％的十二烷基磺酸钠(PH4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm出的光密度OD值，OD值的大小与所生成的Formazan结晶的量成正比，从而反应出药物对细胞成活率的影响。
(2)MTT法的测定方法
药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于490nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100％，计算各组细胞抑制率。

3、统计方法
全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’s T3检验进行组间比较。
4、IC50的计算方法
将各剂量和抑制率等参数用非线性回归拟合计算IC50。
实验结果
表1化合物对肿瘤细胞HL-60成活的抑制率(％)(M±SE)

^***P＜0.001 Vs Control；^**P＜0.01 Vs Control；^*P＜0.05Vs Control
表2化合物YH-21对肿瘤细胞HL-60成活的抑制率(％)(M±SE)