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芫花中新的瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及芫花中新的瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法，本发明还涉及该类新化合物在抗肿瘤生物活性方面的用途。
背景技术
瑞香科植物芫花(Daphne genkwa sieb.et Zucc)为传统的泻下逐水药。目前对其抗肿瘤、引产、镇咳祛痰、杀虫、抗炎、免疫功能调节等方面研究较多。国内外学者从瑞香科植物芫花的花及花蕾、根、中分离得到了一系列具有特殊结构的瑞香烷型二萜原酸酯类化合物。瑞香烷型二萜又名瑞香毒素类化合物(Daphnetoxin)具有很强的生物活性，20世纪70年代初，人们从瑞香属植物中分离出具有抗肿瘤活性的欧亚瑞香素(Mezerein)和瑞香毒素(Daphnotoxin)后，该类化合物便成为一个研究热点，由于瑞香烷型二萜具有独特的抗肿瘤生理活性而受到重视。
现代医学研究表明癌症是一种特别严重的癌毒扩散症，癌毒的形成是目前的生活方式的产物，并有越来越严重的的趋势。因此寻找更加有效的抗癌、抗肿瘤药物刻不容缓。
发明内容：
本发明的目的旨在从中药芫花中寻找新的抗肿瘤前体药物，提供该类瑞香烷型二萜类化合物的提取、制备方法，并且研究它们的抗肿瘤生物活性和医药用途。本发明的另一个目的在于提供该类化合物的结构鉴定方法。
(一)本发明所述一系列6个新的瑞香烷型二萜类化合物(Genkwanine II，Genkwanin III，Genkwanin IV，Genkwanin V，Genkwanin VI，Genkwanin VII)的结构式如下：


(二)本发明所述新的瑞香烷型二萜类化合物(GenkwanineII，GenkwaninIII，GenkwaninIV，GenkwaninV，GenkwaninVI，GenkwaninVII)的提取、制备方法如下：
选用瑞香科植物芫花(Daphne genkwa.et zucc)的干燥花蕾4000～6000g为原料，5～8倍量的体积比为60％～95％工业乙醇室温下冷浸提取15～20天，每24～48h小时减压浓缩一次，累计总浸膏500～600g，总浸膏用3～5L水混悬后，分别用氯仿，正丁醇以1:1的体积比进行萃取，萃取3～5次，得到的氯仿层干浸膏200～300g，正丁醇层干浸膏200～300g，及浓缩后水液10～15L；
氯仿层浸膏进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，沸程为30～60℃，或60～90℃的石油醚-丙酮50:1～2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，每300～500ml体积为一馏分，共收集到40～50个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并得到F1～F6的6个馏分，
馏分F4经氯仿-甲醇100:0～2:1混合溶剂梯度洗脱，得到F4-1～F4-6的6个馏分，F4-4分别经MCI gel柱色谱甲醇-水系统梯度洗脱除去叶绿素，硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇系统洗脱分离，C₁₈反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水系统梯度洗脱分离，旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质，化合物Genkwanin VI和Genkwanin VII；
馏分F6经氯仿-甲醇80:0～2:1或二氯甲烷-甲醇80:0～2:1混合溶剂梯度洗脱，得到F6-1～F6-4的4个馏分，F6-2分别经MCI gel柱色谱甲醇-水系统梯度洗脱除去叶绿素，硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇系统洗脱分离，C₁₈反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水系统梯度洗脱分离，旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质，化合物Genkwanin II，GenkwaninIII，GenkwaninIV，GenkwaninV。
根据如上所述的提取及萃取方法得到的氯仿层干浸膏经石油醚-丙酮系统50:1～2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱硅胶柱层析后得到馏分F1-F6。
馏分F3经石油醚-丙酮80:0～2:1或二氯甲烷-甲醇100:0～2:1混合溶剂梯度洗脱，得到F3-1～F3-7的7个馏分，馏分F3-3经MCI gel柱色谱以甲醇-水或乙醇-水系统梯度洗脱，收集20～50％洗脱的馏分，经C₁₈反相硅胶柱色谱以甲醇-水系统梯度洗脱，收集50～80％洗脱的馏分，经反相制备高效液相色谱分离，采用甲醇-水系统梯度洗脱，回收溶剂后，共得到化合物GenkwaninII，GenkwaninIV，GenkwaninV。
洗脱后的馏分中含有瑞香烷型二萜的部分用氯仿-甲醇系统30:1～20:1展开，其Rf值在0.1～0.8；254nm紫外灯鉴别或显色剂鉴别，显色剂可以是10％硫酸显色剂，或10％硫酸偏矾酸铵-显色剂，或10％硫酸-香草醛显色剂。
(三)本发明所述新的瑞香烷型二萜类化合物(Genkwanine II，GenkwaninIII，GenkwaninIV，GenkwaninV，GenkwaninVI，GenkwaninVII)具有较好的抗肿瘤活性。
1.实验材料
1.1 受试品：化合物GenkwanineII，GenkwaninIII，GenkwaninIV，GenkwaninV，GenkwaninVI，GenkwaninVII。
1.2 实验细胞株及来源HL-60：人急性髓性白血病细胞
2.实验方法
2.1 药物处理
药物的溶解
化合物GenkwanineII，GenkwaninIII，GenkwaninIV，GenkwaninV，GenkwaninVI，GenkwaninVII均为粉末状，使用DMSO溶解。配成浓度为100mmol/L的母液，储存于-20℃。临用时用相应的培养液将其稀释为100μmol/L，10μmol/L，1μmol/L进行实验。DMSO配置的样品进行实验时，DMSO的终浓度为1‰。文献报道yuanhuacine具有抗肿瘤活性且结构与待测化合物类似，因此选取yuanhuacine作为阳性对照药，浓度为10μmol/L。
给药处理
取对数生长期的细胞，调整适当的细胞密度，接种于96孔板内，100μL/well，培养于37℃，5％CO₂的培养箱内。培养24h后，将药物稀释为100μmol/L，10μmol/L，1μmol/L三个浓度，10μL/well，作用48h。分设空白组、给药组，每组设5个复孔。
2.2 MTT法的测定方法
药物作用48h后，将细胞与0.25mg/ml MTT于37℃下共同孵育4h，吸除培养液后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，完全溶解后使用酶标仪于490nm测定其光密度OD值。最后以空白组OD值为100％，计算各组细胞抑制率。

2.3.统计方法
全部资料采用SPSS(13.0)统计软件包进行检验分析。各组数据用均值±标准误(Mean±S.E.)表示，采用One-Way ANOVA评价整体性差异，并进行Dunnett或Dunnett’s T3检验进行组间比较。
3.实验结果
表1  化合物对肿瘤细胞HL-60成活的抑制率(％)(M±SE)

^***P<0.001Vs Control；^**P<0.01Vs Control；^*P<0.05Vs Control
表2  化合物YH-21对肿瘤细胞HL-60成活的抑制率(％)(M±SE)
 

control6.25μmol/L12.5μmol/L25μmol/L50μmol/LIC50μmol/LYH-210.00±0.1824.041±0.24^***41.20±0.08^***82.96±0.07^***86.653±0.15^***12.90
由上述实验结果可看本发明所涉药物作用48h之后，6种化合物对HL-60细胞株均具有一定杀伤作用。其中化合物GenkwaninVI的作用最为明显，其次是GenkwaninVII。
化合物GenkwanineII，GenkwaninIII，GenkwaninIV，GenkwaninV虽对HL-60细胞株有一定的杀伤作用，但效果不明显。
本发明所涉瑞香烷型二萜类新化合物，部分对HL-60人急性髓性白血病细胞具有显著抑制作用，并且可能对其他肿瘤细胞具有较好的抑制作用，如A-549人非小细胞性肺癌细胞，HeLa子宫颈癌细胞系等，可用于开发抗肿瘤、抗癌类药物，尤其针对临床化疗阶段药物。
本发明制备方法简单，重现性好，提取纯度高。获得的化合物具有较好的抗肿瘤活性作用。
附图说明
图1为Genkwanine II的¹H-NMR
图2为Genkwanine II的¹³C-NMR
图3为Genkwanine II的HSQC
图4为Genkwanine II的HMBC
图5为GenkwanineIII的¹H-NMR
图6为GenkwanineIII的¹³C-NMR
图7为GenkwanineIII的HSQC
图8为GenkwanineIII的HMBC
图9为GenkwaninIV的¹H-NMR
图10为GenkwaninIV的¹³C-NMR
图11为GenkwaninIV的HMBC
图12为GenkwaninV的¹H-NMR
图13为GenkwaninV的¹³C-NMR
图14为GenkwaninV的HSQC
图15为GenkwaninV的HMBC
图16为GenkwaninVI的¹H-NMR
图17为GenkwaninVI的¹³C-NMR
图18为GenkwaninVI的HMBC
图19为GenkwaninVII的¹H-NMR
图20为GenkwaninVII的¹³C-NMR
图21为GenkwaninVII的HMBC
具体实施方式
制备实施例1
选用瑞香科植物芫花(Daphne genkwa.et zucc)的干燥花蕾6000g为原料，6倍量的体积比为95％工业乙醇室温下冷浸提取20天，每48h小时减压浓缩一次，累计总浸膏525g，总浸膏用4L水混悬后，分别用氯仿，正丁醇以1:1的体积比进行萃取，萃取4次，得到的氯仿层干浸膏245g，正丁醇层干浸膏250g，及浓缩后水液15L；
氯仿层浸膏进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，沸程为30～60℃的石油醚-丙酮30:1，10:1，5:1，2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，每500ml体积为一馏分，共收集到46个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并得到F1～F6的6个馏分，
馏分F4经氯仿-甲醇100:0，30:1，8:1，3:1，2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，得到F4-1～F4-6的6个馏分，F4-4分别经MCI gel柱色谱甲醇-水系统梯度洗脱除去叶绿素，硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇系统30:1，8:1，2:1(V/V)洗脱分离，C₁₈反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水系统70％，80％，90％梯度洗脱分离，旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质，化合物Genkwanin VI和Genkwanin VII；
馏分F6经氯仿-甲醇80:1，30:1，8:1，2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，得到F6-1～F6-4的4个馏分，F6-2分别经MCI gel柱色谱甲醇-水系统梯度洗脱除去叶绿素，硅胶柱色谱二氯甲烷-甲醇系统30:1，10:1，2:1(V/V)洗脱分离，C₁₈反相硅胶柱色谱以及制备高效液相色谱甲醇-水系统60％，80％梯度洗脱分离，旋转蒸发仪回收溶剂得到白色粉末或透明状物质，化合物Genkwanin II，GenkwaninIII，GenkwaninIV，Genkwanin V。
制备实施例2
选用瑞香科植物芫花(Daphne genkwa.et zucc)的干燥花蕾6000g为原料，6倍量的体积比为95％工业乙醇室温下冷浸提取20天，每48h小时减压浓缩一次，累计总浸膏525g，总浸膏用4L水混悬后，用氯仿以1:1的体积比进行萃取，萃取4次，得到的氯仿层干浸膏245g。
氯仿层浸膏进行快速减压柱色谱或常压柱色谱分离，沸程为30～60℃的石油醚-丙酮30:1，10:1，5:1，2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，每500ml体积为一馏分，共收集到46个馏分，经硅胶薄层层析检识，合并得到F1～F6的6个馏分，
馏分F3经石油醚-丙酮80:0，50:1，10:1，5:1，2:1(V/V)或二氯甲烷-甲醇100:0，30:1，10:1，3:1，2:1(V/V)混合溶剂梯度洗脱，得到F3-1～F3-7的7个馏分，馏分F3-3经MCI gel柱色谱以甲醇-水系统梯度洗脱，收集30％洗脱的馏分，经C₁₈反相硅胶柱色谱以甲醇-水系统梯度洗脱，收集70％洗脱的馏分，经反相制备高效液相色谱分离，采用甲醇-水系统55％，65％，80％梯度洗脱，回收溶剂后，共得到化合物Genkwanin II，GenkwaninIV，Genkwanin V。
本发明所述新的瑞香烷型二萜类化合物(Genkwanine II，GenkwaninIII，GenkwaninIV，Genkwanin V，GenkwaninVI，GenkwaninVII)的结构解析
实验例1：
Genkwanine II，白色无定形粉末(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇。[α]_D²²-57.3(c0.012，CHCl₃)高分辨质谱给出准分子离子峰m/z 527.2258[M+Na]⁺(计算值为527.2252)，结合¹H，¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₇H₃₆O₉，显示有10个不饱和度。
¹H NMR(600MHz，CDCl₃)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征，¹H NMR谱中δ_H 8.12(2H，m)，7.56(1H，m)和7.45(2H，m)的存在，提示分子中有一单取代苯基；三个甲基特征质子信号δ_H 1.87(3H，s)，1.00(3H，d，J＝6.6)，0.96(3H，d，J＝7.2)；一个连在季碳上的羟甲基氢信号，δ_H 3.70(1H，d，J＝12)和3.93(1H，d，J＝12)；四个连氧碳上的氢信号δ_H 4.13(1H，d，J＝10.2)，4.52(1H，s)，3.24(1H，bs)，5.95(1H，s)；以及2个连在末端双键上的特征氢信号δ_H 5.17(1H，s，H-16)和5.14(1H，s，H-16)。¹³C NMR谱中可以看到27个碳信号，三个甲基碳信号δ_C 12.8，19.3，21.4；一对末端双键碳信号δ_C 144.9(C-15)和114.0(C-16)，一组苯环上的碳信号，其中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失，取而代之的是δ_C 167.1的酯羰基碳信号，说明原酸酯的氧环开裂，形成一苯甲酰氧基；δ_C 67.3和64.5的特征连氧碳信号，提示6，7位成氧环。
通过HSQC谱对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关，在HMBC谱中甲基氢信号δ_H 1.87(δ_C 18.9)与δ_C 144.9(C-15)，114.0(C-16)，73.7有远程相关，提示存在结构片段1，说明δ_H 1.87与末端双键相连，为17位甲基信号。δ_H 1.00(δ_C15.4)的甲基氢信号与δ_C 33.9，36.1，73.1有远程相关，推出结构片段2，δ_H 0.96(δ_C 15.7)的甲基氢信号与δ_C 35.1，31.4，75.5有远程相关，其化学环境与结构片段2极其相似，暂不能归属δ_H 1.00与0.96的甲基信号是18位还是19位甲基。H-14(δ_H 5.95)与δ_C 167.1有远程相关，提示苯甲酰氧基与C-14(δ_C 77.2)相连接，H-14(δ_H 5.95)还与δ_C33.9，73.5，39.5，67.3的碳信号有远程相关，推出结构片段3，说明与δ_C33.9，73.5有相关的δ_H 1.00为18位甲基氢信号，δ_H 0.96为19位甲基信号。δ_H 4.13(H-3)与δ_C 15.7(C-19)，35.1(C-1)，31.4(C-2)，79.8(C-4)，76.7(C-5)有远程相关，δ_H 4.52(H-5)与δ_C 54.4(C-10)，64.5(C-6)有远程相关；δ_H 3.24(H-7)与δ_C 68.0(C-20)，64.5(C-6)，39.5(C-8)，77.2(C-14)有远程相关；由以上推导可确定化合物的结构，分子式为C₂₇H₃₆O₉，与HR-ESIMS所给出的分子式一致。经sci finder文献检索，未见报道，为一新化合物，命名为genkwanine II
其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属及HMBC见表1，相关图谱见附图1-图4。

表1  gcnkwanin II的¹H NMR谱(600MHz，CDCl₃)和¹³C NMR谱(150MHz，CDCl₃)数据


实验例2
GenkwanineIII，白色结晶(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇。[α]_D²²-39.3(c0.019，CHCl₃)高分辨质谱给出准分子离子峰m/z：527.2251[M+Na]⁺(计算值为527.2252)，结合¹H，¹³C NMR谱，确定分子式为C₂₇H₃₆O₉，显示有10个不饱和度，为化合物genkwanin II的同分异构体。
¹H NMR(600MHz，CDCl₃)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征，¹H NMR谱中δ_H 8.00(2H，m)，7.55(1H，m)和7.42(2H，m)的存在，提示分子中有一单取代苯基；三个甲基特征氢信号δ_H 1.82(3H，s)，0.82(3H，d，J＝7.2)，0.95(3H，d，J＝6.6)；一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δ_H4.41(1H，d，J＝12)和4.82(1H，d，J＝12)，较化合物genkwanin II移向低场；四个连氧碳上的氢信号δ_H 4.23(1H，d，J＝10.2)，5.02(1H，s)，4.16(1H，s)，4.10(1H，s)；以及2个连在末端双键上的特征氢信号δ_H 5.12(1H，s，H-16)和5.11(1H，s，H-16)。¹³C NMR谱中可以看到27个碳信号，三个甲基碳信号δ_C 15.9，13.8，19.1；一对末端双键碳信号δ_C 144.7(C-15)和114.8(C-16)，一组苯环上的碳信号(δ_C 129.9，129.6×2，128.5，133.3，128.5)；其中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失，取而代之的是δ_C 167.2的酯羰基碳信号，说明原酸酯的氧环开裂，形成一苯甲酰氧基，δ_C 81.0和83.0的连氧碳信号较genkwanin II移向较低场，提示6，7位氧环开裂。
HSQC谱对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关，在HMBC谱中甲基氢信号δ_H 1.82(δ_C19.1)与δ_C 144.8(C-15)，114.0(C-16)，74.8有远程相关，提示存在结构片段1，说明δ_H 1.82与末端双键相连，为17位甲基信号。δ_H 0.84(δ_C 13.8)的甲基氢信号与δ_C 35.7，36.4，73.1有远程相关，推出结构片段2，δ_H 0.95(δ_C 15.9)的甲基氢信号与δ_C 34.1，31.9，74.1有远程相关，其化学环境与结构片段2相似，暂不能归属δ_H 0.84与0.95的甲基信号是18位还是19位甲基。H-14(δ_H 4.10)较化合物genkwanin II移向高场，说明14位不连取代基，同时H-14(δ_H 4.10)与δ_C 35.7，73.1，44.5，81.0的碳信号有远程相关，推出结构片段3，说明与δ_C 35.7，73.1有相关的δ_H0.84为18位甲基氢信号，δ_H 0.96为19位甲基信号。4.82(1H，d，J＝12，Hβ-20)和δ_H 4.41(1H，d，J＝12，Hα-20)较化合物genkwanin II移向低场，说明羟基上有取代，并且看到与δ_C 167.2的酯羰基碳信号有相关，证明了苯甲酰基与C-20相连；δ_H 4.23(H-3)与δ_C 15.9(C-19)，34.1(C-1)，31.9(C-2)，90.8(C-4)，83.1(C-5)有远程相关，δ_H 5.02(H-5)与δ_C 47.7(C-10)，83.0(C-6)有远程相关，δ_H 4.16(H-7)与δ_C 67.4(C-20)，80.3(C-6)，72.0(C-14)有远程相关；另外还看到δ_H 4.16(H-7)与δ_C 90.8(C-4)有三根健的远程相关，即7位和4位通过氧原子相连接，说明7位和4位的羟基脱水成氧环，C-4，C-5，C-6，C-7的化学位移较化合物genkwanin II均移向较低场，也说明其形成五元氧环；推导结构符合HR-ESIMS给出分子量，与不饱和度10相吻合，由此确定了化合物的结构。经sci finder文献检索，未见报道，为一新化合物，命名为genkwanineIII。
其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属及HMBC见表2，相关图谱见附图5-图8。

表2  gcnkwaninIII的¹H NMR谱(600MHz，CDCl₃)和¹³C NMR谱(150MHz，CDCl₃)数据


实验例3
GenkwaninIV，白色结晶(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇。[α]_D²²-14.9(c0.022，CHCl₃)。
¹H NMR(600MHz，CDCl₃)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征，¹H NMR谱中δ_H 8.00(2H，m)，7.55(1H，m)和7.45(2H，m)的存在，提示分子中有一单取代苯基；三个甲基特征氢信号δ_H 1.92(3H，s)，0.96(3H，d，J＝6.6)，0.98(3H，d，J＝7.2)；一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δ_H 3.47(1H，d，J＝11.4)和3.95(1H，d，J＝11.4)；四个连氧碳上的氢信号δ_H 4.23(1H，d，J＝10.2)，4.59(1H，s)，3.90(1H，s)，5.79(1H，s)；以及2个连在末端双键上的特征氢信号δ_H 5.20(1H，s，H-16)和5.19(1H，s，H-16)。¹³C NMR谱中可以看到27个碳信号，三个甲基碳信号δ_C 15.9，13.6，19.2；一对末端双键碳信号δ_C 144.8(C-15)和114.9(C-16)，一组苯环上的碳信号(δ_C 129.6×2，128.6×2，130.0，133.0)；其中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失，取而代之的是δ_C 166.6的酯羰基碳信号，说明原酸酯的氧环开裂，形成一苯甲酰氧基，δ_C 80.5和83.8的连氧碳信号较genkwanin II移向低场，提示6，7位氧环开裂，其化学位移值与genkwaninIII相似。
HMBC谱中，甲基氢信号δ_H 1.92与δ_C 144.8(C-15)，114.9(C-16)，74.2有远程相关，提示存在结构片段1，说明δ_H 1.92与末端双键相连，为17位甲基信号。δ_H 0.96(δ_C13.6)的甲基氢信号与δ_C 35.9，35.8，71.8有远程相关，推出结构片段2，δ_H 0.98(δ_C 15.9)的甲基氢信号与δ_C 34.9，31.9，74.3有远程相关，其化学环境与结构片段2相似，暂不能归属δ_H 0.84与0.95的甲基信号是18位还是19位甲基。H-14(δ_H 5.79)与δ_C 166.6有远程相关，提示苯甲酰氧基与C-14(δ_C 72.2)相连接，同时H-14(δ_H 5.79)还与δ_C 35.9，71.8，45.8，80.5，74.2的碳信号有远程相关，推出结构片段3，说明与δ_C 35.9，71.8有相关的δ_H 0.96为18位甲基氢信号，δ_H 0.98为19位甲基信号；以化合物GenkwanineIII化学位移值做参照，δ_H 4.23(1H，d，J＝10.2)确定为H-3；δ_H 4.59(1H，s)确定为H-5；δ_H 1.59(1H，m)确定为H-11；δ_H 1.91与δ_C 34.9(C-1)，71.8(C-9)，45.8(C-8)相关，确定为H-10；δ_H 1.84与δ_C 71.8(C-9)，74.3(C-3)有相关，确定其为H-1β，δ_H 1.18与31.9(C-2)49.0(C-10)，71.8(C-9)有相关，确定为H-1α；同时δ_H 1.18与δ_C 15.9有相关，确定δ_C15.9为C-19；由于δ_H 4.16与C-20(δ_C 67.4)，C-6(δ_C 80.3)，C-14(δ_C 72.2)有远程相关，确定δ_H 4.16为H-7；与化合物genkwanineIII相似，还看到H-7与C-4有三根健的远程相关，7位和4位通过氧原子相连接，说明7位和4位的羟基脱水成氧环，C-4，C-5，C-6，C-7的化学位移较化合物genkwaninII均移向较低场，说明其形成五元氧环；由以上分析确定了化合物的结构，为genkwanineIII的同分异构体。经scifinder文献检索，未见相关文献报道，为一新化合物，命名为genkwaninIV。
其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属及HMBC见表3，相关图谱见附图9-图11。

表3  genkwaninIV的¹H NMR谱(600MHz，CDCl₃)和¹³C NMR谱(150MHz，CDCl₃)数据


实验例4
GenkwaninV：白色结晶(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇。
¹H NMR(600MHz，CDCl₃)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征，¹H NMR谱中δ_H 8.02(2H，m)，7.55(1H，m)和7.42(2H，m)的存在，提示分子中有一单取代苯基；三个甲基特征氢信号δ_H 1.82(3H，s)，0.95(3H，d，J＝6.6)，0.91(3H，d，J＝7.2)；一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δ_H 3.70(1H，d，J＝12)和3.90(1H，d，J＝12)；四个连氧碳上的氢信号δ_H 4.22(1H，d，J＝10.2)，5.50(1H，s)，4.36(1H，s)，5.91(1H，s)；以及2个连在末端双键上的特征氢信号δ_H 5.09(1H，s，H-16)和5.07(1H，s，H-16)。¹³C NMR谱中可以看到27个碳信号，三个甲基碳信号δ_C 15.7，15.4，19.1；一对末端双键碳信号δ_C 144.3(C-15)，114.9(C-16)，一组苯环上的碳信号(δ_C 129.9×2，128.4×2，130.2，133.3)；其中瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号消失，取而代之的是δ_C 166.8的酯羰基碳信号，说明原酸酯的氧环开裂，形成一苯甲酰氧基。
HSQC谱对除季碳以外的所有碳氢信号进行了直接相关；在HMBC谱中δ_H 0.95(δ_C 15.4)的甲基氢信号与δ_C 33.5，36.1，77.0有远程相关，推出结构片段1，δ_H 0.91(δ_C 15.7)的甲基氢信号与δ_C 35.1，31.6，73.5有远程相关，其化学环境与结构片段1相似，暂不能归属δ_H 0.95与0.91的甲基信号是18位还是19位甲基。δ_H 1.82与δ_C 74.9，144.3(C-15)，114.9(C-16)有相关；δ_H 4.36(δ_C 75.329)与δ_C 33.5，74.9，77.0，41.2的碳信号有远程相关；δ_H 5.91(δ_C 75.330)与δ_C 77.0，73.6，86.1有相关，另外还与δ_C 166.1的羰基碳信号，及δ_C 63.2(C-20)有相关，推出结构片段2；结构片段2说明δ_H5.91为7位氢信号，而苯甲酰基于C-7相连；H-7与δ_C 77.0(C-9)有相关说明δ_H 0.95为18位甲基氢信号，0.91为19位甲基氢信号；由以上分析确定了化合物的结构。经scifinder检索，未见相关文献报道，为一新化合物，命名为genkwanin V。
其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属及HMBC见表4，相关图谱见附图12-图15。

表4  genkwaninV的¹H NMR谱(600MHz，CDCl₃)和¹³C NMR谱(150MHz，CDCl₃)数据


实验例5
GenkwaninVI无定型粉末(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇。
¹H NMR(600MHz，CDCl₃)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征，¹HNMR谱中低场区可以看到两组单取代苯基信号，δ_H 8.06(2H，m)，7.56(1H，m)和7.44(2H，m)为一苯甲酰基信号，δ_H 7.74(2H，m)，7.34(3H，m)为与瑞香烷型二萜原酸酯季碳相连的苯基信号；三个甲基特征信号δ_H 1.84(3H，s)，1.31(3H，d，J＝6.6)，1.05(3H，d，J＝6.6)，根据文献中同类化合物的化学位移值判断其分别为17，18，19位甲基信号；一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δ_H 4.02(1H，d，J＝12)和5.09(1H，d，J＝12)为20位羟甲基信号，较化合物genkwaninIV移向低场，说明20位连有取代基，2个连在末端双键上的特征氢信号δ_H 5.07(1H，s，H-16)和4.92(1H，s，H-16)。¹³CNMR谱中，三个甲基碳信号δ_C 19.2，20.8，13.0；一对末端双键碳信号δ_C146.5(C-15)和111.2(C-16)，两组苯环上的碳信号(δ_C 129.8×3，129.2×2，128.4×2，127.9×2，126.1×2，133.2，136.0)；δ_C 117.0为瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号；δ_C 166.6为苯甲酰氧基的羰基碳信号；δ_C 60.2和64.2的特征连氧碳信号，提示6，7位成氧环。
在HMBC谱中δ_H 1.84(CH3-17)与δ_C 146.5(C-15)，111.2(C-16)，84.3(C-13)有远程相关，推出结构片段1；δ_H 1.31(CH₃-18)与δ_C 35.3(C-11)，35.9(C-12)，80.0(C-9)有远程相关，推出结构片段2；δ_H 1.05(CH₃-19)与δ_C 34.3(C-1)，36.7(C-2)，78.3(C-3)有远程相关，推出结构片段3；20位氢信号δ_H 5.09移向低场，并且与δ_C 166.6有远程相关，说明苯甲酰基与20位相连，δ_H 4.52(H-14)与δ_C 80.0(C-9)，117.0(-C＝O)有相关；δ_H 3.43(H-7)与δ_C 36.5(C-8)，80.0(C-9)，82.5(C-14)有远程相关；δ_H 3.05(1H，d，J＝3.0，H-8)与δ_C 60.2(C-7)，64.2(C-6)有远程相关；δ_H 2.77(H-10)与80.1(C-4)，71.3(C-5)，35.3(C-11)有远程相关；δ_H 2.77(H-11)与δ_C 48.6(C-10)，35.3(C-11)，20.8(C-18)有远程相关；通过HMBC将¹H，¹³C信号进行归属，并确定了化合物的结构；通过sci finder进行文献检索，未见报道，说明该化合物为一新化合物，命名为genkwaninVI。
其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属及HMBC见表5，相关图谱见附图16-图18。

表5  genkwaninVI的¹H NMR谱(600MHz，CDCl₃)和¹³C NMR谱(150MHz，CDCl₃)数据


实验例6
GenkwaninVII无定型粉末(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇。
¹H NMR(600MHz，CDCl₃)信息给出瑞香烷型二萜的基本母核特征，¹HNMR谱中低场区可以看到两组单取代苯基信号，δ_H 8.06(2H，m)，7.63(1H，m)和7.50(2H，m)为一苯甲酰基信号，δ_H 7.75(2H，m)，7.36(3H，m)为与瑞香烷型二萜原酸酯季碳相连的苯基信号；三个甲基特征信号δ_H 1.84(3H，s)，1.35(3H，d，J＝6.6)，1.14(3H，d，J＝6)，根据文献中同类化合物的化学位移值判断其分别为17，18，19位甲基信号；一个连在季碳上的羟甲基特征氢信号δ_H 3.81(1H，d，J＝12)和3.86(1H，d，J＝12)为20位羟甲基信号，较化合物genkwaninVI移向高场，说明20不连取代基；2个连在末端双键上的特征氢信号δ_H 5.03(1H，s，H-16)和4.90(1H，s，H-16)；δ_H4.84(H-3)较化合物genkwaninVI移向低场，说明3位连有取代基；¹³C NMR谱中，三个甲基碳信号δ_C 19.2，20.8，13.0；一对末端双键碳信号δ_C 146.5(C-15)和111.2(C-16)，两组苯环上的碳信号(δ_C 129.8×3，129.2×2，128.4×2，127.9×2，126.1×2，133.2，136.0)；δ_C 117.0为瑞香烷型二萜原酸酯的特征季碳信号；δ_C 166.6为苯甲酰氧基的羰基碳信号；δ_C 60.2和64.2的特征连氧碳信号，提示6，7位成氧环。
HMBC谱中，δ_H 1.81(CH₃-17)与δ_C 146.6(C-15)，111.4(C-16)，84.6(C-13)有远程相关，推出结构片段1；δ_H 1.50(CH₃-18)与δ_C 35.5(C-11)，36.3(C-12)，80.5(C-9)有远程相关，δ_H 1.14(CH₃-19)与δ_C 36.1(C-1)，36.55(C-2)，82.9(C-3)有远程相关，δ_H 2.88(H-10)与36.1(C-1)，80.5(C-9)，81.8(C-5)有远程相关，3位氢信号δ_H 4.84移向低场，并且与δ_C 168.8有远程相关，说明苯甲酰基与3位相连。以上分析推出结构片段2；δ_H 4.49(H-14)与δ_C 80.5(C-9)，117.6(-C＝O)有相关；δ_H 3.43(H-7)与δ_C 36.59(C-8)，80.5(C-9)，82.7(C-14)，66.3(C-20)有相关；δ_H 4.13(H-5)与δ_C 82.9(C-3)，60.7(C-6)，64.2(C-8)有远程相关；由以上¹H NMR谱，¹³C NMR谱，及HMBC谱的分析确定了化合物的结构，并将信号归属；经sci finder文献检索，未见报道，说明该化合物为一新化合物，命名为genkwaninVII。
其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属及HMBC见表6，相关图谱见附图19-图21。

表6  genkwaninVII的¹H NMR谱(600MHz，CDCl₃)和¹³C NMR谱(150MHz，CDCl₃)数据