利用高速逆流色谱法纯化异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的方法 【技术领域】
本发明涉及利用高速逆流色谱法纯化异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的方法，主要用于从复杂的天然药物提取物中分离和制备高纯度植物异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷化学对照品的制备。
背景技术
近20年来发展起来的高速逆流色谱技术(High-speedcounter-current chromatography，HSCCC)是一种没有固态支撑体的液-液分配色谱技术，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作为分离柱，固定相和流动相都是液态，螺旋管自转的同时，绕一平行于自转轴的外部轴线做公转运动，借以获得足够强的离心力场，在两相中的一相得以保留的前提下，形成固定相与流动相的两相分割趋势和对流趋势，这种分割和对流的过程是连续进行的，如果把要分离的样品从螺旋管柱的入口注入，连续的分配传递过程就会在管柱里进行，从而实现连续的、高效的液-液分配过程。HSCCC分离效率高；操作简单，样品不需严格的预处理；可从极复杂的粗制样品中一步分离得到高纯度的组分；分析/分离粘度较高和易被固定相吸附的样品方面具有明显优势；可以分析/分离黄酮、生物碱、醌类、类脂等小分子化合物，也可分析/分离多肽、多糖、蛋白质等高分子化合物，适用范围比较广泛；能够明确表达中药材这种复杂体系中不同批次间的差异，稳定性和重现性好；其仪器及耗材完全国产化，成本明显低于高效液相色谱。随着天然药物的蓬勃发展HSCCC的主要研究领域集中于天然药物的分离纯化，已从几十种天然原料中分离得到数百种高纯度的单体化合物。非常适合于维药化学对照品的制备。
维吾尔药有着独特的治病理念，是中国民族药的重要组成部分，但其应用基本局限在新疆自治区的范围内，在全国范围及世界各地的推广速度缓慢。导致这种情况的主要原因：一是生产工艺离现代医药工业优质化生产要求还有很大差距；二是原药材的主要活性成分是次生代谢物，对后天的生长环境依赖性很强，原料药来自天然，又多为人工分散采收、加工，受天气、地域差别及人为因素影响很大，原料、中间体及最终产品离规范化、标准化管理还有很大差距，缺乏严格的质量监控标准和良好的监控方法，很难保证产品质量的稳定性；三是维药产品的疗效缺乏采用现代药物临床研究常用的“随机分组”、“对照”、“双盲”、“多点观察”等科学实验方法获得的科学数据说明，难为现代医学工作者和管理机构所信服。维药现代化是维药产业可持续发展的根本出路。维药原料和成药(片剂、颗粒剂、口服液、注射剂)的质量监控是维药现代化进程中迫切需要解决的关键问题之一。而标准对照品是质量监控的重要物质基础，可供原药材种植基地监控气候、地域、采收期及人为因素等对药材质量的影响，指导种植；可供成药生产厂家指导药材的合理勾兑，控制中间体及最终产品的质量，建立相关企业标准；为指纹图谱中重要指标成分的标定及谱效关系建立提供基础。
而无论是维吾尔药还是中药的研究与开发，都严重缺乏高纯度的标准对照品，这是制约标准制订与实施的关键因素之一。目前国家质量技术监督局正在建立各种国家实物标准，天然药物的标准品是其中的重要内容。
沙生蜡菊(Helichrysum arenium(L.)Moech.)是菊科(Compositae)蜡菊属植物，广泛分布于中国新疆，中亚，欧洲等地，为维吾尔医常用药材，在民间有悠久的历史。据文献报道沙生蜡菊有利尿、保肝、抗病毒、抗氧化等活性，主要用于治疗胆囊炎、胆结石。为了更深入的了解沙生蜡菊物质作用基础，我们对该植物全草提取物的化学成分进行了深入的研究。
我们针对化学对照品严重缺乏的问题，在已有的维吾尔药药效学研究基础上，采用近年来发展迅速的高速逆流色谱技术，同时制备异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷等两种代表性化学成分的方法，并采用该方法获得了高纯度(纯度95％上)的异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的单体化合物；建立以高速逆流色谱为核心技术的标准对照品制备平台，为维药化合物库的建立及国家实物标准的申请打下基础。
【发明内容】
本发明目的在于，提供一种利用高速逆流色谱法纯化异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的方法，该方法是将分离溶剂系统置于分液漏斗中充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取沙生蜡菊提取物溶解于上相和下相的混合溶液中，再将固定相用泵灌满色谱分离柱，然后将柱的首端与进样阀相接，待流动相开始流出色谱柱时，收集分离物，将不同成分分别收集、浓缩、干燥，分离得到95％以上的异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的单体化合物。
本发明所述的一种利用高速逆流色谱法纯化沙生辣菊异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的方法，按下列步骤进行：
a、取沙生辣菊，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次1-3小时，合并提取液减压浓缩成浸膏，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取；
b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粗样品；
c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由乙酸乙酯和水组成，其体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品溶于上层和下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，再将流动相泵入柱，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，根据检测器谱图接收目标成分；
e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱温30℃，流动相：A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。
步骤d进样量为10-500毫克。
步骤d异槲皮素的保留时间为200-240分钟，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间为300-380分钟。
使用的高速逆流色谱仪流速范围为1-3ml/min，转速范围为750-900转数。
本方法适用于对含有异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一种植物的提取和前处理方法。
本发明所述的利用高速逆流色谱法纯化沙生辣菊异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的方法，为实现该方法本发明采取了以下设计方案：
样品的制备：沙生蜡菊全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次1-3小时，合并提取液减压浓缩成浸膏(150g)，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥得到粗样品110.08g，该样品用于HSCCC的分离。
溶剂系统的筛选：取1mg粗样品溶于2ml溶剂系统中，连续震荡5分钟，静置，分层，分层时间少于30秒，分开两相后置于试管中，干燥后重新溶解于1ml甲醇中，通过HPLC对样品进行分析，目标化合物上相峰面积与下相峰面积的比值即为该化合物在两相溶剂中的分配系数(K)，溶剂系统为乙酸乙酯和水1∶1(v/v)，目标化合物异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的K在0.5-3的范围内，适合用高速逆流色谱分离。
样品溶液的制备：将50毫克粗样品溶于2ml等体积的上下相溶液中，超声使其溶解，滤去不溶物。
HSCCC分离过程：首先用固定相充满“色谱柱”，开启逆流色谱仪，转数为800rpm/min，以1.5ml/min的流速注入流动相后，进2ml样品溶液。流出液通过紫外检测器检测，检测波长254nm。根据峰型手动收集流出液。
HPLC检测HSCCC的原料和产品：粗样品和HSCCC分离得到的样品通过HPLC检测，色谱条件为：C18 column(4.6mmI.D.×250mm，5μm)，柱温30℃，流动相：A(甲醇)；B(0.2％甲酸)；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B(25∶75，v/v)到A∶B(75∶25，v/v)。流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间分别为22.84min、26.58min。
HSCCC分离得到的单体通过MS、NMR鉴定结构。
【附图说明】
图1为本发明高速逆流色谱分离沙生蜡菊异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的图，其中1为异槲皮素，2为山萘酚-3-O-葡萄糖苷。
图2为本发明高效液相检测异槲皮素图，其中1为异槲皮素。
图3为本发明该校液相检测山萘酚-3-O-葡萄糖苷图，其中2为山萘酚-3-O-葡萄糖苷。
【具体实施方式】
实施例1：
a、取沙生辣菊全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次1小时，合并提取液减压浓缩成浸膏150g，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；
b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粗样品110.08g；
c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由乙酸乙酯和水组成，其体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品10mg溶于2ml上层和2ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，转速范围为750转数，开始以1ml/min流速泵入流动相，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，异槲皮素的保留时间为200分钟，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间为300分钟，根据检测器谱图接收目标成分，得到异槲皮素10.1毫克、山萘酚-3-O-葡萄糖苷6.2毫克；
e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱温30℃，流动相：A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。
本方法适用于对含有异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一种植物的提取和前处理方法。
实施例2
a、取沙生辣菊全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液减压浓缩成浸膏150g，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；
b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粗样品110.08g；
c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由乙酸乙酯和水组成，其体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品50mg溶于3ml上层和3ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，转速范围为800转数，开始以2ml/min流速泵入流动相，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，异槲皮素的保留时间为220分钟，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间为320分钟，根据检测器谱图接收目标成分，得到异槲皮素13.7毫克、山萘酚-3-O-葡萄糖苷12.5毫克；
e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱温30℃，流动相：A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。
本方法适用于对含有异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一种植物的提取和前处理方法。
实施例3
a、取沙生辣菊全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并提取液减压浓缩成浸膏150g，用水混悬，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取；
b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粗样品110.08g；
c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由乙酸乙酯和水组成，其体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品150mg溶于5ml上层和5ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，转速范围为850转数，开始以1.5ml/min流速泵入流动相，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，异槲皮素的保留时间为210分钟，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间为330分钟，根据检测器谱图接收目标成分，得到异槲皮素53.7毫克、山萘酚-3-O-葡萄糖苷37.5毫克；
e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱温30℃，流动相：A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。
本方法适用于对含有异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一种植物的提取和前处理方法。
实施例4
a、取沙生辣菊全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次2.5小时，合并提取液减压浓缩成浸膏150g，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取；
b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粗样品110.08g；
c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由乙酸乙酯和水组成，其体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品250mg溶于7ml上层和7ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，转速范围为820转数，开始以2.5ml/min流速泵入流动相，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，异槲皮素的保留时间为240分钟，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间为360分钟，根据检测器谱图接收目标成分，得到异槲皮素90.7毫克、山萘酚-3-O-葡萄糖苷61.5毫克；
e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱温30℃，流动相：A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。
本方法适用于对含有异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一种植物的提取和前处理方法。
实施例5
a、取沙生辣菊全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液减压浓缩成浸膏150g，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取；
b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粗样品110.08g；
c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由乙酸乙酯和水组成，其体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品400mg溶于8ml上层和8ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，转速范围为880转数，开始以2.ml/min流速泵入流动相，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，异槲皮素的保留时间为230分钟，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间为380分钟，根据检测器谱图接收目标成分，得到异槲皮素140毫克、山萘酚-3-O-葡萄糖苷95毫克；
e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱温30℃，流动相：A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。
本方法适用于对含有异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一种植物的提取和前处理方法。
实施例6
a、取沙生辣菊全草500g(干重)，粉碎后用70％乙醇回流提取3次，每次3小时，合并提取液减压浓缩成浸膏150g，用水混悬，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取；
b、萃取液浓缩至干，得乙酸乙酯部分干燥粗样品110.08g；
c、采用高速逆流色谱仪，色谱仪分离溶剂系统由乙酸乙酯和水组成，其体积比为1∶1；
d、将溶剂系统配置于分液漏斗中，充分振摇后静置分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，取步骤b提取粗样品500mg溶于10ml上层和10ml下层的混合溶剂中，使高速逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使其主机转动，转速范围为900转数，开始以3ml/min流速泵入流动相，再由进样阀进入粗样品溶于上层和下层的混合溶剂，异槲皮素的保留时间为240分钟，山萘酚-3-O-葡萄糖苷的保留时间为380分钟，根据检测器谱图接收目标成分，得到异槲皮素150毫克、山萘酚-3-O-葡萄糖苷100.5毫克；
e、将高速逆流色谱分离得到的样品利用高效液相检测，色谱条件为：C18 column，4.6mmI.D.×250mm，5μm，柱温30℃，流动相：A甲醇；B 0.2％甲酸；梯度洗脱程序：0-50min，A∶B＝25-75∶75-25v/v，流速：1.0ml min-1，检测波长：245nm。
本方法适用于对含有异槲皮素和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的任意一种植物的提取和前处理方法。
本发明提供了一种利用高速逆流色谱法(HSCCC)从天然产物粗提取物中同时分离得到两种化合物的方法，该方法主要用于在制备高纯度化学对照品和化学样品的制备；具有高效、低成本、样品无损失、样品分离量大等特点，所有未分离的组分均可回收用于进一步分离。