一种噻唑联吡唑酮类化合物及其作为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用 【技术领域】
本发明涉及一种噻唑联吡唑酮类化合物及其作的小分子抑制剂为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用，特别是(E)-4-(2-(芳基亚肼基)-3-甲基-1-(4-芳基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮类化合物与作为Bcl-2家族蛋白拮抗剂的应用。该类化合物能够抑制Bcl-2家族蛋白成员Bcl-xL与天然底物多肽(Bid BH3多肽)的结合，可作为Bcl-2家族蛋白用于抑制其抗凋亡活性，并有望开发成为一类新型的抗肿瘤药物。
背景技术
细胞凋亡(某些情况下又可称为细胞程序性死亡)是一种去除衰老细胞或异常细胞的正常死亡机制，该机制的紊乱与多种疾病的发生有直接的关系。自上世纪90年代以来，人们逐渐发现肿瘤的发生是细胞的增殖与凋亡失衡所致(Okada，H.；Mak，T.W.Nat.Rev.Cancer 2004，4，592-603)。研究表明在多种肿瘤细胞中凋亡机制被抑制，肿瘤细胞因而得以过度增生；另外，凋亡机制被抑制也使得肿瘤细胞对化疗药物的抵抗性增强(Igney，F.H.；Krammer，P.H.Nat.Rev.Cancer 2002，2，277-288)。因此，设法恢复肿瘤细胞中的凋亡机制成为当今抗肿瘤药物设计的一条新思路，在国际上得到了广泛重视(Reed，J.C.Nat.Rev.Drug Discov.2002，1，111-121；Andersen，M.H.；Becker，J.C.；Straten，P.Nat.Rev.Drug Discov.2005，4，399-409.)。
在与细胞凋亡有关的药物靶点中，Bcl-2(B-cell lymphoma 2)相关蛋白是较早得到研究的一类。该类蛋白可分为三个家族：Bcl-2家族，Bax家族和BH3-only家族。其中，Bcl-2家族成员(Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Bcl-w等)起着抗细胞凋亡的作用，后两个家族的成员起促细胞凋亡的作用。目前人们认为Bcl-2相关蛋白主要是在细胞凋亡的线粒体途径中发挥作用。其中经活化的Bax家族蛋白(Bax、Bak等)可以结合在线粒体膜上使得细胞色素C从线粒体中释放出来从而最终导致凋亡的发生；而Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白则能够与Bax和Bak相结合，使其不能发挥作用；另外，一些BH3-only家族成员(Bim，Bad，Bid，Bik等)又能够与Bcl-2和Bcl-xL相结合，抑制其抗凋亡作用。因此，Bcl-2相关蛋白之间的平衡与否对细胞凋亡起着至关重要的调控作用。研究表明，多种类型的肿瘤细胞至少过量表达其中一种Bcl-2家族蛋白，但是在正常细胞中这些蛋白的表达水平则相对较低。使用有机小分子拮抗这些蛋白的功能有望恢复肿瘤细胞中的凋亡机制，从而达到消除肿瘤的目的(Huang，Z.Curr.Opin.Drug Discov.Devel.2000，3，565-574；Cory，S.；Adams，J.M.Nat.Rev.Cancer 2002，2，647-656)。
有机小分子对Bcl-2家族蛋白的抑制活性通常用荧光偏振(FluorescencePolarization，简称FP)方法检测(Zhang，H.；Nimmer，P.；Rosenberg，S.H.；Ng，S.C.；Joseph，M.Anal.Biochem.2002，307，70-75)。该方法是基于分子在均相溶液中的自由旋转，当一个荧光标记的分子被一个平面的极化光所激发时，其发射光可发射到一个固定的平面，而该发射光的极化水平与分子的旋转速度成反比。荧光标记的小分子在均相体系里处于高速旋转状态，发射光表现为除极化，得到一个较低的极化值，而非荧光标记的大分子旋转速度远远低于荧光标记的小分子，当小分子和大分子发生特异性结合后，复合物的旋转速度与大分子的旋转速度相比变化不明显，而远远低于荧光标记小分子的旋转速度，极化值显著升高。当该方法用于检测小分子抑制Bcl-2家族蛋白与天然底物多肽的结合时，在荧光标记多肽与蛋白共存的体系中加入待测化合物，如果化合物也能够与蛋白特异性结合，则会与荧光标记多肽发生竞争从而抑制其与蛋白的结合，进而导致荧光极化值降低。因此通过检测荧光极化值的变化情况就可以测得化合物的活性。
【发明内容】
本发明的第一个目的是提供一种新的噻唑联吡唑酮类化合物。
本发明的第二个目的是提供一种噻唑联吡唑酮类化合物用于制备抑制Bcl-xL与天然底物多肽结合的小分子抑制剂和抗肿瘤药物的应用。
本发明所提供的一种新的噻唑联吡唑酮类化合物具有如下的结构式：
式中R1为o-Ph、p-OMe、m-CO2H、o-CO2Me或8-喹啉；R2为H、m-Ph、p-Ph、m-Bn、o-OMe、m-OMe、m-NO2、β-萘基、p-N-四氢吡咯或8H-茚并[1，2-d]噻唑-2-基。
限制条件是：当R1为m-CO2H时，R2为m-Ph、p-Ph、m-Bn、o-OMe、m-OMe、m-NO2、β-萘基、p-N-四氢吡咯或8H-茚并[1，2-d]噻唑-2-基；当R1为o-Ph、p-OMe、o-CO2Me或8-喹啉时，R2为H。
本发明的用于制备抑制Bcl-xL与天然底物多肽结合的小分子抑制剂和抗肿瘤药物的噻唑联吡唑酮类化合物没有上述的限制，具体地说是具有如下结构式的(E)-4-(2-(芳基亚肼基)-3-甲基-1-(4-芳基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮类化合物：
式X
式中R1为H，m-Me，p-Me，o-Ph，p-F，o-Cl，m-Cl，p-Cl，p-Br，m-OH，p-OMe，p-OEt，m-CH2OH，o-CO2H，m-CO2H，p-CO2H，o-CO2Me，p-CONH2，p-SO3H，p-SO2NH2，p-NMeCOMe，3，4-二氯，2，4，6-三溴或8-喹啉；R2为H，p-Me，m-Ph，p-Ph，m-Bn，o-OMe，m-OMe，p-OMe，p-Br，m-NO2，β-萘基，p-N-四氢吡咯或8H-茚并[1，2-d]噻唑-2-基。没有前述的限制条件。可以进一步描述为如下的化合物：
式X-01、 式X-02、 式X-03、
式X-04、 式X-05、 式X-06、
式X-07、 式X-08、 式X-09、
式X-10、 式X-11、 式X-12、
式X-13、 式X-14、 式X-15、
式X-16、 式X-17、 式X-18、
式X-19、 式X-20、 式X-21、
式X-22、 式X-23、 式X-24、
式X-25、 式X-26、 式X-27、
式X-28、 式X-29、 式X-30、
式X-31、 式X-32、 式X-33、
式X-34、 式X-35、 式X-36、
式X-37、 式X-38、 式X-39、
式X-40 或 式X-41
实验表明，上述噻唑联吡唑酮类化合物为抑制Bcl-2家族蛋白成员Bcl-xL与天然底物多肽(Bid BH3多肽)相结合的有效成分，基于荧光偏振(FP)原理的活性测试表明该类化合物具有微摩尔级的活性。FP方法检测此类化合物抑制Bcl-xL与N端用5-FAM标记的Bid BH3多肽(序列为：5-FAM-QEDIIRNIARH-LAQVGDSMDR)结合的活性如下：
1)(E)-4-(2-(3-羟甲基苯基)亚肼基)-1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-01)在10μM下的抑制率为78.7％；
2)(E)-2-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-02)在10μM下的抑制率为77.0％；
3)(E)-3-(2-(1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-03)在10μM下的抑制率为92.4％；
4)(E)-3-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-04)的抑制常数Ki为0.74μM；
5)(E)-3-(2-(1-(4-(联苯-3-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-05)在10μM下的抑制率为32.8％；
6)(E)-3-(2-(1-(4-(3-苄基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-06)在10μM下的抑制率为31.4％；
7)(E)-3-(2-(3-甲基-1-(4-(萘基-2-)噻唑-2-基)-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-07)的抑制常数Ki为2.2μM；
8)(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯基磺酰胺(式X-08)在10μM下的抑制率为43.0％；
9)(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-09)在10μM下的抑制率为35.3％；
10)(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-10)的抑制常数Ki为13.1μM；
11)(E)-1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-4-(2-苯基亚肼基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-11)在10μM下的抑制率为68.4％；
12)(E)-4-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯磺酸(式X-12)在10μM下的抑制率为56.5％；
13)(E)-4-(2-(4-甲基苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-13)在10μM下的抑制率为54.0％；
14)(E)-N-(4-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯基)-N-甲基乙酰胺(式X-14)在10μM下的抑制率为48.8％；
15)(E)-3-甲基-1-(4-(3-硝基苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(2，4，6-三溴苯基)亚肼基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-15)在10μM下的抑制率为43.9％；
16)(E)-4-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯磺酰胺(式X-16)在10μM下的抑制率为42.8％；
17)(E)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(3-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-17)在10μM下的抑制率为42.6％；
18)(E)-4-(2-(4-溴苯基)亚肼基)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-18)在10μM下的抑制率为36.0％；
19)(E)-3-(2-(3-甲基-1-(4-(3-硝基苯基)噻唑-2-基)-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-19)在10μM下的抑制率为34.6％；
20)(E)-3-甲基-4-(2-苯基亚肼基)-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-20)在10μM下的抑制率为28.2％；
21)(E)-4-(2-(4-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-21)在10μM下的抑制率为26.6％；
22)(E)-4-(2-(2-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-22)在10μM下的抑制率为25.5％；
23)(E)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(3-羟苯基)亚肼基)-3-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-23)在10μM下的抑制率为25.4％；
24)(E)-3-(2-(1-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-24)在10μM下的抑制率为25.3％；
25)(E)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-4-(2-m-甲苯亚肼基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-25)在10μM下的抑制率为23.7％；
26)(E)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-26)在10μM下的抑制率为22.5％；
27)(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-(4-(四氢吡咯-1-基)苯基)噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-27)在10μM下的抑制率为20.5％；
28)(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-p-甲苯噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酰胺(式X-28)在10μM下的抑制率为19.5％；
29)(E)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亚肼基)-3-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-29)在10μM下的抑制率为18.9％；
30)(E)-1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-4-(2-m-甲苯亚肼基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-30)在10μM下的抑制率为18.0％；
31)(E)-3-(2-(1-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-31)在10μM下的抑制率为17.5％；
32)(E)-4-(2-(4-氟苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-32)在10μM下的抑制率为14.5％；
33)(E)-4-(2-(3-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-33)在10μM下的抑制率为14.2％；
34)(E)-3-(2-(1-(8H-茚并[1，2-d]噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-34)在10μM下的抑制率为13.5％；
35)(E)-4-(2-(3，4-二氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-35)在10μM下的抑制率为13.2％；
36)(E)-4-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酰胺(式X-36)在10μM下的抑制率为8.9％；
37)(E)-3-(2-(1-(4-(联苯-4-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-37)在10μM下的抑制率为8.2％；
38)(E)-1-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-基)-4-(2-(4-乙氧基苯基)亚肼基)-3-甲基-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-38)在10μM下的抑制率为6.3％；
39)(E)-4-(2-(联苯-2-基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-39)在10μM下的抑制率为6.3％；
40)(E)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-4-(2-(喹啉-8-基)亚肼基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-40)在10μM下的抑制率为4.4％；
41)(E)-2-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸甲酯(式X-41)在10μM下的抑制率为1.2％。
本发明的噻唑联吡唑酮类化合物还可以用于制备抗肿瘤药物。
实验表明，噻唑联吡唑酮类化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞显示出抑制活性，是一类具有广泛应用价值的抗肿瘤先导化合物。其中化合物X-01和X-15对MDA-MB-231的CC50值(50％Cytotoxic Concentration，半数细胞毒浓度)分别为3.5和0.95μM；化合物X-01对MCF-7的CC50值为16.8μM。
本发明的有益效果在于所涉及的噻唑联吡唑酮类化合物是一类结构新颖的Bcl-2家族蛋白抑制剂，具有微摩尔级的分子水平抑制活性，而且对肿瘤细胞具有较强的细胞毒活性，因此作为先导化合物具有良好的潜力和应用前景，有望开发成为靶向Bcl-2家族蛋白的抗肿瘤药物。
【附图说明】
图1-图3为噻唑联吡唑酮类化合物的荧光偏振测活曲线；
图4-图6为噻唑联吡唑酮类化合物的MTT测活曲线。
其中，图4为噻唑联吡唑酮类化合物X-01对MDA-MB-231细胞系细胞毒性测定；图5为噻唑联吡唑酮类化合物X-15对MDA-MB-231细胞系细胞毒性测定；图6为噻唑联吡唑酮类化合物X-01对MCF-7细胞系细胞毒性测定。
【具体实施方式】
实施例1：制备(E)-4-(2-(4-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮
一、(Z)-2-(2-(4-氯苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-05)的合成
将1.276g(10mmol)4-氯苯胺(式I-05)悬浮在8mL水中，控制约室温下慢慢注入5mL浓HCl，降至低温(0℃)下慢慢注入含0.690g(10mmol)亚硝酸钠的5mL水溶液，之后直接过滤到含1.28mL(10mmol)乙酰乙酸乙酯和8g(97.5mmol)乙酸钠的25mL乙醇溶液中，有黄色固体析出，抽滤，水洗，无水乙醇重结晶得黄色针状晶体1.914g(产率71％)。
经检测，结构正确，检测结果如下：mp 80-84℃；IR(KBr)：v 2994，1704，1617，1587，1528，1495，1474，1456，1419，1396，1372，1330，1276，1205，1167，1116，1093，1021，1008，977，836，818，784，657，512，457cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ14.76(s，1H)，7.35(s，4H)，4.34(q，J＝7.2Hz，2H)，2.60(s，3H)，1.40(t，J＝7.2Hz，3H)；MS(ESI)(m/z)：269(M+H+)，291(M+Na+)，323(M+MeOH+Na+)，349(M+acetone+Na+)；Anal.Calcd for C12H13ClN2O3：C 53.64，H 4.88，N 10.43.Found：C 53.60，H 4.89，N 10.42.
二、(E)-4-(2-(4-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-05)的合成
将1.904g(7.08mmol)的(Z)-2-(2-(4-氯苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-05)加入15mL乙酸中溶解，再加入0.646g(7.08mmol)氨基硫脲，加热回流4小时，冷却后抽滤，依次用乙酸和冷冻的乙醇洗涤，直接抽干，得黄色固体1.898g(产率91％)。
经检测，结构正确，检测结果如下：mp 215-220℃；IR(KBr)：v 3375，3264，1693，1600，1549，1481，1446，1397，1313，1288，1269，1234，1087，1045，997，871，823，771，595，547cm-1；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ13.05(s，1H)，9.48(s，1H)，8.92(s，1H)，7.69(d，J＝9.0Hz，2H)，7.51(d，J＝8.7Hz，2H)，2.26(s，3H)；13CNMR(75MHz，DMSO-d6)：δ176.7，156.4，149.6，140.4，129.8，129.4，126.7，118.2，11.5；MS(ESI)(m/z)：296(M+H+)，318(M+Na+)；HRMS(EI)(m/z)：Calcd forC11H10ClN5OS(M+)：295.0295，Found：295.0294.
三、(E)-4-(2-(4-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-21)的合成
将0.148g(0.5mmol)的(E)-4-(2-(4-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-05)加入15mL二氧六环中，加热回流至溶解，停止加热，加入0.249g(1.25mmol)2-溴-1-(3-苄基苯基)乙酮，加热回流0.5h，停止加热，浓缩除去二噁烷，依次用石油醚和乙醇洗涤，得化合物X-06(0.198g，产率100％)。
经检测，结构正确，检测结果如下：mp 216-223℃；IR(KBr)：v 1664，1592，1551，1519，1480，1445，1373，1325，1280，1263，1229，1184，1100，1085，1023，1004，922，884，824，775，728cm-1；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ13.25(s，1H)，7.96(dd，J＝7.8Hz，J＝1.5Hz，2H)，7.43-7.26(m，8H)，2.45(s，3H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)：δ156.4，154.9，151.8，151.2，139.3，133.9，131.8，129.9，128.5，128.1，127.2，126.4，117.1，107.8，11.9；MS(ESI)(m/z)：396(M+H+)，418(M+Na+)，450(M+MeOH+Na+)；HRMS(ESI)(m/z)：Calcd for C19H15ClN5OS(M+H+)：396.0686，Found：396.0682.
实施例2：式X-04，X-05，X-06，X-07，X-09，X-10，X-13，X-19，X-20，X-24，X-26，X-27，X-31，X-32，X-33，X-34，X-35，X-37，X-39，X-40，X-41化合物的合成
一、式II-01-04和式II-06-17的合成
在与实施实例一中合成式II-05化合物类似的条件下，从相应的式I-01-04和式I-06-17得到化合物式II-01-04和式II-06-17：(Z)-2-(2-苯基亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-01)；(Z)-2-(2-(4-氟苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-02)；(Z)-2-(2-(2-氯苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-03)；(Z)-2-(2-(3-氯苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-04)；(Z)-2-(2-(3，4-二氯苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-06)；(Z)-2-(2-(2-甲基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-07)；(Z)-2-(2-(3-甲基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-08)；(Z)-2-(2-(4-甲基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-09)；(Z)-2-(2-(4-甲氧基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-10)；(Z)-2-(2-(3-羧基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-11)；(Z)-2-(2-(4-羧基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-12)；(Z)-2-(2-(2-甲氧羰基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-13)；(Z)-2-(2-(4-正丁氧羰基苯基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-14)；(Z)-2-(2-(联苯-2-基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-15)；(Z)-2-(2-(1-萘基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-16)；(Z)-2-(2-(8-喹啉基)亚肼基)-3-氧代丁酸乙酯(式II-17)。
二、式III-01-04和式III-06-17合成
在与实施实例一中合成式III-05化合物类似的条件下，从相应的式II-01-04和式II-06-17得到化合物式式III-01-04和式III-06-17：(E)-4-(2-苯基亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-01)；(E)-4-(2-(4-氟苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-02)；(E)-4-(2-(2-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-03)；(E)-4-(2-(3-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-04)；(E)-4-(2-(3，4-二氯苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-06)；(E)-4-(2-(2-甲基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-07)；(E)-4-(2-(3-甲基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-08)；(E)-4-(2-(4-甲基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-09)；(E)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-10)；(E)-4-(2-(3-羧基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-11)；(E)-4-(2-(4-羧基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-12)；(E)-4-(2-(2-甲氧羰基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-13)；(E)-4-(2-(4-正丁氧羰基苯基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-14)；(E)-4-(2-(联苯-2-基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-15)；(E)-4-(2-(1-萘基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-16)；(E)-4-(2-(8-喹啉基)亚肼基)-3-甲基-5-氧代-4，5-二氢-1H-吡唑-1-硫代酰胺(式III-17)。
三、式X-04，X-05，X-06，X-07，X-09，X-10，X-13，X-19，X-20，X-24，X-26，X-27，X-31，X-32，X-33，X-34，X-35，X-37，X-39，X-40，X-41化合物的合成
在与实施实例一中合成式X-21化合物类似的条件下，从相应的式III-01-04和式III-06-17和式IV-01-04和式IV-06-17得到化合物式X-04，X-05，X-06，X-07，X-09，X-10，X-13，X-19，X-20，X-24，X-26，X-27，X-31，X-32，X-33，X-34，X-35，X-37，X-39，X-40，X-41：(E)-3-(2-(1-(4-(4-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-04)，(E)-3-(2-(1-(4-(联苯-3-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-05)，(E)-3-(2-(1-(4-(3-苄基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-06)，(E)-3-(2-(3-甲基-1-(4-(萘基-2-)噻唑-2-基)-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-07)，(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-09)，(E)-4-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-10)，(E)-4-(2-(4-甲基苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-13)，(E)-3-(2-(3-甲基-1-(4-(3-硝基苯基)噻唑-2-基)-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-19)，(E)-3-甲基-4-(2-苯基亚肼基)-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-20)，(E)-3-(2-(1-(4-(3-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-24)，(E)-4-(2-(4-甲氧基苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-26)，(E)-3-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-(4-(四氢吡咯-1-基)苯基)噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-27)，(E)-3-(2-(1-(4-(2-甲氧基苯基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-31)，(E)-4-(2-(4-氟苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-32)，(E)-4-(2-(3-氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-33)，(E)-3-(2-(1-(8H-茚并[1，2-d]噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-34)，(E)-4-(2-(3，4-二氯苯基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-35)，(E)-3-(2-(1-(4-(联苯-4-基)噻唑-2-基)-3-甲基-5-氧代-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸(式X-37)，(E)-4-(2-(联苯-2-基)亚肼基)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-39)，(E)-3-甲基-1-(4-苯基噻唑-2-基)-4-(2-(喹啉-8-基)亚肼基)-1H-吡唑-5(4H)-酮(式X-40)，(E)-2-(2-(3-甲基-5-氧代-1-(4-苯基噻唑-2-基)-1H-吡唑-4(5H)-亚基)肼基)苯甲酸甲酯(式X-41)。
实施例3：噻唑联吡唑酮类化合物对Bcl-xL抑制作用的荧光偏振检测
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的Bcl-xL(GST-Bcl-xL)蛋白在大肠杆菌BL21中表达，经谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱亲和层析的方法分离纯化；荧光标记多肽为N端用5-FAM标记的Bid BH3多肽(序列为：5-FAM-QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)；化合物X-04，X-05，X-06，X-07，X-09，X-10，X-13，X-19，X-20，X-21，X-24，X-26，X-27，X-31，X-32，X-33，X-34，X-35，X-37，X-39，X-40，X-41用上述方法制备，其余化合物购自SPECS公司。
一、化合物式X-04，X-07和X-10的抑制常数测定
在测试缓冲液(1×磷酸盐缓冲溶液，含0.02％(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-xL的1×PBS溶液和化合物不同浓度的DMSO溶液，混匀后室温避光孵育30min；再加入荧光标记多肽的1×PBS溶液(终浓度为10nM)，使各溶液的总体积均为200μL，混匀后室温避光孵育20min；将上述溶液及校正溶液1(1nM fluorescein)和校正溶液2(10mM NaOH)各取60μL转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nM为激发波长，535nM为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP，测得各浓度下的荧光偏振值(mP)并计算抑制率，拟合得到半数抑制浓度IC50，抑制常数使用如下公式求得：Ki＝[I]50/([L]50/Kd+[P]0/Kd+1)([I]50：达到半数抑制时游离的抑制剂的浓度；[L]50：达到半数抑制时游离的荧光标记多肽的浓度；[P]0：没有抑制时游离的蛋白浓度；Kd：蛋白与荧光标记多肽的解离常数)。结果见表1-表3：
表1：化合物X-04的荧光偏振检测结果
表2：化合物X-07的荧光偏振检测结果
表3：化合物X-10的荧光偏振检测结果
二、化合物式X-01-X-03，X-05，X-06，X-08，X-09，X-11-X-41的抑制活性检测
在测试缓冲液(1×磷酸盐缓冲溶液，含0.02％(w/v)NaN3)中加入GST-Bcl-xL的1×PBS溶液，分别加入DMSO(2μL)和待测化合物的DMSO溶液(终浓度为10μM)，混匀后室温避光孵育30min；再加入荧光标记多肽的1×PBS溶液(终浓度为10nM)，使各溶液的总体积均为200μL，混匀后室温避光孵育20min；将上述溶液及校正溶液1(1nM fluorescein)和校正溶液2(10mM NaOH)各取60μL转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nM为激发波长，535nM为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP，测得各化合物的荧光偏振值(mP)。
结果见表4：
表4：化合物式X-01-X-03，X-05，X-06，X-08，X-09，X-11-X-41的荧光偏振检测结果
化合 物 GST-Bcl-x L的浓度 GST-Bcl-x L与荧光标 记多肽的 解离常数 Kd 对照mP±SD 荧光标记多 肽mP±SD 化合物 mP±SD 抑 制 率 ％ X-0 1 160nM 78.7nM 175.93±5.93 117.87±7.90 130.23±0.63 78. 7 X-0 2 120nM 51.3nM 237.88±16.7 7 151.92±53.5 9 171.65±22.0 6 77. 0 X-0 3 160nM 78.7nM 175.93±5.93 117.87±7.90 122.29±2.15 92. 4 X-0 5 132nM 55.3nM 148.37±4.24 82.32±6.13 126.69±0.11 32. 8 X-0 6 132nM 55.3nM 148.37±4.24 82.32±6.13 127.63±1.67 31. 4 X-0 8 87.5nM 75nM 152.84±3.59 109.38±15.7 6 134.15±4.26 43. 0 X-0 9 132nM 55.3nM 183.18±1.96 108.77±8.12 156.93±3.32 35. 3 X-1 1 160nM 78.7nM 175.93±5.93 117.87±7.90 136.22±0.25 68. 4 X-1 2 160nM 78.7nM 168.93±12.8 5 99.44±14.63 129.64±2.49 56. 5 X-1 3 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 142.41±5.72 54. 0 X-1 4 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 143.96±2.85 48. 8 X-1 5 87.5nM 75nM 152.84±3.59 109.38±15.7 6 133.74±2.20 43. 9 X-1 6 160nM 78.7nM 168.93±12.8 5 99.44±14.63 139.18±4.01 42. 8 X-1 7 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 145.79±4.34 42. 6
X-1 8 160nM 78.7nM 153.85±7.37 105.76±14.6 5 136.53±3.66 36. 0 X-1 9 132nM 55.3nM 168.49±3.18 65.25±7.07 132.78±1.84 34. 6 X-2 0 132nM 55.3nM 183.18±1.96 108.77±8.11 162.21±3.12 28. 2 X-2 1 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 150.57±4.92 26. 6 X-2 2 160nM 78.7nM 175.93±5.93 117.87±7.90 161.1±11.04 25. 5 X-2 3 160nM 78.7nM 153.85±7.37 105.76±14.6 5 141.62±2.93 25. 4 X-2 4 132nM 55.3nM 148.37±4.24 82.319±6.13 131.69±4.03 25. 3 X-2 5 160nM 78.7nM 168.93±12.8 5 99.44±14.63 152.48±10.7 5 23. 7 X-2 6 132nM 55.3nM 183.18±1.96 108.77±8.11 166.46±1.44 22. 5 X-2 7 132nM 55.3nM 148.37±4.24 82.32±6.13 134.8±0.24 20. 5 X-2 8 87.5nM 75nM 179.4±1.91 92.84±15.08 162.51±2.73 19. 5 X-2 9 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 152.86±3.92 18. 9 X-3 0 160nM 78.7nM 168.93±12.8 5 99.44±14.63 156.42±12.1 5 18. 0 X-3 1 132nM 55.3nM 168.49±3.18 65.25±7.07 150.38±0.23 17. 5 X-3 2 132nnM 55.3nM 183.18±1.96 108.77±8.11 172.39±4.41 14. 5 X-3 3 132nM 55.3nM 163.99±0.92 75.73±7.93 151.45±3.22 14. 2 X-3 4 132nM 55.3nM 148.37±4.24 82.32±6.13 139.44±0.51 13. 5 X-3 5 132nM 55.3nM 163.99±0.92 75.73±7.93 152.33±3.76 13. 2 X-3 6 160nM 78.7nM 168.93±12.8 5 99.44±14.63 162.76±0.22 8.9 X-3 7 132nM 55.3nM 148.37±4.24 82.32±6.13 142.98±4.33 8.2 X-3 8 160nM 78.7nM 158.48±4.47 128.71±15.5 1 156.59±2.84 6.3 X-3 9 132nM 55.3nM 183.18±1.96 108.77±8.11 178.49±2.15 6.3
X-4 0 132nM 55.3nM 163.99±0.92 75.73±7.93 160.06±0.40 4.4 X-4 1 132nM 55.3nM 163.99±0.92 75.73±7.93 162.95±2.57 1.2
实施例4：噻唑联吡唑酮类化合物对人乳腺癌MDA-MB-231细胞系的细胞毒性检测
一、化合物X-01，X-02，X-15在10μM下对MDA-MB-231细胞抑制率测定
4×104/ml MDA-MB-231细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，与不同的待测化合物溶液混合(终浓度10μM)，37℃，5％CO2培养2天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算细胞抑制率。
表5：化合物X-01，X-02，X-15在10μM下对MDA-MB-231细胞抑制率测定
二、化合物X-01对MDA-MB-231的细胞毒性检测
4×104/ml MDA-MB-231细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，加入混合了不同浓度化合物的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养2天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算CC50值(50％Cytotoxic Concentration)为3.5μM。
表6：化合物X-01对MDA-MB-231细胞毒性
三、化合物X-15对MDA-MB-231的细胞毒性检测
4×104/ml MDA-MB-231细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，加入混合了不同浓度化合物的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养2天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算CC50值(50％Cytotoxic Concentration)为0.95μM。
表7：化合物X-15对MDA-MB-231细胞毒性
实施例5：噻唑联吡唑酮类化合物对人乳腺癌MCF-7细胞系的细胞毒性检测
一、化合物X-01，X-02，X-03，X-11，X-15在10μM下对MCF-7细胞抑制率测定
6×104/ml MCF-7细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，与不同的待测化合物溶液混合(终浓度10μM)，37℃，5％CO2培养4天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算细胞抑制率。
表8：化合物X-01，X-02，X-03，X-11，X-15在10μM下对MCF-7细胞抑制率测定
二、化合物X-01对MCF-7的细胞毒性检测
6×104/ml MCF-7细胞悬液100μL每孔，孵育一天后，加入混合了不同浓度化合物的DMEM培养液，37℃，5％CO2培养4天，采用MTT比色法检测细胞毒性。570nm TECAN GENios Pro多功能酶标仪测定OD值，计算CC50值(50％Cytotoxic Concentration)为16.8μM。
表9：化合物X-01对MCF-7细胞毒性