一种提取连翘叶片 DNA 的方法 一、 技术领域
本发明涉及医药， 特别是一种提取连翘叶片 DNA 的方法。 二、 背景技术
连 翘 (Forsythia suspensa(Thunb.)Vah1) 为 木 犀 科 (Oleaceae) 连 翘 属 (Forsythia) 多年生落叶灌木， 果实初熟尚带绿色时采收称为青翘， 果实熟透颜色发黄时采 收称为老翘， 具有清热解毒、 消肿散结之功效。
随着分子生物学的发展， 目前 DNA 标记技术已经渗透到中药的各个领域， 而 DNA 提 取技术是分子标记技术的关键。 连翘叶片内含有较多的酚类、 鞣质类物质， 这些次生代谢物 的存在严重影响了 DNA 的纯度， 进而影响到其后续的 DNA 扩增工作。因而连翘 DNA 的提取 是分子标记技术应用其研究中的重中之重。
电泳检测表明经典的 CTAB 法提取出来的 DNA 含有少量的蛋白， 并且 DNA 条带弥 散， A260/280 ＝ 1.38， 所提取 DNA 中因纯度低， 连翘叶片内含有过多的酚类、 鞣质等杂质， 对其 后续分子标记技术的研究造成很大的影响， 因此很有必要对连翘 DNA 提取方法进行改进。 三、 发明内容
针对上述情况， 为克服现有技术缺陷， 本发明之目的就是提供一种提取连翘叶片 DNA 的方法， 可有效克服连翘 DNA 的含有少量的蛋白， 并且 DNA 条带弥散， A260/280 ＝ 1.38， 并 消除连翘叶片内过多的酚类、 鞣质等杂质对连翘 DNA 影响造成的纯度低问题。
本发明解决的技术方案是， 以连翘幼嫩叶片为材料， 在研钵中加液氮迅速研磨成 粉末 ( 必要时， 在加液氮之前， 可先在研钵中加入 0.05gPVP)， 之后将粉末转入灭菌离心 管中， 加入 0-4 ℃预冷的提取缓冲液 I， 提取缓冲液 I 加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的 6-10 倍， ( 所说的重量体积为连翘幼嫩叶片以重量 g 计， 提取缓冲液 I 以体积 ml 计， 以下 同 )， 连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液 I 混匀， 冰浴 10min， 4 ℃下离 心 10min， 弃去上清液， 得离心后的沉淀物， 沉淀物中加入提取缓冲液 II， 提取缓冲液 II 加 入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的 6 倍， 沉淀物与提取缓冲液 II 混匀， 冰浴 10min， 4℃下 离心 10min， 弃去上清液， 立即加入预热的 2×CTAB 和 β- 巯基乙醇， 2×CTAB 加入量为连 翘幼嫩叶片重量体积的 6-10 倍， β- 巯基乙醇加入量为每 0.5g 连翘幼嫩叶片原材料加入 60-120μL， 充分混匀， 在 65℃水浴中保温 4h 期间每隔 0.5h 轻轻摇动离心管一次 ； 水浴后， 4℃下离心 10min ； 取上清液置灭菌离心管中， 加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇的混合 溶液， 其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比 24 ∶ 1， 轻轻颠倒离心管， 混匀， 4 ℃下离 心 10min， 重复此操作， 至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止 ； 把上清 轻轻晃动， 液转移到灭菌离心管中， 加入 2/3 倍量上清液体积、 并于 -20 ℃预冷的异丙醇， 于 -20℃静置过夜 (8-12 小时 ) ； 4℃下离心 5min， 收集沉淀， 弃去上清液， 用 75％ (V/V) 的 乙醇漂洗沉淀 2-3 次， 每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的 2 倍， 将离心管倒置在吸 水纸上， 风干， 得风干物 ； 每 0.5g 连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用 50-60μLTE 缓冲液溶解， 并加入 0.5μL 5-10mg/mLRNase， 轻轻混匀， 于 37℃水浴中温浴 30min， 即得到高质量 的可直接用于 PCR 扩增的连翘叶片基因组 DNA ；
所说的提取缓冲液 I 是由 0.25mol/L Tris-HCl、 50mmol/L EDTA、 0.25mol/LNaCl 和余量为水混合均匀制成 ； 所 说 的 提 取 缓 冲 液 II 是 由 100mmol/LTris-HCl， 20mmol/L EDTA， 0.25mol/L NaCl， 0.025mol/L Na2B4O7 和余量为水混合均匀制成。
本发明有效用于提取连翘叶片 DNA， 提出物纯度高， 效率高， 有效克服了电泳检测 表明经典的 CTAB 法提取出来的 DNA 含有少量的蛋白， 并且 DNA 条带弥散， A260/280 ＝ 1.38， 所 提取 DNA 纯度较低的问题， 有效保证了对其后续分子标记技术的研究创造了良好的技术条 件， 是提取连翘叶片 DNA 的方法的一大创造。 四、 具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例 1
本发明在实施中， 具体可由以下步骤实现 ：
取 0.5g 连翘幼嫩叶片为材料， 在研钵中加液氮迅速研磨成粉末， 之后将粉末 转 入 灭 菌 离 心 管 中， 加 入 0-4 ℃ 预 冷 的 提 取 缓 冲 液 I 3-5mL， 混 匀， 冰 浴 10min， 4℃下 6000-10000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 再加入提取缓冲液 II 3ml， 混匀， 冰浴 10min， 4℃下 6000-10000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 立即加入 3-5mL 65℃预热的 2×CTAB 和 60-120μL β- 巯基乙醇， 充分混匀， 在 65℃水浴中保温 4h 期间每隔 0.5h 轻轻摇动离心管 一次 ； 温浴后， 4℃下 10000r/min 离心 10min ； 取上清液至 5mL 的灭菌离心管中， 加入与上清 液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液， 其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比 24 ∶ 1， 轻 轻颠倒离心管， 混匀， 4℃下 12000r/min 离心 10min， 重复此操作， 至上清液与氯仿和异戊醇 混合溶液的液面无白色沉淀为止 ； 把上清液转移到灭菌离心管中， 加入 2/3 倍量上清液体 积、 并于 -20℃预冷的异丙醇， 轻轻晃动， 于 -20℃静置 (8-12 小时 ) 过夜 ； 4℃下 8000r/min 离心 5min， 弃去上清液， 收集沉淀物， 沉淀物用 75％ (V/V) 的乙醇漂洗沉淀物 2 次或 3 次， 每次 1mL， 将离心管倒置在吸水纸上， 风干， 得风干物 ； 风干物用 50-60μLTE 缓冲液溶解， 并 加入 0.5μL5-10mg/mLRNase， 轻轻混匀， 于 37℃水浴中温浴 30min， 即得到高质量的可直接 用于 PCR 扩增的连翘叶片基因组 DNA。
实施例 2
①称取 0.5g 连翘嫩叶片， 在研钵中加入液氮迅速研磨成粉末 ( 必要时， 在加液氮 之前， 可先在研钵中加入 0.05gPVP) ；
②将粉末材料转入 5mL 的灭菌离心管中， 加入 4℃遇冷的提取缓冲液 I(0.25mol/L Tris-HCl， 50mmol/L EDTA， 0.25mol/L NaCl)3-5mL， 混匀， 冰浴 10min， 4℃下 6000-10000r/ min 离心 10min， 倾去上清液， 再加入提取缓冲液 II(100mmol/L Tris-HCl， 20mmol/L EDTA， 0.25mol/L NaCl， 0.025mol/L Na2B4O7)3ml， 混匀， 冰浴 10min， 4℃下 6000-10000r/min 离心 10min， 倾去上清液， 立即加入 3mL 65℃预热的 2×CTAB 和 60μL β- 巯基乙醇， 充分混匀， 在 65℃水浴中保温 4h 期间每隔 0.5h 轻轻摇动离心管一次 )。
③温浴后， 4℃下 10000r/min 离心 10min。
④取上清液至 5mL 的灭菌离心管中， 加入等体积的氯仿 / 异戊醇 V/V ＝ (24/1)，轻轻颠倒离心管， 混匀， 4℃下 12000r/min 离心 10min， 重复此操作， 至两液面无白色沉淀为 止。
⑤把上清液转移到 5mL 的灭菌离心管中， 加入 2/3 倍体积并于 -20℃预冷的异丙 醇， 轻轻晃动， 于 -20℃静置过夜。
⑥ 4℃下 8000r/min 离心 5min， 收集沉淀。倾去上清液， 用 75％ (V/V) 的乙醇漂洗 沉淀 3 次每次 1mL， 将离心管倒置在吸水纸上， 风干。
⑦沉淀用 50μLTE 缓冲液溶解， 并加入 0.5μL 10mg/mLRNase， 轻轻混匀， 于 37℃ 水浴中温浴 30min， -20℃中保存备用。
实施例 3
①称取 0.5g 连翘嫩叶片， 在研钵中加液氮迅速研磨成粉末。
②将粉末材料转入 5mL 的灭菌离心管中， 加入 4mL 65℃预热的 2×CTAB 和 60μL β- 巯基乙醇， 充分混匀， 在 65℃水浴中保温 4h 期间每隔 0.5h 轻轻摇动离心管一次。
③温浴后， 4℃下 10000r/min 离心 10min。
④取上清液至 5mL 的灭菌离心管中， 加入等体积的氯仿 / 异戊醇 V/V ＝ (24/1)， 轻轻颠倒离心管， 混匀， 4℃下 12000r/min 离心 10min， 重复此操作， 至两液面无白色沉淀为 止。
⑤把上清液转移到 5mL 的灭菌离心管中， 加入 2/3 倍体积并于 -20℃预冷的异丙 醇， 轻轻晃动， 于 -20℃静置过夜。
⑥ 4℃下 8000r/min 离心 5min， 收集沉淀。倾去上清液， 用 75％ (V/V) 的乙醇漂洗 沉淀 2 次每次 1mL， 将离心管倒置在吸水纸上， 风干。
⑦沉淀用 60μLTE 缓冲液溶解， 并加入 0.5μL5mg/mLRNase， 轻轻混匀， 于 37℃水 浴中温浴 20min， -20℃中保存备用。
实施例 4
①称取 0.5g 连翘嫩叶片， 在研钵中加液氮迅速研磨成粉末。
②将粉末材料转入 5mL 的灭菌离心管中， 加入 0℃遇冷的提取缓冲液 4mL， 混匀， 冰 浴 10min， 4℃下 10000r/min 离心 10min， 倾去上清液， 立即加入 5mL 65℃预热的 2×CTAB 和 80μL β- 巯基乙醇， 充分混匀， 在 65℃水浴中保温 4h 期间每隔 0.5h 轻轻摇动离心管一次。
③温浴后， 4℃下 10000r/min 离心 10min。
④取上清液至 5mL 的灭菌离心管中， 加入等体积的氯仿 / 异戊醇 V/V ＝ (24/1)， 轻轻颠倒离心管， 混匀， 4℃下 12000r/min 离心 10min， 重复此操作， 至两液面无白色沉淀为 止。
⑤把上清液转移到 5mL 的灭菌离心管中， 加入 2/3 倍体积并于 -20℃预冷的异丙 醇， 轻轻晃动， 于 -20℃静置过夜。
⑥ 4℃下 8000r/min 离心 5min， 收集沉淀。倾去上清液， 用 75％ (V/V) 的乙醇漂洗 沉淀 2 次每次 1mL， 将离心管倒置在吸水纸上， 风干。
⑦沉淀用 55μLTE 缓冲液溶解， 并加入 0.5μL6mg/mLRNase， 轻轻混匀， 于 37℃水 浴中温浴 20min， -20℃中保存备用。
本发明方法稳定可靠， 提取的连翘总 DNA 纯度高， 经先后 10 次试验， 均取得了相同 和相似的结果， 并经检测， 本发明提出的连翘总 DNA 与经典 CTAB 法提出来的 DNA 相比基本上没有蛋白， A260/280 ＝ 1.81， 而经典 CTAB 法提取出来的 DNA 含有少量的蛋白， 并且 DNA 条带 弥散， A260/280 ＝ 1.38， 说明本发明方法提取出来的 DNA 纯度较高， 有效解决了长期以来科研 人员未能解决的制备连翘 DNA 纯度低的技术难题， 经济和社会效益巨大。6