猪蓝耳病病毒实时荧光定量 PCR 检测方法 【技术领域】
一种猪蓝耳病病毒 (PRRS) 实时荧光定量 PCR( 聚合酶链式反应 ) 检测方法， 涉及 一种病毒检测方法， 属于生物技术领域。背景技术
猪蓝耳病病毒 (PRRS) 是单股正链 RNA 病毒， 属套式病毒目， 动脉炎病毒科， 动脉炎 病毒属。 该病毒可引起猪繁殖与呼吸综合症， 是一种高度传染性疾病， 1987 年首次在美国爆 发， 现已成为全球范围内流行的、 危害性最大的猪传染性疾病。
猪蓝耳病又称 “猪繁殖与呼吸障碍综合症” ， 是由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒引 起， 以成年猪生殖障碍、 早产、 流产和死胎， 以及仔猪呼吸异常为特症的传染病， 是一种免疫 抑制病， 常常继发其他病原感染。
目前， 检测猪病毒的方法很多， 如血清学实验、 组织块培养和共培技术、 核酸杂交 和常规 PCR 检测技术等， 其中常规 PCR 检测技术敏感性、 特异性、 稳定性和可操作性都比较 好， 但常规 PCR 反应后的处理存在交叉污染， 也比较容易出现假阳性结果， 并且实验时间也 相对较长。而实时荧光定量 PCR 检测技术就弥补了以上的缺陷， 无论是在研究中还是在临 床样品的检测上， 实时荧光定量 PCR 快速、 敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效 方法。实时荧光定量 PCR 技术具有以下优点 ： (1)PCR 的高灵敏性、 DNA 杂交的高特异性和光 谱技术的高精确性 ； (2) 仪器自动分析， 效率高、 无后续处理 ； (3) 独特的定量原理， 即时反 映扩增过程， 摒弃终点数据， 更适用于定量， 结果重现性好 ； (4) 采用 dUTP-UNG 酶的防污染 系统， 所有试剂均是一次扩增， 毋须开盖， 不产生污染。 发明内容 本发明的目的在于提供一种猪蓝耳病病毒实时荧光定量 PCR 检测方法， 克服现有 4 技术中存在的上述不足， 本发明检测方法的检测灵敏度可达到 1.0×10 个拷贝的病毒分 子， 对于单个样本检测时间为 2 个小时， 可同时进行大批量的样本分析， 具有良好的特异 性、 敏感性、 重复性和稳定性， 适用于病毒感染的前期诊断。
本发明的技术方案 ： 猪蓝耳病病毒实时荧光定量 PCR 方法， 步骤如下 ：
1、 标准质粒的构建 ： 在美国国立生物信息中心 NCBI 基因库 Genbank 中检索获得猪 蓝耳病病毒的保守基因， 基因片段从 11271 ～ 11387， 序列 (SEQ ID NO ： 4) 为 ： GGGGGATGTC ATCACGTTACCTCCAAATACCTTCCGCGCTTCCTTCCCAAGGAATCAGTTGCGGTGGTCGGGGTTTCGAGCCCCGGG AAAGCCGCGAAAGCAGTTTGCACATTGACG ； 利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分 子， 所用的标准质粒为 PUC57， 由金斯瑞公司提供合成 ；
2、 特异性引物及荧光探针的设计 ： 以步骤 1 中选取的高度保守序列为基准， 设计 一对特异性引物及一条荧光探针 ； 设计原则为 ： 每条引物的长度为 18 ～ 25 个碱基， 荧光探 针长度为 20 ～ 30 个碱基 ； 特异性引物和荧光探针中 GC 含量要求在 40％～ 60％， 理论 Tm ＞ 50℃ ； 特异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的 3’ 端避免碱基配对 ；
选用的特异性引物和荧光探针要设计在猪蓝耳病病毒基因中的保守区， 只对猪蓝耳病病毒 特异， 和其他物种无交叉反应 ； 荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域 ； 根据 PRRSV 全 序列 (GenBank 号为 EF488048)， 在 PRRSV 基因组 ORF1b 编码区， 应用 primer express 3.0 软件在其保守区设计如下引物和探针 ：
所述特异性引物包含有正向引物 (PrimerF)、 反向引物 (PrimerR)， 其中正向引物 的序列为 ： 5’ -GGGGGATGTCATCACGTTAC-3’ (nt 11271 ～ nt 11290)， 反向引物的序列为 ： 5’ -CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’ (nt 11387 ～ nt 11368) ；
所 述 荧 光 探 针 的 序 列 为： 5’ -FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’ (nt 11305 ～ nt 11326)。
3、 实时荧光定量 PCR 扩增及建立检测标准曲线， 包括步骤 ：
(1) 模板的制备 ：
将步骤 1 中构建的标准质粒作 10 倍系列稀释成标准液， 以标准液为模板 ； 具体如 9 下： 定量标准质粒为 2.94×10 拷贝 /μl， 用稀释液将标准质粒按 10 倍稀释， 即稀释成浓度 8 7 6 5 4 分别为 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 的标准液， 标准液在 -20℃条件下 保存备用 ；
(2) 实时荧光定量 PCR 反应体系 ：
25μl 的 PCR 反 应 体 系 含 有 成 分 如 下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向引物 (PrimerR)， 2.5μl ； 模板， 1μl ；
(3) 循环反应 ：
根据步骤 (2) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的 PCR 试剂管放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 40 个循环后反应结束， 得到反应产物 ；
(4) 建立检测标准曲线 ： 荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为 x 轴， CT 值为 y 轴的标准曲线 ；
4、 感染病毒样本的 RNA 提取及 cDNA 的制备， 包括步骤 ：
(1) 采用 Trizol 法提取感染病毒样本的 RNA ；
(2) 采用 Invitrogen 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒做反转录， 制备 cDNA ；
5、 有效性验证及结果检测判定 ：
(1) 利用未感染 PRRS 猪的 cDNA 配制阴性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向 引物 (PrimerR)， 2.5μl ； PRRS 阴性猪的 cDNA， 1μl ；
利用感染 PRRS 猪的 cDNA 制备阳性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的阳性对照 PCR 反应 体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚 合 酶， 0.25μl ； 300nM 正 向 引 物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反 向 引 物 (PrimerR)， 2.5μl ； PRRS 阳性猪的 cDNA， 1μl ；
(2) 循环反应 ：按照步骤 (1) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的阴性对照和阳性对照 PCR 试剂 管同时放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 40 个循环后反 应结束， 得到反应产物 ；
(3) 有效性验证 ：
荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点 ； 阴性对 照应无 CT 值并且无扩增曲线， 阳性对照点应位于标准曲线上， 并且其 CT 值应＜ 32， 否则重 做。
本发明的有益效果 ： 采用实时定量荧光 PCR 进行猪蓝耳病病毒的特异性检测， 具 有以下优点 ：
(1) 特异性好 ： 由于 TaqMan 荧光探针定量使用杂交对定量分子进行甄别， 具有很 高的准确性， 同时， 靶序列由引物和荧光探针双重控制， 特异性好， 假阳性低。
(2) 灵敏度高 ： 荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术， 因此 Taqman 检测的灵敏 度很高。
(3) 线性关系好 ： 由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系， 通过 荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。 (4) 操作简单， 自动化程度高、 防污染 ； 使用 Taqman 荧光探针定量扩增和检测可以 在同一管内检测， 不需要开盖， 不易污染。 同时扩增和检测一步完成， 操作简单， 易于实现自 动化。
附图说明
图 1 猪蓝耳病病毒 (PRRS) 的检测标准曲线。 图 2 猪蓝耳病病毒 (PRRS)PCR 电泳图谱。具体实施方式
一、 实验材料 ：
1、 病毒株 ： 取自感染猪蓝耳病病毒 (PRRS) 猪 ( 来自无锡市血防所动物实验室 ) 的 肝脏组织。
2、 实验试剂 ： 裂解液 Trizol( 购于美国 Invitrogen 公司 )， 反转录试剂盒、 TaqDNA 聚合酶及引物 ( 购于美国 Promega 公司 )， 液氮、 氯仿、 异丙醇、 75 ％乙醇、 DEPC 处理水、 dNTPs、 DL2000 Marker( 其余试剂均购自美国 Sigma 公司 )。
实验仪器 ：
离心机 (TGL-18B-C， 上海安亭科学仪器厂 )、 荧光 PCR 仪 (FQD-48A， 杭州博日科技 有限公司 )、 紫外分光光度仪 (UV-3300PC， 上海棱谱仪器仪表有限公司 )、 扫描仪 (YLN-26、 北京市朝阳区京南机电综合服务部 )、 数码照相机 ( 索尼 WX1)、 冰箱 (MDF-382E(N)， 三洋电 机国贸公司 )。
二、 实验方法 ：
1、 标准质粒的构建 ： 在美国国立生物信息中心 NCBI 基因库 (Genbank) 中检索获得 猪蓝耳病病毒的保守基因， 基因片段从 11271 ～ 11387， 序列 (SEQ ID NO 4) 为 ： GGGGGATGTCATCACGTTACCTCCAAATACCTTCCGCGCTTCCTTCCCAAGGAATCAGTTGCGGTGGTCGGGGTTTCGAGCCCCG GGAAAGCCGCGAAAGCAGTTTGCACATTGACG ； 利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒 分子， 所用的质粒为 PUC57( 由金斯瑞公司提供 )， 由金斯瑞公司提供合成。
2、 特异性引物及荧光探针的设计 ： 以步骤 1 中选取的高度保守序列为基准， 按照 发明内容部分的设计原则设计一对包含有正向引物 (PrimerF)、 反向引物 (PrimerR) 的特 异性引物及一条荧光探针 ： 其中
正向引物的序列 (SEQ ID NO ： 1) 为 ： 5’ -GGGGGATGTCATCACGTTAC-3
反向引物的序列 (SEQ ID NO ： 2) 为 ： 5’ -CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’
荧光探针的序列 (SEQ ID NO ： 3) 为 ： 5’ -FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’
3、 实时荧光定量 PCR 扩增及建立检测标准曲线 ：
(1) 模板的制备 ：
将步骤 1 中构建的标准质粒作 10 倍系列稀释成标准液， 以标准液为模板 ； 具体如 9 下： 定量标准质粒为 2.94×10 拷贝 /μl， 用稀释液将标准质粒按 10 倍稀释， 即稀释成浓度 8 7 6 5 4 分别为 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 的标准液， 标准液在 -20℃条件下 保存备用 ； (2) 实时荧光定量 PCR 反应体系 ：
25μl 的 PCR 反 应 体 系 含 有 成 分 如 下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚 合 酶， 0.25μl ； 300nM 正 向 引 物 (Primer F)， 2.5μl ； 300nM 反向引物 (Primer R)， 2.5μl ； 模板， 1μl ；
(3) 循环反应 ：
根据步骤 (2) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的 PCR 试剂管放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 40 个循环后反应结束， 得到反应产物 ；
(4) 建立检测标准曲线 ： 荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为 x 轴， CT 值为 y 轴的标准曲线 ( 如图 1 所示 ) ；
对图 1 所示的检测标准曲线进行分析可见， 模板的 5 个稀释点均在同一条直线上， 8 4 表明当基因拷贝数在 1.0×10 ～ 1.0×10 范围内时， 检测域值与拷贝数之间均呈良好的线 2 性关系 ； 回归分析显示， y ＝ -3.514x+46.694， R ＝ 0.9934 ； 可见本发明设计的引物及荧光 探针的特异且工作性能良好。
4、 感染病毒样本的 RNA 提取及 cDNA 的制备 ：
(1) 采用 Trizol 法提取感染病毒样本的 RNA ； 具体步骤为 ：
(a)、 将猪肝组织在液氮中磨成粉末， 按照每 50 ～ 100mg 组织加入 1ml Trizol 液 的比例加入 Trizol 液研磨形成研磨液， ( 注意 ： 组织的总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10％ )， 然后转入离心管中 ；
(b)、 将上述的研磨液在室温下放置 5 分钟， 然后按照每 1ml Trizol 液加入 0.2ml 氯仿的比例加入氯仿， 盖紧离心管， 用手剧烈振荡离心管 15 秒， 4℃下 12000g 离心 15 分钟 ；
(c)、 吸取上述离心后的上层水相加入到另一个新的离心管中， 按每 1mlTrizol 液 加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇， 室温放置 10 分钟， 4℃下 12000g 离心 10 分钟 ；
(d)、 弃去上清液， 按每 1ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75％乙醇， 涡旋混
匀， 4℃下 7500g 离心 5 分钟。
(e)、 小心弃去上清液， 室温晾干或真空干燥 5 ～ 10 分钟 ( 注意不要干燥过分， 否 则会降低 RNA 的溶解度 ) ；
(f)、 将干燥后的 RNA 溶于水中， 必要时可 55℃～ 60℃水溶 10 分钟。RNA 可进行 mRNA 分离， 或贮存于 70％乙醇并保存于 -70℃条件下。
(2)cDNA 的制备 ：
采 用 Invitrogen 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒做反转录， 具体步骤为 ：
(a)、 在 0.5ml 微量离心管中， 加入总 RNA 1 ～ 5μg， 补充适量的 DEPC 水使总体积 达 11μl ； 向微量离心管中加入 10μM Oligo(dT)15μl， 轻轻混匀、 离心 ；
(b)、 将微量离心管 70℃加热 10min 后立即插入冰浴中至少 1min ； 然后加入下列 混合试剂， 混合试剂的成分为 ： 10×PCR buffer， 2μl ； 25mM MgCl2， 2μl ； 10mM each dNTP mix， 1μl ； 0.1M DTT， 2μl ； 然后轻轻混匀， 4℃下 10000g 离心 1min ； 然后转入 42℃水浴中 下孵育 2 ～ 5min ；
(c)、 加入反转录酶 200U1μl， 在 42℃水浴中继续孵育 50min ； (d)、 将微量离心管 70℃加热 15min， 终止反应 ；
(e)、 将微量离心管插入冰中， 加入 RNase H 1μl， 在 37℃下孵育 20min， 降解残留 的 RNA， 反转录的最终体系为 35μl， 最后补足 DEPC 水 165μl， 得最终 cDNA 为 200μl， 置 于 -20℃保存备用。
5、 有效性验证及结果检测判定
(1) 利用未感染 PRRS 猪的 cDNA 配制阴性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向 引物 (PrimerR)， 2.5μl ； 未感染 PRRS 猪的 cDNA， 1μl ；
利用步骤 4 中制备的感染 PRRS 猪的 cDNA 制备阳性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的 阳性对照 PCR 反应体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCRbuffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向引物 (PrimerR)， 2.5μl ； 感染 PRRS 猪的 cDNA， 1μl ；
(2) 循环反应 ：
按照步骤 (1) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的阴性对照和阳性对照的 PCR 试 剂管同时放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s|、 72℃延伸 30s， 40 个循环后 反应结束， 得到反应产物 ；
(3) 有效性验证 ：
荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点 ( 如图 1 所示 ) ； 阴性对照在本检测试验中无 CT 值并且无扩增曲线， 表明该反应体系中无猪蓝耳病 病毒 ； 图中的阳性对照点位于标准曲线上， 并且其 CT 值＜ 32， 实验有效， 可见， 本发明的检 测方法能够准确有效地检测出猪蓝耳病病毒。
三、 常规 PCR 检测 ：
(1) 以 DL2000 Marker 作为参照， 采用步骤 1 中构建的标准质粒作为模板， 以未感 染 PRRS 猪的 cDNA 作为样本 cDNA， 进行 PCR 电泳检测， 分为参照组、 阴性对照组、 阳性对照组 和样本组 a、 b、 c、 d， 各组的反应体系成分如表 1 所示 ：
表1： 常规 PCR 电泳检测中的各组的反应体系成分
其 中， 8.25μl 的 混 合 液 由 2.5μl 的 10×PCR buffer， 0.5μl 的 10mM dNTPs， 0.25μl 的 1.25U Taq DNA 聚合酶， 2.5μl 的 300nM PrimerF 和 2.5μl 的 300nM PrimerR 组成。
(2) 常规 PCR 反应 ： 反应循环程序及参数为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 35 个循环后反应结束， 得到反应产物 ；
(3) 将上述反应产物进行常规凝胶电泳检测 (120V 40min)， 检测结果如图 2 所示 ( 泳道 M ： 参照组 DL2000 Marker， 泳道 1 ： 阴性对照组， 泳道 2 ： 阳性对照组， 泳道 3 ： 样品组 a， 泳道 4 ： 样品组 b， 泳道 5 ： 样品组 c)， 由图 2 可见， 泳道 1 未跑出条带， 说明本实验方法的 非特异性较好。
一种猪蓝耳病病毒 (PRRS) 实时荧光定量 PCR( 聚合酶链式反应 ) 检测方法， 涉及 一种病毒检测方法， 属于生物技术领域。背景技术
猪蓝耳病病毒 (PRRS) 是单股正链 RNA 病毒， 属套式病毒目， 动脉炎病毒科， 动脉炎 病毒属。 该病毒可引起猪繁殖与呼吸综合症， 是一种高度传染性疾病， 1987 年首次在美国爆 发， 现已成为全球范围内流行的、 危害性最大的猪传染性疾病。
猪蓝耳病又称 “猪繁殖与呼吸障碍综合症” ， 是由猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒引 起， 以成年猪生殖障碍、 早产、 流产和死胎， 以及仔猪呼吸异常为特症的传染病， 是一种免疫 抑制病， 常常继发其他病原感染。
目前， 检测猪病毒的方法很多， 如血清学实验、 组织块培养和共培技术、 核酸杂交 和常规 PCR 检测技术等， 其中常规 PCR 检测技术敏感性、 特异性、 稳定性和可操作性都比较 好， 但常规 PCR 反应后的处理存在交叉污染， 也比较容易出现假阳性结果， 并且实验时间也 相对较长。而实时荧光定量 PCR 检测技术就弥补了以上的缺陷， 无论是在研究中还是在临 床样品的检测上， 实时荧光定量 PCR 快速、 敏感的特性使它成为应用于检测微生物的有效 方法。实时荧光定量 PCR 技术具有以下优点 ： (1)PCR 的高灵敏性、 DNA 杂交的高特异性和光 谱技术的高精确性 ； (2) 仪器自动分析， 效率高、 无后续处理 ； (3) 独特的定量原理， 即时反 映扩增过程， 摒弃终点数据， 更适用于定量， 结果重现性好 ； (4) 采用 dUTP-UNG 酶的防污染 系统， 所有试剂均是一次扩增， 毋须开盖， 不产生污染。 发明内容 本发明的目的在于提供一种猪蓝耳病病毒实时荧光定量 PCR 检测方法， 克服现有 4 技术中存在的上述不足， 本发明检测方法的检测灵敏度可达到 1.0×10 个拷贝的病毒分 子， 对于单个样本检测时间为 2 个小时， 可同时进行大批量的样本分析， 具有良好的特异 性、 敏感性、 重复性和稳定性， 适用于病毒感染的前期诊断。
本发明的技术方案 ： 猪蓝耳病病毒实时荧光定量 PCR 方法， 步骤如下 ：
1、 标准质粒的构建 ： 在美国国立生物信息中心 NCBI 基因库 Genbank 中检索获得猪 蓝耳病病毒的保守基因， 基因片段从 11271 ～ 11387， 序列 (SEQ ID NO ： 4) 为 ： GGGGGATGTC ATCACGTTACCTCCAAATACCTTCCGCGCTTCCTTCCCAAGGAATCAGTTGCGGTGGTCGGGGTTTCGAGCCCCGGG AAAGCCGCGAAAGCAGTTTGCACATTGACG ； 利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分 子， 所用的标准质粒为 PUC57， 由金斯瑞公司提供合成 ；
2、 特异性引物及荧光探针的设计 ： 以步骤 1 中选取的高度保守序列为基准， 设计 一对特异性引物及一条荧光探针 ； 设计原则为 ： 每条引物的长度为 18 ～ 25 个碱基， 荧光探 针长度为 20 ～ 30 个碱基 ； 特异性引物和荧光探针中 GC 含量要求在 40％～ 60％， 理论 Tm ＞ 50℃ ； 特异性引物和荧光探针自身以及特异性引物和荧光探针之间的 3’ 端避免碱基配对 ；
选用的特异性引物和荧光探针要设计在猪蓝耳病病毒基因中的保守区， 只对猪蓝耳病病毒 特异， 和其他物种无交叉反应 ； 荧光探针应位于一对特异性引物之间的区域 ； 根据 PRRSV 全 序列 (GenBank 号为 EF488048)， 在 PRRSV 基因组 ORF1b 编码区， 应用 primer express 3.0 软件在其保守区设计如下引物和探针 ：
所述特异性引物包含有正向引物 (PrimerF)、 反向引物 (PrimerR)， 其中正向引物 的序列为 ： 5’ -GGGGGATGTCATCACGTTAC-3’ (nt 11271 ～ nt 11290)， 反向引物的序列为 ： 5’ -CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’ (nt 11387 ～ nt 11368) ；
所 述 荧 光 探 针 的 序 列 为： 5’ -FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’ (nt 11305 ～ nt 11326)。
3、 实时荧光定量 PCR 扩增及建立检测标准曲线， 包括步骤 ：
(1) 模板的制备 ：
将步骤 1 中构建的标准质粒作 10 倍系列稀释成标准液， 以标准液为模板 ； 具体如 9 下： 定量标准质粒为 2.94×10 拷贝 /μl， 用稀释液将标准质粒按 10 倍稀释， 即稀释成浓度 8 7 6 5 4 分别为 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 的标准液， 标准液在 -20℃条件下 保存备用 ；
(2) 实时荧光定量 PCR 反应体系 ：
25μl 的 PCR 反 应 体 系 含 有 成 分 如 下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向引物 (PrimerR)， 2.5μl ； 模板， 1μl ；
(3) 循环反应 ：
根据步骤 (2) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的 PCR 试剂管放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 40 个循环后反应结束， 得到反应产物 ；
(4) 建立检测标准曲线 ： 荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为 x 轴， CT 值为 y 轴的标准曲线 ；
4、 感染病毒样本的 RNA 提取及 cDNA 的制备， 包括步骤 ：
(1) 采用 Trizol 法提取感染病毒样本的 RNA ；
(2) 采用 Invitrogen 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒做反转录， 制备 cDNA ；
5、 有效性验证及结果检测判定 ：
(1) 利用未感染 PRRS 猪的 cDNA 配制阴性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向 引物 (PrimerR)， 2.5μl ； PRRS 阴性猪的 cDNA， 1μl ；
利用感染 PRRS 猪的 cDNA 制备阳性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的阳性对照 PCR 反应 体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚 合 酶， 0.25μl ； 300nM 正 向 引 物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反 向 引 物 (PrimerR)， 2.5μl ； PRRS 阳性猪的 cDNA， 1μl ；
(2) 循环反应 ：按照步骤 (1) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的阴性对照和阳性对照 PCR 试剂 管同时放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 40 个循环后反 应结束， 得到反应产物 ；
(3) 有效性验证 ：
荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点 ； 阴性对 照应无 CT 值并且无扩增曲线， 阳性对照点应位于标准曲线上， 并且其 CT 值应＜ 32， 否则重 做。
本发明的有益效果 ： 采用实时定量荧光 PCR 进行猪蓝耳病病毒的特异性检测， 具 有以下优点 ：
(1) 特异性好 ： 由于 TaqMan 荧光探针定量使用杂交对定量分子进行甄别， 具有很 高的准确性， 同时， 靶序列由引物和荧光探针双重控制， 特异性好， 假阳性低。
(2) 灵敏度高 ： 荧光检测技术是一个很灵敏的检测技术， 因此 Taqman 检测的灵敏 度很高。
(3) 线性关系好 ： 由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系， 通过 荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。 (4) 操作简单， 自动化程度高、 防污染 ； 使用 Taqman 荧光探针定量扩增和检测可以 在同一管内检测， 不需要开盖， 不易污染。 同时扩增和检测一步完成， 操作简单， 易于实现自 动化。
【附图说明】
图 1 猪蓝耳病病毒 (PRRS) 的检测标准曲线。 图 2 猪蓝耳病病毒 (PRRS)PCR 电泳图谱。具体实施方式
一、 实验材料 ：
1、 病毒株 ： 取自感染猪蓝耳病病毒 (PRRS) 猪 ( 来自无锡市血防所动物实验室 ) 的 肝脏组织。
2、 实验试剂 ： 裂解液 Trizol( 购于美国 Invitrogen 公司 )， 反转录试剂盒、 TaqDNA 聚合酶及引物 ( 购于美国 Promega 公司 )， 液氮、 氯仿、 异丙醇、 75 ％乙醇、 DEPC 处理水、 dNTPs、 DL2000 Marker( 其余试剂均购自美国 Sigma 公司 )。
实验仪器 ：
离心机 (TGL-18B-C， 上海安亭科学仪器厂 )、 荧光 PCR 仪 (FQD-48A， 杭州博日科技 有限公司 )、 紫外分光光度仪 (UV-3300PC， 上海棱谱仪器仪表有限公司 )、 扫描仪 (YLN-26、 北京市朝阳区京南机电综合服务部 )、 数码照相机 ( 索尼 WX1)、 冰箱 (MDF-382E(N)， 三洋电 机国贸公司 )。
二、 实验方法 ：
1、 标准质粒的构建 ： 在美国国立生物信息中心 NCBI 基因库 (Genbank) 中检索获得 猪蓝耳病病毒的保守基因， 基因片段从 11271 ～ 11387， 序列 (SEQ ID NO 4) 为 ： GGGGGATGTCATCACGTTACCTCCAAATACCTTCCGCGCTTCCTTCCCAAGGAATCAGTTGCGGTGGTCGGGGTTTCGAGCCCCG GGAAAGCCGCGAAAGCAGTTTGCACATTGACG ； 利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒 分子， 所用的质粒为 PUC57( 由金斯瑞公司提供 )， 由金斯瑞公司提供合成。
2、 特异性引物及荧光探针的设计 ： 以步骤 1 中选取的高度保守序列为基准， 按照 发明内容部分的设计原则设计一对包含有正向引物 (PrimerF)、 反向引物 (PrimerR) 的特 异性引物及一条荧光探针 ： 其中
正向引物的序列 (SEQ ID NO ： 1) 为 ： 5’ -GGGGGATGTCATCACGTTAC-3
反向引物的序列 (SEQ ID NO ： 2) 为 ： 5’ -CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’
荧光探针的序列 (SEQ ID NO ： 3) 为 ： 5’ -FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’
3、 实时荧光定量 PCR 扩增及建立检测标准曲线 ：
(1) 模板的制备 ：
将步骤 1 中构建的标准质粒作 10 倍系列稀释成标准液， 以标准液为模板 ； 具体如 9 下： 定量标准质粒为 2.94×10 拷贝 /μl， 用稀释液将标准质粒按 10 倍稀释， 即稀释成浓度 8 7 6 5 4 分别为 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 、 1.0×10 的标准液， 标准液在 -20℃条件下 保存备用 ； (2) 实时荧光定量 PCR 反应体系 ：
25μl 的 PCR 反 应 体 系 含 有 成 分 如 下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚 合 酶， 0.25μl ； 300nM 正 向 引 物 (Primer F)， 2.5μl ； 300nM 反向引物 (Primer R)， 2.5μl ； 模板， 1μl ；
(3) 循环反应 ：
根据步骤 (2) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的 PCR 试剂管放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 40 个循环后反应结束， 得到反应产物 ；
(4) 建立检测标准曲线 ： 荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件自动生成以起始 模板数对数为 x 轴， CT 值为 y 轴的标准曲线 ( 如图 1 所示 ) ；
对图 1 所示的检测标准曲线进行分析可见， 模板的 5 个稀释点均在同一条直线上， 8 4 表明当基因拷贝数在 1.0×10 ～ 1.0×10 范围内时， 检测域值与拷贝数之间均呈良好的线 2 性关系 ； 回归分析显示， y ＝ -3.514x+46.694， R ＝ 0.9934 ； 可见本发明设计的引物及荧光 探针的特异且工作性能良好。
4、 感染病毒样本的 RNA 提取及 cDNA 的制备 ：
(1) 采用 Trizol 法提取感染病毒样本的 RNA ； 具体步骤为 ：
(a)、 将猪肝组织在液氮中磨成粉末， 按照每 50 ～ 100mg 组织加入 1ml Trizol 液 的比例加入 Trizol 液研磨形成研磨液， ( 注意 ： 组织的总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10％ )， 然后转入离心管中 ；
(b)、 将上述的研磨液在室温下放置 5 分钟， 然后按照每 1ml Trizol 液加入 0.2ml 氯仿的比例加入氯仿， 盖紧离心管， 用手剧烈振荡离心管 15 秒， 4℃下 12000g 离心 15 分钟 ；
(c)、 吸取上述离心后的上层水相加入到另一个新的离心管中， 按每 1mlTrizol 液 加 0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇， 室温放置 10 分钟， 4℃下 12000g 离心 10 分钟 ；
(d)、 弃去上清液， 按每 1ml Trizol 液加入至少 1ml 的比例加入 75％乙醇， 涡旋混
匀， 4℃下 7500g 离心 5 分钟。
(e)、 小心弃去上清液， 室温晾干或真空干燥 5 ～ 10 分钟 ( 注意不要干燥过分， 否 则会降低 RNA 的溶解度 ) ；
(f)、 将干燥后的 RNA 溶于水中， 必要时可 55℃～ 60℃水溶 10 分钟。RNA 可进行 mRNA 分离， 或贮存于 70％乙醇并保存于 -70℃条件下。
(2)cDNA 的制备 ：
采 用 Invitrogen 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒做反转录， 具体步骤为 ：
(a)、 在 0.5ml 微量离心管中， 加入总 RNA 1 ～ 5μg， 补充适量的 DEPC 水使总体积 达 11μl ； 向微量离心管中加入 10μM Oligo(dT)15μl， 轻轻混匀、 离心 ；
(b)、 将微量离心管 70℃加热 10min 后立即插入冰浴中至少 1min ； 然后加入下列 混合试剂， 混合试剂的成分为 ： 10×PCR buffer， 2μl ； 25mM MgCl2， 2μl ； 10mM each dNTP mix， 1μl ； 0.1M DTT， 2μl ； 然后轻轻混匀， 4℃下 10000g 离心 1min ； 然后转入 42℃水浴中 下孵育 2 ～ 5min ；
(c)、 加入反转录酶 200U1μl， 在 42℃水浴中继续孵育 50min ； (d)、 将微量离心管 70℃加热 15min， 终止反应 ；
(e)、 将微量离心管插入冰中， 加入 RNase H 1μl， 在 37℃下孵育 20min， 降解残留 的 RNA， 反转录的最终体系为 35μl， 最后补足 DEPC 水 165μl， 得最终 cDNA 为 200μl， 置 于 -20℃保存备用。
5、 有效性验证及结果检测判定
(1) 利用未感染 PRRS 猪的 cDNA 配制阴性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的阴性对照 PCR 反应体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCR buffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向 引物 (PrimerR)， 2.5μl ； 未感染 PRRS 猪的 cDNA， 1μl ；
利用步骤 4 中制备的感染 PRRS 猪的 cDNA 制备阳性对照 PCR 反应体系 ： 25μl 的 阳性对照 PCR 反应体系为含有成分如下 ： DEPC 水， 15.75μl ； 10×PCRbuffer， 2.5μl ； 10mM dNTPs， 0.5μl ； 1.25U Taq DNA 聚合酶， 0.25μl ； 300nM 正向引物 (PrimerF)， 2.5μl ； 300nM 反向引物 (PrimerR)， 2.5μl ； 感染 PRRS 猪的 cDNA， 1μl ；
(2) 循环反应 ：
按照步骤 (1) 中的 PCR 反应体系加样， 将加好样的阴性对照和阳性对照的 PCR 试 剂管同时放入荧光 PCR 仪中， 设置相应的荧光采集条件后进行扩增， 反应循环程序为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s|、 72℃延伸 30s， 40 个循环后 反应结束， 得到反应产物 ；
(3) 有效性验证 ：
荧光 PCR 仪采集荧光信号， 经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点 ( 如图 1 所示 ) ； 阴性对照在本检测试验中无 CT 值并且无扩增曲线， 表明该反应体系中无猪蓝耳病 病毒 ； 图中的阳性对照点位于标准曲线上， 并且其 CT 值＜ 32， 实验有效， 可见， 本发明的检 测方法能够准确有效地检测出猪蓝耳病病毒。
三、 常规 PCR 检测 ：
(1) 以 DL2000 Marker 作为参照， 采用步骤 1 中构建的标准质粒作为模板， 以未感 染 PRRS 猪的 cDNA 作为样本 cDNA， 进行 PCR 电泳检测， 分为参照组、 阴性对照组、 阳性对照组 和样本组 a、 b、 c、 d， 各组的反应体系成分如表 1 所示 ：
表1： 常规 PCR 电泳检测中的各组的反应体系成分
其 中， 8.25μl 的 混 合 液 由 2.5μl 的 10×PCR buffer， 0.5μl 的 10mM dNTPs， 0.25μl 的 1.25U Taq DNA 聚合酶， 2.5μl 的 300nM PrimerF 和 2.5μl 的 300nM PrimerR 组成。
(2) 常规 PCR 反应 ： 反应循环程序及参数为 ： (a)、 95℃预变性 5min， 1 个循环 ； (b)、 95℃变性 20s、 55℃退火 30s、 72℃延伸 30s， 35 个循环后反应结束， 得到反应产物 ；
(3) 将上述反应产物进行常规凝胶电泳检测 (120V 40min)， 检测结果如图 2 所示 ( 泳道 M ： 参照组 DL2000 Marker， 泳道 1 ： 阴性对照组， 泳道 2 ： 阳性对照组， 泳道 3 ： 样品组 a， 泳道 4 ： 样品组 b， 泳道 5 ： 样品组 c)， 由图 2 可见， 泳道 1 未跑出条带， 说明本实验方法的 非特异性较好。
本发明采用的实时荧光定量 PCR 技术巧妙地利用了 PCR 技术的 DNA 高效扩增、 荧 光探针技术高特异性和光谱技术的敏感性及实时定量分析的优点， 克服了常规 PCR 定性检 测的一些不足， 极大地提高了检测的敏感性和特异性， 缩短了实验时间， 简化了实验操作。 而且荧光检测的结果由电脑分析读数， 避免了产物后处理过程所致的污染， 较常规 PCR 更 为客观、 灵敏、 准确。同时， 本发明中采用的阳性对照是根据猪蓝耳病病毒的保守基因序列 设计构建的标准质粒分子， 相对于以往采用灭活病毒液作为阳性品的检测， 更增加了安全 性， 标准质粒分子还可以大量进行复制， 使得阳性标准品的来源更加稳定和可靠， 避免了阳 性病毒株在每次试验中的使用。10CN 101899535 A
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