搔痒症治疗药 【技术领域】
本发明涉及用于治疗或预防搔痒症的药物。背景技术 作为参与各种细胞的增殖分化或分化成熟的细胞的功能激活的体液因素， 已知存 在多种细胞因子。 在机体内， 接受了细胞因子刺激的细胞产生其他细胞因子， 由多个细胞因 子形成网络。机体的恒定性通过该网络的相互调节而保持微妙的平衡。认为多种免疫炎症 性疾病是由这些细胞因子、 网络的破绽产生的， 利用单克隆抗体进行的抗细胞因子疗法受 到关注。例如， 抗 TNF 抗体及抗 IL-6 受体抗体在临床上显示出高的疗效。但另一方面， 在 实际病情中是补偿途径在起作用， 仅凭阻断 IL-4 等一个细胞因子， 无法取得治疗效果， 失 败的例子颇多。
本发明人等成功地分离了与 IL-6 的信号传递受体 gp130 的同源性高的新型细 胞因子受体 NR10( 专利文献 1)。NR10 与制癌蛋白 M 受体 (OSMR) 形成异源二聚体， 发挥 IL-31 受体的功能 ( 非专利文献 1)。 NR10 还以 glm-r( 非专利文献 2)、 GPL( 非专利文献 3)、 IL-31RA( 非专利文献 4) 等名称而已知。有报道称 ： 过剩表达 IL-31 的转基因小鼠自然发 生搔痒性皮炎 ( 非专利文献 4)。
但还不能断定小鼠体内细胞因子的强制表达、 或病态小鼠的血中细胞因子浓度高 实际上就是致病原因。还完全不明确利用抗体阻断信号时是否会取得治疗效果。例如， 使 IL-18 在角质形成细胞中过剩表达的转基因小鼠出现搔痒性皮炎。 此外， 在特应性皮炎自然 发病模型 NC/Nga 小鼠中， 血中 IL-18 浓度随着病情的进展而升高。 由此推测 ： IL-18 的过剩 表达是致病原因。但实际上尚未确认到给予中和抗体所产生的治疗效果 ( 非专利文献 5)。
如上所述， 在细胞因子的表达上升的疾病中， 即使抑制其细胞因子的功能， 也未必 能够取得治疗效果， 难以根据细胞因子的表达量来推测实际中会取得治疗效果的疾病。因 此， 重要的在于 ： 发现通过抑制作为靶的细胞因子的信号传递而在实际中取得治疗效果的 疾病。
需要说明的是， 本发明的在先技术文献如下所示。
专利文献 1 ： WO00/75314
非 专 利 文 献 1： IL-31i s associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis.， JAllergy Clin Immunol.2006 Feb ； 117(2) ： 418-25.
非 专 利 文 献 2： A novel type I cytokine receptor is expressed on monocytes， signals proliferation， and activates STAT-3 and STAT-5.JBiol Chem 277， 16831-6， 2002.
非专利文献 3 ： GPL， a novel cytokine receptor related to GP130 andleukemia inhibitory factor receptor.J Biol Chem 278， 49850-9， 2003.
非专利文献 4 ： Interleukin 31， a cytokine produced by activated T cells，
induces dermatitis in mice.Nat Immunol 5， 752-60， 2004.
非专利文献 5 ： Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga.， British Journal of Dermatology 149 ： 39-45， 2003. 发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述背景而设， 其课题在于 ： 提供用于治疗或预防搔痒症的药物。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。 本发明人等发现 ： 抗 NR10 中和抗 体等的 NR10 拮抗剂作为搔痒症的治疗药或预防药有效， 从而完成了本发明。
本发明涉及用于治疗或预防搔痒症的药物， 更具体而言， 本发明提供以下 [1] ～ [6] ：
[1] 搔痒症的预防或治疗药， 其中含有 NR10 拮抗剂作为有效成分。
[2][1] 所述的预防或治疗药， 其中 NR10 拮抗剂为对 NR10 具有中和活性的抗体。 [3][2] 所述的预防或治疗药， 其中抗体为单克隆抗体。
[4][3] 所述的预防或治疗药， 其中抗体为对人 NR10 具有中和活性的单克隆抗体。
[5][2] ～ [4] 中任一项所述的预防或治疗药， 其中抗体为重组抗体。
[6][2] ～ [5] 中任一项所述的预防或治疗药， 其中抗体为嵌合抗体、 人源化抗体 或人抗体。
附图说明 图 1 是评价 IL-31 诱发的搔痒行为的曲线图。平均值 ± 标准偏差。
图 2 是评价螨抗原诱发的搔痒行为的图。平均值 ± 标准偏差。
图 3 是显示 DSS 大肠炎模型小鼠的体重变化率的推移的曲线图。
图 4 是显示急性苦基氯 (picryl chloride) 接触性皮炎模型的耳廓厚度变化的推 移的图。
图 5 是显示以搔痒次数为指标的、 抗 NR10 抗体 H0L0 对搔痒症的抑制效果的图。
具体实施方式
NR10 是与制癌蛋白 M 受体 (OSMR) 形成异源二聚体、 发挥 IL-31 的受体作用的蛋 白。其还以 glm-r(J Biol Chem 277， 16831-6， 2002)、 GPL(J Biol Chem 278， 49850-9， 2003)、 IL31RA(Nat Immunol 5， 752-60， 2004) 等名称而已知， 本发明的 NR10 还包括以这些 名称命名的蛋白。
本发明的 NR10 也包括来自人、 小鼠和其他哺乳动物的 NR10， 对其没有特别限定， 优选的 NR10 的例子有 ： 来自人或小鼠的 NR10。作为来自人的 NR10， 已知有多个剪接变体 (WO00/075314)。上述剪接变体中， NR10.1 的特征在于 ： 包括 662 个氨基酸， 具有跨膜区。 而 NR10.2 是包括 252 个氨基酸序列的、 不具有跨膜区的可溶性受体样蛋白。另一方面， 作 为发挥跨膜型受体蛋白作用的 NR10 剪接变体， 已知有 NR10.3 和 IL31RAv3。本发明中的人NR10 只要与制癌蛋白 M 受体 (OSMR) 形成异源二聚体、 且发挥 IL-31 受体作用即可， 没有 特别限定， 优选的 NR10 例如有 NR10.3( 也称作 ILRAv4(Nat Immunol 5， 752-60， 2004)) 和 IL31RAv3。NR10.3(IL31RAv4) 包括 662 个氨基酸 (WO00/075314， Nat Immunol 5， 752-60， 2004)， IL31RAv3 包括 732 个氨基酸 (GenBank 检索号 ： NM_139017)。IL-31RAv4 的氨基酸序 列见 SEQ ID NO ： 6， IL-31RAv3 的氨基酸序列见 SEQ ID NO ： 7。另一方面， 来自小鼠的 NR10 的例子有 ： 包含 SEQ ID NO ： 5 记载的氨基酸序列的蛋白。
本发明中， NR10 拮抗剂是指， 通过与 NR10 结合， 阻断基于 NR10 活化的细胞内信号 传递， 从而使细胞的生理活性丧失或抑制的物质。 其中， 作为生理活性， 例如有 ： 生理活性物 质 ( 例如趋化因子、 炎症性细胞因子等 ) 的产生诱导活性、 产生抑制活性、 分泌促进活性、 分 泌抑制活性、 增殖活性、 增殖诱导活性、 生存活性、 分化活性、 分化诱导活性、 转录活性、 膜输 送活性、 结合活性、 蛋白分解活性、 磷酸化 / 脱磷酸化活性、 氧化还原活性、 转移活性、 核酸 分解活性、 脱水活性、 细胞死亡诱导活性、 凋亡诱导活性等， 但并不限于这些。
判定是否具有拮抗剂活性， 可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。 例如， 在配体存在下， 使被检化合物与在细胞表面上表达的 NR10 接触， 判定是否产生作为 NR10 的 活化指标的细胞内信号传递。上述判定例如可以按照文献 “Dillon SR 等人， Interleukin 31， acytokine produced by activated T cells， induces dermatitis in mice.Nat Immunol.2004J ul ； 5(7) ： 752-60.” 中记载的方法来进行。认为抑制对配体刺激作出响应 的细胞内信号传递的化合物是 NR10 拮抗剂。
本发明中的拮抗剂可以是天然化合物， 也可以是人工化合物。作为本发明中的拮 抗剂， 可以使用公知物质。 还可以使用通过上述方法判定为具有拮抗剂活性的新型化合物。
本发明中的 NR10 拮抗剂的一个方式为 ： 与 NR10 结合的抗体。对与 NR10 结合的 抗体没有特别限定， 优选为与 NR10 特异性结合的抗体。与 NR10 结合的抗体的优选方式为 ： 具有 NR10 中和活性的抗体。本发明中的 “具有 NR10 中和活性的抗体” 是指， 具有抑制基于 NR10 的生理活性的作用的抗体。本发明中的 “具有 NR10 中和活性的抗体” 可以是多克隆抗 体， 也可以是单克隆抗体， 但优选的方式为单克隆抗体。
本 发 明 的 抗 体 只 要 是 与 NR10 结 合 的 抗 体 即 可， 没 有 特 别 限 定， 还包括嵌合 (chimeric) 抗体、 人源化 (humanized) 抗体、 人抗体等重组抗体。 嵌合抗体是指包含人以外 的哺乳动物、 例如小鼠抗体的重链、 轻链的可变区和人抗体的重链、 轻链的恒定区的抗体。 嵌合抗体可以利用已知的方法来制备。例如， 由杂交瘤克隆抗体基因， 将其插入到适当的 载体中， 再将其导入宿主中， 即可制备嵌合抗体 ( 例如参照 Carl， A.K.Borrebaeck， James， W.Larrick， THERAPEUTIC MONOCLONALANTIBODIES， Published in the United Kingdom by MACMILLANPUBLISHERS LTD， 1990)。具体而言， 使用逆转录酶， 由杂交瘤的 mRNA 合成抗体可 变区 (V 区 ) 的 cDNA。得到编码目标抗体 V 区的 DNA 时， 将其与编码所期望的人抗体恒定区 (C 区 ) 的 DNA 连接， 再将其插入到表达载体中。或者， 可以将编码抗体 V 区的 DNA 插入到包 含人抗体 C 区的 DNA 的表达载体中。将其插入到表达载体中， 使之在表达调节区、 例如增强 子、 启动子的调节下表达。接下来， 利用该表达载体转化宿主细胞， 可以使嵌合抗体表达。
人源化抗体也称作重构 (reshaped) 人抗体， 是将人以外的哺乳动物、 例如小鼠抗 体的互补性决定区 (CDR) 移植到人抗体的互补性决定区中的人源化抗体， 其常规基因重组 方法也是已知的。具体而言， 利用 PCR 法， 由多个制作成在末端部位具有重叠部分的寡核苷酸合成 DNA 序列， 所述 DNA 序列设计成连接小鼠抗体的 CDR 和人抗体的构架区 (framework region ； FR)。将所得 DNA 与编码人抗体恒定区的 DNA 连接， 接着插入到表达载体中， 再将 其导入宿主中使之产生抗体， 从而得到人源化抗体 ( 参照欧州专利申请公开号 EP 239400、 国际专利申请公开号 WO96/02576)。经由 CDR 连接的人抗体的 FR， 选择互补性决定区形成 良好的抗原结合位点的 FR。根据需要， 还可以取代抗体可变区的构架区的氨基酸， 使重构 人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点 (Sato， K. 等人， Cancer Res.(1993)53， 851-856)。
另外， 人抗体的获得方法也是已知的。例如， 在体外用所需抗原或表达所需抗原 的细胞致敏人淋巴细胞， 使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、 例如 U266 融合， 从而可以获得 与抗原具有结合活性的所需人抗体 ( 参照日本特公平 1-59878)。另外， 通过用所需抗原对 具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物进行免疫， 可以获得所需的人抗体 ( 参 照国际专利申请公开号 WO93/12227、 WO92/03918、 WO94/02602、 WO94/25585、 WO96/34096、 WO96/33735)。
并且， 还已知使用人抗体噬菌体文库， 通过淘选法获得人抗体的技术。例如， 利用 噬菌体展示法， 使人抗体的可变区作为单链抗体 (scFv) 在噬菌体表面表达， 可以选择与抗 原结合的噬菌体。分析所选择的噬菌体的基因时， 可以确定编码与抗原结合的人抗体可变 区的 DNA 序列。明确了与抗原结合的 scFv 的 DNA 序列后， 制作具有该序列的适当的表达载 体， 可以获得人抗体。这些方法众所周知， 可以参考 WO92/01047、 WO92/20791、 WO93/06213、 WO93/11236、 WO93/19172、 WO95/01438、 WO95/15388 等。 重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列， 只要具有 NR10 中和活性即可， 在确认 到 NR10 中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中， 有 1 个或多个氨 基酸可以被取代、 缺失、 添加和 / 或插入。作为用于制备在重链可变区或轻链可变区的 氨基酸序列中， 有 1 个或多个氨基酸被取代、 缺失、 添加和 / 或插入， 并具有 NR10 中和活 性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的、 本领域技术人员所熟知的方法， 已知有向蛋白中导入突变的方法。例如， 本领域技术人员可以采用位点特异性诱变法 (Hashimoto-Gotoh， T， Mizuno， T， Ogasahara， Y 和 Nakagawa， M.(1995)An oligodeoxyri bonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis( 寡 脱 氧核糖核苷酸定向双琥珀色法位点定向诱变 ).Gene 152， 271-275 ； Zoller， MJ 和 Smith， M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors(DNA 片 段 克 隆 到 M13 载 体 的 寡 聚 核 苷 酸 定 向 诱 变 ).Methods Enzymol.100， 468-500 、 Kramer ， W， Drutsa ， V， Jansen ， HW ， Kramer ， B， Pflugfelder ， M 和 Fritz ， HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction( 带 缺 口 的 双 链 体 DNA 接 近 于 寡 聚 核 苷 酸 定 向 突 变 结 构 ).Nucleic Acids Res.12， 9441-9456、 Kramer W 和 Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods( 经由带缺口的双链体 DNA 法突变的寡聚核苷酸定向结构 ).Enzymol.154， 350-367、 Kunkel， TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection( 无表型筛选的 迅速及高效的位点特异性诱变法 ).Proc Natl Acad Sci USA.82， 488-492) 等， 向具有 NR10 中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中导入适当突变， 从而可以制备
与具有 NR10 中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区功能同等的突变体。这样， 重链可 变区或轻链可变区中有 1 个或多个氨基酸发生突变、 且具有 NR10 中和活性的抗体的重链可 变区或轻链可变区也包含在本发明的重链可变区或轻链可变区中。
当改变氨基酸残基时， 优选突变成保存有氨基酸侧链的性质的其它氨基酸。 例如， 氨基酸侧链的性质有 ： 疏水性氨基酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) ； 亲水性氨基酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) ； 具有脂肪族侧链的氨基酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P) ； 具有含羟基侧链的氨基酸 (S、 T、 Y) ； 具有含硫原子侧链的氨基酸 (C、 M) ； 具有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸 (D、 N、 E、 Q) ； 具有 含碱性侧链的氨基酸 (R、 K、 H) ； 以及具有含芳香族侧链的氨基酸 (H、 F、 Y、 W)( 括号内均表示 氨基酸的单字母符号 )。 将上述各组内的氨基酸的取代称作保守取代。 已知具有对某一氨基 酸序列通过 1 个或多个氨基酸残基的缺失、 添加和 / 或用其它氨基酸的取代进行修饰的氨 基酸序列的多肽维持其生物学活性 (Mark， D.F. 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81 ： 5662-6 ； Zoller， M.J. 和 Smith， M.， Nucleic Acids Res.(1982)10 ： 6487-500 ； Wang， A. 等 人， Science(1984)224 ： 1431-3 ； Dalbadie-McFarland， G. 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1982)79 ： 6409-13)。 这样的突变体与氨基酸突变前的重链可变区或轻链可变区的氨基 酸序列具有至少 70％、 更优选至少 75％、 更优选至少 80％、 进一步优选至少 85％、 更进一步 优选至少 90％、 而且最优选至少 95％的氨基酸序列的同源性。本说明书中， 序列的同源性 如下定义 ： 根据需要将序列整列化和导入适当的缺口， 使序列同源性达到最大， 之后以残基 与原始重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的残基相同的比例来定义。 氨基酸序列的同 源性可以通过上述方法来确定。
另外， 重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中有 1 个或多个氨基酸被取代、 缺 失、 添加和 / 或插入、 且具有 NR10 中和活性的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列， 还 可以由在严格条件下与包含编码该重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列 的核酸杂交的核酸而得到。 作为用于分离在严格条件下与包含编码重链可变区或轻链可变 区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸的严格的杂交条件， 可以例示 ： 6M 尿素、 0.4％ SDS、 0.5×SSC、 37℃的条件或与其同等的严格的杂交条件。采用更严格的条件、 例如 6M 尿素、 0.4％ SDS、 0.1×SSC 的条件、 42℃时， 有望分离同源性更高的核酸。分离的核酸的 序列可以利用后述公知的方法来确定。所分离的核酸的同源性， 以核苷酸序列整体计， 具 有至少 50％以上、 进一步优选 70％以上、 更进一步优选 90％以上 ( 例如 95％、 96％、 97％、 98％、 99％以上 ) 的序列同源性。
除利用上述杂交技术的方法以外， 还可以利用使用根据编码重链可变区或轻链可 变区的氨基酸序列的核苷酸序列信息合成的引物的基因扩增法、 例如聚合酶链反应 (PCR) 法， 分离在严格条件下与包含编码重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的 核酸杂交的核酸。
核 苷 酸 序 列 和 氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 可 以 根 据 Karlin 和 Altschul 的 算 法 BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90 ： 5873-7) 来确定。根据该算法， 开发了被称作 BLASTN 和 BLASTX 的程序 (Altschul 等人， J.Mol.Biol.(1990)215 ： 403-10)。根据 BLAST， 通过 BLASTN 分析核苷酸序列时， 参数例如为 ： 分值 (score) ＝ 100、 读取词长 (wordlength) ＝ 12。此外， 根据 BLAST， 通过 BLASTX 分析氨基酸序列时， 参数例如为 ： 分值＝ 50、 读取词 长＝ 3。使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序时， 使用各程序的缺省参数。上述分析方法的具体方法是公知的 ( 参照 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 的 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 的网址 ； http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本发明中的抗体可以是低分子抗体。本发明的低分子抗体只要包括全长抗体 (whole antibody， 例如全长 IgG 等 ) 的一部分缺失的抗体片段、 且具有 NR10 中和活性即可， 没有特别限定。 本发明的低分子抗体只要包含全长抗体的一部分即可， 没有特别限定， 但优 选含有重链可变区 (VH) 或轻链可变区 (VL)， 特别优选为包含 VH 和 VL 两者的低分子抗体。 此外， 本发明的低分子抗体的其他优选例子有 ： 包含抗体的 CDR 的低分子抗体。 低分子抗体 中所含的 CDR 可以包含抗体的全部 6 个 CDR， 也可以包含一部分 CDR。
本发明中的低分子抗体优选比全长抗体的分子量小， 但有时例如形成二聚体、 三 聚体、 四聚体等多聚体等， 有时分子量比全长抗体的分子量大。
作为本发明中的低分子抗体之一， 例如有 scFv 抗体。scFv 抗体是重链可变区 ([VH]) 和轻链可变区 ([VL]) 通过接头等连接形成单链多肽的抗体 (Huston， J.S. 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85， 5879-5883、 Plickthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” 第 113 卷， Resenburg 和 Moore 编， Springer Verlag， New York， 第 269-315 页， (1994))。对所结合的重链可变区和轻链可变区的顺序没有特别限定， 可以 按照任何顺序进行排列， 例如包括以下的排列。 [VH] 接头 [VL]
[VL] 接头 [VH]
重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列可以被取代、 缺失、 添加和 / 或插入。并 且， 使重链可变区与轻链可变区连接时， 只要具有抗原结合活性即可， 可以缺失一部分， 也 可以添加其他多肽。还可以将可变区嵌合化或人源化。
本发明中， 连接抗体可变区的接头可以使用能够通过基因工程导入的任意肽接 头、 或合成接头 (synthetic linker)， 例如可以使用 Protein Engineering， 9(3)， 299 ～ 305， 1996 中公开的接头。
本发明中优选的接头为肽接头。对肽接头的长度没有特别限定， 本领域技术人员 根据目的可以适当选择。 通常为 1 ～ 100 个氨基酸， 优选 3 ～ 50 个氨基酸， 进一步优选 5 ～ 30 个氨基酸， 特别优选为 12 ～ 18 个氨基酸 ( 例如 15 个氨基酸 )。
作为肽接头的氨基酸序列， 例如有以下的序列。
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 8)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 9)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 10)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 11)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 12)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 13)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 14)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 15)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 10))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 11))n
[n 为 1 以上的整数 ] 等。
合成接头 ( 化学交联剂 ) 是通常用于交联肽的交联剂， 例如有 ： N- 羟基琥珀酰亚 胺 (NHS)、 二琥珀酰亚氨基辛二酸酯 (DSS)、 双 ( 磺基琥珀酰亚氨基 ) 辛二酸酯 (BS3)、 二 硫代双 ( 琥珀酰亚氨基丙酸酯 )(DSP)、 二硫代双 ( 磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯 )(DTSSP)、 双 ( 琥珀酰亚氨基琥珀酸 ) 乙二醇酯 (EGS)、 双 ( 磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸 ) 乙二醇酯 ( 磺 基 -EGS)、 二琥珀酰亚氨基酒石酸盐 (DST)、 二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐 ( 磺基 -DST)、 双 [2-( 琥珀酰亚胺氧基羰基氧基 ) 乙基 ] 砜 (BSOCOES)、 以及双 [2-( 磺基琥珀酰亚胺氧基羰 基氧基 ) 乙基 ] 砜 ( 磺基 -BSOCOES) 等， 这些交联剂均有销售。
本发明的抗体还包括 ： 在本发明抗体的氨基酸序列中添加有多个氨基酸残基的 抗体。而且， 还包括这些抗体与其他肽或蛋白融合的融合蛋白。关于制作融合蛋白的方 法， 只要连接编码本发明抗体的多核苷酸和编码其他肽或多肽的多核苷酸使构架一致， 再将其导入表达载体中， 使之在宿主中表达即可， 可以采用本领域技术人员所公知的方 法。作为用于与本发明抗体融合的其他肽或多肽， 例如可以使用 ： FLAG(Hopp， T.P. 等人， BioTechnology(1988)6， 1204-1210)、 包含 6 个 His( 组氨酸 ) 残基的 6×His、 10×His、 流感 血凝素 (HA)、 人 c-myc 片段、 VSV-GP 片段、 p18HIV 片段、 T7-tag、 HSV-tag、 E-tag、 SV40T 抗 原片段、 lck tag、 α- 微管蛋白片段、 B-tag、 蛋白 C 的片段等公知的肽。作为用于与本发明 抗体融合的其他多肽， 例如可以使用 ： GST( 谷胱甘肽 -S- 转移酶 )、 HA( 流感血凝素 )、 免疫 球蛋白恒定区、 β- 半乳糖苷酶、 MBP( 麦芽糖结合蛋白 ) 等。使市售的编码这些肽或多肽的 多核苷酸与编码本发明抗体的多核苷酸融合， 再使由此制备的融合多核苷酸表达， 从而可 以制备融合多肽。
本发明的抗体可以是与聚乙二醇 (PEG)、 透明质酸、 放射性物质、 荧光物质、 发光 物质、 酶、 毒素等各种分子结合的缀合抗体。这样的缀合抗体可以通过对所得抗体实施 化学修饰而得到。需要说明的是， 抗体的修饰方法在该领域已经确立 ( 例如 US5057313、 US5156840)。本发明中的 “抗体” 也包括这些缀合抗体。
虽然没有特别限定， 但本发明中的抗 NR10 抗体的优选方式之一为 ： 识别结构域 1 的抗体。本发明中， 结构域 1 是指， 在 SEQ ID NO ： 7 记载的人 NR10 的氨基酸序列中， 以包含 信号肽的状态下的序号计， 第 21 位氨基酸～第 120 位氨基酸的区 (LPAKP ～ LENIA)。
本发明的抗体， 根据后述的产生其的细胞或宿主或纯化方法， 其氨基酸序列、 分子 量、 等电点或糖链的有无及形态等可以不同。但只要所得抗体具有 NR10 拮抗剂的功能， 即 包含在本发明中。例如， 使本发明的抗体在原核细胞、 例如大肠杆菌中表达时， 在原抗体的 氨基酸序列的 N 末端添加甲硫氨酸残基。本发明的抗体也包含这样的抗体。
具有 NR10 中和活性的单克隆抗体可如下得到 ： 例如以来自人或小鼠等哺乳动物 的 NR10 或其片段肽作为免疫原， 利用公知方法制备抗 NR10 单克隆抗体， 之后从所得的抗 NR10 单克隆抗体中选择具有 NR10 中和活性的抗体， 即可得到单克隆抗体。即， 使用所需的 抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原， 按照常规免疫方法对其进行免疫。按照通常的 细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的亲本细胞融合， 利用通常的筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞 ( 杂交瘤 )， 从而可以制作抗 NR10 单克隆抗体。被免疫的动物可以使用 ： 例如 小鼠、 大鼠、 兔、 绵羊、 猴、 山羊、 驴、 牛、 马、 猪等哺乳动物。抗原的制备可以使用公知 NR10 基 因序列， 按照公知方法、 例如使用杆状病毒的方法 (WO98/46777 等 ) 等来进行。
杂交瘤的制作例如可以按照 Milstein 等人的方法 (Kohler.G. 和 Milstein， C.， Methods Enzymol.(1981)73 ： 3-46) 等来进行。抗原的免疫原性低时， 可以使其与白蛋白等 具有免疫原性的巨大分子结合后再进行免疫。
本发明的具有 NR10 中和活性的抗体的一个方式为 ： 具有人 NR10 中和活性的单克 隆抗体。作为用于制作具有人 NR10 中和活性的单克隆抗体的免疫原， 只要可以制作具有人 NR10 中和活性的抗体即可， 没有特别限定。例如已知人 NR10 中存在多个变体， 但只要可以 制作具有人 NR10 中和活性的抗体即可， 可以以任一种变体作为免疫原。或者， 在同样的条 件下， 可以以 NR10 的片段肽或在天然 NR10 序列中导入了人工突变的蛋白作为免疫原。人 NR10.3 除了可以制作与本发明的 NR10 具有结合活性和 / 或中和活性的抗体， 还是优选的免 疫原之一。
抗体的 NR10 中和活性的测定， 例如可以按照参考例所述的、 观察该 IL-31 依赖性 细胞株的增殖抑制效果的方法来进行。 一方面， 单克隆抗体还可以通过 DNA 免疫 (DNA Immunization) 而得到。所谓 DNA 免疫， 是指将在免疫动物中以编码抗原蛋白的基因能够表达的方式构建的载体 DNA 给予该 免疫动物， 使免疫抗原在免疫动物体内表达， 从而给予免疫刺激的方法。 与给予蛋白抗原的 普通免疫方法相比， DNA 免疫可期待下述的优势。
- 可以维持膜蛋白结构而给予免疫刺激
- 不必纯化免疫抗原
但另一方面， 在 DNA 免疫中难以与佐剂等免疫刺激手段组合。
为了通过 DNA 免疫获得单克隆抗体， 首先， 对免疫动物给予编码 NR10 的 DNA。 编码 NR10 的 DNA 可以通过 PCR 等公知方法来合成。将得到的 DNA 插入适当的表达载体中， 之后 给予免疫动物。作为表达载体， 例如可以使用 pcDNA3.1 等市售的表达载体。对生物体给予 载体的方法也可采用通常所用的方法。例如， 用基因枪 (gene gun) 将吸附有表达载体的金 颗粒射入细胞内， 从而可以进行 DNA 免疫。在 DNA 免疫后利用 NR10 表达细胞进行追加免疫 ( 加强免疫 )， 这是获得单克隆抗体的优选方法。
如此地对哺乳动物进行免疫， 确认血清中所需抗体量升高后， 从哺乳动物中采集 免疫细胞用于细胞融合。优选特别使用脾细胞作为免疫细胞。
与上述免疫细胞融合的细胞使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。 优选骨髓瘤细胞具备用 于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指， 可以 ( 或者不可以 ) 在特定的培养条件下 生存的特性。选择标志物中， 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶缺陷 ( 以下简记为 HGPRT 缺陷 ) 或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷 ( 以下简记为 TK 缺陷 ) 等是公知的。存在 HGPRT 或 TK 缺 陷的细胞具有次黄嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸苷感受性 ( 以下简记为 HAT 感受性 )。HAT 感受性 的细胞在 HAT 选择培养基中无法进行 DNA 合成而死亡， 但与正常细胞融合时， 利用正常细胞 的补救途径可以继续进行 DNA 的合成， 因此在 HAT 选择培养基中也能够增殖。
HGPRT 缺陷或 TK 缺陷的细胞， 各自可以在含有 6- 硫代鸟嘌呤、 8- 氮鸟嘌呤 ( 以下 简记为 8AG) 或 5’ - 溴脱氧尿苷的培养基中进行选择。正常细胞由于将上述嘧啶类似物摄
入 DNA 中而死亡， 但缺失了上述酶的细胞由于不能摄入上述嘧啶类似物， 所以可以在选择 培养基中生存。此外， 被称作 G418 耐性的选择标志物通过新霉素耐性基因， 提供对 2- 脱氧 链霉胺类抗生素 ( 庆大霉素类似物 ) 的耐性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。
基本上可以按照公知的方法、 例如 Kohler 和 Milstein 等人的方法 (Kohler.G. 和 Milstein， C.， Methods Enzymol.(1981)73， 3-46) 等， 进行免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融 合。
更具体而言， 例如在细胞融合促进剂的存在下、 在通常的营养培养液中， 可以实施 细胞融合。融合促进剂例如可以使用聚乙二醇 (PEG)、 仙台病毒 (HVJ) 等。为了进一步提高 融合效率， 根据需要， 还可以添加二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如， 优选使免疫细胞为骨 髓瘤细胞的 1 ～ 10 倍。用于细胞融合的培养液例如可以使用 ： 适合骨髓瘤细胞株增殖的 RPMI1640 培养液、 MEM 培养液、 以及用于该种细胞培养的常规培养液。并且， 可以在培养液 中添加胎牛血清 (FCS) 等血清补液。
细胞融合可如下进行 ： 将规定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞在培养液中充分混合， 再混合预先加热至 37℃左右的 PEG 溶液， 从而形成目标融合细胞 ( 杂交瘤 )。 在细胞融合法 中， 通常可以以 30 ～ 60％ (w/v) 的浓度添加例如平均分子量为 1000 ～ 6000 左右的 PEG。 接着， 依次添加上述列举的适当培养液， 离心以除去上清， 通过重复该操作， 除去不利于杂 交瘤生长的细胞融合剂等。 如此操作得到的杂交瘤， 可以通过使用选择培养液而进行选择， 所述选择培养液 对应于用于细胞融合的杂交瘤所具有的选择标志物。例如， 具有 HGPRT 或 TK 缺陷的细胞， 可通过在 HAT 培养液 ( 含有次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液 ) 中培养来进行选择。 即， 将 HAT 感受性的骨髓瘤细胞用于细胞融合时， 在 HAT 培养液中， 成功地与正常细胞进行 细胞融合的细胞能够选择性地增殖。为了使目标杂交瘤以外的细胞 ( 非融合细胞 ) 死亡， 使用上述 HAT 培养液继续培养足够的时间。具体而言， 通常通过培养数天至数周， 可以选择 目标杂交瘤。 接着， 通过实施常规的极限稀释法， 可以实施产生目标抗体的杂交瘤的筛选和 单克隆。或者， 还可以按照国际公开 WO03/104453 中所述的方法制备识别 NR10 的抗体。
目标抗体的筛选和单克隆可优选按照基于公知的抗原抗体反应的筛选方法来实 施。例如， 使抗原与用聚苯乙烯等制成的珠或市售 96 孔微量滴定板等载体结合， 再与杂交 瘤的培养上清反应。然后清洗载体， 之后与用酶标记的二次抗体等反应。当培养上清中含 有与致敏抗原反应的目标抗体时， 二次抗体经由该抗体与载体结合。 最终， 通过检测与载体 结合的二次抗体， 可以确定培养上清中是否存在目标抗体。利用极限稀释法等可以克隆产 生对抗原具有结合能力的所需抗体的杂交瘤。 此时， 抗原不仅可以使用用于免疫的抗原， 还 可以适当使用实质上为相同性质的 NR10 蛋白。 例如， 可以使用表达 NR10 的细胞株、 NR10 的 胞外域、 或者包含构成该区的部分氨基酸序列的寡肽作为抗原。
除通过用抗原对人以外的动物进行免疫而获得上述杂交瘤的方法外， 对人淋巴细 胞进行抗原致敏， 也可得到目标抗体。具体而言， 首先， 在体外用 NR10 蛋白致敏人淋巴细 胞。然后， 使免疫致敏的淋巴细胞与适当的融合配偶体融合。融合配偶体可以使用例如来 自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞 ( 参照日本特公平 1-59878 号公报 )。通过该方法 得到的抗体是与 NR10 蛋白具有结合活性的人抗体。
如上操作取得的抗体， 可以利用本领域技术人员所公知的方法来制作。例如， 可 以根据识别 NR10 的抗体的序列， 使用本领域技术人员所公知的基因重组技术来制作。具 体而言， 根据识别 NR10 的抗体的序列构建编码抗体的多核苷酸， 将其导入表达载体中， 之 后使之在适当的宿主细胞中表达即可 ( 例如参照 Co， M.S.et al.， J.Immunol.(1994)152， 2968-2976 ； Better ， M. 和 Horwitz ， A.H. ， Methods Enzymol.(1989)178 ， 476-496 ； Pluckthun， A. 和 Skerra， A.， Methods Enzymol.(1989)178， 497-515 ； Lamoyi， E.， Methods Enzymol.(1986)121， 652-663 ； Rousseaux， J. 等人， Methods Enzymol.(1986)121， 663-669 ； Bird， R.E. 和 Walker， B.W.， Trends Biotechnol.(1991)9， 132-137)。
载体的例子有 ： M13 系载体、 pUC 系载体、 pBR322、 pBluescript、 pCR-Script 等。另 外， 为了亚克隆、 切出 cDNA 时， 除上述载体外， 例如还有 pGEM-T、 pDIRECT、 pT7 等。为了生产 本发明的抗体而使用载体时， 表达载体特别有用。 作为表达载体， 例如为了在大肠杆菌中表 达时， 载体除了具有在大肠杆菌中扩增的上述特征外， 当以 JM109、 DH5α、 HB101、 XL1-Blue 等大肠杆菌作为宿主时， 还必需具有可以在大肠杆菌中高效率表达的启动子、 例如 lacZ 启 动 子 (Ward 等 人， Nature(1989)341， 544-546 ； FASEB J.(1992)6， 2422-2427)、 araB 启 动 子 (Better 等人， Science(1988)240， 1041-1043)、 或 T7 启动子等。作为这样的载体， 除上 述载体外， 还有 pGEX-5X-1(Pharmacia 制 )、 “QIAexpress system” (Qiagen 制 )、 pEGFP 或 pET( 此时， 宿主优选表达 T7RNA 聚合酶的 BL21) 等。 另外， 载体中可以包含用于抗体分泌的信号序列。 作为用于抗体分泌的信号序列， 当其在大肠杆菌的周质中产生时， 可以使用 pelB 信号序列 (Lei， S.P. 等人， J.Bacteriol. (1987)169， 4379)。向宿主细胞中导入载体， 例如可以采用氯化钙法、 电穿孔法来进行。
除大肠杆菌外， 作为用于制备本发明抗体的载体， 例如有来自哺乳动物的表达载 体 ( 例 如 pcDNA3(Invitrogen 社 制 ) 或 pEF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990， 18(17)， 第 5322 页 )、 pEF、 pCDM8)、 来自昆虫细胞的表达载体 ( 例如 “Bac-to-BAC 杆状病毒表达系 统” (Gibco-BRL 制 )、 pBacPAK8)、 来自植物的表达载体 ( 例如 pMH1、 pMH2)、 来自动物病毒的 表达载体 ( 例如 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、 来自逆转录病毒的表达载体 ( 例如 pZIPneo)、 来自 酵母的表达载体 ( 例如 “Pichia 表达试剂盒” (Invitrogen 制 )、 pNV11、 SP-Q01)、 来自枯草 杆菌的表达载体 ( 例如 pPL608、 pKTH50)。
为了在 CHO 细胞、 COS 细胞、 NIH3T3 细胞等动物细胞中表达时， 必需具有用于在 细胞内表达所需的启动子、 例如 SV40 启动子 (Mulligan 等人， Nature(1979)277， 108)、 MMLV-LTR 启动子、 EF1α 启动子 (Mizushima 等人， Nucleic Acids Res.(1990)18， 5322)、 CMV 启动子等， 进一步优选具有用于选择转化细胞的基因 ( 例如利用药物 ( 新霉素、 G418 等 ) 可以判别的耐药基因 )。作为具有这样的特性的载体， 例如有 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 pOPRSV、 pOP13 等。
并 且， 为 了 使 基 因 稳 定 表 达、 且 扩 增 细 胞 内 的 基 因 拷 贝 数 时， 可以列举 ： 向 缺 失 核 酸 合 成 途 径 的 CHO 细 胞 中 导 入 携 带 补 偿 该 途 径 的 DHFR 基 因 的 载 体 ( 例 如 pSV2-dhfr( “Molecular Cloning 2nd edition” Cold Spring Harbor Laboratory Press， (1989)) 等 )， 之后利用甲氨蝶呤 (MTX) 使其扩增的方法 ； 为了实现基因的一过性表达时， 使用染色体上具有表达 SV40T 抗原的基因的 COS 细胞， 利用具有 SV40 的复制起点的载体 (pcD 等 ) 进行转化的方法。作为复制起点， 还可以使用来自多瘤病毒、 腺病毒、 牛乳头瘤病
毒 (BPV) 等的复制起点。并且， 为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数， 表达载体中可以包 含氨基糖苷磷酸转移酶 (APH) 基因、 胸腺嘧啶核苷激酶 (TK) 基因、 大肠杆菌黄嘌呤 - 鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶 (Ecogpt) 基因、 二氢叶酸还原酶 (dhfr) 基因等作为选择标志物。
由此得到的本发明的抗体， 可以将其从宿主细胞内或细胞外 ( 培养基等 ) 分离， 并 纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、 纯化可以使用通常抗体的纯化中所使用的 分离、 纯化方法， 但对其没有任何限定。例如， 可以适当选择、 组合层析柱、 过滤器、 超滤、 盐 析、 溶剂沉淀、 溶剂提取、 蒸馏、 免疫沉淀、 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳、 等电点电泳法、 透析、 重结晶等来分离和纯化抗体。
层析例如有 ： 亲合层析、 离子交换层析、 疏水层析、 凝胶过滤层析、 反相层析、 吸附 层析等 (Strategies for Protein Purification and Characterization( 蛋白质纯化与 鉴定实验指南 ) ： A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak 等人， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1996)。上述层析可以使用液相层析、 例如 HPLC、 FPLC 等液相层 析来进行。用于亲合层析的柱例如有 ： 蛋白 A 柱、 蛋白 G 柱。使用蛋白 A 的柱例如有 ： Hyper D、 POROS、 Sepharose FF(GE Amersham Biosciences) 等。本发明还包括利用上述纯化方法 进行高度纯化的抗体。
抗体的 NR10 结合活性的测定， 可以采用本领域技术人员所公知的方法来进行。例 如， 作为测定抗体的抗原结合活性的方法， 可以使用 ELISA( 酶联免疫吸附测定法 )、 EIA( 酶 免疫测定法 )、 RIA( 放射免疫测定法 ) 或荧光抗体法。例如， 采用酶免疫测定法时， 向包被 有抗原的板中加入含有抗体的试样、 例如抗体产生细胞的培养上清或纯化抗体。添加用碱 性磷酸酶等酶标记的二次抗体， 将板温育、 清洗， 之后加入对硝基苯基磷酸等酶底物， 测定 吸光度， 从而可以评价抗原结合活性。
抗体的 NR10 中和活性的测定， 例如可以按照参考例所述的、 观察该 IL-31 依赖性 细胞株的增殖抑制效果的方法来进行。
本发明的 NR10 拮抗剂或具有 NR10 中和活性的抗体， 可在搔痒症的预防药或治疗 药中使用。本发明人等证实了 ： 将抗小鼠 NR10 中和抗体给予搔痒症模型动物， 取得了显著 疗效。并且， 认为即使是抗体以外的 NR10 拮抗剂， 与本实施例之所见一样， 对搔痒症也有疗 效。
本发明人等发现 ： 抗 NR10 拮抗抗体对搔痒症具有疗效。另一方面， 判定在急性接 触性皮炎和 DSS 急性大肠炎模型中， 抗 NR10 拮抗抗体对这些疾病本身没有疗效。
本发明中， 搔痒症的治疗有别于引起搔痒症的疾病或症状 ( 例如以下记载的特应 性皮炎、 丙型肝炎等疾病 ) 的治疗。因此， 本发明的搔痒症的治疗药或预防药， 并不是治疗 或预防引起搔痒症的疾病或症状本身， 而是以搔痒症本身的预防或治疗为目的。本发明的 治疗药或预防药的给药目的不是治疗或预防引起搔痒症的疾病或症状， 而是对需要治疗或 预防搔痒症的患者， 为了治疗或预防搔痒症而进行给药。
对利用本发明来治疗的搔痒症没有特别限定， 可以是任何搔痒症。利用本发明治 疗的搔痒症的具体例子有 ： 例如疥癣、 虱病、 虫咬伤和刺伤、 荨麻疹、 特应性皮炎、 接触性皮 炎、 扁平苔癣、 汗疹、 疱疹样皮炎、 干皮病、 胆道阻塞、 原发性胆汁性肝硬化 (PBC)、 丙型肝炎 等传染性肝炎、 尿毒症、 慢性肾功能衰竭、 肾透析、 淋巴瘤、 白血病、 真性一次性红细胞增多 症、 妊娠、 药物的服用 ( 巴比妥盐、 水杨酸等 )、 甲状腺功能亢进、 真性糖尿病、 内脏癌症等中的搔痒症。
本发明的搔痒症的预防或治疗药的特征在于 ： 含有上述 NR10 拮抗剂或具有 NR10 中和活性的抗体作为有效成分。 “含有 NR10 拮抗剂作为有效成分” 是指， 含有 NR10 拮抗剂 作为活性成分的至少一种， 不限定其含量。 此外， 本发明的搔痒症的预防或治疗药可以在含 有 NR10 拮抗剂的同时， 一并含有其他促进搔痒症的预防或治疗的成分。
本发明的搔痒症治疗药或预防药对作为对象的搔痒症没有特别限定， 可以是任何 原因引起的搔痒症， 但优选为 IL-31 参与的搔痒症。 IL-31 参与的搔痒症的例子有 ： 由 IL-31 引起的搔痒症、 IL-31 高度表达的搔痒症等。
本 发 明 的 NR10 拮 抗 剂 可 以 按 照 常 规 方 法 制 成 制 剂 ( 例 如 Remington’ s Pharmaceutical Science， latest edition， Mark Publishing Company， Easton， U.S.A)。 并 且， 根据需要， 可以同时含有药学上可接受的载体和 / 或添加剂。 例如有 ： 表面活性剂 (PEG、 Tween 等 )、 赋形剂、 抗氧剂 ( 抗坏血酸等 )、 着色剂、 香料、 保存剂、 稳定剂、 缓冲剂 ( 磷酸、 枸橼酸、 其他有机酸等 )、 螯合剂 (EDTA 等 )、 悬浮剂、 等渗剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 流动 性促进剂、 矫味剂等。 但本发明的炎症性疾病的预防或治疗药并不限于这些， 可以适当含有 其它常用的载体。 载体具体有 ： 轻质硅酸酐、 乳糖、 结晶纤维素、 甘露糖醇、 淀粉、 羧甲纤维素 钙、 羧甲纤维素钠、 羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、 聚 乙烯吡咯烷酮、 明胶、 中链脂肪酸三甘油酯、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 60、 蔗糖、 羧甲基纤维素、 玉米淀粉、 无机盐类等。还可以含有其他低分子量的多肽、 血清白蛋白、 明胶和免疫球蛋白 等蛋白、 以及甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸和赖氨酸等氨基酸。制成注射用水溶液 时， 将 NR10 拮抗剂溶于含有例如生理盐水、 葡萄糖或其他辅剂的等渗溶液中。辅剂例如有 ： D- 山梨醇、 D- 甘露糖、 D- 甘露醇、 氯化钠， 并且， 上述注射用水溶液可以和适当的助溶剂、 例 如醇 ( 乙醇等 )、 多元醇 ( 丙二醇、 PEG 等 )、 非离子性表面活性剂 ( 聚山梨醇酯 80、 HCO-50) 等结合使用。
根据需要， 还可以将 NR10 拮抗剂封入微囊 ( 羟甲基纤维素、 明胶、 聚 [ 甲基丙烯 酸 ] 等的微囊 ) 中、 或者制成胶体给药系统 ( 脂质体、 白蛋白微球、 微乳、 纳米颗粒和纳米 囊等 )( 参照 Remington’ s Pharmaceutical Science 16th edition &， Oslo Ed.(1980) 等 )。 并 且， 将 药 物 制 成 缓 释 制 剂 的 方 法 也 是 公 知 的， 该 方 法 可 适 用 于 NR10 拮 抗 剂 (Langer 等 人， J.Biomed.Mater.Res.(1981)15 ： 167-277 ； Langer， Chem.Tech.(1982)12 ： 98-105 ； 美国专利第 3,773,919 号 ； 欧州专利申请公开 (EP) 第 58,481 号 ； Sidman 等人， Biopolymers(1983)22 ： 547-56 ； EP 第 133,988 号 )。
本发明的搔痒症的预防或治疗药可以口服给药， 也可以胃肠外给药， 优选胃肠外 给药。具体通过注射和经皮给药对患者进行给药。注射剂型的例子有 ： 例如通过静脉内注 射、 肌肉内注射或皮下注射等进行全身或局部给药。可以对想要抑制炎症的部位或其周边 进行局部注入、 特别是肌肉内注射。可以根据患者的年龄、 症状选择适当的给药方法。作为 给药量， 例如可以在每次每 kg 体重、 活性成分为 0.0001mg ～ 100mg 的范围内选择。或者， 例如对病人给药时， 每名患者在活性成分为 0.001 ～ 1000mg/kg 体重的范围内选择， 每次的 给药量例如优选 NR10 拮抗剂的含量为 0.01 ～ 50mg/kg 体重左右。但本发明的搔痒症的预 防或治疗药并不限于上述给药量。
本发明还提供含有 IL-31 拮抗剂作为有效成分的搔痒症治疗药。IL-31 拮抗剂只要是与 IL-31 结合、 抑制 IL-31 的生物学活性的物质即可， 没有特别限定。 IL-31 拮抗剂的优 选例子有 ： 抗 IL-31 抗体 ( 例如 WO2006/088955、 WO2006/88956、 WO2006/122079)。抗 IL-31 抗体的制作、 改变、 修饰、 制造、 纯化、 给药、 制剂化等均可按照上述抗 NR10 抗体的记载来进 行。
需要说明的是， 本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书 中。 实施例 以下， 利用实施例来具体地说明本发明， 但本发明并不限于这些实施例。
[ 实施例 1]
评价 IL-31 诱发的搔痒行为
对 9 周龄的雌性正常 BALB/c 小鼠 ( 日本 Charles River) 静脉内给予 10μg 小鼠 IL-31( 室内 )， 使用搔痒测定装置 (MicroAct、 NeuroScience) 测定、 分析自刚刚给药直后起 12 个小时的搔痒行为。其结果， 与溶剂 (Vehicle)( 含有 0.5％ BALB/c 小鼠血清的 PBS) 给 药组 (n ＝ 8) 相比， 在 IL-31 给药组 (n ＝ 8) 中确认到以给药后约 5 小时为峰值的搔痒次 数的明显增加。此外， 通过在 IL-31 给药前以 350mg/kg 静脉内给予抗小鼠 NR10 中和抗体 BM095(n ＝ 8)， 使该 IL-31 诱发的搔痒行为完全被抑制 ( 图 1)。该结果证实 ： 抗 NR10 中和 抗体对 IL-31 引起的搔痒症具有抑制效果。
抗 NR10 中和抗体对螨抗原诱发皮炎模型的效果
在 9 周龄的 SPF 雌性 NC/Nga Tnd Crlj 小鼠 ( 日本 Charles River) 的腹侧耳廓 皮内给予 5μg 作为螨抗原的屋尘螨 (Dp) 粗提取物 (Cosmo BioLSL)， 每周 3 次、 给药 3 周， 以诱发皮炎 (Int Arch Allergy Immunol 2004 ； 133 ： 55-63)。 Dp 的溶剂对照组则按照同样 的时间表给予 5μL 生理盐水 ( 大塚制药 )(n ＝ 7)。对于该病态模型， 于第 0、 3、 7、 10、 14、 17、 21 天以 20mg/kg 静脉内给予抗小鼠 R10 中和抗体 BM-095(n ＝ 8)。对于溶剂对照组， 按 照同样的时间表静脉内给予 200mmol/L NaCl/20mmol/L 乙酸钠缓冲液 (pH5.5)(n ＝ 8)。
搔痒症的评价如下进行： 在 第 21 天， 使 用 搔 痒 测 定 装 置 (MicroAct， NeuroScience)， 计测 12 小时测定期间内的搔痒次数 ( 抓痒 )。其结果， 相对于 Dp 的溶剂对 照组， 溶剂对照组的搔痒次数显著 (p ＜ 0.005) 增加。此时， 相对于溶剂对照组， BM095 给 药组的搔痒次数得到显著 (p ＜ 0.05) 抑制 ( 图 2)。
该结果显示 ： 抗 NR10 中和抗体对搔痒症具有抑制效果。
[ 实施例 2]H0L0 对食蟹猴中的 IL-31 诱发搔痒症的抑制效果
对 4-5 岁的食蟹猴静脉内给予食蟹猴 IL-31 以诱发搔痒症， 研究抗人 NR10 抗体 H0L0( 重链氨基酸序列 /SEQ ID NO ： 17、 轻链氨基酸序列 /SEQ ID NO ： 18) 对上述搔痒症的 影响。静脉内给予 PBS( 溶剂 ) 或 0.01、 0.03、 0.06、 0.3、 0.6mg/kg 的 H0L0， 于之后的第 24 小时以 1g/kg 静脉内给予食蟹猴 IL-31， 用摄像机对之后 2 小时的行为进行录像。 重放录制 的录像， 以连续 3 次以上的搔破行为作为搔痒行为， 计测搔痒次数。其结果， H0L0 用量依赖 性地抑制由食蟹猴 IL-31 诱发的搔痒次数 ( 图 5)。该结果表明 ： 抗 NR10 抗体 H0L0 对搔痒 症具有抑制效果。[ 参考例 1] 确立表达 NR10 和 OSMR 的 Ba/F3 细胞株
将 人 NR10cDNA(WO0075314SEQ ID No ： 1/SEQ ID NO ： 16) 插 入 到 表 达 载 体
pCOS1(Biochem Biophys Res Commun.228， 第 838-45 页， 1996) 中， 构建 pCosNR10.3。利用 PCR 法从人胎盘文库中分离制癌蛋白 M 受体 cDNA(OSMR， GenBank 检索号 NM003999)， 同样构 建表达载体 pCos1-hOSMR。利用电穿孔法， 将各 10μg 的载体同时导入来自小鼠 IL-3 依赖 性 pro-B 细胞的细胞株 Ba/F3 中 (BioRad Gene Pulser， 960μF， 0.33kV)。导入后， 添加人 IL-31 并培养， 得到显示 IL-31 依赖性增殖的细胞株。同样， 由表达小鼠 NR10 和小鼠 OSMR 基因的 Ba/F3 细胞制作小鼠 IL-31 依赖性细胞株。
上述细胞株均显示出数 ng/mL 的 ED50， 得到了良好增殖的细胞株。人 IL-31 依赖 性细胞株不与小鼠 IL-31 反应， 通过添加人 NR10 蛋白 ( 胞外区 ) 而被抑制。小鼠 IL-31 依 赖性细胞株不与人 IL-31 反应， 不受小鼠 NR10 添加蛋白 ( 胞外区 ) 的抑制。
[ 参考例 2]NR10 蛋白 ( 胞外区 ) 的制备
以人 NR10cDNA 为模板， 利用 PCR 法仅扩增胞外区， 并在 C 末端添加 FLAG tag 序列， 再将其插入到表达载体 pCXND3(WO2005/005636) 中 (pCXND3-NR10-flag)。利用电穿孔法， 将 10μg 直链状的该载体导入中国仓鼠卵巢细胞株 DG44 中 (BioRad GenePulserII， 25μF， 1.5kV)， 得到显示高度表达的细胞株。 大量培养该细胞株， 利用抗 FLAG 抗体柱 (SIGMA 制 )、 凝胶过滤法从培养上清中得到纯化标准品， 用于以下实验。同样制备在 C 末端添加有 FLAG tag 序列的小鼠 NR10( 胞外区 )。 [ 参考例 3] 具有抗小鼠 NR10 中和活性的 scFv 的分离和嵌合 IgG 化 BM095 的制备
使用生物素化的小鼠 NR10 蛋白 ( 胞外区 )， 通过淘选法从人抗体噬菌体文库中筛 选候选克隆。从这些克隆中纯化分泌 scFv， 将其添加到参考例 1 记载的 IL-31 依赖性 Ba/ F3 细胞增殖测定系统中。其结果， 成功地获得了显示强的增殖抑制活性的克隆 BM095。
利用 PCR 法， 将 BM095 的人 H 链可变区序列 (VH) 与小鼠 IgG2a 恒定区 (CH1 后 ) 连 接、 并将人 L 链可变区序列 (VL) 与小鼠 λ 链恒定区连接， 构建表达载体。此时， VH 的氨基 酸序列见 SEQ ID NO ： 1， 编码该氨基酸序列的核苷酸序列见 SEQ ID NO ： 2。VL 的氨基酸序 列见 SEQ ID NO ： 3， 编码该氨基酸序列的核苷酸序列见 SEQ ID NO ： 4。 将直链状的各表达载 体同时导入 DG44 株中， 选择显示高水平表达嵌合 IgG 的细胞株。大量培养该细胞株， 利用 蛋白 A(rProtein A Sepharose Fast Flow， GE Amersham Biosciences 制 ) 柱、 阳离子交换 (SP-TOYOPEARL 650M， TOSOH 制 ) 柱层析， 从培养上清中得到纯化标准品。 再利用 ActiClean Etox(Sterogen 制 ) 树脂将致热原降低至检测限以下。
[ 参考例 4]BM095 对葡聚糖硫酸钠 (DSS) 诱发大肠炎的药效
制作作为炎症性肠疾病 (IBD) 的病态模型报道的 DSS 诱发大肠炎模型 (J Immunol 2003 ； 171 ： 5507-5513)， 研究抗小鼠 NR10 中和抗体 BM-095 的效果。使用经 0.22μm 滤器 (Millipore 制 ) 过滤灭菌的蒸馏水， 制备 5％ (w/v) 的葡聚糖硫酸钠盐 ( 和光纯药制 ) 水 溶液， 让 6 周龄的雄性 Balb/cAnN Crj 小鼠 ( 日本 Charles River 制 ) 通过供水瓶自由饮 水 7 天， 测定体重， 以相对于 DSS 给药起始日的体重的变化率作为药效的评价项目。
本模型中， 有关是否通过中和 IL-31 信号而使病情得到改善， 于 DSS 给药前 1 天 将抗小鼠 NR10 中和抗体 BM095 以 10mg/kg 的用量进行静脉内给药， 评价体重的减少 (n ＝ 10)。设定在 DSS 给药前 1 天静脉内给予溶剂 ( 乙酸缓冲液 [20mmol/L 乙酸钠、 20mmol/L 氯 化钠 ] 与磷酸缓冲生理盐水 [PBS， GIBCO 制 ] 以容量比 1 ∶ 5 混合的混合液 ) 的组 ( 溶剂 组， n ＝ 10)， 作为溶剂对照组。为了把握正常小鼠的体重变化率的推移， 还观察与 DSS 给药
组相同周龄、 性别的 Balb/cAnN Crj 小鼠的体重变化率的推移 (n ＝ 1)。
体重变化见图 3。在溶剂组中， 通过给予 DSS， 体重变化率下降。而在 BM095 给药 组中， 也显示出与溶剂组同样的体重变化， 但在 DSS 给药后的 4 天和 5 天后， 与溶剂组相比， BM095 组的体重变化率显著下降。 根据上述结果， 没有确认到 BM095 给药所产生的本模型的 大肠炎治疗效果。
有报道称 ： 在本模型中 IL-31RA 表达亢进 (WO2004/003140)， 但由上述实验结果可 知： 同分子的中和抗体对本模型的大肠炎没有疗效。
[ 参考例 5]BM095 对急性苦基氯接触性皮炎模型的药效
制作作为急性接触性皮炎模型报道的 (Clin Immunol 2003 ； 108 ： 257-262)、 通过 敷用苦基氯而致敏 / 诱发的延迟型过敏症反应的结果导致的皮炎， 研究抗小鼠 NR10 中和抗 体 BM-095 的效果。在 8 周龄雌性 Balb/cAnN Crj 小鼠 ( 日本 Charles River 制 ) 的腹部 皮肤上敷用 50μL 的 7％苦基氯 (nacalai tesque， Inc.) 溶液 ( 乙醇∶丙酮＝ 3 ∶ 1， v/v) 进行致敏， 5 天后在右耳耳廓皮肤上敷用 20μL 的 1％苦基氯溶液 ( 丙酮∶橄榄油＝ 1 ∶ 4， v/v)， 引发接触性皮炎 ( 诱发 )。作为用于评价溶剂对耳廓厚度的影响的对照， 在同一只小 鼠左耳耳廓皮肤上敷用 20μL 溶剂 ( 丙酮∶橄榄油＝ 1 ∶ 4， v/v)( 阳性对照组， n ＝ 6)。 在临诱发前和诱发后 24、 48、 72 小时， 使用表盘式厚度规 (dial thickness gauge)( 尾崎制 作所制 ) 测定左右耳的厚度， 以相对于临诱发前的耳廓厚度的变化作为药效评价项目。
作为用于评价病态成立的对照组， 设定致敏时在腹部皮肤上敷用不含苦基氯的乙 醇∶丙酮混合液 (3 ∶ 1， v/v)、 5 天后在右耳耳廓皮肤上敷用 20μL 的 1％苦基氯溶液、 在左 耳耳廓皮肤上敷用 20μL 溶剂 ( 丙酮∶橄榄油＝ 1 ∶ 4， v/v) 的组 ( 阴性对照组， n ＝ 6)。
为了评价本模型病态中抗 NR10 抗体的给药效果， 设定以下各组 ： 按照上述阳性对 照组的方法引发急性接触性皮炎， 在致敏前 1 天和诱发前 1 天以 10mg/kg 静脉内给予 BM095 的组 (BM095 组， n ＝ 6) ； 以及按照相同时间表给予溶剂 ( 乙酸缓冲液 [20mmol/L 乙酸钠、 20mmol/L 氯化钠 ] 与磷酸缓冲生理盐水 [PBS， GIBCO 制 ] 以容量比 1 ∶ 5 混合的混合液 ) 的组 ( 溶剂组、 n ＝ 5)。
直至诱发后 72 小时的耳廓的厚度变化见图 4。相对于阴性对照组， 阳性对照组在 诱发后 24、 48、 72 小时耳廓均明显肥厚， 这表明病态成立。此时， BM-095 组显示出与溶剂组 同样的耳廓厚度的变化， 没有确认到明显的抑制。
根据上述结果判明 ： 没有确认到给予 BM095 对本模型中观察到的急性接触性皮炎 的疗效。
产业实用性
本发明涉及用于治疗或预防搔痒症的药物。背景技术 作为参与各种细胞的增殖分化或分化成熟的细胞的功能激活的体液因素， 已知存 在多种细胞因子。 在机体内， 接受了细胞因子刺激的细胞产生其他细胞因子， 由多个细胞因 子形成网络。机体的恒定性通过该网络的相互调节而保持微妙的平衡。认为多种免疫炎症 性疾病是由这些细胞因子、 网络的破绽产生的， 利用单克隆抗体进行的抗细胞因子疗法受 到关注。例如， 抗 TNF 抗体及抗 IL-6 受体抗体在临床上显示出高的疗效。但另一方面， 在 实际病情中是补偿途径在起作用， 仅凭阻断 IL-4 等一个细胞因子， 无法取得治疗效果， 失 败的例子颇多。
本发明人等成功地分离了与 IL-6 的信号传递受体 gp130 的同源性高的新型细 胞因子受体 NR10( 专利文献 1)。NR10 与制癌蛋白 M 受体 (OSMR) 形成异源二聚体， 发挥 IL-31 受体的功能 ( 非专利文献 1)。 NR10 还以 glm-r( 非专利文献 2)、 GPL( 非专利文献 3)、 IL-31RA( 非专利文献 4) 等名称而已知。有报道称 ： 过剩表达 IL-31 的转基因小鼠自然发 生搔痒性皮炎 ( 非专利文献 4)。
但还不能断定小鼠体内细胞因子的强制表达、 或病态小鼠的血中细胞因子浓度高 实际上就是致病原因。还完全不明确利用抗体阻断信号时是否会取得治疗效果。例如， 使 IL-18 在角质形成细胞中过剩表达的转基因小鼠出现搔痒性皮炎。 此外， 在特应性皮炎自然 发病模型 NC/Nga 小鼠中， 血中 IL-18 浓度随着病情的进展而升高。 由此推测 ： IL-18 的过剩 表达是致病原因。但实际上尚未确认到给予中和抗体所产生的治疗效果 ( 非专利文献 5)。
如上所述， 在细胞因子的表达上升的疾病中， 即使抑制其细胞因子的功能， 也未必 能够取得治疗效果， 难以根据细胞因子的表达量来推测实际中会取得治疗效果的疾病。因 此， 重要的在于 ： 发现通过抑制作为靶的细胞因子的信号传递而在实际中取得治疗效果的 疾病。
需要说明的是， 本发明的在先技术文献如下所示。
专利文献 1 ： WO00/75314
非 专 利 文 献 1： IL-31i s associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis.， JAllergy Clin Immunol.2006 Feb ； 117(2) ： 418-25.
非 专 利 文 献 2： A novel type I cytokine receptor is expressed on monocytes， signals proliferation， and activates STAT-3 and STAT-5.JBiol Chem 277， 16831-6， 2002.
非专利文献 3 ： GPL， a novel cytokine receptor related to GP130 andleukemia inhibitory factor receptor.J Biol Chem 278， 49850-9， 2003.
非专利文献 4 ： Interleukin 31， a cytokine produced by activated T cells，
本发明人等成功地分离了与 IL-6 的信号传递受体 gp130 的同源性高的新型细 胞因子受体 NR10( 专利文献 1)。NR10 与制癌蛋白 M 受体 (OSMR) 形成异源二聚体， 发挥 IL-31 受体的功能 ( 非专利文献 1)。 NR10 还以 glm-r( 非专利文献 2)、 GPL( 非专利文献 3)、 IL-31RA( 非专利文献 4) 等名称而已知。有报道称 ： 过剩表达 IL-31 的转基因小鼠自然发 生搔痒性皮炎 ( 非专利文献 4)。
但还不能断定小鼠体内细胞因子的强制表达、 或病态小鼠的血中细胞因子浓度高 实际上就是致病原因。还完全不明确利用抗体阻断信号时是否会取得治疗效果。例如， 使 IL-18 在角质形成细胞中过剩表达的转基因小鼠出现搔痒性皮炎。 此外， 在特应性皮炎自然 发病模型 NC/Nga 小鼠中， 血中 IL-18 浓度随着病情的进展而升高。 由此推测 ： IL-18 的过剩 表达是致病原因。但实际上尚未确认到给予中和抗体所产生的治疗效果 ( 非专利文献 5)。
如上所述， 在细胞因子的表达上升的疾病中， 即使抑制其细胞因子的功能， 也未必 能够取得治疗效果， 难以根据细胞因子的表达量来推测实际中会取得治疗效果的疾病。因 此， 重要的在于 ： 发现通过抑制作为靶的细胞因子的信号传递而在实际中取得治疗效果的 疾病。
需要说明的是， 本发明的在先技术文献如下所示。
专利文献 1 ： WO00/75314
非 专 利 文 献 1： IL-31i s associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis.， JAllergy Clin Immunol.2006 Feb ； 117(2) ： 418-25.
非 专 利 文 献 2： A novel type I cytokine receptor is expressed on monocytes， signals proliferation， and activates STAT-3 and STAT-5.JBiol Chem 277， 16831-6， 2002.
非专利文献 3 ： GPL， a novel cytokine receptor related to GP130 andleukemia inhibitory factor receptor.J Biol Chem 278， 49850-9， 2003.
非专利文献 4 ： Interleukin 31， a cytokine produced by activated T cells，
induces dermatitis in mice.Nat Immunol 5， 752-60， 2004.
非专利文献 5 ： Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga.， British Journal of Dermatology 149 ： 39-45， 2003. 发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述背景而设， 其课题在于 ： 提供用于治疗或预防搔痒症的药物。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。 本发明人等发现 ： 抗 NR10 中和抗 体等的 NR10 拮抗剂作为搔痒症的治疗药或预防药有效， 从而完成了本发明。
本发明涉及用于治疗或预防搔痒症的药物， 更具体而言， 本发明提供以下 [1] ～ [6] ：
[1] 搔痒症的预防或治疗药， 其中含有 NR10 拮抗剂作为有效成分。
[2][1] 所述的预防或治疗药， 其中 NR10 拮抗剂为对 NR10 具有中和活性的抗体。 [3][2] 所述的预防或治疗药， 其中抗体为单克隆抗体。
[4][3] 所述的预防或治疗药， 其中抗体为对人 NR10 具有中和活性的单克隆抗体。
[5][2] ～ [4] 中任一项所述的预防或治疗药， 其中抗体为重组抗体。
[6][2] ～ [5] 中任一项所述的预防或治疗药， 其中抗体为嵌合抗体、 人源化抗体 或人抗体。
[4][3] 所述的预防或治疗药， 其中抗体为对人 NR10 具有中和活性的单克隆抗体。
[5][2] ～ [4] 中任一项所述的预防或治疗药， 其中抗体为重组抗体。
[6][2] ～ [5] 中任一项所述的预防或治疗药， 其中抗体为嵌合抗体、 人源化抗体 或人抗体。
附图说明 图 1 是评价 IL-31 诱发的搔痒行为的曲线图。平均值 ± 标准偏差。
图 2 是评价螨抗原诱发的搔痒行为的图。平均值 ± 标准偏差。
图 3 是显示 DSS 大肠炎模型小鼠的体重变化率的推移的曲线图。
图 4 是显示急性苦基氯 (picryl chloride) 接触性皮炎模型的耳廓厚度变化的推 移的图。
图 5 是显示以搔痒次数为指标的、 抗 NR10 抗体 H0L0 对搔痒症的抑制效果的图。
图 2 是评价螨抗原诱发的搔痒行为的图。平均值 ± 标准偏差。
图 3 是显示 DSS 大肠炎模型小鼠的体重变化率的推移的曲线图。
图 4 是显示急性苦基氯 (picryl chloride) 接触性皮炎模型的耳廓厚度变化的推 移的图。
图 5 是显示以搔痒次数为指标的、 抗 NR10 抗体 H0L0 对搔痒症的抑制效果的图。
具体实施方式
NR10 是与制癌蛋白 M 受体 (OSMR) 形成异源二聚体、 发挥 IL-31 的受体作用的蛋 白。其还以 glm-r(J Biol Chem 277， 16831-6， 2002)、 GPL(J Biol Chem 278， 49850-9， 2003)、 IL31RA(Nat Immunol 5， 752-60， 2004) 等名称而已知， 本发明的 NR10 还包括以这些 名称命名的蛋白。
本发明的 NR10 也包括来自人、 小鼠和其他哺乳动物的 NR10， 对其没有特别限定， 优选的 NR10 的例子有 ： 来自人或小鼠的 NR10。作为来自人的 NR10， 已知有多个剪接变体 (WO00/075314)。上述剪接变体中， NR10.1 的特征在于 ： 包括 662 个氨基酸， 具有跨膜区。 而 NR10.2 是包括 252 个氨基酸序列的、 不具有跨膜区的可溶性受体样蛋白。另一方面， 作 为发挥跨膜型受体蛋白作用的 NR10 剪接变体， 已知有 NR10.3 和 IL31RAv3。本发明中的人NR10 只要与制癌蛋白 M 受体 (OSMR) 形成异源二聚体、 且发挥 IL-31 受体作用即可， 没有 特别限定， 优选的 NR10 例如有 NR10.3( 也称作 ILRAv4(Nat Immunol 5， 752-60， 2004)) 和 IL31RAv3。NR10.3(IL31RAv4) 包括 662 个氨基酸 (WO00/075314， Nat Immunol 5， 752-60， 2004)， IL31RAv3 包括 732 个氨基酸 (GenBank 检索号 ： NM_139017)。IL-31RAv4 的氨基酸序 列见 SEQ ID NO ： 6， IL-31RAv3 的氨基酸序列见 SEQ ID NO ： 7。另一方面， 来自小鼠的 NR10 的例子有 ： 包含 SEQ ID NO ： 5 记载的氨基酸序列的蛋白。
本发明中， NR10 拮抗剂是指， 通过与 NR10 结合， 阻断基于 NR10 活化的细胞内信号 传递， 从而使细胞的生理活性丧失或抑制的物质。 其中， 作为生理活性， 例如有 ： 生理活性物 质 ( 例如趋化因子、 炎症性细胞因子等 ) 的产生诱导活性、 产生抑制活性、 分泌促进活性、 分 泌抑制活性、 增殖活性、 增殖诱导活性、 生存活性、 分化活性、 分化诱导活性、 转录活性、 膜输 送活性、 结合活性、 蛋白分解活性、 磷酸化 / 脱磷酸化活性、 氧化还原活性、 转移活性、 核酸 分解活性、 脱水活性、 细胞死亡诱导活性、 凋亡诱导活性等， 但并不限于这些。
判定是否具有拮抗剂活性， 可以通过本领域技术人员所公知的方法来进行。 例如， 在配体存在下， 使被检化合物与在细胞表面上表达的 NR10 接触， 判定是否产生作为 NR10 的 活化指标的细胞内信号传递。上述判定例如可以按照文献 “Dillon SR 等人， Interleukin 31， acytokine produced by activated T cells， induces dermatitis in mice.Nat Immunol.2004J ul ； 5(7) ： 752-60.” 中记载的方法来进行。认为抑制对配体刺激作出响应 的细胞内信号传递的化合物是 NR10 拮抗剂。
本发明中的拮抗剂可以是天然化合物， 也可以是人工化合物。作为本发明中的拮 抗剂， 可以使用公知物质。 还可以使用通过上述方法判定为具有拮抗剂活性的新型化合物。
本发明中的 NR10 拮抗剂的一个方式为 ： 与 NR10 结合的抗体。对与 NR10 结合的 抗体没有特别限定， 优选为与 NR10 特异性结合的抗体。与 NR10 结合的抗体的优选方式为 ： 具有 NR10 中和活性的抗体。本发明中的 “具有 NR10 中和活性的抗体” 是指， 具有抑制基于 NR10 的生理活性的作用的抗体。本发明中的 “具有 NR10 中和活性的抗体” 可以是多克隆抗 体， 也可以是单克隆抗体， 但优选的方式为单克隆抗体。
本 发 明 的 抗 体 只 要 是 与 NR10 结 合 的 抗 体 即 可， 没 有 特 别 限 定， 还包括嵌合 (chimeric) 抗体、 人源化 (humanized) 抗体、 人抗体等重组抗体。 嵌合抗体是指包含人以外 的哺乳动物、 例如小鼠抗体的重链、 轻链的可变区和人抗体的重链、 轻链的恒定区的抗体。 嵌合抗体可以利用已知的方法来制备。例如， 由杂交瘤克隆抗体基因， 将其插入到适当的 载体中， 再将其导入宿主中， 即可制备嵌合抗体 ( 例如参照 Carl， A.K.Borrebaeck， James， W.Larrick， THERAPEUTIC MONOCLONALANTIBODIES， Published in the United Kingdom by MACMILLANPUBLISHERS LTD， 1990)。具体而言， 使用逆转录酶， 由杂交瘤的 mRNA 合成抗体可 变区 (V 区 ) 的 cDNA。得到编码目标抗体 V 区的 DNA 时， 将其与编码所期望的人抗体恒定区 (C 区 ) 的 DNA 连接， 再将其插入到表达载体中。或者， 可以将编码抗体 V 区的 DNA 插入到包 含人抗体 C 区的 DNA 的表达载体中。将其插入到表达载体中， 使之在表达调节区、 例如增强 子、 启动子的调节下表达。接下来， 利用该表达载体转化宿主细胞， 可以使嵌合抗体表达。
人源化抗体也称作重构 (reshaped) 人抗体， 是将人以外的哺乳动物、 例如小鼠抗 体的互补性决定区 (CDR) 移植到人抗体的互补性决定区中的人源化抗体， 其常规基因重组 方法也是已知的。具体而言， 利用 PCR 法， 由多个制作成在末端部位具有重叠部分的寡核苷酸合成 DNA 序列， 所述 DNA 序列设计成连接小鼠抗体的 CDR 和人抗体的构架区 (framework region ； FR)。将所得 DNA 与编码人抗体恒定区的 DNA 连接， 接着插入到表达载体中， 再将 其导入宿主中使之产生抗体， 从而得到人源化抗体 ( 参照欧州专利申请公开号 EP 239400、 国际专利申请公开号 WO96/02576)。经由 CDR 连接的人抗体的 FR， 选择互补性决定区形成 良好的抗原结合位点的 FR。根据需要， 还可以取代抗体可变区的构架区的氨基酸， 使重构 人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合位点 (Sato， K. 等人， Cancer Res.(1993)53， 851-856)。
另外， 人抗体的获得方法也是已知的。例如， 在体外用所需抗原或表达所需抗原 的细胞致敏人淋巴细胞， 使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、 例如 U266 融合， 从而可以获得 与抗原具有结合活性的所需人抗体 ( 参照日本特公平 1-59878)。另外， 通过用所需抗原对 具有完全人抗体基因的所有组成成分的转基因动物进行免疫， 可以获得所需的人抗体 ( 参 照国际专利申请公开号 WO93/12227、 WO92/03918、 WO94/02602、 WO94/25585、 WO96/34096、 WO96/33735)。
并且， 还已知使用人抗体噬菌体文库， 通过淘选法获得人抗体的技术。例如， 利用 噬菌体展示法， 使人抗体的可变区作为单链抗体 (scFv) 在噬菌体表面表达， 可以选择与抗 原结合的噬菌体。分析所选择的噬菌体的基因时， 可以确定编码与抗原结合的人抗体可变 区的 DNA 序列。明确了与抗原结合的 scFv 的 DNA 序列后， 制作具有该序列的适当的表达载 体， 可以获得人抗体。这些方法众所周知， 可以参考 WO92/01047、 WO92/20791、 WO93/06213、 WO93/11236、 WO93/19172、 WO95/01438、 WO95/15388 等。 重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列， 只要具有 NR10 中和活性即可， 在确认 到 NR10 中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中， 有 1 个或多个氨 基酸可以被取代、 缺失、 添加和 / 或插入。作为用于制备在重链可变区或轻链可变区的 氨基酸序列中， 有 1 个或多个氨基酸被取代、 缺失、 添加和 / 或插入， 并具有 NR10 中和活 性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的、 本领域技术人员所熟知的方法， 已知有向蛋白中导入突变的方法。例如， 本领域技术人员可以采用位点特异性诱变法 (Hashimoto-Gotoh， T， Mizuno， T， Ogasahara， Y 和 Nakagawa， M.(1995)An oligodeoxyri bonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis( 寡 脱 氧核糖核苷酸定向双琥珀色法位点定向诱变 ).Gene 152， 271-275 ； Zoller， MJ 和 Smith， M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNAfragments cloned into M13 vectors(DNA 片 段 克 隆 到 M13 载 体 的 寡 聚 核 苷 酸 定 向 诱 变 ).Methods Enzymol.100， 468-500 、 Kramer ， W， Drutsa ， V， Jansen ， HW ， Kramer ， B， Pflugfelder ， M 和 Fritz ， HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction( 带 缺 口 的 双 链 体 DNA 接 近 于 寡 聚 核 苷 酸 定 向 突 变 结 构 ).Nucleic Acids Res.12， 9441-9456、 Kramer W 和 Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods( 经由带缺口的双链体 DNA 法突变的寡聚核苷酸定向结构 ).Enzymol.154， 350-367、 Kunkel， TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection( 无表型筛选的 迅速及高效的位点特异性诱变法 ).Proc Natl Acad Sci USA.82， 488-492) 等， 向具有 NR10 中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中导入适当突变， 从而可以制备
与具有 NR10 中和活性的抗体的重链可变区或轻链可变区功能同等的突变体。这样， 重链可 变区或轻链可变区中有 1 个或多个氨基酸发生突变、 且具有 NR10 中和活性的抗体的重链可 变区或轻链可变区也包含在本发明的重链可变区或轻链可变区中。
当改变氨基酸残基时， 优选突变成保存有氨基酸侧链的性质的其它氨基酸。 例如， 氨基酸侧链的性质有 ： 疏水性氨基酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V) ； 亲水性氨基酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T) ； 具有脂肪族侧链的氨基酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P) ； 具有含羟基侧链的氨基酸 (S、 T、 Y) ； 具有含硫原子侧链的氨基酸 (C、 M) ； 具有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸 (D、 N、 E、 Q) ； 具有 含碱性侧链的氨基酸 (R、 K、 H) ； 以及具有含芳香族侧链的氨基酸 (H、 F、 Y、 W)( 括号内均表示 氨基酸的单字母符号 )。 将上述各组内的氨基酸的取代称作保守取代。 已知具有对某一氨基 酸序列通过 1 个或多个氨基酸残基的缺失、 添加和 / 或用其它氨基酸的取代进行修饰的氨 基酸序列的多肽维持其生物学活性 (Mark， D.F. 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81 ： 5662-6 ； Zoller， M.J. 和 Smith， M.， Nucleic Acids Res.(1982)10 ： 6487-500 ； Wang， A. 等 人， Science(1984)224 ： 1431-3 ； Dalbadie-McFarland， G. 等 人， Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1982)79 ： 6409-13)。 这样的突变体与氨基酸突变前的重链可变区或轻链可变区的氨基 酸序列具有至少 70％、 更优选至少 75％、 更优选至少 80％、 进一步优选至少 85％、 更进一步 优选至少 90％、 而且最优选至少 95％的氨基酸序列的同源性。本说明书中， 序列的同源性 如下定义 ： 根据需要将序列整列化和导入适当的缺口， 使序列同源性达到最大， 之后以残基 与原始重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的残基相同的比例来定义。 氨基酸序列的同 源性可以通过上述方法来确定。
另外， 重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列中有 1 个或多个氨基酸被取代、 缺 失、 添加和 / 或插入、 且具有 NR10 中和活性的重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列， 还 可以由在严格条件下与包含编码该重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列 的核酸杂交的核酸而得到。 作为用于分离在严格条件下与包含编码重链可变区或轻链可变 区的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸杂交的核酸的严格的杂交条件， 可以例示 ： 6M 尿素、 0.4％ SDS、 0.5×SSC、 37℃的条件或与其同等的严格的杂交条件。采用更严格的条件、 例如 6M 尿素、 0.4％ SDS、 0.1×SSC 的条件、 42℃时， 有望分离同源性更高的核酸。分离的核酸的 序列可以利用后述公知的方法来确定。所分离的核酸的同源性， 以核苷酸序列整体计， 具 有至少 50％以上、 进一步优选 70％以上、 更进一步优选 90％以上 ( 例如 95％、 96％、 97％、 98％、 99％以上 ) 的序列同源性。
除利用上述杂交技术的方法以外， 还可以利用使用根据编码重链可变区或轻链可 变区的氨基酸序列的核苷酸序列信息合成的引物的基因扩增法、 例如聚合酶链反应 (PCR) 法， 分离在严格条件下与包含编码重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列的核苷酸序列的 核酸杂交的核酸。
核 苷 酸 序 列 和 氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 可 以 根 据 Karlin 和 Altschul 的 算 法 BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90 ： 5873-7) 来确定。根据该算法， 开发了被称作 BLASTN 和 BLASTX 的程序 (Altschul 等人， J.Mol.Biol.(1990)215 ： 403-10)。根据 BLAST， 通过 BLASTN 分析核苷酸序列时， 参数例如为 ： 分值 (score) ＝ 100、 读取词长 (wordlength) ＝ 12。此外， 根据 BLAST， 通过 BLASTX 分析氨基酸序列时， 参数例如为 ： 分值＝ 50、 读取词 长＝ 3。使用 BLAST 和 Gapped BLAST 程序时， 使用各程序的缺省参数。上述分析方法的具体方法是公知的 ( 参照 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 的 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 的网址 ； http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本发明中的抗体可以是低分子抗体。本发明的低分子抗体只要包括全长抗体 (whole antibody， 例如全长 IgG 等 ) 的一部分缺失的抗体片段、 且具有 NR10 中和活性即可， 没有特别限定。 本发明的低分子抗体只要包含全长抗体的一部分即可， 没有特别限定， 但优 选含有重链可变区 (VH) 或轻链可变区 (VL)， 特别优选为包含 VH 和 VL 两者的低分子抗体。 此外， 本发明的低分子抗体的其他优选例子有 ： 包含抗体的 CDR 的低分子抗体。 低分子抗体 中所含的 CDR 可以包含抗体的全部 6 个 CDR， 也可以包含一部分 CDR。
本发明中的低分子抗体优选比全长抗体的分子量小， 但有时例如形成二聚体、 三 聚体、 四聚体等多聚体等， 有时分子量比全长抗体的分子量大。
作为本发明中的低分子抗体之一， 例如有 scFv 抗体。scFv 抗体是重链可变区 ([VH]) 和轻链可变区 ([VL]) 通过接头等连接形成单链多肽的抗体 (Huston， J.S. 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85， 5879-5883、 Plickthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” 第 113 卷， Resenburg 和 Moore 编， Springer Verlag， New York， 第 269-315 页， (1994))。对所结合的重链可变区和轻链可变区的顺序没有特别限定， 可以 按照任何顺序进行排列， 例如包括以下的排列。 [VH] 接头 [VL]
[VL] 接头 [VH]
重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列可以被取代、 缺失、 添加和 / 或插入。并 且， 使重链可变区与轻链可变区连接时， 只要具有抗原结合活性即可， 可以缺失一部分， 也 可以添加其他多肽。还可以将可变区嵌合化或人源化。
本发明中， 连接抗体可变区的接头可以使用能够通过基因工程导入的任意肽接 头、 或合成接头 (synthetic linker)， 例如可以使用 Protein Engineering， 9(3)， 299 ～ 305， 1996 中公开的接头。
本发明中优选的接头为肽接头。对肽接头的长度没有特别限定， 本领域技术人员 根据目的可以适当选择。 通常为 1 ～ 100 个氨基酸， 优选 3 ～ 50 个氨基酸， 进一步优选 5 ～ 30 个氨基酸， 特别优选为 12 ～ 18 个氨基酸 ( 例如 15 个氨基酸 )。
作为肽接头的氨基酸序列， 例如有以下的序列。
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 8)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 9)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 10)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 11)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 12)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 13)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 14)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 15)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO ： 10))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO ： 11))n
[n 为 1 以上的整数 ] 等。
合成接头 ( 化学交联剂 ) 是通常用于交联肽的交联剂， 例如有 ： N- 羟基琥珀酰亚 胺 (NHS)、 二琥珀酰亚氨基辛二酸酯 (DSS)、 双 ( 磺基琥珀酰亚氨基 ) 辛二酸酯 (BS3)、 二 硫代双 ( 琥珀酰亚氨基丙酸酯 )(DSP)、 二硫代双 ( 磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯 )(DTSSP)、 双 ( 琥珀酰亚氨基琥珀酸 ) 乙二醇酯 (EGS)、 双 ( 磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸 ) 乙二醇酯 ( 磺 基 -EGS)、 二琥珀酰亚氨基酒石酸盐 (DST)、 二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐 ( 磺基 -DST)、 双 [2-( 琥珀酰亚胺氧基羰基氧基 ) 乙基 ] 砜 (BSOCOES)、 以及双 [2-( 磺基琥珀酰亚胺氧基羰 基氧基 ) 乙基 ] 砜 ( 磺基 -BSOCOES) 等， 这些交联剂均有销售。
本发明的抗体还包括 ： 在本发明抗体的氨基酸序列中添加有多个氨基酸残基的 抗体。而且， 还包括这些抗体与其他肽或蛋白融合的融合蛋白。关于制作融合蛋白的方 法， 只要连接编码本发明抗体的多核苷酸和编码其他肽或多肽的多核苷酸使构架一致， 再将其导入表达载体中， 使之在宿主中表达即可， 可以采用本领域技术人员所公知的方 法。作为用于与本发明抗体融合的其他肽或多肽， 例如可以使用 ： FLAG(Hopp， T.P. 等人， BioTechnology(1988)6， 1204-1210)、 包含 6 个 His( 组氨酸 ) 残基的 6×His、 10×His、 流感 血凝素 (HA)、 人 c-myc 片段、 VSV-GP 片段、 p18HIV 片段、 T7-tag、 HSV-tag、 E-tag、 SV40T 抗 原片段、 lck tag、 α- 微管蛋白片段、 B-tag、 蛋白 C 的片段等公知的肽。作为用于与本发明 抗体融合的其他多肽， 例如可以使用 ： GST( 谷胱甘肽 -S- 转移酶 )、 HA( 流感血凝素 )、 免疫 球蛋白恒定区、 β- 半乳糖苷酶、 MBP( 麦芽糖结合蛋白 ) 等。使市售的编码这些肽或多肽的 多核苷酸与编码本发明抗体的多核苷酸融合， 再使由此制备的融合多核苷酸表达， 从而可 以制备融合多肽。
本发明的抗体可以是与聚乙二醇 (PEG)、 透明质酸、 放射性物质、 荧光物质、 发光 物质、 酶、 毒素等各种分子结合的缀合抗体。这样的缀合抗体可以通过对所得抗体实施 化学修饰而得到。需要说明的是， 抗体的修饰方法在该领域已经确立 ( 例如 US5057313、 US5156840)。本发明中的 “抗体” 也包括这些缀合抗体。
虽然没有特别限定， 但本发明中的抗 NR10 抗体的优选方式之一为 ： 识别结构域 1 的抗体。本发明中， 结构域 1 是指， 在 SEQ ID NO ： 7 记载的人 NR10 的氨基酸序列中， 以包含 信号肽的状态下的序号计， 第 21 位氨基酸～第 120 位氨基酸的区 (LPAKP ～ LENIA)。
本发明的抗体， 根据后述的产生其的细胞或宿主或纯化方法， 其氨基酸序列、 分子 量、 等电点或糖链的有无及形态等可以不同。但只要所得抗体具有 NR10 拮抗剂的功能， 即 包含在本发明中。例如， 使本发明的抗体在原核细胞、 例如大肠杆菌中表达时， 在原抗体的 氨基酸序列的 N 末端添加甲硫氨酸残基。本发明的抗体也包含这样的抗体。
具有 NR10 中和活性的单克隆抗体可如下得到 ： 例如以来自人或小鼠等哺乳动物 的 NR10 或其片段肽作为免疫原， 利用公知方法制备抗 NR10 单克隆抗体， 之后从所得的抗 NR10 单克隆抗体中选择具有 NR10 中和活性的抗体， 即可得到单克隆抗体。即， 使用所需的 抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原， 按照常规免疫方法对其进行免疫。按照通常的 细胞融合法使所得的免疫细胞与公知的亲本细胞融合， 利用通常的筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞 ( 杂交瘤 )， 从而可以制作抗 NR10 单克隆抗体。被免疫的动物可以使用 ： 例如 小鼠、 大鼠、 兔、 绵羊、 猴、 山羊、 驴、 牛、 马、 猪等哺乳动物。抗原的制备可以使用公知 NR10 基 因序列， 按照公知方法、 例如使用杆状病毒的方法 (WO98/46777 等 ) 等来进行。
杂交瘤的制作例如可以按照 Milstein 等人的方法 (Kohler.G. 和 Milstein， C.， Methods Enzymol.(1981)73 ： 3-46) 等来进行。抗原的免疫原性低时， 可以使其与白蛋白等 具有免疫原性的巨大分子结合后再进行免疫。
本发明的具有 NR10 中和活性的抗体的一个方式为 ： 具有人 NR10 中和活性的单克 隆抗体。作为用于制作具有人 NR10 中和活性的单克隆抗体的免疫原， 只要可以制作具有人 NR10 中和活性的抗体即可， 没有特别限定。例如已知人 NR10 中存在多个变体， 但只要可以 制作具有人 NR10 中和活性的抗体即可， 可以以任一种变体作为免疫原。或者， 在同样的条 件下， 可以以 NR10 的片段肽或在天然 NR10 序列中导入了人工突变的蛋白作为免疫原。人 NR10.3 除了可以制作与本发明的 NR10 具有结合活性和 / 或中和活性的抗体， 还是优选的免 疫原之一。
抗体的 NR10 中和活性的测定， 例如可以按照参考例所述的、 观察该 IL-31 依赖性 细胞株的增殖抑制效果的方法来进行。 一方面， 单克隆抗体还可以通过 DNA 免疫 (DNA Immunization) 而得到。所谓 DNA 免疫， 是指将在免疫动物中以编码抗原蛋白的基因能够表达的方式构建的载体 DNA 给予该 免疫动物， 使免疫抗原在免疫动物体内表达， 从而给予免疫刺激的方法。 与给予蛋白抗原的 普通免疫方法相比， DNA 免疫可期待下述的优势。
- 可以维持膜蛋白结构而给予免疫刺激
- 不必纯化免疫抗原
但另一方面， 在 DNA 免疫中难以与佐剂等免疫刺激手段组合。
为了通过 DNA 免疫获得单克隆抗体， 首先， 对免疫动物给予编码 NR10 的 DNA。 编码 NR10 的 DNA 可以通过 PCR 等公知方法来合成。将得到的 DNA 插入适当的表达载体中， 之后 给予免疫动物。作为表达载体， 例如可以使用 pcDNA3.1 等市售的表达载体。对生物体给予 载体的方法也可采用通常所用的方法。例如， 用基因枪 (gene gun) 将吸附有表达载体的金 颗粒射入细胞内， 从而可以进行 DNA 免疫。在 DNA 免疫后利用 NR10 表达细胞进行追加免疫 ( 加强免疫 )， 这是获得单克隆抗体的优选方法。
如此地对哺乳动物进行免疫， 确认血清中所需抗体量升高后， 从哺乳动物中采集 免疫细胞用于细胞融合。优选特别使用脾细胞作为免疫细胞。
与上述免疫细胞融合的细胞使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。 优选骨髓瘤细胞具备用 于筛选的适当的选择标志物。选择标志物是指， 可以 ( 或者不可以 ) 在特定的培养条件下 生存的特性。选择标志物中， 次黄嘌呤 - 鸟嘌呤 - 磷酸核糖转移酶缺陷 ( 以下简记为 HGPRT 缺陷 ) 或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷 ( 以下简记为 TK 缺陷 ) 等是公知的。存在 HGPRT 或 TK 缺 陷的细胞具有次黄嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸苷感受性 ( 以下简记为 HAT 感受性 )。HAT 感受性 的细胞在 HAT 选择培养基中无法进行 DNA 合成而死亡， 但与正常细胞融合时， 利用正常细胞 的补救途径可以继续进行 DNA 的合成， 因此在 HAT 选择培养基中也能够增殖。
HGPRT 缺陷或 TK 缺陷的细胞， 各自可以在含有 6- 硫代鸟嘌呤、 8- 氮鸟嘌呤 ( 以下 简记为 8AG) 或 5’ - 溴脱氧尿苷的培养基中进行选择。正常细胞由于将上述嘧啶类似物摄
入 DNA 中而死亡， 但缺失了上述酶的细胞由于不能摄入上述嘧啶类似物， 所以可以在选择 培养基中生存。此外， 被称作 G418 耐性的选择标志物通过新霉素耐性基因， 提供对 2- 脱氧 链霉胺类抗生素 ( 庆大霉素类似物 ) 的耐性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。
基本上可以按照公知的方法、 例如 Kohler 和 Milstein 等人的方法 (Kohler.G. 和 Milstein， C.， Methods Enzymol.(1981)73， 3-46) 等， 进行免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融 合。
更具体而言， 例如在细胞融合促进剂的存在下、 在通常的营养培养液中， 可以实施 细胞融合。融合促进剂例如可以使用聚乙二醇 (PEG)、 仙台病毒 (HVJ) 等。为了进一步提高 融合效率， 根据需要， 还可以添加二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如， 优选使免疫细胞为骨 髓瘤细胞的 1 ～ 10 倍。用于细胞融合的培养液例如可以使用 ： 适合骨髓瘤细胞株增殖的 RPMI1640 培养液、 MEM 培养液、 以及用于该种细胞培养的常规培养液。并且， 可以在培养液 中添加胎牛血清 (FCS) 等血清补液。
细胞融合可如下进行 ： 将规定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞在培养液中充分混合， 再混合预先加热至 37℃左右的 PEG 溶液， 从而形成目标融合细胞 ( 杂交瘤 )。 在细胞融合法 中， 通常可以以 30 ～ 60％ (w/v) 的浓度添加例如平均分子量为 1000 ～ 6000 左右的 PEG。 接着， 依次添加上述列举的适当培养液， 离心以除去上清， 通过重复该操作， 除去不利于杂 交瘤生长的细胞融合剂等。 如此操作得到的杂交瘤， 可以通过使用选择培养液而进行选择， 所述选择培养液 对应于用于细胞融合的杂交瘤所具有的选择标志物。例如， 具有 HGPRT 或 TK 缺陷的细胞， 可通过在 HAT 培养液 ( 含有次黄嘌呤、 氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养液 ) 中培养来进行选择。 即， 将 HAT 感受性的骨髓瘤细胞用于细胞融合时， 在 HAT 培养液中， 成功地与正常细胞进行 细胞融合的细胞能够选择性地增殖。为了使目标杂交瘤以外的细胞 ( 非融合细胞 ) 死亡， 使用上述 HAT 培养液继续培养足够的时间。具体而言， 通常通过培养数天至数周， 可以选择 目标杂交瘤。 接着， 通过实施常规的极限稀释法， 可以实施产生目标抗体的杂交瘤的筛选和 单克隆。或者， 还可以按照国际公开 WO03/104453 中所述的方法制备识别 NR10 的抗体。
目标抗体的筛选和单克隆可优选按照基于公知的抗原抗体反应的筛选方法来实 施。例如， 使抗原与用聚苯乙烯等制成的珠或市售 96 孔微量滴定板等载体结合， 再与杂交 瘤的培养上清反应。然后清洗载体， 之后与用酶标记的二次抗体等反应。当培养上清中含 有与致敏抗原反应的目标抗体时， 二次抗体经由该抗体与载体结合。 最终， 通过检测与载体 结合的二次抗体， 可以确定培养上清中是否存在目标抗体。利用极限稀释法等可以克隆产 生对抗原具有结合能力的所需抗体的杂交瘤。 此时， 抗原不仅可以使用用于免疫的抗原， 还 可以适当使用实质上为相同性质的 NR10 蛋白。 例如， 可以使用表达 NR10 的细胞株、 NR10 的 胞外域、 或者包含构成该区的部分氨基酸序列的寡肽作为抗原。
除通过用抗原对人以外的动物进行免疫而获得上述杂交瘤的方法外， 对人淋巴细 胞进行抗原致敏， 也可得到目标抗体。具体而言， 首先， 在体外用 NR10 蛋白致敏人淋巴细 胞。然后， 使免疫致敏的淋巴细胞与适当的融合配偶体融合。融合配偶体可以使用例如来 自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞 ( 参照日本特公平 1-59878 号公报 )。通过该方法 得到的抗体是与 NR10 蛋白具有结合活性的人抗体。
如上操作取得的抗体， 可以利用本领域技术人员所公知的方法来制作。例如， 可 以根据识别 NR10 的抗体的序列， 使用本领域技术人员所公知的基因重组技术来制作。具 体而言， 根据识别 NR10 的抗体的序列构建编码抗体的多核苷酸， 将其导入表达载体中， 之 后使之在适当的宿主细胞中表达即可 ( 例如参照 Co， M.S.et al.， J.Immunol.(1994)152， 2968-2976 ； Better ， M. 和 Horwitz ， A.H. ， Methods Enzymol.(1989)178 ， 476-496 ； Pluckthun， A. 和 Skerra， A.， Methods Enzymol.(1989)178， 497-515 ； Lamoyi， E.， Methods Enzymol.(1986)121， 652-663 ； Rousseaux， J. 等人， Methods Enzymol.(1986)121， 663-669 ； Bird， R.E. 和 Walker， B.W.， Trends Biotechnol.(1991)9， 132-137)。
载体的例子有 ： M13 系载体、 pUC 系载体、 pBR322、 pBluescript、 pCR-Script 等。另 外， 为了亚克隆、 切出 cDNA 时， 除上述载体外， 例如还有 pGEM-T、 pDIRECT、 pT7 等。为了生产 本发明的抗体而使用载体时， 表达载体特别有用。 作为表达载体， 例如为了在大肠杆菌中表 达时， 载体除了具有在大肠杆菌中扩增的上述特征外， 当以 JM109、 DH5α、 HB101、 XL1-Blue 等大肠杆菌作为宿主时， 还必需具有可以在大肠杆菌中高效率表达的启动子、 例如 lacZ 启 动 子 (Ward 等 人， Nature(1989)341， 544-546 ； FASEB J.(1992)6， 2422-2427)、 araB 启 动 子 (Better 等人， Science(1988)240， 1041-1043)、 或 T7 启动子等。作为这样的载体， 除上 述载体外， 还有 pGEX-5X-1(Pharmacia 制 )、 “QIAexpress system” (Qiagen 制 )、 pEGFP 或 pET( 此时， 宿主优选表达 T7RNA 聚合酶的 BL21) 等。 另外， 载体中可以包含用于抗体分泌的信号序列。 作为用于抗体分泌的信号序列， 当其在大肠杆菌的周质中产生时， 可以使用 pelB 信号序列 (Lei， S.P. 等人， J.Bacteriol. (1987)169， 4379)。向宿主细胞中导入载体， 例如可以采用氯化钙法、 电穿孔法来进行。
除大肠杆菌外， 作为用于制备本发明抗体的载体， 例如有来自哺乳动物的表达载 体 ( 例 如 pcDNA3(Invitrogen 社 制 ) 或 pEF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990， 18(17)， 第 5322 页 )、 pEF、 pCDM8)、 来自昆虫细胞的表达载体 ( 例如 “Bac-to-BAC 杆状病毒表达系 统” (Gibco-BRL 制 )、 pBacPAK8)、 来自植物的表达载体 ( 例如 pMH1、 pMH2)、 来自动物病毒的 表达载体 ( 例如 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、 来自逆转录病毒的表达载体 ( 例如 pZIPneo)、 来自 酵母的表达载体 ( 例如 “Pichia 表达试剂盒” (Invitrogen 制 )、 pNV11、 SP-Q01)、 来自枯草 杆菌的表达载体 ( 例如 pPL608、 pKTH50)。
为了在 CHO 细胞、 COS 细胞、 NIH3T3 细胞等动物细胞中表达时， 必需具有用于在 细胞内表达所需的启动子、 例如 SV40 启动子 (Mulligan 等人， Nature(1979)277， 108)、 MMLV-LTR 启动子、 EF1α 启动子 (Mizushima 等人， Nucleic Acids Res.(1990)18， 5322)、 CMV 启动子等， 进一步优选具有用于选择转化细胞的基因 ( 例如利用药物 ( 新霉素、 G418 等 ) 可以判别的耐药基因 )。作为具有这样的特性的载体， 例如有 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 pOPRSV、 pOP13 等。
并 且， 为 了 使 基 因 稳 定 表 达、 且 扩 增 细 胞 内 的 基 因 拷 贝 数 时， 可以列举 ： 向 缺 失 核 酸 合 成 途 径 的 CHO 细 胞 中 导 入 携 带 补 偿 该 途 径 的 DHFR 基 因 的 载 体 ( 例 如 pSV2-dhfr( “Molecular Cloning 2nd edition” Cold Spring Harbor Laboratory Press， (1989)) 等 )， 之后利用甲氨蝶呤 (MTX) 使其扩增的方法 ； 为了实现基因的一过性表达时， 使用染色体上具有表达 SV40T 抗原的基因的 COS 细胞， 利用具有 SV40 的复制起点的载体 (pcD 等 ) 进行转化的方法。作为复制起点， 还可以使用来自多瘤病毒、 腺病毒、 牛乳头瘤病
毒 (BPV) 等的复制起点。并且， 为了在宿主细胞体系中扩增基因拷贝数， 表达载体中可以包 含氨基糖苷磷酸转移酶 (APH) 基因、 胸腺嘧啶核苷激酶 (TK) 基因、 大肠杆菌黄嘌呤 - 鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶 (Ecogpt) 基因、 二氢叶酸还原酶 (dhfr) 基因等作为选择标志物。
由此得到的本发明的抗体， 可以将其从宿主细胞内或细胞外 ( 培养基等 ) 分离， 并 纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、 纯化可以使用通常抗体的纯化中所使用的 分离、 纯化方法， 但对其没有任何限定。例如， 可以适当选择、 组合层析柱、 过滤器、 超滤、 盐 析、 溶剂沉淀、 溶剂提取、 蒸馏、 免疫沉淀、 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳、 等电点电泳法、 透析、 重结晶等来分离和纯化抗体。
层析例如有 ： 亲合层析、 离子交换层析、 疏水层析、 凝胶过滤层析、 反相层析、 吸附 层析等 (Strategies for Protein Purification and Characterization( 蛋白质纯化与 鉴定实验指南 ) ： A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak 等人， Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1996)。上述层析可以使用液相层析、 例如 HPLC、 FPLC 等液相层 析来进行。用于亲合层析的柱例如有 ： 蛋白 A 柱、 蛋白 G 柱。使用蛋白 A 的柱例如有 ： Hyper D、 POROS、 Sepharose FF(GE Amersham Biosciences) 等。本发明还包括利用上述纯化方法 进行高度纯化的抗体。
抗体的 NR10 结合活性的测定， 可以采用本领域技术人员所公知的方法来进行。例 如， 作为测定抗体的抗原结合活性的方法， 可以使用 ELISA( 酶联免疫吸附测定法 )、 EIA( 酶 免疫测定法 )、 RIA( 放射免疫测定法 ) 或荧光抗体法。例如， 采用酶免疫测定法时， 向包被 有抗原的板中加入含有抗体的试样、 例如抗体产生细胞的培养上清或纯化抗体。添加用碱 性磷酸酶等酶标记的二次抗体， 将板温育、 清洗， 之后加入对硝基苯基磷酸等酶底物， 测定 吸光度， 从而可以评价抗原结合活性。
抗体的 NR10 中和活性的测定， 例如可以按照参考例所述的、 观察该 IL-31 依赖性 细胞株的增殖抑制效果的方法来进行。
本发明的 NR10 拮抗剂或具有 NR10 中和活性的抗体， 可在搔痒症的预防药或治疗 药中使用。本发明人等证实了 ： 将抗小鼠 NR10 中和抗体给予搔痒症模型动物， 取得了显著 疗效。并且， 认为即使是抗体以外的 NR10 拮抗剂， 与本实施例之所见一样， 对搔痒症也有疗 效。
本发明人等发现 ： 抗 NR10 拮抗抗体对搔痒症具有疗效。另一方面， 判定在急性接 触性皮炎和 DSS 急性大肠炎模型中， 抗 NR10 拮抗抗体对这些疾病本身没有疗效。
本发明中， 搔痒症的治疗有别于引起搔痒症的疾病或症状 ( 例如以下记载的特应 性皮炎、 丙型肝炎等疾病 ) 的治疗。因此， 本发明的搔痒症的治疗药或预防药， 并不是治疗 或预防引起搔痒症的疾病或症状本身， 而是以搔痒症本身的预防或治疗为目的。本发明的 治疗药或预防药的给药目的不是治疗或预防引起搔痒症的疾病或症状， 而是对需要治疗或 预防搔痒症的患者， 为了治疗或预防搔痒症而进行给药。
对利用本发明来治疗的搔痒症没有特别限定， 可以是任何搔痒症。利用本发明治 疗的搔痒症的具体例子有 ： 例如疥癣、 虱病、 虫咬伤和刺伤、 荨麻疹、 特应性皮炎、 接触性皮 炎、 扁平苔癣、 汗疹、 疱疹样皮炎、 干皮病、 胆道阻塞、 原发性胆汁性肝硬化 (PBC)、 丙型肝炎 等传染性肝炎、 尿毒症、 慢性肾功能衰竭、 肾透析、 淋巴瘤、 白血病、 真性一次性红细胞增多 症、 妊娠、 药物的服用 ( 巴比妥盐、 水杨酸等 )、 甲状腺功能亢进、 真性糖尿病、 内脏癌症等中的搔痒症。
本发明的搔痒症的预防或治疗药的特征在于 ： 含有上述 NR10 拮抗剂或具有 NR10 中和活性的抗体作为有效成分。 “含有 NR10 拮抗剂作为有效成分” 是指， 含有 NR10 拮抗剂 作为活性成分的至少一种， 不限定其含量。 此外， 本发明的搔痒症的预防或治疗药可以在含 有 NR10 拮抗剂的同时， 一并含有其他促进搔痒症的预防或治疗的成分。
本发明的搔痒症治疗药或预防药对作为对象的搔痒症没有特别限定， 可以是任何 原因引起的搔痒症， 但优选为 IL-31 参与的搔痒症。 IL-31 参与的搔痒症的例子有 ： 由 IL-31 引起的搔痒症、 IL-31 高度表达的搔痒症等。
本 发 明 的 NR10 拮 抗 剂 可 以 按 照 常 规 方 法 制 成 制 剂 ( 例 如 Remington’ s Pharmaceutical Science， latest edition， Mark Publishing Company， Easton， U.S.A)。 并 且， 根据需要， 可以同时含有药学上可接受的载体和 / 或添加剂。 例如有 ： 表面活性剂 (PEG、 Tween 等 )、 赋形剂、 抗氧剂 ( 抗坏血酸等 )、 着色剂、 香料、 保存剂、 稳定剂、 缓冲剂 ( 磷酸、 枸橼酸、 其他有机酸等 )、 螯合剂 (EDTA 等 )、 悬浮剂、 等渗剂、 粘合剂、 崩解剂、 润滑剂、 流动 性促进剂、 矫味剂等。 但本发明的炎症性疾病的预防或治疗药并不限于这些， 可以适当含有 其它常用的载体。 载体具体有 ： 轻质硅酸酐、 乳糖、 结晶纤维素、 甘露糖醇、 淀粉、 羧甲纤维素 钙、 羧甲纤维素钠、 羟丙基纤维素、 羟丙基甲基纤维素、 聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、 聚 乙烯吡咯烷酮、 明胶、 中链脂肪酸三甘油酯、 聚氧乙烯氢化蓖麻油 60、 蔗糖、 羧甲基纤维素、 玉米淀粉、 无机盐类等。还可以含有其他低分子量的多肽、 血清白蛋白、 明胶和免疫球蛋白 等蛋白、 以及甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸和赖氨酸等氨基酸。制成注射用水溶液 时， 将 NR10 拮抗剂溶于含有例如生理盐水、 葡萄糖或其他辅剂的等渗溶液中。辅剂例如有 ： D- 山梨醇、 D- 甘露糖、 D- 甘露醇、 氯化钠， 并且， 上述注射用水溶液可以和适当的助溶剂、 例 如醇 ( 乙醇等 )、 多元醇 ( 丙二醇、 PEG 等 )、 非离子性表面活性剂 ( 聚山梨醇酯 80、 HCO-50) 等结合使用。
根据需要， 还可以将 NR10 拮抗剂封入微囊 ( 羟甲基纤维素、 明胶、 聚 [ 甲基丙烯 酸 ] 等的微囊 ) 中、 或者制成胶体给药系统 ( 脂质体、 白蛋白微球、 微乳、 纳米颗粒和纳米 囊等 )( 参照 Remington’ s Pharmaceutical Science 16th edition &， Oslo Ed.(1980) 等 )。 并 且， 将 药 物 制 成 缓 释 制 剂 的 方 法 也 是 公 知 的， 该 方 法 可 适 用 于 NR10 拮 抗 剂 (Langer 等 人， J.Biomed.Mater.Res.(1981)15 ： 167-277 ； Langer， Chem.Tech.(1982)12 ： 98-105 ； 美国专利第 3,773,919 号 ； 欧州专利申请公开 (EP) 第 58,481 号 ； Sidman 等人， Biopolymers(1983)22 ： 547-56 ； EP 第 133,988 号 )。
本发明的搔痒症的预防或治疗药可以口服给药， 也可以胃肠外给药， 优选胃肠外 给药。具体通过注射和经皮给药对患者进行给药。注射剂型的例子有 ： 例如通过静脉内注 射、 肌肉内注射或皮下注射等进行全身或局部给药。可以对想要抑制炎症的部位或其周边 进行局部注入、 特别是肌肉内注射。可以根据患者的年龄、 症状选择适当的给药方法。作为 给药量， 例如可以在每次每 kg 体重、 活性成分为 0.0001mg ～ 100mg 的范围内选择。或者， 例如对病人给药时， 每名患者在活性成分为 0.001 ～ 1000mg/kg 体重的范围内选择， 每次的 给药量例如优选 NR10 拮抗剂的含量为 0.01 ～ 50mg/kg 体重左右。但本发明的搔痒症的预 防或治疗药并不限于上述给药量。
本发明还提供含有 IL-31 拮抗剂作为有效成分的搔痒症治疗药。IL-31 拮抗剂只要是与 IL-31 结合、 抑制 IL-31 的生物学活性的物质即可， 没有特别限定。 IL-31 拮抗剂的优 选例子有 ： 抗 IL-31 抗体 ( 例如 WO2006/088955、 WO2006/88956、 WO2006/122079)。抗 IL-31 抗体的制作、 改变、 修饰、 制造、 纯化、 给药、 制剂化等均可按照上述抗 NR10 抗体的记载来进 行。
需要说明的是， 本说明书中引用的所有在先技术文献均作为参照而纳入本说明书 中。 实施例 以下， 利用实施例来具体地说明本发明， 但本发明并不限于这些实施例。
[ 实施例 1]
评价 IL-31 诱发的搔痒行为
对 9 周龄的雌性正常 BALB/c 小鼠 ( 日本 Charles River) 静脉内给予 10μg 小鼠 IL-31( 室内 )， 使用搔痒测定装置 (MicroAct、 NeuroScience) 测定、 分析自刚刚给药直后起 12 个小时的搔痒行为。其结果， 与溶剂 (Vehicle)( 含有 0.5％ BALB/c 小鼠血清的 PBS) 给 药组 (n ＝ 8) 相比， 在 IL-31 给药组 (n ＝ 8) 中确认到以给药后约 5 小时为峰值的搔痒次 数的明显增加。此外， 通过在 IL-31 给药前以 350mg/kg 静脉内给予抗小鼠 NR10 中和抗体 BM095(n ＝ 8)， 使该 IL-31 诱发的搔痒行为完全被抑制 ( 图 1)。该结果证实 ： 抗 NR10 中和 抗体对 IL-31 引起的搔痒症具有抑制效果。
抗 NR10 中和抗体对螨抗原诱发皮炎模型的效果
在 9 周龄的 SPF 雌性 NC/Nga Tnd Crlj 小鼠 ( 日本 Charles River) 的腹侧耳廓 皮内给予 5μg 作为螨抗原的屋尘螨 (Dp) 粗提取物 (Cosmo BioLSL)， 每周 3 次、 给药 3 周， 以诱发皮炎 (Int Arch Allergy Immunol 2004 ； 133 ： 55-63)。 Dp 的溶剂对照组则按照同样 的时间表给予 5μL 生理盐水 ( 大塚制药 )(n ＝ 7)。对于该病态模型， 于第 0、 3、 7、 10、 14、 17、 21 天以 20mg/kg 静脉内给予抗小鼠 R10 中和抗体 BM-095(n ＝ 8)。对于溶剂对照组， 按 照同样的时间表静脉内给予 200mmol/L NaCl/20mmol/L 乙酸钠缓冲液 (pH5.5)(n ＝ 8)。
搔痒症的评价如下进行： 在 第 21 天， 使 用 搔 痒 测 定 装 置 (MicroAct， NeuroScience)， 计测 12 小时测定期间内的搔痒次数 ( 抓痒 )。其结果， 相对于 Dp 的溶剂对 照组， 溶剂对照组的搔痒次数显著 (p ＜ 0.005) 增加。此时， 相对于溶剂对照组， BM095 给 药组的搔痒次数得到显著 (p ＜ 0.05) 抑制 ( 图 2)。
该结果显示 ： 抗 NR10 中和抗体对搔痒症具有抑制效果。
[ 实施例 2]H0L0 对食蟹猴中的 IL-31 诱发搔痒症的抑制效果
对 4-5 岁的食蟹猴静脉内给予食蟹猴 IL-31 以诱发搔痒症， 研究抗人 NR10 抗体 H0L0( 重链氨基酸序列 /SEQ ID NO ： 17、 轻链氨基酸序列 /SEQ ID NO ： 18) 对上述搔痒症的 影响。静脉内给予 PBS( 溶剂 ) 或 0.01、 0.03、 0.06、 0.3、 0.6mg/kg 的 H0L0， 于之后的第 24 小时以 1g/kg 静脉内给予食蟹猴 IL-31， 用摄像机对之后 2 小时的行为进行录像。 重放录制 的录像， 以连续 3 次以上的搔破行为作为搔痒行为， 计测搔痒次数。其结果， H0L0 用量依赖 性地抑制由食蟹猴 IL-31 诱发的搔痒次数 ( 图 5)。该结果表明 ： 抗 NR10 抗体 H0L0 对搔痒 症具有抑制效果。[ 参考例 1] 确立表达 NR10 和 OSMR 的 Ba/F3 细胞株
将 人 NR10cDNA(WO0075314SEQ ID No ： 1/SEQ ID NO ： 16) 插 入 到 表 达 载 体
pCOS1(Biochem Biophys Res Commun.228， 第 838-45 页， 1996) 中， 构建 pCosNR10.3。利用 PCR 法从人胎盘文库中分离制癌蛋白 M 受体 cDNA(OSMR， GenBank 检索号 NM003999)， 同样构 建表达载体 pCos1-hOSMR。利用电穿孔法， 将各 10μg 的载体同时导入来自小鼠 IL-3 依赖 性 pro-B 细胞的细胞株 Ba/F3 中 (BioRad Gene Pulser， 960μF， 0.33kV)。导入后， 添加人 IL-31 并培养， 得到显示 IL-31 依赖性增殖的细胞株。同样， 由表达小鼠 NR10 和小鼠 OSMR 基因的 Ba/F3 细胞制作小鼠 IL-31 依赖性细胞株。
上述细胞株均显示出数 ng/mL 的 ED50， 得到了良好增殖的细胞株。人 IL-31 依赖 性细胞株不与小鼠 IL-31 反应， 通过添加人 NR10 蛋白 ( 胞外区 ) 而被抑制。小鼠 IL-31 依 赖性细胞株不与人 IL-31 反应， 不受小鼠 NR10 添加蛋白 ( 胞外区 ) 的抑制。
[ 参考例 2]NR10 蛋白 ( 胞外区 ) 的制备
以人 NR10cDNA 为模板， 利用 PCR 法仅扩增胞外区， 并在 C 末端添加 FLAG tag 序列， 再将其插入到表达载体 pCXND3(WO2005/005636) 中 (pCXND3-NR10-flag)。利用电穿孔法， 将 10μg 直链状的该载体导入中国仓鼠卵巢细胞株 DG44 中 (BioRad GenePulserII， 25μF， 1.5kV)， 得到显示高度表达的细胞株。 大量培养该细胞株， 利用抗 FLAG 抗体柱 (SIGMA 制 )、 凝胶过滤法从培养上清中得到纯化标准品， 用于以下实验。同样制备在 C 末端添加有 FLAG tag 序列的小鼠 NR10( 胞外区 )。 [ 参考例 3] 具有抗小鼠 NR10 中和活性的 scFv 的分离和嵌合 IgG 化 BM095 的制备
使用生物素化的小鼠 NR10 蛋白 ( 胞外区 )， 通过淘选法从人抗体噬菌体文库中筛 选候选克隆。从这些克隆中纯化分泌 scFv， 将其添加到参考例 1 记载的 IL-31 依赖性 Ba/ F3 细胞增殖测定系统中。其结果， 成功地获得了显示强的增殖抑制活性的克隆 BM095。
利用 PCR 法， 将 BM095 的人 H 链可变区序列 (VH) 与小鼠 IgG2a 恒定区 (CH1 后 ) 连 接、 并将人 L 链可变区序列 (VL) 与小鼠 λ 链恒定区连接， 构建表达载体。此时， VH 的氨基 酸序列见 SEQ ID NO ： 1， 编码该氨基酸序列的核苷酸序列见 SEQ ID NO ： 2。VL 的氨基酸序 列见 SEQ ID NO ： 3， 编码该氨基酸序列的核苷酸序列见 SEQ ID NO ： 4。 将直链状的各表达载 体同时导入 DG44 株中， 选择显示高水平表达嵌合 IgG 的细胞株。大量培养该细胞株， 利用 蛋白 A(rProtein A Sepharose Fast Flow， GE Amersham Biosciences 制 ) 柱、 阳离子交换 (SP-TOYOPEARL 650M， TOSOH 制 ) 柱层析， 从培养上清中得到纯化标准品。 再利用 ActiClean Etox(Sterogen 制 ) 树脂将致热原降低至检测限以下。
[ 参考例 4]BM095 对葡聚糖硫酸钠 (DSS) 诱发大肠炎的药效
制作作为炎症性肠疾病 (IBD) 的病态模型报道的 DSS 诱发大肠炎模型 (J Immunol 2003 ； 171 ： 5507-5513)， 研究抗小鼠 NR10 中和抗体 BM-095 的效果。使用经 0.22μm 滤器 (Millipore 制 ) 过滤灭菌的蒸馏水， 制备 5％ (w/v) 的葡聚糖硫酸钠盐 ( 和光纯药制 ) 水 溶液， 让 6 周龄的雄性 Balb/cAnN Crj 小鼠 ( 日本 Charles River 制 ) 通过供水瓶自由饮 水 7 天， 测定体重， 以相对于 DSS 给药起始日的体重的变化率作为药效的评价项目。
本模型中， 有关是否通过中和 IL-31 信号而使病情得到改善， 于 DSS 给药前 1 天 将抗小鼠 NR10 中和抗体 BM095 以 10mg/kg 的用量进行静脉内给药， 评价体重的减少 (n ＝ 10)。设定在 DSS 给药前 1 天静脉内给予溶剂 ( 乙酸缓冲液 [20mmol/L 乙酸钠、 20mmol/L 氯 化钠 ] 与磷酸缓冲生理盐水 [PBS， GIBCO 制 ] 以容量比 1 ∶ 5 混合的混合液 ) 的组 ( 溶剂 组， n ＝ 10)， 作为溶剂对照组。为了把握正常小鼠的体重变化率的推移， 还观察与 DSS 给药
组相同周龄、 性别的 Balb/cAnN Crj 小鼠的体重变化率的推移 (n ＝ 1)。
体重变化见图 3。在溶剂组中， 通过给予 DSS， 体重变化率下降。而在 BM095 给药 组中， 也显示出与溶剂组同样的体重变化， 但在 DSS 给药后的 4 天和 5 天后， 与溶剂组相比， BM095 组的体重变化率显著下降。 根据上述结果， 没有确认到 BM095 给药所产生的本模型的 大肠炎治疗效果。
有报道称 ： 在本模型中 IL-31RA 表达亢进 (WO2004/003140)， 但由上述实验结果可 知： 同分子的中和抗体对本模型的大肠炎没有疗效。
[ 参考例 5]BM095 对急性苦基氯接触性皮炎模型的药效
制作作为急性接触性皮炎模型报道的 (Clin Immunol 2003 ； 108 ： 257-262)、 通过 敷用苦基氯而致敏 / 诱发的延迟型过敏症反应的结果导致的皮炎， 研究抗小鼠 NR10 中和抗 体 BM-095 的效果。在 8 周龄雌性 Balb/cAnN Crj 小鼠 ( 日本 Charles River 制 ) 的腹部 皮肤上敷用 50μL 的 7％苦基氯 (nacalai tesque， Inc.) 溶液 ( 乙醇∶丙酮＝ 3 ∶ 1， v/v) 进行致敏， 5 天后在右耳耳廓皮肤上敷用 20μL 的 1％苦基氯溶液 ( 丙酮∶橄榄油＝ 1 ∶ 4， v/v)， 引发接触性皮炎 ( 诱发 )。作为用于评价溶剂对耳廓厚度的影响的对照， 在同一只小 鼠左耳耳廓皮肤上敷用 20μL 溶剂 ( 丙酮∶橄榄油＝ 1 ∶ 4， v/v)( 阳性对照组， n ＝ 6)。 在临诱发前和诱发后 24、 48、 72 小时， 使用表盘式厚度规 (dial thickness gauge)( 尾崎制 作所制 ) 测定左右耳的厚度， 以相对于临诱发前的耳廓厚度的变化作为药效评价项目。
作为用于评价病态成立的对照组， 设定致敏时在腹部皮肤上敷用不含苦基氯的乙 醇∶丙酮混合液 (3 ∶ 1， v/v)、 5 天后在右耳耳廓皮肤上敷用 20μL 的 1％苦基氯溶液、 在左 耳耳廓皮肤上敷用 20μL 溶剂 ( 丙酮∶橄榄油＝ 1 ∶ 4， v/v) 的组 ( 阴性对照组， n ＝ 6)。
为了评价本模型病态中抗 NR10 抗体的给药效果， 设定以下各组 ： 按照上述阳性对 照组的方法引发急性接触性皮炎， 在致敏前 1 天和诱发前 1 天以 10mg/kg 静脉内给予 BM095 的组 (BM095 组， n ＝ 6) ； 以及按照相同时间表给予溶剂 ( 乙酸缓冲液 [20mmol/L 乙酸钠、 20mmol/L 氯化钠 ] 与磷酸缓冲生理盐水 [PBS， GIBCO 制 ] 以容量比 1 ∶ 5 混合的混合液 ) 的组 ( 溶剂组、 n ＝ 5)。
直至诱发后 72 小时的耳廓的厚度变化见图 4。相对于阴性对照组， 阳性对照组在 诱发后 24、 48、 72 小时耳廓均明显肥厚， 这表明病态成立。此时， BM-095 组显示出与溶剂组 同样的耳廓厚度的变化， 没有确认到明显的抑制。
根据上述结果判明 ： 没有确认到给予 BM095 对本模型中观察到的急性接触性皮炎 的疗效。
产业实用性
本发明提供的抗 NR10 中和抗体等 NR10 拮抗剂， 可以作为搔痒症的治疗药或预防 药。17101939025 A CN 101939028
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