利用 UGT72B14 制备红景天甙的方法 【技术领域】
本发明涉及一种利用 UGT72B14 制备红景天甙的方法。背景技术 高 山 红 景 天 (Rhodiola sachalinensis A.Bor) 又 名 库 页 红 景 天， 是景天科 (Crassulaceae) 红景天属 (Rhodiola rosea L.) 植物， 为多年生草本或亚灌木， 常具肉 质匍匐根状茎， 是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景天甙 (salidroside) 和甙元酪醇 (tyrosol) 等， 现代药理学研究结果表明红景天甙具有明显的 抗缺氧、 抗寒冷、 抗疲劳、 抗辐射、 抗病毒、 延缓机体衰老等功效， 对于航天、 深海、 沙漠、 高 原、 体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物， 同时对高辐射从业人员、 微机使 用频繁人员、 强脑力劳动者、 中老年人群具有积极的滋补保健作用。
发明内容 本发明的目的是提供一种利用 UGT72B14 制备红景天甙的方法。
本发明提供的一种制备红景天甙的方法， 包括如下步骤 ： 将 UGT72B14 蛋白的编码 基因导入目的植物的外植体， 得到转基因愈伤组织 ； 2) 从所述转基因愈伤组织中提取红景 天甙， 得到红景天甙 ； 所述 UGT72B14 蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。
上述序列 2 由 473 个氨基酸组成。
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因通过重组根癌农杆菌介导导入目的植物的外植 体；
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。
所述重组根癌农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根 癌农杆菌 ；
所 述 重 组 植 物 表 达 载 体 为 将 所 述 UGT72B14 蛋 白 的 编 码 基 因 插 入 载 体 pCAMBIA1301 的 BgLII 和 Bst EII 识别位点间得到的。
将所述 UGT72B14 蛋白的编码基因导入目的植物的外植体， 得到转基因愈伤组织 的方法包括如下步骤 ： 用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体， 再依次进行共培养、 抑菌培养、 诱导培养、 抗性筛选培养和继代抗性筛选培养 ； 所述重组根癌农杆菌为将所述重 组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根癌农杆菌。
所述用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体的步骤中， 所述侵染的时间为 9 分钟。
所述外植体为叶盘。
从叶片上通过打孔器打下来的小圆片即为叶盘， 可用于转基因转染。
所述共培养所用的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌呤、 1- 萘乙酸和 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯， 得到所述共培养所用的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在 所述共培养所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述共培养所用的培养基
中的浓度为 0.15mg/L， 所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培养所用的培养基中的浓度 为 0.5mg/L ；
所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌 呤、 1- 萘乙酸和头孢霉素， 得到所述抑菌培养所用的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在所述抑 菌培养所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述抑菌培养所用的培养基中 的浓度为 0.15mg/L， 所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为 500mg/L ；
所述诱导培养所用的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌 呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到所述诱导培养所用的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在 所述诱导培养所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述诱导培养所用的培 养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为 5mg/L， 所述头孢霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为 500mg/L ；
所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌 呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到所述抗性筛选培养的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在 所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述抗性筛选培养的培 养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为 20mg/L， 所述头孢霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为 500mg/L ；
每 1000ml 所述共培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.5ml 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述共培养用的培养基 ；
每 1000ml 所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容 至 1000ml， 得到所述抑菌培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述诱导培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.05ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素 母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述诱导培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.2ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母 液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述抗性筛选培养的培养基 ；
所述共培养的时间为 3 天， 所述共培养的温度为 25℃， 所述共培养为连续光照 ；
所述抑菌培养的时间为 5 天， 所述抑菌培养的温度为 25℃， 所述抑菌培养为连续 光照 ；
所述诱导培养的时间为 2 周， 所述诱导培养的温度为 25℃， 所述诱导培养为连续 光照 ；
所述抗性筛选培养的时间为 10 周， 所述抗性筛选培养的温度为 25℃， 所述抗性筛 选培养为连续光照 ；
所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下Ⅰ和Ⅱ所示步骤进行培养 ：
Ⅰ： 在连续光照、 25℃， 在如下培养基中继代 3 次培养， I 所用的培养基按照如下方 法配制 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到Ⅰ所用的 培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 15mg/L， 所述 头孢霉素在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 500mg/L ；
Ⅱ： 在连续光照、 25℃， 在如下培养基中继代 2 次培养， Ⅱ所用的培养基按照如下 方法配制 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到Ⅱ所用 的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在Ⅱ所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在Ⅱ 所用的培养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在Ⅱ所用的培养基中的浓度为 10mg/L， 所 述头孢霉素在Ⅱ所用的培养基中的浓度为 500mg/L。
Ⅰ： 每 1000ml 所 用 的 培 养 基 按 照 如 下 方 法 配 制 ： 700mlMS 液 体 培 养 基 中 加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.15ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液 后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到Ⅰ所用的培养基 ； 所述步骤Ⅰ中， 所述继代 3 次按照每 10-13 天的间隔进行继代 ；
Ⅱ： 每 1000ml 所 用 的 培 养 基 按 照 如 下 方 法 配 制 ： 700mlMS 液 体 培 养 基 中 加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.1ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液 后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到Ⅱ所用的培养基 ； 所述步骤Ⅱ中， 所述继代 2 次按照每 15 天 的间隔进行继代。 所述 6- 苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg6- 苄氨基嘌呤用 10ml 1M 的 NaOH 水溶液溶解后加水定容到 50ml， 得到所述 6- 苄氨基嘌呤母液 ；
所述 1- 萘乙酸母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg1- 萘乙酸用 10ml1M 的 NaOH 水 溶液溶解后加水定容 50ml， 得到所述 1- 萘乙酸母液 ；
所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置 ： 称取 20mg2， 4- 二氯苯氧乙 酸丁酯用 15ml 无水乙醇溶解后加水定容 20ml， 得到所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液 ； 所 述头孢霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 头孢霉素溶于水中后， 加水定容到 10ml， 得到所述头孢霉素母液 ；
所述潮霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 潮霉素溶于水中后， 加水定容到 10ml， 得到所述潮霉素母液 ；
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因为序列表中的序列 1 的自 5’ 末端第 53 位到第 1474 位核苷酸所示的 DNA 分子。上述序列 1 由 1671 个核苷酸组成， 其 OFR 为序列 1 的自 5’ 末 端第 53 位到第 1474 位核苷酸所示的 DNA 分子。
所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物， 所述双子叶植物优选为景天科植 物， 所述景天科植物优选为红景天属植物， 所述红景天属植物尤其优选为高山红景天。
本发明的实验证明， 将 UGT72B14 基因置于植物高效表达载体 pCAMBIA1301 的 35S 启动子 +Ω 增强子下游， 通过发根农杆菌介导法转化高山红景天， 通过强效启动子的增进 表达及基因转化培养基优化， UGT72B14 的高效表达导致转基因高山红景天愈伤组织中红景 天甙含量较对照提高 3.3 倍。本发明为利用高山红景天转基因愈伤组织过表达红景天甙生 物合成途径关键酶 -UGT72B14 提供了具有创新性和实用性的相关技术方法及应用。
附图说明
图 1 为红景天根中糖基转移酶活性随时间变化趋势 图 2 为红景天根总 RNA 的电泳结果图 3 为红景天根 3’ RACE 结果 图 4 为所获得基因 5’ RACE 结果 图 5 为 UGT72B14 全长 cDNA 的 PCR 扩增 图 6 为 UGT72B14 蛋白的结构功能域分析 图 7 为 pBSUGT72B14 表达载体的 BgLII 和 Bst EII 双酶切鉴定 图 8 为 pBSUGT72B14 表达载体的 PCR 鉴定 图 9 为潮霉素对叶片生长状态的影响 图 10 为 UGT72B14 的高山红景天遗传转化过程 ( 农杆菌介导法 ) 之一 图 11 为部分转基因高山红景天愈伤组织的 PCR 检测结果 图 12 为部分转基因高山红景天愈伤组织的 PCR-Southern 检测结果 图 13 为部分转基因高山红景天的 Northern 检测结果 图 14 为转基因高山红景天 HPLC 分析结果具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 UGT72B14 基因分离
应 用 RACE(rapid-amplification of cDNA ends) 结 合 CODEHOP(consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers) 简并引物设计以及 茉莉酮酸甲酯 (MeJA) 诱导的方法成功地从高山红景天根组织分离得到 1 个新的 UDP- 葡萄 糖基转移酶基因 cDNA 全序列， 国际糖基转移酶专业委员会命名为 UGT72B14。
具体过程如下 ：
1、 红景天根中糖基转移酶活性随时间变化趋势
为了优化分离酪醇葡萄糖基转移酶基因的 RNA 提取时期， 本研究对 MeJA 诱导高山 红景天根产生的糖基转移酶活性随时间变化趋势进行分析。研究以酪醇为底物， 测定了不 同时间高山红景天愈伤与根粗酶液中糖基转移酶的比活力 (U/mg FW)， 结果见图 1。由图可 见， 根中催化酪醇的酶比活力在第 12 天时测量值在 6 次中最高， 由于蛋白合成要滞后于转 录过程， 因此选取 10 天的根组织作为 RNA 提取材料。
2、 总 RNA 的提取
使用改进的 CTAB 方法提取红景天根 RNA， 改良的 RNA 提取缓冲液中加入强还原剂 β- 巯基乙醇和螯合剂 PVP40， 有效的降低了多酚类物质的影响 ； 而 LiCl 的选择性沉淀则排 除了红景天中大量糖类物质对提取的干扰。纯度检测结果为根总 RNA 平均的 OD260/OD280 值 约为 1.85， 说明提取的总 RNA 比较纯净， 这种方法是一种有效的红景天根总 RNA 提取方法 ( 图 2)。
3、 UGT72B14 基因 3’ 端序列的分离
以高山红景天根组织总 RNA 为模板， 以 QT(5’ -CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCT CAAGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3′ ) 为反转录引物， 按照 Promega 反转录试剂盒说明书进行 cDNA 第一链的合成。 之后以反转录的 cDNA 第一链为模板， 根据 CODEHOP 设计的简并引物 (Block H： 5’ -CAGCTGTTGGAGTTTTTGTTACTCAytgyggntgga-3’ .N 是任何碱基 ； Y 是 C 或 T)， 与设计的
锚定引物为组合进行套式 PCR 扩增， PCR 电泳结果显示获得 1 条大小约 500bp 左右的特异 条带 ( 图 3 ： M： DL2000marker ； 1-3 ： 分别为 16d， 12d， 0d RNA 的 PCR 扩增结果 )， 所获得基因 的碱基长度与预计的可能长度相符。
将所获得的 cDNA 片段经 DNA 测序后并进行生物信息学分析后后发现， 其氨基酸 序列与已注册的植物 UDP- 葡萄糖基转移酶羧基末端序列具有较高的同源性 ( 最高达到 65％ )， 说明该序列是高山红景天 1 个 UDP- 葡萄糖基转移酶基因的 3’ 端， 长度为 530bp， 而 且是一个新基因。
4、 UGTC2 和 UGTR 基因 5’ 端序列的克隆
所获得基因的 5’ -RACE 的试验结果如图 4(M ： DL 2000marker ； 1： PCR 扩增结果 ) 所示。将图 4 中所示特异性的、 与预计大小 ( 保守区到 5’ 端碱基长度 ) 相符的条带回收、 连接 T 载体、 转化、 鉴定、 测序、 分析、 测序后， 结果发现所得序列与其它植物 UDP- 葡萄糖基 转移酶基因同源性不是很高， 最高分别达到 62％， 基因长度为 1241bp。
5、 全长 cDNA 的克隆
利用 DNAman 软件对分离的基因的 cDNA3’ 端序列和 5’ 端序列测序结果进行电子 合并， 得到全长为 1671 的序列， 命名为 UGT72B14。UGT72B14 的核苷酸序列为序列表中的序 列 1， OFR 序列为序列表中序列 1 的自 5’ 末端第 53 位到第 1474 位核苷酸。UGT72B14 编码 的蛋白命名为 UGT72B14， 其氨基酸序列为序列表中的序列 2。 表 1 中相应的引物， 以根反转录的 cDNA 第一链为模板， 扩增出长度为 1433bp( 保 括酶切位点和保护碱基的序列 ) 的 UGT72B14 基因的完整开放读码框内序列， 结果见图 5(M ： DL2000 marker ； 1： UGTR 基因全长 PCR 扩增结果 )， 电泳显示序列长度与预期大小相符。同 样， 该条带经回收、 T 载体连接、 转化、 鉴定后测序。测序结果同电子合并的结果相符。
表 1UGT72B14 cDNA 全长引物 ( 酶切位点用于植物表达载体的构建 )
6、 UGT72B14 基因的生物信息学分析
将获得的 UGT72B14 基因的全长 cDNA 序列通过 NCBI 网站 (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BankIt/index.html) 上的 Bankit 工具递交 GenBank， 接受号为 EU567325。
利用 DNAman 软件对获得的 UGT72B14 基因全长 cDNA 序列进行分析， 所获得的所获 得的 UGT72B14 cDNA 全长 1671bp( 序列 1)， 其中包括 1422bp( 序列 1 自 5’ 末端第 53 位到 第 1474 位核苷酸 ) 完整的开放阅读框 (open reading frame， ORF)， 推测编码 473 个氨基 酸的多肽， 同时含有 53bp 的 5’ 非转译区 (5’ UTR) 和 97bp 3’ 非转译区 (3’ UTR) 以及多聚 腺苷酸尾。5’ UTR 区起始密码子前出现终止密码子， 并且通过 BLASTp 和已知其他植物糖基 转移酶的序列比对， 结果证明获得的 UGT72B14 基因的 cDNA 是完整的。
7、 UGT72B14 基因的结构和功能域分析
用 BLAST 服务器 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 中的 protein blast 对 UGT72B14 基因推测编码的氨基酸序列进行结构域分析， 结果见图 6， 分析表明 UGT72B14 在 261-440 之间含有一个典型的 UDP- 葡萄糖基转移酶特征性结构域， 而在 255-442 之间有 一个典型的 COG1819 也即糖基转移酶结构域， 见图 6。
UGT72B14 基因可通过上述方法获得， 也可人工合成。
实施例 2. 转 UGT72B14 高山红景天
人工合成序列表中序列 1 所示 CDNA。
1、 pCAUGT72B14 载体的构建
用含有 BgLII 和 Bst EII 酶切位点 pUGTRup 和 pUGTRdown( 表 1) 为引物， 以人工合 成的 CDNA 为模板， 扩增出 PCR 产物。 将该 PCR 产物经过 BgLII 和 Bst EII 酶切后得到的片段 插入到 pCAMBIA1301 载体 (Ge Y， Cheng X， Hopkins A， Wang ZY.Generation of transgenic Lolium temulentum plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Rep.200726(6) ： 783-789 ； ； 公众可从北京农学院获得。) 的 BgLII 和 Bst EII 识别位点间得到重组载体， 将重组载体转化大肠杆菌 DH5α， 经过抗生素筛选后得到重组 菌， 提取质粒进行酶切鉴定和 PCR 鉴定， 鉴定结果表明， 酶切后产生 1.5kb 左右的条带和载 体条带 ( 如图 7 所示， M， DL15000+2000 Marker ； 1-8， 阳性质粒。)， 且 PCR 的电泳结果也出 现 1.5kb 左右的条带 ( 图 8， M， DL2000 Marker ； 1-8， 阳性质粒 ) 的质粒命名为 pCAUGT72B14。 将 pCAUGT72B14 送上海生工生物技术服务有限公司进一步测序验证， 结果为 pCAUGT72B14 为在 pCAMBIA1301 载体的 BgLII 和 Bst EII 识别位点间插入序列表中序列 1 自 5’ 末端第 53 位到第 1474 位核苷酸 (UGT72B14 的 ORF 序列 )。
通 过 冻 融 法 将 重 组 质 粒 pCAUGT72B14 转 化 到 农 杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105(Ma， L.Q.， Liu， B.Y.， Gao， D.Y.， Pang， X.B.， Lu， S.Y.， Yu， H.S.， Wang， H.， Yan， F.， Li， Z.Q.， Li， Y.F.， Ye， H.C.， 2007.Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis.Plant Cell Rep.26， 989-999 ；； 公众可从北京农学院获得。) 感受态细胞 中， 获得重组菌， 提取质粒酶切鉴定， 产生 1.5kb 左右的条带和 9.5kb 左右条带的质粒对应 的重组菌为阳性 EHA105/pCAUGT72B14。
2、 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织的获得
选择性标记抗性筛选是获得转基因植物材料的关键。如果筛选压力过高， 会造成 转基因材料生长状态低下甚至死亡 ； 反之则会出现大量的假阳性材料， 为后续筛选工作增 加难度。本实验采用的植物表达载体中含有潮霉素磷酸转移酶基因 Hpt 可分解培养基中的 潮霉素 (Hyg)。
不同浓度的潮霉素 (Hyg) 处理对高山红景天叶片外植体的影响见图 9。当潮霉 素浓度为 0 时， 外植体生长旺盛 ； 潮霉素浓度为 5mg/L 时， 外植体生长减慢， 致死率达到 50.17％ ； 潮霉素浓度为 10mg/L 时， 致死率高达 93.0％ ； 潮霉素浓度为 15mg/L 时， 叶片全部 死亡。从高山红景天叶片对潮霉素敏感性实验的结果看， 当 Hyg 浓度达到 10mg/L 时， 可完 全抑制从叶片诱导愈伤组织的形成。但如果外植体一开始就经历高压选择， 可能导致已转 化细胞的死亡。所以， 本实验确定转基因初期抗生素筛选浓度 Hyg 为 5mg/L。为能获得阳性转基因抗性愈伤组织， 在转基因初期潮霉素浓度为 5mg/L 获得大量生长状态良好愈伤组织 基础上， 为提高筛选效率， 将潮霉素浓度增加到 20mg/L， 进行抗性愈伤组织筛选， 获得理想 的实验结果。
将上述获得的阳性 EHA105/pCAUGT72B14 接种在固体培养基 (YEB) 上划线培养， 于 27℃下活化 3 次， 挑取平板上单菌落， 接种在 50ml YEB 液体培养基， 于 27℃、 120rpm\min， 黑 暗下震荡培养， 继代 3 次， 培养阳性 EHA105/pCAUGT72B14 的 OD600 至 0.5， 用于侵染高山红景 天 (Rhodiola sachalinensis A.Bor ； Ma， L.Q.， Liu， B.Y.， Gao， D.Y.， Pang， X.B.， Lu， S.Y.， Yu， H.S.， Wang， H.， Yan， F.， Li， Z.Q.， Li， Y.F.， Ye， H.C.， 2007.Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis.Plant Cell Rep.26， 989-999 ； 公众可从北京农学院获得。) 叶盘， 侵染时间为 9 分钟。
先将高山红景天的无菌苗叶片切成 0.5×0.5cm 的小块， 叶面向下接在预培养培 养基上， 25℃暗培养 2d( 表 2)， 再用上述获得的 D600 为 0.5 的阳性 EHA105/pCAUGT72B14 侵染 预培养培养基上高山红景天的无菌苗叶片， 将阳性 EHA105/pCAUGT72B14 侵染过的高山红 景天叶盘置于共培养基上 ( 图 10A 侵染过农杆菌的高山红景天叶盘置于共培养基上 )， 25℃ 光照条件下共培养 3 天后， 转移到只含有抑制农杆菌生长抗生素 ( 头孢霉素， Cef 500mg/ L) 的抑菌培养基上进行 5 天的抑菌培养 ； 将经过抑菌培养的外植体接到含有潮霉素 5mg/ L、 Cef 500mg/L 诱导培养培养基上， 25℃连续光照条件下， 2 周继代一次， 进行诱导培养 ( 图 10B 转化叶盘在选择培养基上产生愈伤 ； )。待诱导培养获得的愈伤形成后， 将一部分愈伤 组织接到抗性筛选培养培养基上， 在高浓度潮霉素 Hyg(20mg/L) 条件下筛选转基因抗性愈 伤组织 ( 图 10C 愈伤置于高选择压培养基上 ) ； 取在抗性筛选培养培养基上成活的愈伤组 织采取逐渐降低潮霉素浓度的方式依次进行Ⅰ和Ⅱ所示的继代抗性筛选培养， 具体为在潮 霉素 15mg/L 培养基上继代 3 次后转入潮霉素 10mg/L 的培养基上继代保存培养， 形成生长 状态良好的抗性愈伤组织 ( 图 10D 筛选出的抗性愈伤 )， 作为转 UGT72B14 高山红景天愈伤 组织进行分子检测和指标测定。
每 1000ml 所述共培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.5ml 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述共培养用的培养基 ；
每 1000ml 所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容 至 1000ml， 得到所述抑菌培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述诱导培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.05ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素 母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述诱导培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.2ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母 液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述抗性筛选培养的培养基 ；
所述共培养的时间为 3 天， 所述共培养的温度为 25℃， 所述共培养为连续光照 ； 所 述抑菌培养的时间为 5 天， 所述抑菌培养的温度为 25℃， 所述抑菌培养为连续光照 ；所述诱导培养的时间为 2 周， 所述诱导培养的温度为 25℃， 所述诱导培养为连续光照 ； 所述抗性筛选培养的时间为 10 周， 所述抗性筛选培养的温度为 25℃， 所述抗性筛 选培养为连续光照 ；
所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下Ⅰ和Ⅱ所示步骤进行培养 ：
Ⅰ： 所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加入 1.5ml6- 苄氨基 嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.15ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容 至 1000ml， 得到Ⅰ所用的培养基 ； 培养时间为 40d， 继代 3 次， 25℃， 连续光照 ；
Ⅱ： 所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加入 1.5ml6- 苄氨基 嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.1ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到Ⅱ所用的培养基 ； 培养时间为 30d， 每 15d 继代 1 次， 25℃， 连续光照 ；
所述 6- 苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg6- 苄氨基嘌呤用 10ml 1M 的 NaOH 水溶液溶解后加水定容到 50ml， 得到所述 6- 苄氨基嘌呤母液 ；
所述 1- 萘乙酸母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg1- 萘乙酸用 10ml1M 的 NaOH 水 溶液溶解后加水定容 50ml， 得到所述 1- 萘乙酸母液 ；
所述 2， 4- 氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置 ： 称取 20mg2， 4- 二氯苯氧乙酸 丁酯用 15ml 无水乙醇溶解后加水定容 20ml， 得到所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液 ；
所述头孢霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 头孢霉素溶解在水中后， 加水 定容到 10ml， 得到所述头孢霉素母液 ；
所述潮霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 潮霉素溶解在水中后， 加水定容 到 10ml， 得到所述潮霉素母液 ；
所述 MS 培养基的组成及配制方法如下 ：
表 1 为 MS 培养基母液
表 2 为 MS 培养基配制方法 (1000ml) 母液 用量 大量 20ml 微量 10ml 钙盐 10ml 铁盐 有机Ⅰ 10ml 10ml 有机Ⅱ 10ml
配制方法 ： 大量筒中先放置 200ml 左右的蒸馏水， 将上述母液称量后加入大量筒 中， 再加入 400--500ml 蒸馏水， 加入 30 克蔗糖溶解后定容到 1000ml， 倒入三角瓶中。用 PH计测 PH 值到 5.80--5.85。加入 7--7.5g 琼脂后融化倒瓶灭菌。
3、 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织鉴定
1)PCR 鉴定
以上述获得的转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织为材料， 提取基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 检测。 为了避免内源基因的干扰， PCR 引物之一为目标基因的 3’ 引物 (pUGTRdown)， 另一个引物为对应于 CaMV 35S 启动子上游的一段核苷酸序列 (35S-UP， 5’ -TGATATCTCCAC TGACGTAAGGGATG-3’ )， 该引物在野生型高山红景天基因组上没有互补序列。图 11 为转化 UGT72B14 的部分转基因愈伤组织的 PCR 检测结果 ； PCK 为质粒 pCAUGT72B14 ； RCK 为野生型 ； 1-20 为部分转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织， 阳性对照用质粒 pCAUGT72B14 为模板。 结果 显示用引物 pUGTRdown 与 35S-UP 从转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中扩增得到的 DNA 片 断与阳性对照 (PCK) 相同， 为 1.6Kb 左右， 阴性对照 ( 野生型高山红景天， RCK) 没有该扩增 产物。在检测的 20 团转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中 PCR 检测结果全部为阳性。说明 高浓度潮霉素筛选的效率极高。
2)PCR-Southern 鉴定
以 Digoxigenin 标记的 UGT72B14 cDNA 为探针 (UGT72B14 的 ORF 序列， 序列表中 序列 1 的自 5’ 末端第 53-1474 位核苷酸。) 对部分 PCR 阳性转 UGT72B14 高山红景天愈伤 组织扩增产物进行 PCR-Southern 检测， 结果如图 12， PCK- 质粒 pCAUGT72B14 ； RCK- 野生型 ； 7， 20- 部分转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织。
扩增产物均与探针产生杂交信号。说明 UGT72B14 基因整合到基因组 DNA 上。
基于转基因材料在一段时间内与农杆菌共同生长， 取一部分愈伤组织在诱导、 筛 选、 继代 5 个月实验过程中一直添加头孢霉素 (Cef 500mg/L)， 另一部分在检测前 4 周停止 脱菌， 停止脱菌的材料培养过程中没有农杆菌的再生， 添加 Cef 和停止脱菌的转基因愈伤 组织均得到了阳性检测结果。
3)Northern 鉴定
分别提取转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织、 及相应野生型对照 ( 高山红景天 ) 总 RNA， 经甲醛变性胶电泳后转移至尼龙膜上， 以 Digoxigenin 标记的 UGT72B14 为探针进 行 Northern 检测。由于 UGT72B14 基因是从高山红景天中分离又转回其中， 实验中应区分 UGT72B14 内源基因转录对实验结果的干扰， 因此以野生型愈伤组织为对照从转录表达量上 进行区别。Northern 检测结果表明 ( 图 13 中， 1， 野生型愈伤组织 ； 5、 7、 9 为转 UGT72B14 高 山红景天愈伤组织。)， 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织转录水平明显高于野生型对照， 综 合前述分子检测以及 Northern 实验结果， 说明 UGT72B14 基因不仅成功整合到高山红景天 基因组 DNA 中， 而且得到转录水平表达且转录水平较高。
采用同样的方法将空载体 pCAMBIA1301 载体也转入高山红景天愈伤组织中， 获得 转 pCAMBIA1301 高山红景天愈伤组织。
实施例 3、 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织的红景天甙的 HPLC 检测
Northern 杂交结果证实， UGT72B14 转化高山红景天后得到且转录水平较高， 为进 一步对 UGT72B14 功能进行分析， 对转基因高山红景天愈伤组织及其野生型对照 ( 高山红景 天的愈伤组织 ) 中的红景天甙含量进行了高效液相色谱测定， 具体方法如下 ：
从由实施例 2 的 2 步骤获得的所述转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中提取红景天甙， 具体提取方法如下 ： 将高山红景天转基因愈伤组织于烘箱中 60℃烘至恒重， 粉碎 后过 80 目网筛， 精确称取 0.8g 样品加入甲醇 8ml， 超生提取 30min( 超声功率 100w、 时间 30min)， 之后于 60℃孵育 30min， 于室温 11000g 离心 15min， 收集上清 ； 沉淀用 50％的甲醇 水溶液再提取一次， 将上清合并后， 过 0.45μm 滤膜。
取过滤后的溶液进行 HPLC 检测， 检测条件为 ： 色谱柱 ： Hypersyl ODS 柱， 5mm， 4.6×150mm ； 流动相 ： 水 - 甲醇 - 乙腈 (70 ∶ 25 ∶ 5， v/v/v) ； 流速 ： 0.8ml/min ； 检测波长 275nm， 带宽 10nm， 参比波长 400nm， 带宽 80nm ； 外标法定量。
红景天甙标准品 ( 上海同田生物技术有限公司， Catalog E-0069)， 保留时间为 4.13 分钟。HPLC 检测的野生型对照愈伤组织中的红景天甙的保留时间为 4.13 分钟， 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中的红景天甙的保留时间为 4.13 分钟。
对由实施例 2 获得的转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织进行了 HPLC 测定， 以野生 型对照 ( 高山红景天的愈伤组织 ) 及由实施例 2 获得的转 pCAMBIA1301 高山红景天愈伤组 织为对照。实验重复三次， 结果取平均值。
愈伤组织中的红景天甙含量测定结果的数据分析如图 14(C ： 愈伤组织， TC ： 转基 因愈伤组织 ) 所示， 结果表明 ： 野生型对照愈伤组织 (C) 中的红景天甙含量为 1.75mg/g 干 重， 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织 (TC) 中的红景天甙含量为 7.53mg/g 干重， 较其野生 型对照提高 3.3 倍。
野生型对照与转 pCAMBIA1301 空载体高山红景天愈伤组织的结果无显著差异。
本发明涉及一种利用 UGT72B14 制备红景天甙的方法。背景技术 高 山 红 景 天 (Rhodiola sachalinensis A.Bor) 又 名 库 页 红 景 天， 是景天科 (Crassulaceae) 红景天属 (Rhodiola rosea L.) 植物， 为多年生草本或亚灌木， 常具肉 质匍匐根状茎， 是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景天甙 (salidroside) 和甙元酪醇 (tyrosol) 等， 现代药理学研究结果表明红景天甙具有明显的 抗缺氧、 抗寒冷、 抗疲劳、 抗辐射、 抗病毒、 延缓机体衰老等功效， 对于航天、 深海、 沙漠、 高 原、 体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物， 同时对高辐射从业人员、 微机使 用频繁人员、 强脑力劳动者、 中老年人群具有积极的滋补保健作用。
发明内容 本发明的目的是提供一种利用 UGT72B14 制备红景天甙的方法。
本发明提供的一种制备红景天甙的方法， 包括如下步骤 ： 将 UGT72B14 蛋白的编码 基因导入目的植物的外植体， 得到转基因愈伤组织 ； 2) 从所述转基因愈伤组织中提取红景 天甙， 得到红景天甙 ； 所述 UGT72B14 蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。
上述序列 2 由 473 个氨基酸组成。
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因通过重组根癌农杆菌介导导入目的植物的外植 体；
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。
所述重组根癌农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根 癌农杆菌 ；
所 述 重 组 植 物 表 达 载 体 为 将 所 述 UGT72B14 蛋 白 的 编 码 基 因 插 入 载 体 pCAMBIA1301 的 BgLII 和 Bst EII 识别位点间得到的。
将所述 UGT72B14 蛋白的编码基因导入目的植物的外植体， 得到转基因愈伤组织 的方法包括如下步骤 ： 用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体， 再依次进行共培养、 抑菌培养、 诱导培养、 抗性筛选培养和继代抗性筛选培养 ； 所述重组根癌农杆菌为将所述重 组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根癌农杆菌。
所述用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体的步骤中， 所述侵染的时间为 9 分钟。
所述外植体为叶盘。
从叶片上通过打孔器打下来的小圆片即为叶盘， 可用于转基因转染。
所述共培养所用的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌呤、 1- 萘乙酸和 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯， 得到所述共培养所用的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在 所述共培养所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述共培养所用的培养基
本发明提供的一种制备红景天甙的方法， 包括如下步骤 ： 将 UGT72B14 蛋白的编码 基因导入目的植物的外植体， 得到转基因愈伤组织 ； 2) 从所述转基因愈伤组织中提取红景 天甙， 得到红景天甙 ； 所述 UGT72B14 蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2。
上述序列 2 由 473 个氨基酸组成。
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因通过重组根癌农杆菌介导导入目的植物的外植 体；
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因通过重组植物表达载体导入目的植物的外植体。
所述重组根癌农杆菌为将所述重组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根 癌农杆菌 ；
所 述 重 组 植 物 表 达 载 体 为 将 所 述 UGT72B14 蛋 白 的 编 码 基 因 插 入 载 体 pCAMBIA1301 的 BgLII 和 Bst EII 识别位点间得到的。
将所述 UGT72B14 蛋白的编码基因导入目的植物的外植体， 得到转基因愈伤组织 的方法包括如下步骤 ： 用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体， 再依次进行共培养、 抑菌培养、 诱导培养、 抗性筛选培养和继代抗性筛选培养 ； 所述重组根癌农杆菌为将所述重 组植物表达载体导入宿主农杆菌得到的重组根癌农杆菌。
所述用重组根癌农杆菌侵染所述目的植物的外植体的步骤中， 所述侵染的时间为 9 分钟。
所述外植体为叶盘。
从叶片上通过打孔器打下来的小圆片即为叶盘， 可用于转基因转染。
所述共培养所用的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌呤、 1- 萘乙酸和 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯， 得到所述共培养所用的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在 所述共培养所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述共培养所用的培养基
中的浓度为 0.15mg/L， 所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯在所述共培养所用的培养基中的浓度 为 0.5mg/L ；
所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌 呤、 1- 萘乙酸和头孢霉素， 得到所述抑菌培养所用的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在所述抑 菌培养所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述抑菌培养所用的培养基中 的浓度为 0.15mg/L， 所述头孢霉素在所述抑菌培养所用的培养基中的浓度为 500mg/L ；
所述诱导培养所用的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌 呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到所述诱导培养所用的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在 所述诱导培养所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述诱导培养所用的培 养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为 5mg/L， 所述头孢霉素在所述诱导培养所用的培养基中的浓度为 500mg/L ；
所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法制备 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌 呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到所述抗性筛选培养的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在 所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在所述抗性筛选培养的培 养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为 20mg/L， 所述头孢霉素在所述抗性筛选培养的培养基中的浓度为 500mg/L ；
每 1000ml 所述共培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.5ml 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述共培养用的培养基 ；
每 1000ml 所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容 至 1000ml， 得到所述抑菌培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述诱导培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.05ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素 母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述诱导培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.2ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母 液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述抗性筛选培养的培养基 ；
所述共培养的时间为 3 天， 所述共培养的温度为 25℃， 所述共培养为连续光照 ；
所述抑菌培养的时间为 5 天， 所述抑菌培养的温度为 25℃， 所述抑菌培养为连续 光照 ；
所述诱导培养的时间为 2 周， 所述诱导培养的温度为 25℃， 所述诱导培养为连续 光照 ；
所述抗性筛选培养的时间为 10 周， 所述抗性筛选培养的温度为 25℃， 所述抗性筛 选培养为连续光照 ；
所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下Ⅰ和Ⅱ所示步骤进行培养 ：
Ⅰ： 在连续光照、 25℃， 在如下培养基中继代 3 次培养， I 所用的培养基按照如下方 法配制 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到Ⅰ所用的 培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 15mg/L， 所述 头孢霉素在Ⅰ所用的培养基中的浓度为 500mg/L ；
Ⅱ： 在连续光照、 25℃， 在如下培养基中继代 2 次培养， Ⅱ所用的培养基按照如下 方法配制 ： 向 MS 培养基中添加 6- 苄氨基嘌呤、 1- 萘乙酸、 潮霉素和头孢霉素， 得到Ⅱ所用 的培养基， 所述 6- 苄氨基嘌呤在Ⅱ所用的培养基中的浓度为 1.5mg/L， 所述 1- 萘乙酸在Ⅱ 所用的培养基中的浓度为 0.15mg/L， 所述潮霉素在Ⅱ所用的培养基中的浓度为 10mg/L， 所 述头孢霉素在Ⅱ所用的培养基中的浓度为 500mg/L。
Ⅰ： 每 1000ml 所 用 的 培 养 基 按 照 如 下 方 法 配 制 ： 700mlMS 液 体 培 养 基 中 加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.15ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液 后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到Ⅰ所用的培养基 ； 所述步骤Ⅰ中， 所述继代 3 次按照每 10-13 天的间隔进行继代 ；
Ⅱ： 每 1000ml 所 用 的 培 养 基 按 照 如 下 方 法 配 制 ： 700mlMS 液 体 培 养 基 中 加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.1ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液 后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到Ⅱ所用的培养基 ； 所述步骤Ⅱ中， 所述继代 2 次按照每 15 天 的间隔进行继代。 所述 6- 苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg6- 苄氨基嘌呤用 10ml 1M 的 NaOH 水溶液溶解后加水定容到 50ml， 得到所述 6- 苄氨基嘌呤母液 ；
所述 1- 萘乙酸母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg1- 萘乙酸用 10ml1M 的 NaOH 水 溶液溶解后加水定容 50ml， 得到所述 1- 萘乙酸母液 ；
所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置 ： 称取 20mg2， 4- 二氯苯氧乙 酸丁酯用 15ml 无水乙醇溶解后加水定容 20ml， 得到所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液 ； 所 述头孢霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 头孢霉素溶于水中后， 加水定容到 10ml， 得到所述头孢霉素母液 ；
所述潮霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 潮霉素溶于水中后， 加水定容到 10ml， 得到所述潮霉素母液 ；
所述 UGT72B14 蛋白的编码基因为序列表中的序列 1 的自 5’ 末端第 53 位到第 1474 位核苷酸所示的 DNA 分子。上述序列 1 由 1671 个核苷酸组成， 其 OFR 为序列 1 的自 5’ 末 端第 53 位到第 1474 位核苷酸所示的 DNA 分子。
所述目的植物为双子叶植物或者单子叶植物， 所述双子叶植物优选为景天科植 物， 所述景天科植物优选为红景天属植物， 所述红景天属植物尤其优选为高山红景天。
本发明的实验证明， 将 UGT72B14 基因置于植物高效表达载体 pCAMBIA1301 的 35S 启动子 +Ω 增强子下游， 通过发根农杆菌介导法转化高山红景天， 通过强效启动子的增进 表达及基因转化培养基优化， UGT72B14 的高效表达导致转基因高山红景天愈伤组织中红景 天甙含量较对照提高 3.3 倍。本发明为利用高山红景天转基因愈伤组织过表达红景天甙生 物合成途径关键酶 -UGT72B14 提供了具有创新性和实用性的相关技术方法及应用。
【附图说明】
图 1 为红景天根中糖基转移酶活性随时间变化趋势 图 2 为红景天根总 RNA 的电泳结果图 3 为红景天根 3’ RACE 结果 图 4 为所获得基因 5’ RACE 结果 图 5 为 UGT72B14 全长 cDNA 的 PCR 扩增 图 6 为 UGT72B14 蛋白的结构功能域分析 图 7 为 pBSUGT72B14 表达载体的 BgLII 和 Bst EII 双酶切鉴定 图 8 为 pBSUGT72B14 表达载体的 PCR 鉴定 图 9 为潮霉素对叶片生长状态的影响 图 10 为 UGT72B14 的高山红景天遗传转化过程 ( 农杆菌介导法 ) 之一 图 11 为部分转基因高山红景天愈伤组织的 PCR 检测结果 图 12 为部分转基因高山红景天愈伤组织的 PCR-Southern 检测结果 图 13 为部分转基因高山红景天的 Northern 检测结果 图 14 为转基因高山红景天 HPLC 分析结果具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
实施例 1、 UGT72B14 基因分离
应 用 RACE(rapid-amplification of cDNA ends) 结 合 CODEHOP(consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers) 简并引物设计以及 茉莉酮酸甲酯 (MeJA) 诱导的方法成功地从高山红景天根组织分离得到 1 个新的 UDP- 葡萄 糖基转移酶基因 cDNA 全序列， 国际糖基转移酶专业委员会命名为 UGT72B14。
具体过程如下 ：
1、 红景天根中糖基转移酶活性随时间变化趋势
为了优化分离酪醇葡萄糖基转移酶基因的 RNA 提取时期， 本研究对 MeJA 诱导高山 红景天根产生的糖基转移酶活性随时间变化趋势进行分析。研究以酪醇为底物， 测定了不 同时间高山红景天愈伤与根粗酶液中糖基转移酶的比活力 (U/mg FW)， 结果见图 1。由图可 见， 根中催化酪醇的酶比活力在第 12 天时测量值在 6 次中最高， 由于蛋白合成要滞后于转 录过程， 因此选取 10 天的根组织作为 RNA 提取材料。
2、 总 RNA 的提取
使用改进的 CTAB 方法提取红景天根 RNA， 改良的 RNA 提取缓冲液中加入强还原剂 β- 巯基乙醇和螯合剂 PVP40， 有效的降低了多酚类物质的影响 ； 而 LiCl 的选择性沉淀则排 除了红景天中大量糖类物质对提取的干扰。纯度检测结果为根总 RNA 平均的 OD260/OD280 值 约为 1.85， 说明提取的总 RNA 比较纯净， 这种方法是一种有效的红景天根总 RNA 提取方法 ( 图 2)。
3、 UGT72B14 基因 3’ 端序列的分离
以高山红景天根组织总 RNA 为模板， 以 QT(5’ -CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCT CAAGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3′ ) 为反转录引物， 按照 Promega 反转录试剂盒说明书进行 cDNA 第一链的合成。 之后以反转录的 cDNA 第一链为模板， 根据 CODEHOP 设计的简并引物 (Block H： 5’ -CAGCTGTTGGAGTTTTTGTTACTCAytgyggntgga-3’ .N 是任何碱基 ； Y 是 C 或 T)， 与设计的
锚定引物为组合进行套式 PCR 扩增， PCR 电泳结果显示获得 1 条大小约 500bp 左右的特异 条带 ( 图 3 ： M： DL2000marker ； 1-3 ： 分别为 16d， 12d， 0d RNA 的 PCR 扩增结果 )， 所获得基因 的碱基长度与预计的可能长度相符。
将所获得的 cDNA 片段经 DNA 测序后并进行生物信息学分析后后发现， 其氨基酸 序列与已注册的植物 UDP- 葡萄糖基转移酶羧基末端序列具有较高的同源性 ( 最高达到 65％ )， 说明该序列是高山红景天 1 个 UDP- 葡萄糖基转移酶基因的 3’ 端， 长度为 530bp， 而 且是一个新基因。
4、 UGTC2 和 UGTR 基因 5’ 端序列的克隆
所获得基因的 5’ -RACE 的试验结果如图 4(M ： DL 2000marker ； 1： PCR 扩增结果 ) 所示。将图 4 中所示特异性的、 与预计大小 ( 保守区到 5’ 端碱基长度 ) 相符的条带回收、 连接 T 载体、 转化、 鉴定、 测序、 分析、 测序后， 结果发现所得序列与其它植物 UDP- 葡萄糖基 转移酶基因同源性不是很高， 最高分别达到 62％， 基因长度为 1241bp。
5、 全长 cDNA 的克隆
利用 DNAman 软件对分离的基因的 cDNA3’ 端序列和 5’ 端序列测序结果进行电子 合并， 得到全长为 1671 的序列， 命名为 UGT72B14。UGT72B14 的核苷酸序列为序列表中的序 列 1， OFR 序列为序列表中序列 1 的自 5’ 末端第 53 位到第 1474 位核苷酸。UGT72B14 编码 的蛋白命名为 UGT72B14， 其氨基酸序列为序列表中的序列 2。 表 1 中相应的引物， 以根反转录的 cDNA 第一链为模板， 扩增出长度为 1433bp( 保 括酶切位点和保护碱基的序列 ) 的 UGT72B14 基因的完整开放读码框内序列， 结果见图 5(M ： DL2000 marker ； 1： UGTR 基因全长 PCR 扩增结果 )， 电泳显示序列长度与预期大小相符。同 样， 该条带经回收、 T 载体连接、 转化、 鉴定后测序。测序结果同电子合并的结果相符。
表 1UGT72B14 cDNA 全长引物 ( 酶切位点用于植物表达载体的构建 )
6、 UGT72B14 基因的生物信息学分析
将获得的 UGT72B14 基因的全长 cDNA 序列通过 NCBI 网站 (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BankIt/index.html) 上的 Bankit 工具递交 GenBank， 接受号为 EU567325。
利用 DNAman 软件对获得的 UGT72B14 基因全长 cDNA 序列进行分析， 所获得的所获 得的 UGT72B14 cDNA 全长 1671bp( 序列 1)， 其中包括 1422bp( 序列 1 自 5’ 末端第 53 位到 第 1474 位核苷酸 ) 完整的开放阅读框 (open reading frame， ORF)， 推测编码 473 个氨基 酸的多肽， 同时含有 53bp 的 5’ 非转译区 (5’ UTR) 和 97bp 3’ 非转译区 (3’ UTR) 以及多聚 腺苷酸尾。5’ UTR 区起始密码子前出现终止密码子， 并且通过 BLASTp 和已知其他植物糖基 转移酶的序列比对， 结果证明获得的 UGT72B14 基因的 cDNA 是完整的。
7、 UGT72B14 基因的结构和功能域分析
用 BLAST 服务器 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 中的 protein blast 对 UGT72B14 基因推测编码的氨基酸序列进行结构域分析， 结果见图 6， 分析表明 UGT72B14 在 261-440 之间含有一个典型的 UDP- 葡萄糖基转移酶特征性结构域， 而在 255-442 之间有 一个典型的 COG1819 也即糖基转移酶结构域， 见图 6。
UGT72B14 基因可通过上述方法获得， 也可人工合成。
实施例 2. 转 UGT72B14 高山红景天
人工合成序列表中序列 1 所示 CDNA。
1、 pCAUGT72B14 载体的构建
用含有 BgLII 和 Bst EII 酶切位点 pUGTRup 和 pUGTRdown( 表 1) 为引物， 以人工合 成的 CDNA 为模板， 扩增出 PCR 产物。 将该 PCR 产物经过 BgLII 和 Bst EII 酶切后得到的片段 插入到 pCAMBIA1301 载体 (Ge Y， Cheng X， Hopkins A， Wang ZY.Generation of transgenic Lolium temulentum plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Plant Cell Rep.200726(6) ： 783-789 ； ； 公众可从北京农学院获得。) 的 BgLII 和 Bst EII 识别位点间得到重组载体， 将重组载体转化大肠杆菌 DH5α， 经过抗生素筛选后得到重组 菌， 提取质粒进行酶切鉴定和 PCR 鉴定， 鉴定结果表明， 酶切后产生 1.5kb 左右的条带和载 体条带 ( 如图 7 所示， M， DL15000+2000 Marker ； 1-8， 阳性质粒。)， 且 PCR 的电泳结果也出 现 1.5kb 左右的条带 ( 图 8， M， DL2000 Marker ； 1-8， 阳性质粒 ) 的质粒命名为 pCAUGT72B14。 将 pCAUGT72B14 送上海生工生物技术服务有限公司进一步测序验证， 结果为 pCAUGT72B14 为在 pCAMBIA1301 载体的 BgLII 和 Bst EII 识别位点间插入序列表中序列 1 自 5’ 末端第 53 位到第 1474 位核苷酸 (UGT72B14 的 ORF 序列 )。
通 过 冻 融 法 将 重 组 质 粒 pCAUGT72B14 转 化 到 农 杆 菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105(Ma， L.Q.， Liu， B.Y.， Gao， D.Y.， Pang， X.B.， Lu， S.Y.， Yu， H.S.， Wang， H.， Yan， F.， Li， Z.Q.， Li， Y.F.， Ye， H.C.， 2007.Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis.Plant Cell Rep.26， 989-999 ；； 公众可从北京农学院获得。) 感受态细胞 中， 获得重组菌， 提取质粒酶切鉴定， 产生 1.5kb 左右的条带和 9.5kb 左右条带的质粒对应 的重组菌为阳性 EHA105/pCAUGT72B14。
2、 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织的获得
选择性标记抗性筛选是获得转基因植物材料的关键。如果筛选压力过高， 会造成 转基因材料生长状态低下甚至死亡 ； 反之则会出现大量的假阳性材料， 为后续筛选工作增 加难度。本实验采用的植物表达载体中含有潮霉素磷酸转移酶基因 Hpt 可分解培养基中的 潮霉素 (Hyg)。
不同浓度的潮霉素 (Hyg) 处理对高山红景天叶片外植体的影响见图 9。当潮霉 素浓度为 0 时， 外植体生长旺盛 ； 潮霉素浓度为 5mg/L 时， 外植体生长减慢， 致死率达到 50.17％ ； 潮霉素浓度为 10mg/L 时， 致死率高达 93.0％ ； 潮霉素浓度为 15mg/L 时， 叶片全部 死亡。从高山红景天叶片对潮霉素敏感性实验的结果看， 当 Hyg 浓度达到 10mg/L 时， 可完 全抑制从叶片诱导愈伤组织的形成。但如果外植体一开始就经历高压选择， 可能导致已转 化细胞的死亡。所以， 本实验确定转基因初期抗生素筛选浓度 Hyg 为 5mg/L。为能获得阳性转基因抗性愈伤组织， 在转基因初期潮霉素浓度为 5mg/L 获得大量生长状态良好愈伤组织 基础上， 为提高筛选效率， 将潮霉素浓度增加到 20mg/L， 进行抗性愈伤组织筛选， 获得理想 的实验结果。
将上述获得的阳性 EHA105/pCAUGT72B14 接种在固体培养基 (YEB) 上划线培养， 于 27℃下活化 3 次， 挑取平板上单菌落， 接种在 50ml YEB 液体培养基， 于 27℃、 120rpm\min， 黑 暗下震荡培养， 继代 3 次， 培养阳性 EHA105/pCAUGT72B14 的 OD600 至 0.5， 用于侵染高山红景 天 (Rhodiola sachalinensis A.Bor ； Ma， L.Q.， Liu， B.Y.， Gao， D.Y.， Pang， X.B.， Lu， S.Y.， Yu， H.S.， Wang， H.， Yan， F.， Li， Z.Q.， Li， Y.F.， Ye， H.C.， 2007.Molecular cloning and overexpression of a novel UDP-glucosyltransferase elevating salidroside levels in Rhodiola sachalinensis.Plant Cell Rep.26， 989-999 ； 公众可从北京农学院获得。) 叶盘， 侵染时间为 9 分钟。
先将高山红景天的无菌苗叶片切成 0.5×0.5cm 的小块， 叶面向下接在预培养培 养基上， 25℃暗培养 2d( 表 2)， 再用上述获得的 D600 为 0.5 的阳性 EHA105/pCAUGT72B14 侵染 预培养培养基上高山红景天的无菌苗叶片， 将阳性 EHA105/pCAUGT72B14 侵染过的高山红 景天叶盘置于共培养基上 ( 图 10A 侵染过农杆菌的高山红景天叶盘置于共培养基上 )， 25℃ 光照条件下共培养 3 天后， 转移到只含有抑制农杆菌生长抗生素 ( 头孢霉素， Cef 500mg/ L) 的抑菌培养基上进行 5 天的抑菌培养 ； 将经过抑菌培养的外植体接到含有潮霉素 5mg/ L、 Cef 500mg/L 诱导培养培养基上， 25℃连续光照条件下， 2 周继代一次， 进行诱导培养 ( 图 10B 转化叶盘在选择培养基上产生愈伤 ； )。待诱导培养获得的愈伤形成后， 将一部分愈伤 组织接到抗性筛选培养培养基上， 在高浓度潮霉素 Hyg(20mg/L) 条件下筛选转基因抗性愈 伤组织 ( 图 10C 愈伤置于高选择压培养基上 ) ； 取在抗性筛选培养培养基上成活的愈伤组 织采取逐渐降低潮霉素浓度的方式依次进行Ⅰ和Ⅱ所示的继代抗性筛选培养， 具体为在潮 霉素 15mg/L 培养基上继代 3 次后转入潮霉素 10mg/L 的培养基上继代保存培养， 形成生长 状态良好的抗性愈伤组织 ( 图 10D 筛选出的抗性愈伤 )， 作为转 UGT72B14 高山红景天愈伤 组织进行分子检测和指标测定。
每 1000ml 所述共培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加 入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.5ml 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述共培养用的培养基 ；
每 1000ml 所述抑菌培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容 至 1000ml， 得到所述抑菌培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述诱导培养所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.05ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素 母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述诱导培养所用的培养基 ；
每 1000ml 所述抗性筛选培养的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中 加入 1.5ml6- 苄氨基嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.2ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母 液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到所述抗性筛选培养的培养基 ；
所述共培养的时间为 3 天， 所述共培养的温度为 25℃， 所述共培养为连续光照 ； 所 述抑菌培养的时间为 5 天， 所述抑菌培养的温度为 25℃， 所述抑菌培养为连续光照 ；所述诱导培养的时间为 2 周， 所述诱导培养的温度为 25℃， 所述诱导培养为连续光照 ； 所述抗性筛选培养的时间为 10 周， 所述抗性筛选培养的温度为 25℃， 所述抗性筛 选培养为连续光照 ；
所述继代抗性筛选培养的方法为依次按照如下Ⅰ和Ⅱ所示步骤进行培养 ：
Ⅰ： 所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加入 1.5ml6- 苄氨基 嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.15ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容 至 1000ml， 得到Ⅰ所用的培养基 ； 培养时间为 40d， 继代 3 次， 25℃， 连续光照 ；
Ⅱ： 所用的培养基按照如下方法配制 ： 700mlMS 液体培养基中加入 1.5ml6- 苄氨基 嘌呤母液、 0.15ml1- 萘乙酸母液、 0.1ml 潮霉素母液、 5.0ml 头孢霉素母液后， 蒸馏水定容至 1000ml， 得到Ⅱ所用的培养基 ； 培养时间为 30d， 每 15d 继代 1 次， 25℃， 连续光照 ；
所述 6- 苄氨基嘌呤母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg6- 苄氨基嘌呤用 10ml 1M 的 NaOH 水溶液溶解后加水定容到 50ml， 得到所述 6- 苄氨基嘌呤母液 ；
所述 1- 萘乙酸母液按照如下方法配置 ： 称取 50mg1- 萘乙酸用 10ml1M 的 NaOH 水 溶液溶解后加水定容 50ml， 得到所述 1- 萘乙酸母液 ；
所述 2， 4- 氯苯氧乙酸丁酯母液按照如下方法配置 ： 称取 20mg2， 4- 二氯苯氧乙酸 丁酯用 15ml 无水乙醇溶解后加水定容 20ml， 得到所述 2， 4- 二氯苯氧乙酸丁酯母液 ；
所述头孢霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 头孢霉素溶解在水中后， 加水 定容到 10ml， 得到所述头孢霉素母液 ；
所述潮霉素母液按照如下方法配置 ： 称取 1000mg 潮霉素溶解在水中后， 加水定容 到 10ml， 得到所述潮霉素母液 ；
所述 MS 培养基的组成及配制方法如下 ：
表 1 为 MS 培养基母液
表 2 为 MS 培养基配制方法 (1000ml) 母液 用量 大量 20ml 微量 10ml 钙盐 10ml 铁盐 有机Ⅰ 10ml 10ml 有机Ⅱ 10ml
配制方法 ： 大量筒中先放置 200ml 左右的蒸馏水， 将上述母液称量后加入大量筒 中， 再加入 400--500ml 蒸馏水， 加入 30 克蔗糖溶解后定容到 1000ml， 倒入三角瓶中。用 PH计测 PH 值到 5.80--5.85。加入 7--7.5g 琼脂后融化倒瓶灭菌。
3、 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织鉴定
1)PCR 鉴定
以上述获得的转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织为材料， 提取基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 检测。 为了避免内源基因的干扰， PCR 引物之一为目标基因的 3’ 引物 (pUGTRdown)， 另一个引物为对应于 CaMV 35S 启动子上游的一段核苷酸序列 (35S-UP， 5’ -TGATATCTCCAC TGACGTAAGGGATG-3’ )， 该引物在野生型高山红景天基因组上没有互补序列。图 11 为转化 UGT72B14 的部分转基因愈伤组织的 PCR 检测结果 ； PCK 为质粒 pCAUGT72B14 ； RCK 为野生型 ； 1-20 为部分转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织， 阳性对照用质粒 pCAUGT72B14 为模板。 结果 显示用引物 pUGTRdown 与 35S-UP 从转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中扩增得到的 DNA 片 断与阳性对照 (PCK) 相同， 为 1.6Kb 左右， 阴性对照 ( 野生型高山红景天， RCK) 没有该扩增 产物。在检测的 20 团转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中 PCR 检测结果全部为阳性。说明 高浓度潮霉素筛选的效率极高。
2)PCR-Southern 鉴定
以 Digoxigenin 标记的 UGT72B14 cDNA 为探针 (UGT72B14 的 ORF 序列， 序列表中 序列 1 的自 5’ 末端第 53-1474 位核苷酸。) 对部分 PCR 阳性转 UGT72B14 高山红景天愈伤 组织扩增产物进行 PCR-Southern 检测， 结果如图 12， PCK- 质粒 pCAUGT72B14 ； RCK- 野生型 ； 7， 20- 部分转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织。
扩增产物均与探针产生杂交信号。说明 UGT72B14 基因整合到基因组 DNA 上。
基于转基因材料在一段时间内与农杆菌共同生长， 取一部分愈伤组织在诱导、 筛 选、 继代 5 个月实验过程中一直添加头孢霉素 (Cef 500mg/L)， 另一部分在检测前 4 周停止 脱菌， 停止脱菌的材料培养过程中没有农杆菌的再生， 添加 Cef 和停止脱菌的转基因愈伤 组织均得到了阳性检测结果。
3)Northern 鉴定
分别提取转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织、 及相应野生型对照 ( 高山红景天 ) 总 RNA， 经甲醛变性胶电泳后转移至尼龙膜上， 以 Digoxigenin 标记的 UGT72B14 为探针进 行 Northern 检测。由于 UGT72B14 基因是从高山红景天中分离又转回其中， 实验中应区分 UGT72B14 内源基因转录对实验结果的干扰， 因此以野生型愈伤组织为对照从转录表达量上 进行区别。Northern 检测结果表明 ( 图 13 中， 1， 野生型愈伤组织 ； 5、 7、 9 为转 UGT72B14 高 山红景天愈伤组织。)， 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织转录水平明显高于野生型对照， 综 合前述分子检测以及 Northern 实验结果， 说明 UGT72B14 基因不仅成功整合到高山红景天 基因组 DNA 中， 而且得到转录水平表达且转录水平较高。
采用同样的方法将空载体 pCAMBIA1301 载体也转入高山红景天愈伤组织中， 获得 转 pCAMBIA1301 高山红景天愈伤组织。
实施例 3、 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织的红景天甙的 HPLC 检测
Northern 杂交结果证实， UGT72B14 转化高山红景天后得到且转录水平较高， 为进 一步对 UGT72B14 功能进行分析， 对转基因高山红景天愈伤组织及其野生型对照 ( 高山红景 天的愈伤组织 ) 中的红景天甙含量进行了高效液相色谱测定， 具体方法如下 ：
从由实施例 2 的 2 步骤获得的所述转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中提取红景天甙， 具体提取方法如下 ： 将高山红景天转基因愈伤组织于烘箱中 60℃烘至恒重， 粉碎 后过 80 目网筛， 精确称取 0.8g 样品加入甲醇 8ml， 超生提取 30min( 超声功率 100w、 时间 30min)， 之后于 60℃孵育 30min， 于室温 11000g 离心 15min， 收集上清 ； 沉淀用 50％的甲醇 水溶液再提取一次， 将上清合并后， 过 0.45μm 滤膜。
取过滤后的溶液进行 HPLC 检测， 检测条件为 ： 色谱柱 ： Hypersyl ODS 柱， 5mm， 4.6×150mm ； 流动相 ： 水 - 甲醇 - 乙腈 (70 ∶ 25 ∶ 5， v/v/v) ； 流速 ： 0.8ml/min ； 检测波长 275nm， 带宽 10nm， 参比波长 400nm， 带宽 80nm ； 外标法定量。
红景天甙标准品 ( 上海同田生物技术有限公司， Catalog E-0069)， 保留时间为 4.13 分钟。HPLC 检测的野生型对照愈伤组织中的红景天甙的保留时间为 4.13 分钟， 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织中的红景天甙的保留时间为 4.13 分钟。
对由实施例 2 获得的转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织进行了 HPLC 测定， 以野生 型对照 ( 高山红景天的愈伤组织 ) 及由实施例 2 获得的转 pCAMBIA1301 高山红景天愈伤组 织为对照。实验重复三次， 结果取平均值。
愈伤组织中的红景天甙含量测定结果的数据分析如图 14(C ： 愈伤组织， TC ： 转基 因愈伤组织 ) 所示， 结果表明 ： 野生型对照愈伤组织 (C) 中的红景天甙含量为 1.75mg/g 干 重， 转 UGT72B14 高山红景天愈伤组织 (TC) 中的红景天甙含量为 7.53mg/g 干重， 较其野生 型对照提高 3.3 倍。
野生型对照与转 pCAMBIA1301 空载体高山红景天愈伤组织的结果无显著差异。
说明 UGT72B14 的转化显著提高了红景天甙的积累水平。14CN 101914122 A
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