使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法 技术领域 本发明属于分离技术领域， 涉及一种使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉 素的方法。
背景技术 抗生素发明以来， 不仅在人类疾病的治疗和预防方面效果显著， 同时在畜牧业饲 料添加剂方面也发挥着巨大的作用。抗生素对动物的促生长作用是在 20 世纪 40 年代后期 由 Stocktadt 等人发现， 以后相继发现四环素类、 大环内酯类、 β- 内酚胺类等抗生素加入 饲料中， 都有促进生长、 增重、 增产、 提高饲料报酬作用。 1950 年美国 FDA 正式批准允许在饲 料中添加抗生素。 抗生素对于畜禽的生长和提高生产性能的作用是肯定的， 而且很稳定， 许 多国家的畜禽业都长期应用抗生素添加剂。实践证明， 合理地使用抗生素添加剂能促进畜 禽生长， 提高饲料转化率。 同时也有报告显示， 不允许在饲料中添加抗生素或其他抗菌促生 长剂的国家， 会造成畜牧业生产成本增加， 盈利减少， 同时也有可能引发诸如生态环境及国 家之间的贸易战等问题。 但为了避免由于抗生素的滥用引起耐药菌株大量繁殖或使药物在 畜产品中的残留量增大， 对畜禽生长及人体健康造成直接危害， 应用畜禽专用的抗生素饲 料添加剂已迫在眉睫。由于恩拉霉素具有优良的促生长和改善饲料利用率的作用， 因此被 世界上许多国家推荐作为抗生素促生长剂。
恩拉霉素 (Enramycin)， 又名恩来霉素、 恩霉素、 安来霉素、 持久霉素， 是由土壤中 分离出来的放线菌 Streptomyces fungicidious NO.B5477 发酵产生的一种多肽类抗生素， 易溶于稀盐酸， 微溶于水、 甲醇、 乙醇。 市场上主要的来源是先灵葆雅公司的菌丝体预混剂。
作为饲料添加剂恩拉霉素有如下优点 ：
1. 临床应用研究方面， 与其他抗生素添加剂相比， 用量少的情况下饲料系数更低， 生长速度更快。2. 药效学研究方面， 恩拉霉素对主要的革兰氏阳性菌都具有强大的杀菌作 用。恩拉霉素对乙肝病毒 (HBV) 抗原有较强的抑制作用， 包括对乙肝 e 抗原 (HBeAg) 也有 较好的抑制效果。恩拉霉素与临床上现有的抗生素或抗菌药之间不存在交叉耐药性。敏感 菌几乎不对恩拉霉素产生耐药性， 在实验条件下， 耐药性的产生也非常缓慢， 即使出现， 耐 药性也不稳定， 而且极易丢失。3. 药物残留研究方面， 恩拉霉素内服极不易被吸收， 药物主 要通过粪便排出体外。 4. 毒理学研究方面， 恩拉霉素毒性很低。 急性毒性实验表明， 恩拉霉 素在口服、 皮下或肌肉注射给药时实际无毒。 5. 恩拉霉素的盐酸盐对热、 光照和潮湿有极好 的稳定性。 恩拉霉素在饲料中具有很高的稳定性， 在室温条件下长期储藏很少降解， 在制成 颗粒料过程中也非常稳定， 与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。恩拉霉素在肠 道内不被降解， 能够保持原有的抗菌活性。
抗生素的提取主要有以下几种途径 ：
有沉淀法、 溶媒萃取法、 吸附法、 离子交换色谱法、 高效液相色谱法、 膜分离技术、 毛细管电泳、 双水相技术、 反胶束、 超临界萃取等。其中膜分离技术、 毛细管电泳、 双水相技 术、 反胶束、 超临界萃取等为近几年新开始应用的方法， 成本高， 没有较为成熟的工业化模
式， 大多在实验室小规模对个别品种进行探索。
沉淀法、 溶媒萃取法、 吸附法等传统方法， 由于活性炭和大多数溶媒不能很好的将 杂质分离， 得到的物质纯度不够， 从而达不到分离提取要求的效果， 目前大多应用于粗提， 粗品预处理阶段， 配合其他方法共同应用。 高效液相色谱法中， 大多通过使用预柱来排除部 分相关杂质， 预柱常因不能再生利用而造成耗损成本比较高。目前大多数抗生素品种在分 离、 提取、 浓缩、 纯化、 脱色等方面广泛应用的是色谱法。
中国发明专利申请 《一 种 安 来 霉 素 产 生 菌 及 利 用 大 孔 树 脂 提 取 的 方 法》 (200910032340.1) 中记载用大孔吸附树脂安伯莱特 XAD-4、 安伯莱特 XAD-16 等来分离提取 恩来霉素。 大孔吸附树脂的吸附实质为一种物体高度分散或表面分子受作用力不均等而产 生的表面吸附现象， 这种吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的结果。同时由于大孔吸 附树脂的多孔结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。通过上述这种吸附和筛选 原理， 有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小， 在大孔吸附树脂上经一定溶剂洗脱 而达到分离、 纯化、 除杂、 浓缩等不同目的。其理化性质稳定， 不溶于酸、 碱及有机溶剂， 对 有机物选择性好， 不受无机盐类及强离子、 低分子化合物存在的影响， 近年来也广泛应用于 中药、 微生物的分离提取。但该发明方法对于菌丝体中恩拉霉素的产率只能控制在 60％～ 71％， 回收率较低， 对于规模化工业生产耗损太多， 含量检测方面也难满足准确度要求。 离子交换色谱法应用到的离子交换树脂分为阳离子树脂和阴离子树脂两大类， 它 们可分别与溶液中的阳离子和阴离子进行离子交换。按照孔隙结构分凝胶型和大孔型两 种， 凡具有物理孔结构的称大孔型树脂。 阳离子树脂又分为弱酸性和强酸性， 其中弱酸性阳 + 离子树脂含弱酸性基团， 如羧基 -COOH， 能在水中离解出 H 而呈酸性。树脂离解后余下的负 电基团， 能与溶液中的其他阳离子吸附结合， 从而产生阳离子交换作用。 这种树脂的酸性即 离解性较弱， 但比强酸性树脂较易再生。 但针对恩拉霉素， 一般认为无法使用离子交换树脂 纯化， 主要使用吸附树脂 (《饲料中恩拉霉素的微生物学含量测定方法研究》 中国兽药杂志 2008， 42(9) ： 17 ～ 21 顾欣等 )。本领域需要寻找更好的方法来分离提取恩拉霉素， 提高回 收率和纯度。
发明内容 本发明所要解决的技术问题是为恩拉霉素的分离纯化提供一种有效的方法。 解决 该问题的技术方案是提供了一种使用大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法。 本 发明大孔弱酸性阳离子树脂分离提取恩拉霉素的方法的技术方案包括以下步骤 ：
a、 由恩拉霉素粗品提取得含恩拉霉素提取液备用 ；
b、 将大孔弱酸性阳离子树脂用足量甲醇浸泡后， 去掉上层甲醇液体， 再加入足量 水， 静置以备装柱 ；
c、 将预处理的大孔弱酸性阳离子树脂装层析柱， 使用 pH 8.0 的 1 ∶ 1 甲醇水过 柱， 平衡后待用 ；
d、 将步骤 a 所述含恩拉霉素提取液调至 pH 8.0， 再过滤， 用上清液上柱 ； 用1∶1 甲醇水溶液过柱， 洗涤去除杂质 ； 再用 7 ∶ 3 甲醇水溶液过柱， 收集洗脱液， 浓缩， 蒸干得到 恩拉霉素产品。
其中， 上述方法中所述大孔弱酸性阳离子树脂为 HD-2 型。
其中， 上述方法步骤 a 所述的恩拉霉素粗品提取的方法为将恩拉霉素粗品加入 pH3.0 的 1 ∶ 1 甲醇水适量， 充分搅拌混合后静置， 过滤， 取上清液体作为提取液备用。
其中， 上述方法步骤 d 所述蒸干的温度不超过 45℃。
另， 所述 7 ∶ 3 甲醇水是指体积比为 70％甲醇和 30％水的混合溶液， 1 ∶ 1 甲醇水 同理可配制。
其中， 上述方法中所述调节 pH 值的物质为盐酸和氢氧化钠的水溶液。
其中上述方法中， 所述恩拉霉素粗品可为产恩拉霉素菌的菌丝体， 也可为先灵葆 雅公司市售的恩拉霉素菌丝体预混剂。
本发明方法具体操作如下 ：
恩拉霉素粗品提取 ： 样品加入用调 pH 3.0 的甲醇水 (1 ∶ 1) 适量， 充分搅拌混合 后静置， 过滤， 取上清液体作为提取液备用 ；
树脂预处理 ： 将弱酸性阳离子树脂 HD-2 用甲醇浸泡后， 去掉上层甲醇， 再加入足 量水， 静置以备装柱 ；
层析柱装柱及处理 ： 将预处理的树脂装层析柱， 使用 pH 8.0 的甲醇水 (1 ∶ 1) 过 柱， 平衡后待用。在整个装柱过程中， 装柱的柱子不能干枯 ；
分离纯化 ： 将前述提取液用 NaOH 调至 pH 8.0， 再过滤后的上清液上柱， 用甲醇水 (1 ∶ 1) 过柱， 洗涤去除杂质 ； 再用甲醇水 (7 ∶ 3) 过柱， 收集洗脱液， 浓缩， 蒸干得到恩拉 霉素产品。
本发明分离提取恩拉霉素的主要是打破了常规， 引入弱酸性阳离子树脂 HD-2 型 进行恩拉霉素的纯化， 并对该方法进行了优化， 提取产物纯度均达到 98％以上， 回收率高达 85％以上， 适用于规模化工业生产， 为本领域纯化恩拉霉素提供了一种新的选择。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。 具体实施方式
本发明方法将大孔弱酸性阳离子树脂浸入足量的甲醇中， 使充分活化， 放置后， 除 去上层甲醇液体， 加入足量的水， 搅拌混合后装柱， 用弱碱性的甲醇溶液过柱平衡。恩拉霉 素菌丝体经乙醇水浴加热回流得到粗品， 粗品与弱酸性的甲醇水溶液混合， 搅拌， 过滤， 滤 液调至弱碱性， 再次过滤， 取该滤液流经层析柱， 发生吸附后， 再用普通甲醇水洗去杂质， 然 后用水洗为中性， 最后用适量的甲醇水洗脱， 收集全部洗脱液， 浓缩， 蒸干后得产品恩拉霉 素。
上述方法中优选使用 HD-2 型阳离子树脂， 优选使用甲醇水 (1 ∶ 1) 和甲醇水 (7 ∶ 3) 进行洗涤和洗脱。
具体而言， 本发明方法为 ：
恩拉霉素粗品提取 ： 样品加入用调 pH 3.0 的甲醇水 (1 ∶ 1) 适量， 充分搅拌混合 后静置， 过滤， 取上清液体作为提取液备用。调 pH 一般用浓盐酸和氢氧化钠。
树脂预处理 ： 将弱酸性阳离子树脂 HD-2 用甲醇浸泡后， 去掉上层甲醇， 再用加入 甲醇同量水， 静置 20 分钟以备装柱。
层析柱装柱及处理 ： 将预处理的树脂装层析柱， 使用的 pH 8.0 的甲醇水 (1 ∶ 1) 过柱， 流速 0.4ml/min， 平衡后待用。在整个装柱过程中， 装柱的柱子不能干枯。分离纯化 ： 将前述提取液用 NaOH 调至 pH 8.0， 再过滤后的上清液上柱， 上柱流速 0.5ml/min， 用甲醇水 (1 ∶ 1) 过柱， 流速 0.4ml/min， 洗涤去除杂质， 再用甲醇水 (7 ∶ 3) 过 柱， 流速 0.3ml/min， 收集洗脱液， 浓缩， 蒸干得到恩拉霉素产品。
详细实施过程及与现有方法的比较请见实施例。
以下实例中使用的恩拉霉素粗品为先灵葆雅公司市售的恩拉霉素 4％菌丝体预混 剂。恩拉霉素标准品为先灵葆雅公司市售， 纯度检测使用常规 HPLC 进行。大孔弱酸性阳离 子树脂 HD-2， 河北沧恩化工生产。
实施例一 用 HD-2 型阳离子树脂分离纯化恩拉霉素
本实施例是移用的大孔吸附树脂上使用的条件。
1、 恩拉霉素粗品 10g+50ml 的 50％甲醇水 (pH 3.0) 混合， 搅拌， 过滤， 取上清液体 作为提取液备用。
2、 分离纯化， 本实施例是移用的大孔吸附树脂上使用的条件。
(1) 树脂预处理 ：
HD-2 型大孔弱酸性阳离子树脂浸入足量的甲醇中， 缓缓搅拌， 使充分混合， 放置 后， 小心除去上层甲醇液体， 加入足量的水， 搅拌混合后， 放置， 备用。 (2) 层析柱处理 ：
选用 1cmX20cm 规格的层析柱， 将预处理好的树脂装柱， 在整个装柱过程中， 使装 柱的柱子不能干枯。使用 25ml 的 pH 8.0 碱性的甲醇水 (1 ∶ 1) 以 0.4ml/min 流速过柱， 平衡后， 待用。
(3) 分离纯化 ：
将提取液用 NaOH 液调至 PH 为碱性 (pH ＝ 8.0) 过滤， 取滤液以 0.5ml/min 速度流 经过层析柱， 再用适量的 pH 值 8.0 甲醇溶液 ( 浓度为 1 ∶ 1) 流速以 0.4ml/min 过柱， 洗涤 去除杂质， 然后用 50ml 的 pH3.0 甲醇溶液 ( 浓度 7 ∶ 3) 以 0.3ml/min 流速过柱， 收集全 部洗脱液体， 浓缩， 蒸干后得产品恩拉霉素。经检测所得恩拉霉素回收率为 73.1％， 纯度为 97.4％。
实施例二 使用本发明方法用大孔弱酸性阳离子树脂 HD-2 分离纯化恩拉霉素
1、 样品粗提
恩拉霉素粗品 130g+200ml( 甲醇 )+200mlH2O
用浓盐酸 HCl 调 pH 3.0 充分搅拌 120min 后静置， 过滤， 取上清液体作为提取液备 用。
2、 分离纯化， 本实例是使用本发明方法进行中量纯化。
(1) 树脂预处理 ：
弱酸性阳离子树脂 HD-2 用甲醇浸泡 60min 后， 去掉甲醇， 再用水浸泡 20min 装柱。
(2) 层析柱处理 ：
选用 1cmX20cm 规格的层析柱， 将预处理好的树脂装柱， 在整个装柱过程中， 使装 柱的柱子不能干枯。使用 25ml 的 pH 8.0 的甲醇水 (1 ∶ 1) 以 0.5ml/min 流速过柱， 平衡 后， 待用。
(3) 分离纯化 ：
将步骤 1 所得的提取液用 NaOH 调至 pH 8.0， 过滤后的上清以 0.5ml/min 上柱，
用甲醇水 (1 ∶ 1) 过柱， 0.4ml/min ； 洗涤去除杂质， 洗涤共用 650ml。再用 650ml 甲醇水 (7 ∶ 3)0.3ml/min 过柱， 收集洗脱液， 浓缩， 蒸干得到产品。经检测所得恩拉霉素回收率 86.3％， 纯度为 98.5％。7