一种减少细胞产品中异源蛋白残留量的细胞培养方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种减少细胞产品中异源蛋白残留量的细胞培养方法。
背景技术
目前在实验室里，一般使用含有动物来源血清的细胞培养基进行小批量的贴壁细胞培养工作，但是，如果是在产业化大规模应用当中，尤其是培养出的贴壁细胞作为药用时，使用含有动物来源血清的细胞培养基有着许多不利因素：
(1)用于细胞培养的血清一般要经过热灭活，热灭活的过程可以防止血清对细胞的溶解作用，但是这个过程也可以使血清中的许多重要成分失活。
(2)由于不同批次血清所来源的生物体不同，不同批次血清之间也不可避免地含有不同的成分，其中有些成分会给所培养的细胞带来变化，导致给终产品带来无法预知的影响，使得其产品质量难以达到标准化。
(3)血清中的成分并没有也不可能在短时间内完全被阐明，因此，它们对所培养细胞的影响既是未知的，也是不能控制的。
在细胞治疗产品中去除细胞培养基中的动物成分，将提高产品的安全性，减弱或降低免疫排斥反应。理论上在细胞治疗产品中使用无血清培养基也更利于生产的标准化。
但是，到目前为止还没有真正适合于大规模制备细胞产品的无血清培养基：
(1)用于细胞治疗产品的无血清培养基由于要添加各种细胞因子，导致成本远远高于含血清培养基。
(2)到目前为止，我们还不了解血清中哪些成分对细胞增殖、分化、基因稳定性等等产生相应作用；所以，应用无血清培养基大规模制备细胞治疗产品的时候，很难通过配方的改进和调整达到和含血清培养基同样的效果。
(3)到目前为止，各国还没有对用于培养治疗用细胞的无血清培养基制定出相应的标准；但对牛血清等是有相应的要求。
因此在目前，为了在产业化应用中更快、更好的扩增细胞，我们还是需要在培养时添加血清。最终得到的产品当中里会存在较多的异种蛋白，若是用于临床，则大大增加了使用时的隐患，所以亟需一种减少终产品当中异种蛋白含量的细胞培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种保证细胞其它生理生化参数不变的前提下，减少外源蛋白残留量的细胞培养方法，使得培养出的细胞更适合临床使用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种减少细胞产品中异源蛋白残留量的细胞培养方法，包括以下步骤：将细胞接种到含血清培养基的培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中进行培养，在细胞进入对数增长期时，将含血清培养基更换为无血清培养基。
所述细胞培养方法为贴壁培养。
所述细胞为在培养时具有贴壁特性的细胞。
所述细胞经过传代培养后，再将含血清培养基更换为无血清培养基。
所述细胞为干细胞。
所述干细胞为人干细胞。
所述干细胞为亚全能干细胞。
所述干细胞为人间充质干细胞。
所述干细胞为从体外脐带胎盘来源的人间充质干细胞。
所述含血清培养基为DMEM/F12、DMEM、MCDB-201或M199中的一种或几种的组合，其中含体积比2％～20％的血清。
所述血清为牛血清或马血清。
所述培养基中还加入有细胞因子。
所述细胞因子为EGF、bFGF或VEGF中的一种或几种组合。
所述EGF、bFGF或VEGF的含量均为1～100ng/ml。
所述二氧化碳培养的条件为37℃、饱和湿度、二氧化碳浓度5％，氧浓度为1％～20％。
所述细胞接种于培养瓶时的密度为(0.1～2)×104/cm2。
本发明的有益效果是：用本发明所提供的培养方法得到的贴壁细胞，由于在最后步骤中将含血清培养基替换为无血清培养基，所以可以在不影响最终培养效果的基础上，有效地降低成品中异种蛋白的含量，若是应用于人类干细胞的培养，则得到的最终产品适合于临床直接使用，不良反应明显少于始终使用含血清培养基培养出的产品。
附图说明
图1是人绒毛膜亚全能干细胞不同培养条件MTT结果；
图2是人绒毛膜亚全能干细胞牛血清白蛋白残留ELISA检测结果；
图3是人骨髓间充质干细胞牛血清白蛋白残留ELISA检测结果；
图4是人脐带血来源细胞牛血清白蛋白残留ELISA检测结果；
图5是不同换液时间人绒毛膜亚全能干细胞制剂牛血清白蛋白残留ELISA检测结果；
图6是大鼠胎盘来源间充质干细胞牛血清白蛋白残留ELISA检测结果。
具体实施方式
下面具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
实施例1
(1)从合格的细胞库取出冻存细胞，在37℃解冻复苏细胞；(2)用含体积比浓度10％(下同)血清的DMEM/F12培养基按2×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90％融合时，用消化酶消化细胞，计数；(3)分别用配制好含10％血清的DMEM/F12培养基和DMEM/F12培养基按合适浓度重悬细胞；(4)分成三组：含10％血清的DMEM/F12培养基组、DMEM/F12培养基组和先用含10％血清的DMEM/F12培养基培养到70％融合后再用DMEM/F12培养基换液组，将各组细胞用96孔板培养，每组6复孔；(5)培养结束前四小时加入10微升MTT，到培养结束用专业人事熟知的MTT方法检测每组OD值，OD值高代表活细胞数高。
结果：无血清培养组OD值最低；换液组OD值略低于含血清组，但P值大于0.05，统计学没有显著差异(图1)
实施例2人绒毛膜亚全能干细胞的扩增和牛血清白蛋白残留检测
(1)从合格的细胞库取出冻存细胞，在37℃解冻复苏细胞；(2)用含体积比浓度10％(下同)血清的DMEM/F12培养基按2×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90％融合时按1∶3传代，经过3次传代；(3)在第三次传代细胞融合度达70％时换完全无血清的DMEM/F12培养液培养12小时，对照组不进行该换液步骤；(4)用消化酶消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在合适环境保存；(5)取部分制剂用专业人事熟知的ELISA方法进行牛血清白蛋白残留物检测。
结果：细胞在换液12小时后达到80-90％融合。制备得到的制剂，牛血清白蛋白残留为6.2ng/1×107细胞对照组37.3ng/1×107细胞(图2)。
实施例3人骨髓间充质干细胞的扩增和牛血清白蛋白残留检测
(1)从合格的细胞库取出冻存细胞，在37℃解冻复苏细胞；(2)用含60％DMEM/F12培养液和40％MCDB-201培养液混合组成，体积比浓度2-10％的血清，10-8M dexamethasone(地塞米松)，0.2-5×ITS，，0.1-10mML-glutamine(L-谷氨酰胺)，1-100ng/ml人表皮细胞生长因子，和1-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子等的培养基按2×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90％融合时按1∶3传代，经过3次传代；(3)在第三次传代细胞融合度达70％时换完全无血清的60％DMEM/F12培养液和40％MCDB-201培养液混合培养基培养24小时，对照组不进行该换液步骤；(4)用消化酶消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在合适环境保存；(5)取部分制剂用专业人事熟知的ELISA方法进行牛血清白蛋白残留物检测。
结果：细胞在换液24小时后达到80-90％融合。制备得到的制剂，牛血清白蛋白残留为2.7ng/1×107细胞，对照组32.7ng/1×107细胞(图3)。
实施例4人脐带血来源内皮祖细胞的扩增和牛血清白蛋白残留检测
(1)从合格的细胞库取出冻存细胞，在37℃解冻复苏细胞；(2)用含20％血清、10ng/ml的VEGF、10U/ml的肝素和4ng/ml的bFGF的M199培养基按2×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90％融合时按1∶3传代，(3)在传代细胞融合度达80％时换完全无血清，含10ng/ml的VEGF、10U/ml的肝素和4ng/ml的bFGF的M199培养液培养24小时，对照组不进行该换液步骤；(4)用消化酶消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在合适环境保存；(5)取部分制剂用专业人事熟知的ELISA方法进行牛血清白蛋白残留物检测。
结果：细胞在换液24小时后达到80-90％融合。制备得到的制剂，牛血清白蛋白残留为8.3ng/1×107细胞，对照组52.8ng/1×107细胞(图4)。
实施例5不同换液时间对人绒毛膜亚全能干细胞制剂牛血清白蛋白残留的影响
(1)从合格的细胞库取出冻存细胞，在37℃解冻复苏细胞；(2)用含体积比浓度10％(下同)血清的DMEM/F12培养基按2×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90％融合时按1∶3传代，经过2次传代；(3)在第2次传代细胞进入对数增长期时，分换液4小时、12小时、24小时及对照组4组，对照组不进行该换液步骤；(4)用消化酶消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在合适环境保存；(5)取部分制剂用专业人事熟知的ELISA方法进行牛血清白蛋白残留物检测。
结果：同时收获细胞，制备得到的制剂；检测牛血清白蛋白残留：4小时、12小时、24小时及对照组分别为24.1ng/1×107细胞、6.9ng/1×107细胞、3.2ng/1×107细胞、35.1ng/1×107细胞(图5)。
实施例6大鼠胎盘来源间充质干细胞的扩增和牛血清白蛋白残留检测
(1)取出冻存的大鼠胎盘来源间充质干细胞，在37℃解冻复苏细胞；(2)用含体积比浓度(下同)10％血清的DMEM/F12培养基按2×104/cm2的密度接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞到80-90％融合时按1∶3传代，经过2次传代；(3)在第2次传代细胞进入对数增长期时，实验组进行换液，对照组不进行该换液步骤；(4)12小时后用消化酶消化细胞，计数，用配制好细胞保护液按合适浓度重悬细胞，分装入无菌容器中，密封后，放置在合适环境保存；(5)取部分制剂用专业人事熟知的ELISA方法进行牛血清白蛋白残留物检测。
结果：细胞在换液12小时后达到80-90％融合。制备得到的制剂，牛血清白蛋白残留为4.7ng/1×107细胞对照组27.7ng/1×107细胞(图6)。
上述实施例中用的是牛血清，用马血清也可以，不再举例。
本发明的方法虽然换液去除了牛血清支持，但对数增长期细胞能大量分泌细胞生长需要的细胞因子，可以保证细胞正常扩增；利用该培养方法这样既保证了细胞能良好扩增细胞，也可以大大减少最终收获细胞中的异源蛋白含量。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。