与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段及其获 得方法 本申请为下述专利申请的分案申请 ： 申请号 ： 200710178022.7 申请日 ： 2007 年 11 月 23 日 发明名称 ： 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段及其获得方法技术领域 本发明涉及与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段及其获得方法， 属 于生物技术领域。
背景技术 甜瓜为葫芦科黄瓜属 (Cucumis melo L.) 一年生蔓生草本植物， 是一种国内外广 泛栽培的重要经济作物。我国已有 3000 多年的甜瓜栽培历史， 是世界上最早栽培甜瓜的国 家之一， 也是目前世界上甜瓜栽培面积最大、 产量最高的国家。
白粉病是危害甜瓜生产的一种世界性病害， 在许多国家和地区都有发生， 严重影 响甜瓜的产量和品质， 甚至会造成绝产， 引起了世界各国的广泛重视。 白粉病主要由瓜单囊 壳菌 (Sphaerotheca fuliginea) 和二孢白粉菌 (Erysiphe cichoracearum) 引起。目前人 们已较深入地对病原菌的致病性、 传播途径、 预防措施等进行了研究， 也为寻找相关抗源基 因做了大量工作， 但白粉病菌的危害还是有不断发展的趋势， 开展抗病品种的选育是解决 这一问题的有效途径。因此， 对瓜类白粉病抗病育种的研究已成为育种工作的主要目标之 一。
传统育种方式费时费力， 需要非常大的群体对白粉病菌的抗性进行严格筛选。利 用与抗病性状紧密连锁的特异标记片段进行品种筛选， 可大大缩短传统育种的研究周期， 加速目标基因的转移。目前， 与抗病性状紧密连锁的特异标记片段的获得主要来源于各种 分子标记技术， 如随机扩增多态性 DNA(RAPD)、 扩增片段长度多态性 (AFLP)、 微卫星 DNA 或 简单重复序列 (SSR)、 特异序列扩增 (SCAR)、 单核苷酸多态性 (SNP) 等。其中， RAPD 和 AFLP 标记技术检测易受环境条件的影响而造成实验结果重现性差， SCAR 和 SNP 标记技术需要利 用已知 DNA 序列设计特异引物进行扩增， 而 SSR 标记技术具有重复性好， 标记稳定可靠， 便 于统计等优点， 是目前实际应用中比较稳定的标记工具， 而且利用 SSR 标记技术获得的特 异片段序列也是开发 SCAR 和 SNP 等其他分子标记的重要基础。因此， 本项研究拟利用 SSR 标记技术寻找与甜瓜白粉病抗性基因紧密连锁的特异标记片段， 这将是今后进行甜瓜白粉 病抗性分子育种的基础， 而由此获得的扩增序列又是开发 SCAR 和 SNP 等特异分子标记的基 础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段，该特异片段可用于甜瓜抗白粉病分子标记辅助育种中。
本发明的另一个目的是提供这种特异片段的获得方法。
为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ：
一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段， 其具有序列表中 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 所述的 DNA 序列。
序列表中 SEQID NO ： 1 为抗病特异扩增片段 SSR509-172 的序列 ；
序列表中 SEQ ID NO ： 2 为抗病特异扩增片段 SSR510-98 的序列 ；
序列表中 SEQ ID NO ： 3 为感病特异扩增片段 SSR509-170 的序列 ；
序列表中 SEQ ID NO ： 4 为感病特异扩增片段 SSR510-104 的序列。
一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 所述方法包 括如下步骤 ：
(1) 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的筛选 ： 提取基因组 DNA， 使用 SSR 引物对基因组 DNA 进行 PCR 反应， 对 PCR 产物进行电泳分析 ； 通过 BSA 法， 寻找与 甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异 SSR 片段， 测定连锁距离并验证连锁关系 ；
(2) 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异扩增序列的获得 ： 对 SSR 产物 进行回收、 克隆和测序， 获得特异片段序列。 上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 所述 步骤 (1) 中 SSR 引物为 SSR 引物 509 和 SSR 引物 510 ；
所述 SSR 引物 509 上游引物序列为 ： 5’ -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’ ， 509 下游引物 序列为 5’ -CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’ 。
所述 SSR 引物 510 上游引物序列为 ： 5’ -TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’ ， 510 下游引物序 列为 5’ -AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’ 。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 其 中， 所述步骤 (1) 中的提取基因组 DNA 是指将 1.5 克叶片在液氮中研磨成粉末， 加入 9ml 2％ CTAB 提取液， 混匀 65℃水浴 1 小时 ； 从水浴中取出离心管， 加 1/3 体积 5M 醋酸钾， 混匀 冰浴 20 分钟 ； 加入等体积氯仿 / 异戊醇抽提两次 ； 取上清加入 2/3 体积异丙醇沉淀 DNA ； 洗 涤缓冲液洗涤一次， 吹干， 加 TE 缓冲液溶解 ； 加入 RNase A 使其终浓度达 100μg/ml， 混匀 37℃水浴 1 小时 ； 用等体积氯仿 / 异戊醇抽提 ； 取上清， 加入 1/2 体积 7.5M 醋酸铵和 2 倍体 积无水乙醇沉淀 DNA ； 70％乙醇洗涤沉淀， 吹干， 加适量 ddH2O 溶解 DNA。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 其 中， 所述步骤 (1) 中的 PCR 反应条件是 ： 25μl 的反应体系中含有 2.5μl 10×buffer， 2.0μl 25mM MgCl2， 2.0μl 2.5mM dNTP， 1U TaqDNA 聚合酶， 30ng SSR 引物， 50ng 模板 DNA ； 反应程序为， 94℃预变性 5min， 然后 94℃ 1min， 52℃ 1min， 72℃ 2min 下循环 35 次， 72℃延 伸 7min 后保存在 4℃条件下。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 其 中， 所述步骤 (2) 中的 SSR 产物的回收、 克隆和测序是指用 Gene-Clean 试剂盒纯化回收已 证明是连锁的 SSR 特异片段， 然后连接到 pGEM@-T Vector Easy 载体上， 将重组质粒 DNA 用 EcoRI 进行酶切处理， 用 SSR-PCR 验证扩增产物， 观察扩增出的片段是否与原来的目的片段 和酶切片段一致， 并测序。
本发明应用简单重复序列 (Simple Sequence Repeat， SSR) 技术， 在甜瓜重组自 交系 (Recombinant Inbred Line， RIL) 群体中采用混合分组分析法 (Bulked Segregating Analysis， BSA) 筛选了与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的 SSR 特异片段， 并将 SSR 特 异片段克隆测序获得了特异扩增序列。
本发明的优点是 ： 本发明获得的 SSR 特异片段具有重复性好， 标记稳定可靠， 便于 统计等优点， 其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明， 以使公众对发明内容有整 体和充分的了解， 而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以 实施的保护范围， 因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换， 均属于 对本发明的侵犯。 附图说明
图 1 为引物 SSR509 和 510 对抗感亲本、 F1、 抗感池 DNA 扩增结果图 ； 图 2 为引物 SSR509 对重组自交系群体的 PCR 扩增结果图 ； 图 3 为引物 SSR510 对重组自交系群体的 PCR 扩增结果图 ； 图 4 为引物 SSR509 对甜瓜种质资源的 PCR 扩增结果图 ； 图 5 为引物 SSR510 对甜瓜种质资源的 PCR 扩增结果图。具体实施方式
实施例与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段及其扩增序列的获得
一、 材料和方法 ：
1.1 材料
供试材料亲本为日本类型甜瓜材料 K7-1 和典型的新疆哈密瓜株系 K7-2。两材料 均由新疆农科院吴明珠院士提供。父本 K7-1 为日本高抗白粉病材料， 母本 K7-2 高感白粉 病， 为典型的新疆哈密瓜， 果实糖度高， 肉质脆， 货架期长， 有特殊的芳香味。以二者为亲本 进行杂交， 从它们的杂交后代 F2 材料中随机抽样自交， 通过单粒传获得 F8 重组自交系构成 RIL 群体， 共 106 个株系， 用于特异片段及序列研究。
为进一步验证获得的标记， 还采用了本实验室特有的 120 份优良甜瓜种质资源， 其中 13 份抗病种质资源， 107 份感病种质资源。
1.2 研究方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取
参照 Murry 等 (1980) 的方法 (Murray M， Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res， 1980， 8： 668-673.) 加以改进后进行 DNA 提取。
将 1.5 克叶片在液氮中研磨成粉末， 加入 9ml 2％ CTAB 提取液 (2％ CTAB， 1.4mM NaCl， 100mM Tris-HCl pH8.0， 20mM EDTA pH8.0， 1％ PVP-40， 0.2％ β- 巯基乙醇 )， 混匀 65℃水浴 1 小时 ； 从水浴中取出离心管， 加 1/3 体积 5M 醋酸钾， 混匀， 冰浴 20 分钟 ； 加入等 体积氯仿 / 异戊醇 (24 ∶ 1) 抽提两次 ； 取上清加入 2/3 体积异丙醇沉淀 DNA ； 洗涤缓冲液 (76％乙醇， 10mM 乙酸铵 ) 洗涤一次， 吹干， 加 TE 缓冲液 (10mM Tri s-HCl， 1mM EDTA， pH7.4)溶解 ； 加入 RNase A 使其终浓度达 100μg/ml， 混匀 37℃水浴 1 小时 ； 用等体积氯仿 / 异戊 醇 (24 ∶ 1) 抽提 ； 取上清， 加入 1/2 体积 7.5M 醋酸铵和 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA ； 70％ 乙醇洗涤沉淀， 吹干， 加适量 ddH2O 溶解 DNA。
DNA 浓度用紫外分光光度计 (Shimadzu UV-1201， 日本 ) 以 OD260 值测定， 并用 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量。
1.2.2PCR 扩增与产物的检测
25μl 的反应体系中含有 2.5μl 10×buffer， 2.0μl 25mM MgCl2， 2.0μl 2.5mM dNTP， 1U Taq DNA 聚合酶， 30ng 引物， 50ng 模板 DNA。Taq DNA 聚合酶及反应缓冲液购自 TaKaRa 公司。dNTP 购自上海 Sangon 公司。SSR 引物由北京奥科生物公司合成。
反应程序为， 94℃预变性 5min， 然后 94℃ 1min， 52℃ 1min， 72℃ 2min 下循环 35 次， 72℃延伸 7min 后保存在 4℃条件下。PCR 仪为美国 Biorad 公司制造的 PTC-100。
取扩增产物与载样缓冲液 (98％甲酰胺， 10mM EDTA， 0.25％溴酚兰， 0.25％二甲苯 青 ) 各 5μl 混合， 94℃变性 5min， 立即置于冰上冷却。每个样品取 5μl 上样， 采用 6％聚 丙烯酰胺凝胶、 75W 恒功率电泳分离， 至二甲苯青指示剂跑到胶的 2/3 处结束电泳。银染显 现结果并分析。 1.2.3 特异扩增 PCR 产物与白粉病抗性基因的连锁关系
银染显现 PCR 扩增产物后， 对电泳谱带进行分析。来自父本 K7-1 的纯合带型记为 “a” ， 来自母本 K7-2 的纯合带型记为 “b” ， 模糊不清或者丢失的带记为 “-” 。 利用 Joinmap3.0 软件分析特异扩增 PCR 产物与白粉病抗性基因的连锁关系。
1.2.4 特异扩增序列的获得
确定 PCR 扩增产物与白粉病抗性基因存在紧密连锁关系后， 用 ddH2O 将胶板冲 洗干净， 用刀片切取差异条带， 浸泡在高盐缓冲液中 (20％乙醇， 1M LiCl， 10mM Tris)24h， 然后氯仿抽提， 乙醇沉淀后吹干， 溶于 ddH2O 中， 取 5μl 用作模板在与选择性扩增相同的 PCR 条件下重新扩增。产物在 1.5％的琼脂糖上检测， 如果确定为目标带， 采用博奥生物公 司的凝胶回收纯化试剂盒 Gene-Clean 对目的片段进行纯化。PCR 产物与载体的连接采用 Promega 公司的 PGEM-T easy Vector 系统。参照 《分子克隆实验指南》 中的方法进行重组 质粒的转化与筛选。利用天根生物公司的质粒小提试剂盒提取重组质粒， 采用酶切方法与 PCR 法对其进行检测。将经过 PCR 和酶切检测为阳性克隆的质粒送于北京奥科生物公司进 行测序并提供结果。
1.2.5 父本、 母本、 F1 和重组自交系苗期抗病接种鉴定
1.2.5.1 白粉病菌源及接种菌源制备
从国家蔬菜工程技术研究中心四季青农场收集南瓜上的白粉病菌， 采用孢子悬浮 液喷雾法接种于西葫芦幼苗上纯化繁殖后， 用于白粉病的接种鉴定。
用毛笔刷取西葫芦病叶叶片上的孢子置于无菌水的烧杯中， 搅拌均匀配制孢子悬 5 浮液， 血球计数板计数分生孢子数。接种浓度为 2.0×10 个孢子 /mL。
1.2.5.2 苗期抗病接种鉴定
父本、 母本、 F1 和重组自交系 F8 的 106 个株系， 各取 20 粒种子， 设 2 次重复， 1次 重复 10 株苗。种子用纱布包好， 55℃温汤浸种消毒后， 再浸泡 4h， 置于 28℃恒温培养箱中 催芽 18 小时， 播于装有灭菌营养土的 72 孔穴盘中， 生长于空调温室内， 昼 / 夜温度为 25 ～
28℃ /18 ～ 20℃。子叶展平后， 采用孢子粉喷雾法接种 S.fuliginea 小种 2F， 接种 12 至 15 天充分发病后开始调查抗感反应。
1.2.5.3 苗期抗病接种鉴定的分级标准
共分 6 级。0 级 ： 整株没有任何病斑 ； 1级： 仅子叶有很少量病斑 ； 2级： 仅子叶有 较多病斑或子叶有病斑， 茎上有很少量病斑 ； 3级 ： 子叶有很多病斑， 茎上有少量病斑 ； 4级 ： 子叶和茎上布满病斑 ； 5级： 植株死亡。
1.2.5.4 父本、 母本、 F1 和重组自交系苗期抗感表现型的确定标准
根据病情指数 DI 确定父本、 母本、 F1 和重组自交系的抗感表现型。
病情指数 DI ＝ ( ∑级别 × 株数 )×100/( 总株数 ×6)。
病情指数大于 40 定为感病， 小于 40 定为抗病。
二、 结果与分析
2.1 甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 遗传规律分析
对抗病亲本 K7-1、 感病亲本 K7-2、 F1、 重组自交系 F8 的 106 个株系进行苗期抗病 接种鉴定， 按照白粉病病情分级标准调查每个株系的发病率并计算病情指数。结果表明， K7-1、 K7-2 和 F1 的病情指数分别是 0.00、 93.03 和 3.44， 分别表现为抗病、 感病、 抗病， 说明 甜瓜 K7-1 对白粉病 S.fuliginea 生理小种 2F 的抗性是由显性基因控制。而重组自交系的 抗病鉴定结果表明 106 个株系有 58 个抗病株系和 48 个感病株系， 分离比符合 1 ∶ 1 的理 2 2 论比例， 卡平方检验 χ ＝ 0.94 ＜ α 0.05， 表明甜瓜 K7-1 对白粉病 S.fuliginea 1 ＝ 3.84， 生理小种 2F 的抗性为一对基因控制。综合双亲、 F1 和重组自交系的 106 个株系的苗期抗病 鉴定结果， 甜瓜 K7-1 对白粉病 S.fuliginea 生理小种 2F 的抗性受一对显性基因 Pm-2F 控 制。
2.2 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段
采用集团混合分析法获得与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段。
根据重组自交系苗期抗病鉴定结果， 各取 5 份纯合的抗感株系 DNA 混合构建抗感 基因池。 以抗病亲本 K7-1、 感病亲本 K7-2、 F1 和抗感基因池为模板， 对 660 对 SSR 引物组合进 行 PCR 扩增， 筛选出能在双亲和抗感基因池之间产生明显差异条带的引物组合。660 对 SSR 引物序列来自于目前已经发表的论文 (Danin-Poleg-2001， Genzalo et al.2005， Joobeur T et al， 2004， Fazio et al.2002) 和根据互连网中甜瓜 EST 信息库 (http://melon.bti. cornell.edu) 自行设计。
集团混合分析结果显示， 660 对 SSR 引物中只有引物 SSR509 和 SSR510 的抗感亲 本扩增条带与抗感池的扩增谱带一致， 如图 1 所示， 图 1 为引物 SSR509 和 SSR510 对抗感亲 本、 F1、 抗感池的 PCR 扩增结果。 (M.30-330bpmarker ； 1， 6.K7-2 ； 2， 7.K7-1 ； 3， 8.F1 ； 4， 9. 抗 病基因池 ； 5， 10. 感病基因池 )
所述 SSR 引物 509 上游引物序列为 ： 5’ -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’ ， 509 下游引物 序列为 5’ -CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’ 。
所述 SSR 引物 510 上游引物序列为 ： 5’ -TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’ ， 510 下游引物序 列为 5’ -AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’ 。
将抗病亲本 K7-1 利用引物 SSR509 和 SSR510 进行 PCR 扩增获得的抗病特异扩增 片段分别定名为 SSR509-172 和 SSR510-98。将感病亲本 K7-2 利用引物 SSR509 和 SSR510进行 PCR 扩增获得的感病特异扩增片段分别定名为 SSR509-170 和 SSR510-104。
利用引物 SSR509 和 SSR510 分别对 106 个重组自交系的株系进行 PCR 扩增。
引物 SSR509 的 PCR 扩增中， 如图 2 所示， 图 2 为引物 SSR509 对重组自交系群体 的 PCR 扩增结果图 (1 ： K7-1 ； 2： K7-2 ； 3-57 ： RTL 株系 )。58 个抗病株系中有 56 个株系只 扩增出 SSR509-172 抗病特异片段， 2 个抗病株系同时扩增出 SSR509-172 抗病特异片段和 SSR509-170 感病特异片段， F7 和 F8 两代苗期抗病接种鉴定结果显示这 2 个抗病株系为杂 合株系， 因此 PCR 扩增结果与田间抗病鉴定结果一致。 48 个感病株系中有 47 个株系只扩增 出 SSR509-170 感病特异片段， 1 个株系扩增出 SSR509-172 抗病特异片段， 即 106 个重组自 交系株系中只有 1 个交换株系。经 Joinmap3.0 软件分析， 抗病特异片段 SSR509-172 与甜 瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的连锁距离为 1cm， 呈现紧密连锁关系。
引物 SSR510 扩增中， 如图 3 所示， 图 3 引物 SSR510 对重组自交系群体的 PCR 扩 增结果图 (1 ： K7-1 ； 2： K7-2 ； 3-50 ： RIL 株系 ； )。58 个抗病株系中有 55 个株系只扩增出 SSR510-98 抗病特异片段， 2 个抗病株系同时扩增出 SSR510-98 抗病特异片段和 SSR510-104 感病特异片段， F7 和 F8 两代苗期抗病接种鉴定结果显示这 2 个抗病株系为杂合株系， 1 个抗 病株系只扩增出 SSR510-104 感病特异片段， 表明该抗病株系为交换株系。48 个感病株系 中有 47 个株系只扩增出 SSR510-104 感病特异片段， 1 个感病株系扩增出 SSR510-98 抗病 特异片段， 说明此感病株系也为交换株系。因此， 106 个重组自交系株系中共有 2 个交换株 系。经 Joinmap3.0 软件分析， 抗病特异片段 SSR510-98 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的连 锁距离为 3cM， 呈现紧密连锁关系。
为进一步确认抗病特异片段 SSR509-172、 SSR510-98 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的连锁关系， 利用本实验室的 120 份优良甜瓜种质资源材料进行验证。 田间抗病鉴定 结果显示 120 份甜瓜种质资源材料中有 13 个抗病品种和 107 个感病品种。
SSR509 的 PCR 扩增结果显示， 如图 4 所示， 图 4 为引物 SSR 509 对甜瓜种质资源的 PCR 扩增结果图 ； 13 个抗病品种中有 4 个品种扩增出 SSR509-172 抗病特异片段， 其余品种 扩增出的谱带在另一位置 ； 107 个感病品种中有 101 个扩增出 SSR509-170 感病特异片段， 与田间抗病鉴定结果吻合率为 87.5％。
SSR510 扩增结果显示， 如图 5 所示， 图 5 为引物 SSR 510 对甜瓜种质资源的 PCR 扩 增结果图 ； 13 个抗病品种中有 4 个品种扩增出 SSR510-98 抗病特异片段， 107 个感病品种中 有 83 个扩增出 SSR510-104 感病特异片段， 与田间调查结果的吻合率达到 72.5％。
上述 PCR 扩增结果进一步证实了抗病特异片段 SSR509-172 和 SSR510-98、 感病特 异片段 SSR509-170 和 SSR510-104 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的紧密连锁关系， 准确性 高， 说明上述标记片段在鉴别抗、 感病品种时有非常高的利用价值。
2.4 特异片段的测序结果
本申请为下述专利申请的分案申请 ： 申请号 ： 200710178022.7 申请日 ： 2007 年 11 月 23 日 发明名称 ： 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段及其获得方法技术领域 本发明涉及与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段及其获得方法， 属 于生物技术领域。
背景技术 甜瓜为葫芦科黄瓜属 (Cucumis melo L.) 一年生蔓生草本植物， 是一种国内外广 泛栽培的重要经济作物。我国已有 3000 多年的甜瓜栽培历史， 是世界上最早栽培甜瓜的国 家之一， 也是目前世界上甜瓜栽培面积最大、 产量最高的国家。
白粉病是危害甜瓜生产的一种世界性病害， 在许多国家和地区都有发生， 严重影 响甜瓜的产量和品质， 甚至会造成绝产， 引起了世界各国的广泛重视。 白粉病主要由瓜单囊 壳菌 (Sphaerotheca fuliginea) 和二孢白粉菌 (Erysiphe cichoracearum) 引起。目前人 们已较深入地对病原菌的致病性、 传播途径、 预防措施等进行了研究， 也为寻找相关抗源基 因做了大量工作， 但白粉病菌的危害还是有不断发展的趋势， 开展抗病品种的选育是解决 这一问题的有效途径。因此， 对瓜类白粉病抗病育种的研究已成为育种工作的主要目标之 一。
传统育种方式费时费力， 需要非常大的群体对白粉病菌的抗性进行严格筛选。利 用与抗病性状紧密连锁的特异标记片段进行品种筛选， 可大大缩短传统育种的研究周期， 加速目标基因的转移。目前， 与抗病性状紧密连锁的特异标记片段的获得主要来源于各种 分子标记技术， 如随机扩增多态性 DNA(RAPD)、 扩增片段长度多态性 (AFLP)、 微卫星 DNA 或 简单重复序列 (SSR)、 特异序列扩增 (SCAR)、 单核苷酸多态性 (SNP) 等。其中， RAPD 和 AFLP 标记技术检测易受环境条件的影响而造成实验结果重现性差， SCAR 和 SNP 标记技术需要利 用已知 DNA 序列设计特异引物进行扩增， 而 SSR 标记技术具有重复性好， 标记稳定可靠， 便 于统计等优点， 是目前实际应用中比较稳定的标记工具， 而且利用 SSR 标记技术获得的特 异片段序列也是开发 SCAR 和 SNP 等其他分子标记的重要基础。因此， 本项研究拟利用 SSR 标记技术寻找与甜瓜白粉病抗性基因紧密连锁的特异标记片段， 这将是今后进行甜瓜白粉 病抗性分子育种的基础， 而由此获得的扩增序列又是开发 SCAR 和 SNP 等特异分子标记的基 础。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段，该特异片段可用于甜瓜抗白粉病分子标记辅助育种中。
本发明的另一个目的是提供这种特异片段的获得方法。
为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案 ：
一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段， 其具有序列表中 SEQ ID NO ： 1 ～ 4 所述的 DNA 序列。
序列表中 SEQID NO ： 1 为抗病特异扩增片段 SSR509-172 的序列 ；
序列表中 SEQ ID NO ： 2 为抗病特异扩增片段 SSR510-98 的序列 ；
序列表中 SEQ ID NO ： 3 为感病特异扩增片段 SSR509-170 的序列 ；
序列表中 SEQ ID NO ： 4 为感病特异扩增片段 SSR510-104 的序列。
一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 所述方法包 括如下步骤 ：
(1) 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的筛选 ： 提取基因组 DNA， 使用 SSR 引物对基因组 DNA 进行 PCR 反应， 对 PCR 产物进行电泳分析 ； 通过 BSA 法， 寻找与 甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异 SSR 片段， 测定连锁距离并验证连锁关系 ；
(2) 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异扩增序列的获得 ： 对 SSR 产物 进行回收、 克隆和测序， 获得特异片段序列。 上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 所述 步骤 (1) 中 SSR 引物为 SSR 引物 509 和 SSR 引物 510 ；
所述 SSR 引物 509 上游引物序列为 ： 5’ -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’ ， 509 下游引物 序列为 5’ -CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’ 。
所述 SSR 引物 510 上游引物序列为 ： 5’ -TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’ ， 510 下游引物序 列为 5’ -AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’ 。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 其 中， 所述步骤 (1) 中的提取基因组 DNA 是指将 1.5 克叶片在液氮中研磨成粉末， 加入 9ml 2％ CTAB 提取液， 混匀 65℃水浴 1 小时 ； 从水浴中取出离心管， 加 1/3 体积 5M 醋酸钾， 混匀 冰浴 20 分钟 ； 加入等体积氯仿 / 异戊醇抽提两次 ； 取上清加入 2/3 体积异丙醇沉淀 DNA ； 洗 涤缓冲液洗涤一次， 吹干， 加 TE 缓冲液溶解 ； 加入 RNase A 使其终浓度达 100μg/ml， 混匀 37℃水浴 1 小时 ； 用等体积氯仿 / 异戊醇抽提 ； 取上清， 加入 1/2 体积 7.5M 醋酸铵和 2 倍体 积无水乙醇沉淀 DNA ； 70％乙醇洗涤沉淀， 吹干， 加适量 ddH2O 溶解 DNA。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 其 中， 所述步骤 (1) 中的 PCR 反应条件是 ： 25μl 的反应体系中含有 2.5μl 10×buffer， 2.0μl 25mM MgCl2， 2.0μl 2.5mM dNTP， 1U TaqDNA 聚合酶， 30ng SSR 引物， 50ng 模板 DNA ； 反应程序为， 94℃预变性 5min， 然后 94℃ 1min， 52℃ 1min， 72℃ 2min 下循环 35 次， 72℃延 伸 7min 后保存在 4℃条件下。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段的获得方法， 其 中， 所述步骤 (2) 中的 SSR 产物的回收、 克隆和测序是指用 Gene-Clean 试剂盒纯化回收已 证明是连锁的 SSR 特异片段， 然后连接到 pGEM@-T Vector Easy 载体上， 将重组质粒 DNA 用 EcoRI 进行酶切处理， 用 SSR-PCR 验证扩增产物， 观察扩增出的片段是否与原来的目的片段 和酶切片段一致， 并测序。
本发明应用简单重复序列 (Simple Sequence Repeat， SSR) 技术， 在甜瓜重组自 交系 (Recombinant Inbred Line， RIL) 群体中采用混合分组分析法 (Bulked Segregating Analysis， BSA) 筛选了与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的 SSR 特异片段， 并将 SSR 特 异片段克隆测序获得了特异扩增序列。
本发明的优点是 ： 本发明获得的 SSR 特异片段具有重复性好， 标记稳定可靠， 便于 统计等优点， 其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明， 以使公众对发明内容有整 体和充分的了解， 而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以 实施的保护范围， 因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换， 均属于 对本发明的侵犯。 附图说明
图 1 为引物 SSR509 和 510 对抗感亲本、 F1、 抗感池 DNA 扩增结果图 ； 图 2 为引物 SSR509 对重组自交系群体的 PCR 扩增结果图 ； 图 3 为引物 SSR510 对重组自交系群体的 PCR 扩增结果图 ； 图 4 为引物 SSR509 对甜瓜种质资源的 PCR 扩增结果图 ； 图 5 为引物 SSR510 对甜瓜种质资源的 PCR 扩增结果图。具体实施方式
实施例与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段及其扩增序列的获得
一、 材料和方法 ：
1.1 材料
供试材料亲本为日本类型甜瓜材料 K7-1 和典型的新疆哈密瓜株系 K7-2。两材料 均由新疆农科院吴明珠院士提供。父本 K7-1 为日本高抗白粉病材料， 母本 K7-2 高感白粉 病， 为典型的新疆哈密瓜， 果实糖度高， 肉质脆， 货架期长， 有特殊的芳香味。以二者为亲本 进行杂交， 从它们的杂交后代 F2 材料中随机抽样自交， 通过单粒传获得 F8 重组自交系构成 RIL 群体， 共 106 个株系， 用于特异片段及序列研究。
为进一步验证获得的标记， 还采用了本实验室特有的 120 份优良甜瓜种质资源， 其中 13 份抗病种质资源， 107 份感病种质资源。
1.2 研究方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取
参照 Murry 等 (1980) 的方法 (Murray M， Thompson W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res， 1980， 8： 668-673.) 加以改进后进行 DNA 提取。
将 1.5 克叶片在液氮中研磨成粉末， 加入 9ml 2％ CTAB 提取液 (2％ CTAB， 1.4mM NaCl， 100mM Tris-HCl pH8.0， 20mM EDTA pH8.0， 1％ PVP-40， 0.2％ β- 巯基乙醇 )， 混匀 65℃水浴 1 小时 ； 从水浴中取出离心管， 加 1/3 体积 5M 醋酸钾， 混匀， 冰浴 20 分钟 ； 加入等 体积氯仿 / 异戊醇 (24 ∶ 1) 抽提两次 ； 取上清加入 2/3 体积异丙醇沉淀 DNA ； 洗涤缓冲液 (76％乙醇， 10mM 乙酸铵 ) 洗涤一次， 吹干， 加 TE 缓冲液 (10mM Tri s-HCl， 1mM EDTA， pH7.4)溶解 ； 加入 RNase A 使其终浓度达 100μg/ml， 混匀 37℃水浴 1 小时 ； 用等体积氯仿 / 异戊 醇 (24 ∶ 1) 抽提 ； 取上清， 加入 1/2 体积 7.5M 醋酸铵和 2 倍体积无水乙醇沉淀 DNA ； 70％ 乙醇洗涤沉淀， 吹干， 加适量 ddH2O 溶解 DNA。
DNA 浓度用紫外分光光度计 (Shimadzu UV-1201， 日本 ) 以 OD260 值测定， 并用 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取质量。
1.2.2PCR 扩增与产物的检测
25μl 的反应体系中含有 2.5μl 10×buffer， 2.0μl 25mM MgCl2， 2.0μl 2.5mM dNTP， 1U Taq DNA 聚合酶， 30ng 引物， 50ng 模板 DNA。Taq DNA 聚合酶及反应缓冲液购自 TaKaRa 公司。dNTP 购自上海 Sangon 公司。SSR 引物由北京奥科生物公司合成。
反应程序为， 94℃预变性 5min， 然后 94℃ 1min， 52℃ 1min， 72℃ 2min 下循环 35 次， 72℃延伸 7min 后保存在 4℃条件下。PCR 仪为美国 Biorad 公司制造的 PTC-100。
取扩增产物与载样缓冲液 (98％甲酰胺， 10mM EDTA， 0.25％溴酚兰， 0.25％二甲苯 青 ) 各 5μl 混合， 94℃变性 5min， 立即置于冰上冷却。每个样品取 5μl 上样， 采用 6％聚 丙烯酰胺凝胶、 75W 恒功率电泳分离， 至二甲苯青指示剂跑到胶的 2/3 处结束电泳。银染显 现结果并分析。 1.2.3 特异扩增 PCR 产物与白粉病抗性基因的连锁关系
银染显现 PCR 扩增产物后， 对电泳谱带进行分析。来自父本 K7-1 的纯合带型记为 “a” ， 来自母本 K7-2 的纯合带型记为 “b” ， 模糊不清或者丢失的带记为 “-” 。 利用 Joinmap3.0 软件分析特异扩增 PCR 产物与白粉病抗性基因的连锁关系。
1.2.4 特异扩增序列的获得
确定 PCR 扩增产物与白粉病抗性基因存在紧密连锁关系后， 用 ddH2O 将胶板冲 洗干净， 用刀片切取差异条带， 浸泡在高盐缓冲液中 (20％乙醇， 1M LiCl， 10mM Tris)24h， 然后氯仿抽提， 乙醇沉淀后吹干， 溶于 ddH2O 中， 取 5μl 用作模板在与选择性扩增相同的 PCR 条件下重新扩增。产物在 1.5％的琼脂糖上检测， 如果确定为目标带， 采用博奥生物公 司的凝胶回收纯化试剂盒 Gene-Clean 对目的片段进行纯化。PCR 产物与载体的连接采用 Promega 公司的 PGEM-T easy Vector 系统。参照 《分子克隆实验指南》 中的方法进行重组 质粒的转化与筛选。利用天根生物公司的质粒小提试剂盒提取重组质粒， 采用酶切方法与 PCR 法对其进行检测。将经过 PCR 和酶切检测为阳性克隆的质粒送于北京奥科生物公司进 行测序并提供结果。
1.2.5 父本、 母本、 F1 和重组自交系苗期抗病接种鉴定
1.2.5.1 白粉病菌源及接种菌源制备
从国家蔬菜工程技术研究中心四季青农场收集南瓜上的白粉病菌， 采用孢子悬浮 液喷雾法接种于西葫芦幼苗上纯化繁殖后， 用于白粉病的接种鉴定。
用毛笔刷取西葫芦病叶叶片上的孢子置于无菌水的烧杯中， 搅拌均匀配制孢子悬 5 浮液， 血球计数板计数分生孢子数。接种浓度为 2.0×10 个孢子 /mL。
1.2.5.2 苗期抗病接种鉴定
父本、 母本、 F1 和重组自交系 F8 的 106 个株系， 各取 20 粒种子， 设 2 次重复， 1次 重复 10 株苗。种子用纱布包好， 55℃温汤浸种消毒后， 再浸泡 4h， 置于 28℃恒温培养箱中 催芽 18 小时， 播于装有灭菌营养土的 72 孔穴盘中， 生长于空调温室内， 昼 / 夜温度为 25 ～
28℃ /18 ～ 20℃。子叶展平后， 采用孢子粉喷雾法接种 S.fuliginea 小种 2F， 接种 12 至 15 天充分发病后开始调查抗感反应。
1.2.5.3 苗期抗病接种鉴定的分级标准
共分 6 级。0 级 ： 整株没有任何病斑 ； 1级： 仅子叶有很少量病斑 ； 2级： 仅子叶有 较多病斑或子叶有病斑， 茎上有很少量病斑 ； 3级 ： 子叶有很多病斑， 茎上有少量病斑 ； 4级 ： 子叶和茎上布满病斑 ； 5级： 植株死亡。
1.2.5.4 父本、 母本、 F1 和重组自交系苗期抗感表现型的确定标准
根据病情指数 DI 确定父本、 母本、 F1 和重组自交系的抗感表现型。
病情指数 DI ＝ ( ∑级别 × 株数 )×100/( 总株数 ×6)。
病情指数大于 40 定为感病， 小于 40 定为抗病。
二、 结果与分析
2.1 甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 遗传规律分析
对抗病亲本 K7-1、 感病亲本 K7-2、 F1、 重组自交系 F8 的 106 个株系进行苗期抗病 接种鉴定， 按照白粉病病情分级标准调查每个株系的发病率并计算病情指数。结果表明， K7-1、 K7-2 和 F1 的病情指数分别是 0.00、 93.03 和 3.44， 分别表现为抗病、 感病、 抗病， 说明 甜瓜 K7-1 对白粉病 S.fuliginea 生理小种 2F 的抗性是由显性基因控制。而重组自交系的 抗病鉴定结果表明 106 个株系有 58 个抗病株系和 48 个感病株系， 分离比符合 1 ∶ 1 的理 2 2 论比例， 卡平方检验 χ ＝ 0.94 ＜ α 0.05， 表明甜瓜 K7-1 对白粉病 S.fuliginea 1 ＝ 3.84， 生理小种 2F 的抗性为一对基因控制。综合双亲、 F1 和重组自交系的 106 个株系的苗期抗病 鉴定结果， 甜瓜 K7-1 对白粉病 S.fuliginea 生理小种 2F 的抗性受一对显性基因 Pm-2F 控 制。
2.2 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段
采用集团混合分析法获得与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 紧密连锁的特异片段。
根据重组自交系苗期抗病鉴定结果， 各取 5 份纯合的抗感株系 DNA 混合构建抗感 基因池。 以抗病亲本 K7-1、 感病亲本 K7-2、 F1 和抗感基因池为模板， 对 660 对 SSR 引物组合进 行 PCR 扩增， 筛选出能在双亲和抗感基因池之间产生明显差异条带的引物组合。660 对 SSR 引物序列来自于目前已经发表的论文 (Danin-Poleg-2001， Genzalo et al.2005， Joobeur T et al， 2004， Fazio et al.2002) 和根据互连网中甜瓜 EST 信息库 (http://melon.bti. cornell.edu) 自行设计。
集团混合分析结果显示， 660 对 SSR 引物中只有引物 SSR509 和 SSR510 的抗感亲 本扩增条带与抗感池的扩增谱带一致， 如图 1 所示， 图 1 为引物 SSR509 和 SSR510 对抗感亲 本、 F1、 抗感池的 PCR 扩增结果。 (M.30-330bpmarker ； 1， 6.K7-2 ； 2， 7.K7-1 ； 3， 8.F1 ； 4， 9. 抗 病基因池 ； 5， 10. 感病基因池 )
所述 SSR 引物 509 上游引物序列为 ： 5’ -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’ ， 509 下游引物 序列为 5’ -CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’ 。
所述 SSR 引物 510 上游引物序列为 ： 5’ -TTTCACTTTTTCCCGCCG-3’ ， 510 下游引物序 列为 5’ -AATGGAAAAGGGAAGTGCAA-3’ 。
将抗病亲本 K7-1 利用引物 SSR509 和 SSR510 进行 PCR 扩增获得的抗病特异扩增 片段分别定名为 SSR509-172 和 SSR510-98。将感病亲本 K7-2 利用引物 SSR509 和 SSR510进行 PCR 扩增获得的感病特异扩增片段分别定名为 SSR509-170 和 SSR510-104。
利用引物 SSR509 和 SSR510 分别对 106 个重组自交系的株系进行 PCR 扩增。
引物 SSR509 的 PCR 扩增中， 如图 2 所示， 图 2 为引物 SSR509 对重组自交系群体 的 PCR 扩增结果图 (1 ： K7-1 ； 2： K7-2 ； 3-57 ： RTL 株系 )。58 个抗病株系中有 56 个株系只 扩增出 SSR509-172 抗病特异片段， 2 个抗病株系同时扩增出 SSR509-172 抗病特异片段和 SSR509-170 感病特异片段， F7 和 F8 两代苗期抗病接种鉴定结果显示这 2 个抗病株系为杂 合株系， 因此 PCR 扩增结果与田间抗病鉴定结果一致。 48 个感病株系中有 47 个株系只扩增 出 SSR509-170 感病特异片段， 1 个株系扩增出 SSR509-172 抗病特异片段， 即 106 个重组自 交系株系中只有 1 个交换株系。经 Joinmap3.0 软件分析， 抗病特异片段 SSR509-172 与甜 瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的连锁距离为 1cm， 呈现紧密连锁关系。
引物 SSR510 扩增中， 如图 3 所示， 图 3 引物 SSR510 对重组自交系群体的 PCR 扩 增结果图 (1 ： K7-1 ； 2： K7-2 ； 3-50 ： RIL 株系 ； )。58 个抗病株系中有 55 个株系只扩增出 SSR510-98 抗病特异片段， 2 个抗病株系同时扩增出 SSR510-98 抗病特异片段和 SSR510-104 感病特异片段， F7 和 F8 两代苗期抗病接种鉴定结果显示这 2 个抗病株系为杂合株系， 1 个抗 病株系只扩增出 SSR510-104 感病特异片段， 表明该抗病株系为交换株系。48 个感病株系 中有 47 个株系只扩增出 SSR510-104 感病特异片段， 1 个感病株系扩增出 SSR510-98 抗病 特异片段， 说明此感病株系也为交换株系。因此， 106 个重组自交系株系中共有 2 个交换株 系。经 Joinmap3.0 软件分析， 抗病特异片段 SSR510-98 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的连 锁距离为 3cM， 呈现紧密连锁关系。
为进一步确认抗病特异片段 SSR509-172、 SSR510-98 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的连锁关系， 利用本实验室的 120 份优良甜瓜种质资源材料进行验证。 田间抗病鉴定 结果显示 120 份甜瓜种质资源材料中有 13 个抗病品种和 107 个感病品种。
SSR509 的 PCR 扩增结果显示， 如图 4 所示， 图 4 为引物 SSR 509 对甜瓜种质资源的 PCR 扩增结果图 ； 13 个抗病品种中有 4 个品种扩增出 SSR509-172 抗病特异片段， 其余品种 扩增出的谱带在另一位置 ； 107 个感病品种中有 101 个扩增出 SSR509-170 感病特异片段， 与田间抗病鉴定结果吻合率为 87.5％。
SSR510 扩增结果显示， 如图 5 所示， 图 5 为引物 SSR 510 对甜瓜种质资源的 PCR 扩 增结果图 ； 13 个抗病品种中有 4 个品种扩增出 SSR510-98 抗病特异片段， 107 个感病品种中 有 83 个扩增出 SSR510-104 感病特异片段， 与田间调查结果的吻合率达到 72.5％。
上述 PCR 扩增结果进一步证实了抗病特异片段 SSR509-172 和 SSR510-98、 感病特 异片段 SSR509-170 和 SSR510-104 与甜瓜白粉病抗性基因 Pm-2F 的紧密连锁关系， 准确性 高， 说明上述标记片段在鉴别抗、 感病品种时有非常高的利用价值。
2.4 特异片段的测序结果
将抗病特异扩增片段 SSR509-172 和 SSR510-98 和感病特异扩增片段 SSR509-170 和 SSR510-104 进行测序。4 个测序片段的两端分别有引物 SSR509 和 SSR510 的上下游结合 位点， 且片段的大小与依分子量标准估计的基本吻合， 证实了测序片段的正确性。利用 SSR 引物 509 扩增得到的抗、 感特异片段长度分别为 172bp 和 170bp， 只有 2 个碱基 “CT” 的插 入。利用 SSR 引物 510 扩增得到的抗、 感特异片段长度分别为 98bp 和 102bp， 只有 4 个碱基 “CTCT” 的缺失。8CN 101899439 A
序列表1/2 页
9CN 101899439 A序列表2/2 页