一种农杆菌转化大豆的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110262471.6	申请日：	2011.09.07
公开号：	CN102304545A	公开日：	2012.01.04
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 15/82申请日:20110907授权公告日:20130123终止日期:20140907\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/82申请日:20110907\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/82; A01H4/00; A01H5/00	主分类号：	C12N15/82
申请人：	河北科技师范学院
发明人：	李桂兰; 乔亚科; 王卢平; 钟磊; 崔姗姗
地址：	066004 河北省秦皇岛市河北大街西段360号
优先权：
专利代理机构：	秦皇岛市维信专利事务所 13102	代理人：	戴辉
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内容摘要

本发明公开了一种农杆菌转化大豆的方法，包括对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒，接种到萌发培养基上萌发，获得无菌苗，切制大豆子叶节，用液体培养基，调制活化的农杆菌菌液，调整pH值，然后侵染子叶节，将子叶节转移到共培养基上，调整pH值，在光照条件下进行共培养，将共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出；抗性芽经过伸长、生根、移栽、对植株进行鉴定，获得转化植株。本发明获得的农杆菌转化大豆子叶节的共培养方法，可显著提高农杆菌转化大豆子叶节的效率，对加快大豆转基因育种有重要的理论及实践意义。

权利要求书

1：一种农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒 12-16h，接种到萌发培养基上萌发 4-6d，获得无菌苗，切制大豆子叶节；（2）用液体培养基，其成分为： 1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L 乙酰丁香酮 +400mg/L L- 半胱氨酸 +1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫酸钠 +3mmol/L MES+3% 蔗糖， pH 值为 6.0-7.2，调制活化的农杆菌菌液达到 OD600 为： 0.4-0.6，然后侵染子叶节 30-60min ；（3）将上述的子叶节转移到共培养基上，共培养基成分为： 1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L 乙酰丁香酮 +400mg/L L- 半胱氨酸 +1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫酸钠 +3mmol/L MES+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH 值为 6.0-7.2，在 0-16h/d 光照、 22-25℃条件下，共培养 3-10 天；（4）将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养， 15 天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为 B5 +1.7mg/ L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（5）将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为： B5 + 1.0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（6）抗性芽生长到 4-6cm 后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为 1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（7）当根长达到 4-6cm 后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。
2：根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养基的 pH 值，优选的 pH 范围为 6.0-7.2，最佳 pH 值为 6.6。
3：根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养优选 7-10 天；最佳为 10 天。
4：根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养期间的光照时间在优选 12-16h/d ；最佳为 16h/d。
5： 8 ；（5）将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为： B5 + 1.0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（6）抗性芽生长到 4-6cm 后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为 1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（7）当根长达到 4-6cm 后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。 2. 根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养基的 pH 值，优选的 pH 范围为 6.0-7.2，最佳 pH 值为 6.6。 3. 根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养优选 7-10 天；最佳为 10 天。 4. 根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养期间的光照时间在优选 12-16h/d ；最佳为 16h/d。
6： 0-
7： 2，调制活化的农杆菌菌液达到 OD600 为： 0.4-0.6，然后侵染子叶节 30-60min ；（3）将上述的子叶节转移到共培养基上，共培养基成分为： 1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L 乙酰丁香酮 +400mg/L L- 半胱氨酸 +1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫酸钠 +3mmol/L MES+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH 值为 6.0-7.2，在 0-16h/d 光照、 22-25℃条件下，共培养 3-10 天；（4）将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养， 15 天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为 B5 +1.7mg/ L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（5）将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为： B5 + 1.0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（6）抗性芽生长到 4-6cm 后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为 1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ；（7）当根长达到 4-6cm 后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。 2. 根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养基的 pH 值，优选的 pH 范围为 6.0-7.2，最佳 pH 值为 6.6。 3. 根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养优选 7-10 天；最佳为 10 天。 4. 根据权利要求 1 所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养期间的光照时间在优选 12-16h/d ；最佳为 16h/d。

说明书

一种农杆菌转化大豆的方法
    【技术领域】
     本发明属于植物转基因技术领域，具体说是一种农杆菌介导转化大豆子叶节的方法。背景技术早在 1988 年由 Hinchee 第 1 个以农杆菌介导法获得大豆转基因植株，农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化仍然是目前应用最广泛的一种转基因技术，这种方法有很多优点：获得再生植株的时间短、不可育的再生植株少、外植体来源不受时间限制；具有操作简单、费用低廉、可插入基因片段大、不容易发生重排、拷贝数低且符合孟德尔遗传规律等优点 (Meurer et a.l,1998; 林树柱等 ,2004, 刘海坤 2005)。但是也存在一些实际问题，如子叶节细胞的转化效率低，再生转化细胞和再生芽的无效选择，重复性很差，植株再生困难等仍然是该系统实施的瓶颈（Olhoft 和 Somers2001 等；林树柱 2004 ；姬月梅 2009）。（Biotechnolog. 1988, 6: 915-922 ； Plant Cell Report, 1998.18:180-186 ；植物生理与分子生物学报 , 2005,31(2): 126-134 ； Pla Cell Rep.,2001,20:706-711 ；生物工程学报 ,2004,20(6): 817-820 ；农业科学研究 ,2009,1: 47-49）。
     在已公开的植物转基因技术中，农杆菌介导大豆子叶节遗传转化获得转基因大豆植株经过以下步骤：大豆无菌苗的培养，子叶节制备，农杆菌侵染与共培养，不定芽诱导筛选培养，不定芽生根，植株移栽，转化苗开花结荚获得种子。自 1988 年 Hinchee 等首次报告农杆菌转化大豆成功，之后的研究很多都沿用了这种方法，但是农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化效率至今仍没有取得很大突破，原因是大豆转基因的实际操作是一个较复杂的过程，每一个操作步骤都会对最终的转化效率有影响，甚至起决定作用。在农杆菌介导大豆子叶节遗传转化操作过程中，侵染和共培养这两个步骤是农杆菌粘附在外植体表面和外源基因进入植物细胞及整合到植物基因组的过程，因此对转化率起决定作用。这两个步骤要求合适的侵染时间、侵染液浓度、共培养的时间、温度和合适的共培养基成分及其 pH 值等。子叶节系统目前通常采用的侵染时间一般在 10-30min，侵染农杆菌液浓度在 OD600=0.3-1.0 ；目前通常采用的共培养基的 pH 为 5.4，共培养条件是温度为 22-24℃、完全黑暗，共培养时间为 3d，转化效率一般在 3% 以下，而且不稳定。Chen 认为大豆的转化率一般为 0.5 % ～ 1.8 %，李明春等报道的转化率为 1.27 %, 崔欣的转化率为 0.49 % ～ 0.91 %, 段莹莹的子叶节转化法转化率为 1.86%，吕慧颖研究表明 , 转化率为 2.39 % , 姬丹丹转化率为 2.2-2.5%（Plant Cell Tissue Organ Cult., 2007, 89: 177-183 ； Acata Botan Sinc， 2004 ,46 (5) :610-617 ；农业科学研究， 2009， 30（1） :47-49 ；分子生物学报 , 2007, 40(5): 286-294 ；大豆科学 , 2010， 29 (1): 8-12 ；山东大学学报 ( 理学版 ) 2011， 46 （5） 117-121，）。研究者们相继在 ① 大豆基因型 ; ② 农杆菌菌株和 Ti 质粒 ; ③ 外植体类型 ; ④共培养基中酚类化合物和抗氧化剂种类及转化时合适的筛选剂等各种技术性环节进行了探索，每个试验研究的转化效率都有所提高（农业科学研究 ,2009,1: 47-49）。
     另外，共培养基的 pH 是遗传转化效率最直接的影响因素。农杆菌和外植体大豆子叶节均与培养基直接接触，农杆菌的生长及 T-DNA 向植物细胞转移的活性均受环境 pH 影响，农杆菌生长的适宜 pH 为 6-9，因此给农杆菌创造一个合适的环境很重要，目前通用的 pH 为 5.4。武小霞等研究结果显示，大豆遗传转化共培养基的 pH 在 5.2-5.6 范围内为宜，不定芽诱导率最高；赵晓雯认为 pH 值是影响遗传转化效率的最主要因素 , 最适宜 pH 为 5.2， PCR 阳性率 1.06-5%，平均为 2.27%（东北农业大学学报 , 2010, 41(5): 1-4 ；大豆科学， 2011. 30（3） :362-368）。
     此外，共培养的时间是农杆菌介导的大豆遗传转化过程中重要的影响因素。共培养的过程是附着在伤口的农杆菌不断繁殖和 T-DNA 的转入和与植物基因组整合的过程，完成该过程至少需要 16h，因为 “细胞的调节期” 大致为 16h。理论上共培养的时间越长，农杆菌就会繁殖越多，完成转化的几率越大，但是时间过长，农杆菌会过度繁殖，使外植体遭受毒害而死亡（王关林 1998），目前一般认为大豆子叶节遗传转化的最佳共培养时间为 3d。（植物基因工程原理与技术 . 科学出版社 , 1998 ；Plant Cell Rep., 1998,18:180-186）。
     同样，光照条件也是影响共培养的重要因素，农杆菌是生存在土壤中的一种菌，黑暗是它的自然生存环境状态。共培养时，黑暗条件有利于农杆菌的生长，而光照有利于大豆子叶节分生细胞分裂，因此协调满足农杆菌和大豆子叶节分化的需要对转化很重要。关于共培养光照条件的研究很少，之前的报道认为共培养在黑暗条件下比在光照条件下效果更好，目前通用的方法是在完全黑暗条件下进行共培养（中国农业科学 , 2008, 41(3): 661-668 ；分子生物学报 , 2007, 40(5): 286-294）。因此，农杆共培养是农杆菌完成转化大豆子叶节的关键阶段，是获得转基因植株的前提，改良共培养阶段的重要影响因素，会有效提高大豆子叶节遗传转化效率。
     发明内容本发明的目的是提供一种农杆菌转化大豆的方法，通过优化共培养基 pH 值、共培养时间和共培养期间的光照方式，提高了农杆菌转化高大豆子叶节的效率。
     本发明是通过以下技术方案实现的： 1、对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒 12-16h，接种到萌发培养基上萌发 4-6d，获得无菌苗，切制大豆子叶节； 2、用液体培养基，其成分为： 1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L 乙酰丁香酮 +400mg/ L L- 半胱氨酸 +1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫酸钠 +3mmol/L MES+3% 蔗糖， pH 值为 6.0-7.2，调制活化的农杆菌菌液达到 OD600 为： 0.4-0.6，然后侵染子叶节 30-60min ； 3、将上述的子叶节转移到共培养基上，共培养基成分为： 1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L 乙酰丁香酮 +400mg/L L- 半胱氨酸 +1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫酸钠 +3mmol/L MES+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH 值为 6.0-7.2，在 0-16h/d 光照、 22-25℃条件下，共培养 3-10 天； 4、将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养， 15 天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为 B5 +1.7mg/L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ； 5、将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为： B5 + 1.0mg/LGA3 +
     100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ； 6、抗性芽生长到 4-6cm 后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为 1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ； 7、当根长达到 4-6cm 后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。
     在本发明中，所述的共培养基的 pH 值，优选的 pH 范围为 6.0-7.2，最佳 pH 值为 6.6。
     进一步地，所述的共培养优选 7-10 天；最佳为 10 天。
     进一步地，所述的共培养期间的光照时间在优选 12-16h/d ；最佳为 16h/d。
     本发明的有益效果：本发明获得的农杆菌转化大豆子叶节的共培养方法，可显著提高农杆菌转化大豆子叶节的效率，对加快大豆转基因育种有重要的理论及实践意义。
     本发明的一个特点是选用共培养基 pH 在 6.0-7.2 范围内，转化率分别达到 4.67%、 5.59% 和 5.43%，转化率均高于目前通用的 pH 5.4，提高了 3-3.5 倍 , 以 pH6.6 最高，见表 1。
     表 1 不同 pH 值对大豆子叶节转化效率的影响另外，共培养天数在 7-14d 范围内，转化率分别达到 5.92%、 8.97% 和 1.99%，转化率均高于目前通用的共培养 3d，提高 1.8-3 倍，以 10d 转化率最高 , 与对照差异显著，共培养天数在 14d 时转化率下降，见表 2。
     表 2 不同共培养天数对大豆子叶节转化效率的影响本发明的另一特点是适宜在 12-24h/d 光照条件下，转化率为 12h/d 光照和 16h/d 光照的转化率为分别为 5.06% 和 5.36%，比目前通用的 0h/d 光照培养提高了 3.4 倍 ,12h/d 或 16h/d 光照共培养后的子叶节变绿，有更强的生命力；完全黑暗共培养的的子叶节与共培养前无明显变化，为黄绿色，只有经过 2-3d 的诱导培养才能变成绿色； 24h/d 光照获得的子叶节变深绿色，子叶节周围农杆菌少，抑制了农杆菌的生长，转化率下降到 0.48%，见表 3, 因此适宜的共培养光照方式为 12h/d - 16h/d 光照。表 3 共培养光照时间对转化率的影响具体实施方式实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如植物基因工程技术与原理所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。
     实施例 1 1、首先挑选无病、饱满的成熟大豆种子用氯气法进行消毒 16h，接种到萌发培养基上，萌发培养基为 B5+0.5mg/L 6-BA+3% 蔗糖 +0.6% 琼脂， pH=5.8，萌发 5d，获得无菌苗，切制子叶节； 2、用液体培养基： 1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L 乙酰丁香酮 +400mg/L L- 半胱氨酸 +1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫酸钠 +3% 蔗糖， pH 值为 5.4，调制农杆菌浓度 OD600 达到 0.5，浸泡切制好的大豆子叶节 60min，本实施例中农杆菌含卡纳霉素植物筛选标记； 3、大豆子叶节转移至共培养基上，共培养基的基本成分为： 1/10 B5+1.7mg/L 6-BA+200μmol/L 乙酰丁香酮 +400mg/L L- 半胱氨酸 +1mmol/L 二硫苏糖醇 +1mmol/L 硫代硫酸钠 +3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH 值为 5.4，在 24℃、黑暗条件下，共培养 3 天； 4、将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养， 15 天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为 B5 +1.7mg/L 6-BA +100mg/LKm +250mg/LCarb +250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ； 5、将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为： B5 + 1.0mg/LGA3 + 100mg/LKm + 250mg/LCarb + 250mg/LCef +3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ； 6、抗性芽生长到 4-6cm 后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为 1/2MS+1.0mg/L IBA+0.2mg/L NAA+250mg/LCef+3% 蔗糖 +0.8% 琼脂， pH=5.8 ； 7、当根长达到 4-6cm 后，将苗移栽到营养土中，将苗用塑料薄膜覆盖，保持土壤湿润，待新叶长出后去掉塑料薄膜，获得转化植株。
     说明：针对上述实施例给出的 pH 值，对其共培养基的 pH 值还可进行相应的调整，如选取 pH 值为 6.0、 6.6 或 7.2，其方法均按照上述方案，获得转化植株。
     实施例 2 大豆子叶节的制备按实施例 1 中步骤 1 所述方法进行；按实施例 1 中步骤 2 所述方法进行大豆子叶节侵染；大豆子叶节转移至如同实施例 1 中的步骤 3 所述共培养基上，在 24℃、黑暗条件下共培养 10d，随后的操作步骤均同实施例 1 中 4、 5、 6、 7 相关步骤。
     说明：针对共培养时间还开进行相应的调整，如 3d、 7d 或 14d，其方法均按照实施例 1 的方案，获得转化植株。
     实施例 3 大豆子叶节的制备按实施例 1 中的步骤 1 所述方法进行。
     按实施例 1 中的步骤 2 所述方法进行大豆子叶节侵染；大豆子叶节转移至如同实施例 1 中的步骤 3 所述共培养基上，在光照培养箱中，温度控制在 24℃，光照强度控制在 3000LX， 16h /d 光照条件下共培养 3d，随后的操作步骤均同实施例 1 中 4、 5、 6、 7 相关步骤。
     说明：针对共培养期间的光照时间还可进行相应的调整，可选取 0h /d 光照、 12h / d 光照或 24h /d 光照，其方法均按照实施例 1 的方案，获得转化植株。7

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1、10申请公布号CN102304545A43申请公布日20120104CN102304545ACN102304545A21申请号201110262471622申请日20110907C12N15/82200601A01H4/00200601A01H5/0020060171申请人河北科技师范学院地址066004河北省秦皇岛市河北大街西段360号72发明人李桂兰乔亚科王卢平钟磊崔姗姗74专利代理机构秦皇岛市维信专利事务所13102代理人戴辉54发明名称一种农杆菌转化大豆的方法57摘要本发明公开了一种农杆菌转化大豆的方法，包括对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒，接种到萌发培养基上萌发，获得无菌苗，切制大豆。

2、子叶节，用液体培养基，调制活化的农杆菌菌液，调整PH值，然后侵染子叶节，将子叶节转移到共培养基上，调整PH值，在光照条件下进行共培养，将共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出；抗性芽经过伸长、生根、移栽、对植株进行鉴定，获得转化植株。本发明获得的农杆菌转化大豆子叶节的共培养方法，可显著提高农杆菌转化大豆子叶节的效率，对加快大豆转基因育种有重要的理论及实践意义。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页CN102304551A1/1页21一种农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，包括如下步。

3、骤（1）对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒1216H，接种到萌发培养基上萌发46D，获得无菌苗，切制大豆子叶节；（2）用液体培养基，其成分为1/10B517MG/L6BA200MOL/L乙酰丁香酮400MG/LL半胱氨酸1MMOL/L二硫苏糖醇1MMOL/L硫代硫酸钠3MMOL/LMES3蔗糖，PH值为6072，调制活化的农杆菌菌液达到OD600为0406，然后侵染子叶节3060MIN；（3）将上述的子叶节转移到共培养基上，共培养基成分为1/10B517MG/L6BA200MOL/L乙酰丁香酮400MG/LL半胱氨酸1MMOL/L二硫苏糖醇1MMOL/L硫代硫酸钠3MMOL/LMES3蔗糖08琼。

4、脂，PH值为6072，在016H/D光照、2225条件下，共培养310天；（4）将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为B517MG/L6BA100MG/LKM250MG/LCARB250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；（5）将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为B510MG/LGA3100MG/LKM250MG/LCARB250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；（6）抗性芽生长到46CM后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为1/2MS10MG/LIBA02MG。

5、/LNAA250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；（7）当根长达到46CM后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。2根据权利要求1所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养基的PH值，优选的PH范围为6072，最佳PH值为66。3根据权利要求1所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养优选710天；最佳为10天。4根据权利要求1所述的农杆菌转化大豆的方法，其特征在于，所述的共培养期间的光照时间在优选1216H/D；最佳为16H/D。权利要求书CN102304545ACN102304551A1/5页3一种农杆菌转化大豆的方法技术领域0。

6、001本发明属于植物转基因技术领域，具体说是一种农杆菌介导转化大豆子叶节的方法。背景技术0002早在1988年由HINCHEE第1个以农杆菌介导法获得大豆转基因植株，农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化仍然是目前应用最广泛的一种转基因技术，这种方法有很多优点获得再生植株的时间短、不可育的再生植株少、外植体来源不受时间限制；具有操作简单、费用低廉、可插入基因片段大、不容易发生重排、拷贝数低且符合孟德尔遗传规律等优点MEURERETAL,1998林树柱等,2004,刘海坤2005。但是也存在一些实际问题，如子叶节细胞的转化效率低，再生转化细胞和再生芽的无效选择，重复性很差，植株再生困难等仍然是该系统实施。

7、的瓶颈（OLHOFT和SOMERS2001等；林树柱2004；姬月梅2009）。（BIOTECHNOLOG1988,6915922；PLANTCELLREPORT,199818180186；植物生理与分子生物学报,2005,312126134；PLACELLREP,2001,20706711；生物工程学报,2004,206817820；农业科学研究,2009,14749）。0003在已公开的植物转基因技术中，农杆菌介导大豆子叶节遗传转化获得转基因大豆植株经过以下步骤大豆无菌苗的培养，子叶节制备，农杆菌侵染与共培养，不定芽诱导筛选培养，不定芽生根，植株移栽，转化苗开花结荚获得种子。自1988年H。

8、INCHEE等首次报告农杆菌转化大豆成功，之后的研究很多都沿用了这种方法，但是农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化效率至今仍没有取得很大突破，原因是大豆转基因的实际操作是一个较复杂的过程，每一个操作步骤都会对最终的转化效率有影响，甚至起决定作用。在农杆菌介导大豆子叶节遗传转化操作过程中，侵染和共培养这两个步骤是农杆菌粘附在外植体表面和外源基因进入植物细胞及整合到植物基因组的过程，因此对转化率起决定作用。这两个步骤要求合适的侵染时间、侵染液浓度、共培养的时间、温度和合适的共培养基成分及其PH值等。子叶节系统目前通常采用的侵染时间一般在1030MIN，侵染农杆菌液浓度在OD6000310；目前通常采用的。

9、共培养基的PH为54，共培养条件是温度为2224、完全黑暗，共培养时间为3D，转化效率一般在3以下，而且不稳定。CHEN认为大豆的转化率一般为0518，李明春等报道的转化率为127,崔欣的转化率为049091,段莹莹的子叶节转化法转化率为186，吕慧颖研究表明,转化率为239,姬丹丹转化率为2225（PLANTCELLTISSUEORGANCULT,2007,89177183；ACATABOTANSINC，2004,465610617；农业科学研究，2009，30（1）4749；分子生物学报,2007,405286294；大豆科学,2010，291812；山东大学学报理学版2011，46（5）。

10、117121，）。研究者们相继在大豆基因型农杆菌菌株和TI质粒外植体类型共培养基中酚类化合物和抗氧化剂种类及转化时合适的筛选剂等各种技术性环节进行了探索，每个试验研究的转化效率都有所提高（农业科学研究,2009,14749）。说明书CN102304545ACN102304551A2/5页40004另外，共培养基的PH是遗传转化效率最直接的影响因素。农杆菌和外植体大豆子叶节均与培养基直接接触，农杆菌的生长及TDNA向植物细胞转移的活性均受环境PH影响，农杆菌生长的适宜PH为69，因此给农杆菌创造一个合适的环境很重要，目前通用的PH为54。武小霞等研究结果显示，大豆遗传转化共培养基的PH在5256。

11、范围内为宜，不定芽诱导率最高；赵晓雯认为PH值是影响遗传转化效率的最主要因素,最适宜PH为52，PCR阳性率1065，平均为227（东北农业大学学报,2010,41514；大豆科学，201130（3）362368）。0005此外，共培养的时间是农杆菌介导的大豆遗传转化过程中重要的影响因素。共培养的过程是附着在伤口的农杆菌不断繁殖和TDNA的转入和与植物基因组整合的过程，完成该过程至少需要16H，因为“细胞的调节期”大致为16H。理论上共培养的时间越长，农杆菌就会繁殖越多，完成转化的几率越大，但是时间过长，农杆菌会过度繁殖，使外植体遭受毒害而死亡（王关林1998），目前一般认为大豆子叶节遗传转化。

12、的最佳共培养时间为3D。（植物基因工程原理与技术科学出版社,1998；PLANTCELLREP,1998,18180186）。0006同样，光照条件也是影响共培养的重要因素，农杆菌是生存在土壤中的一种菌，黑暗是它的自然生存环境状态。共培养时，黑暗条件有利于农杆菌的生长，而光照有利于大豆子叶节分生细胞分裂，因此协调满足农杆菌和大豆子叶节分化的需要对转化很重要。关于共培养光照条件的研究很少，之前的报道认为共培养在黑暗条件下比在光照条件下效果更好，目前通用的方法是在完全黑暗条件下进行共培养（中国农业科学,2008,413661668；分子生物学报,2007,405286294）。0007因此，农杆共。

13、培养是农杆菌完成转化大豆子叶节的关键阶段，是获得转基因植株的前提，改良共培养阶段的重要影响因素，会有效提高大豆子叶节遗传转化效率。发明内容0008本发明的目的是提供一种农杆菌转化大豆的方法，通过优化共培养基PH值、共培养时间和共培养期间的光照方式，提高了农杆菌转化高大豆子叶节的效率。0009本发明是通过以下技术方案实现的1、对干燥的大豆种子用氯气法进行消毒1216H，接种到萌发培养基上萌发46D，获得无菌苗，切制大豆子叶节；2、用液体培养基，其成分为1/10B517MG/L6BA200MOL/L乙酰丁香酮400MG/LL半胱氨酸1MMOL/L二硫苏糖醇1MMOL/L硫代硫酸钠3MMOL/LME。

14、S3蔗糖，PH值为6072，调制活化的农杆菌菌液达到OD600为0406，然后侵染子叶节3060MIN；3、将上述的子叶节转移到共培养基上，共培养基成分为1/10B517MG/L6BA200MOL/L乙酰丁香酮400MG/LL半胱氨酸1MMOL/L二硫苏糖醇1MMOL/L硫代硫酸钠3MMOL/LMES3蔗糖08琼脂，PH值为6072，在016H/D光照、2225条件下，共培养310天；4、将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为B517MG/L6BA100MG/LKM250MG/LCARB25。

15、0MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；5、将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为B510MG/LGA3说明书CN102304545ACN102304551A3/5页5100MG/LKM250MG/LCARB250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；6、抗性芽生长到46CM后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为1/2MS10MG/LIBA02MG/LNAA250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；7、当根长达到46CM后，将苗移栽到营养土中，将苗用薄膜覆盖，待新叶长出后去掉薄膜，获得转化植株。0010在本发明中，所述的共培养基的PH值，优选的PH范围为6072，最佳。

16、PH值为66。0011进一步地，所述的共培养优选710天；最佳为10天。0012进一步地，所述的共培养期间的光照时间在优选1216H/D；最佳为16H/D。0013本发明的有益效果本发明获得的农杆菌转化大豆子叶节的共培养方法，可显著提高农杆菌转化大豆子叶节的效率，对加快大豆转基因育种有重要的理论及实践意义。0014本发明的一个特点是选用共培养基PH在6072范围内，转化率分别达到467、559和543，转化率均高于目前通用的PH54，提高了335倍,以PH66最高，见表1。0015表1不同PH值对大豆子叶节转化效率的影响另外，共培养天数在714D范围内，转化率分别达到592、897和199，转。

17、化率均高于目前通用的共培养3D，提高183倍，以10D转化率最高,与对照差异显著，共培养天数在14D时转化率下降，见表2。0016表2不同共培养天数对大豆子叶节转化效率的影响本发明的另一特点是适宜在1224H/D光照条件下，转化率为12H/D光照和16H/D光照的转化率为分别为506和536，比目前通用的0H/D光照培养提高了34倍,12H/D或16H/D光照共培养后的子叶节变绿，有更强的生命力；完全黑暗共培养的的子叶节与共培养前无明显变化，为黄绿色，只有经过23D的诱导培养才能变成绿色；24H/D光照获得的子叶节变深绿色，子叶节周围农杆菌少，抑制了农杆菌的生长，转化率下降到048，见表3,因。

18、此适宜的共培养光照方式为12H/D16H/D光照。说明书CN102304545ACN102304551A4/5页60017表3共培养光照时间对转化率的影响具体实施方式实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如植物基因工程技术与原理所述的条件，或按照具体制造厂商所建议的条件。0018实施例11、首先挑选无病、饱满的成熟大豆种子用氯气法进行消毒16H，接种到萌发培养基上，萌发培养基为B505MG/L6BA3蔗糖06琼脂，PH58，萌发5D，获得无菌苗，切制子叶节；2、用液体培养基1/10B517MG/L6BA200MOL/L乙酰丁香。

19、酮400MG/LL半胱氨酸1MMOL/L二硫苏糖醇1MMOL/L硫代硫酸钠3蔗糖，PH值为54，调制农杆菌浓度OD600达到05，浸泡切制好的大豆子叶节60MIN，本实施例中农杆菌含卡纳霉素植物筛选标记；3、大豆子叶节转移至共培养基上，共培养基的基本成分为1/10B517MG/L6BA200MOL/L乙酰丁香酮400MG/LL半胱氨酸1MMOL/L二硫苏糖醇1MMOL/L硫代硫酸钠3蔗糖08琼脂，PH值为54，在24、黑暗条件下，共培养3天；4、将上述共培养后的大豆子叶节进行脱菌后，转到不定芽诱导及筛选培养基上进行芽诱导及筛选培养，15天继代一次，直到抗性芽长出，诱导及筛选培养基成分为B517。

20、MG/L6BA100MG/LKM250MG/LCARB250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；5、将上述的抗性芽转移到芽伸长培养基上，芽伸长培养基成分为B510MG/LGA3100MG/LKM250MG/LCARB250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；6、抗性芽生长到46CM后，转移到生根培养基上，生根培养基成分为1/2MS10MG/LIBA02MG/LNAA250MG/LCEF3蔗糖08琼脂，PH58；7、当根长达到46CM后，将苗移栽到营养土中，将苗用塑料薄膜覆盖，保持土壤湿润，待新叶长出后去掉塑料薄膜，获得转化植株。0019说明针对上述实施例给出的PH值，对其共培养基的PH。

21、值还可进行相应的调整，如选取PH值为60、66或72，其方法均按照上述方案，获得转化植株。0020实施例2大豆子叶节的制备按实施例1中步骤1所述方法进行；按实施例1中步骤2所述方法进行大豆子叶节侵染；大豆子叶节转移至如同实施例1中的步骤3所述共培养基上，在24、黑暗条件下共培养10D，随后的操作步骤均同实施例1中4、5、6、7相关步骤。0021说明针对共培养时间还开进行相应的调整，如3D、7D或14D，其方法均按照实施说明书CN102304545ACN102304551A5/5页7例1的方案，获得转化植株。0022实施例3大豆子叶节的制备按实施例1中的步骤1所述方法进行。0023按实施例1中的步骤2所述方法进行大豆子叶节侵染；大豆子叶节转移至如同实施例1中的步骤3所述共培养基上，在光照培养箱中，温度控制在24，光照强度控制在3000LX，16H/D光照条件下共培养3D，随后的操作步骤均同实施例1中4、5、6、7相关步骤。0024说明针对共培养期间的光照时间还可进行相应的调整，可选取0H/D光照、12H/D光照或24H/D光照，其方法均按照实施例1的方案，获得转化植株。说明书CN102304545A。

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