驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测方法及检测用引物和探 针 技术领域 本发明涉及动物物种和动物源性成分鉴定技术领域， 具体涉及一种驴或驴源性成 分的检测方法 ； 尤其涉及一种驴或驴源性成分的实时荧光 PCR 检测方法 ； 此外， 本发明还涉 及检测驴或驴源性成分的引物和探针。
背景技术 目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、 进出口贸 易、 市场及餐饮业等领域。国内外肉食品及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的 需求也越来越迫切。同时， 各类人畜共患病也困扰着人类的生存健康。因此， 研究出一种准 确、 快速、 可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法， 就非常有必要。
目前， 为了确定食物及饲料的真实成分， 已经开发了很多对动物源性成分鉴别的 方法， 有物理、 化学、 免疫学和分子生物学等方法。
在分子生物学方法中， 分子标记技术以其快速、 准确、 稳定、 高效等优点显示出巨 大的开发潜力和广阔的应用前景。 目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要 包括核 DNA、 RNA、 线粒体 DNA(mtDNA)、 和蛋白质分子标记等。PCR 分子标记鉴别检测技术， 具有特异性高、 针对性强、 灵敏度高、 简便快速、 对检测样品要求低 ( 几乎所有的样本都可 以作为 PCR 的材料， 它只要求样本中有完整的靶序列核酸 )， 因此， 无论是经过远途运输或 低温保存多年的陈旧样本， 都可以用于 PCR 扩增。
哺乳动物 mtDNA 在遗传上相对独立， 是双链的超螺旋环状分子， 具有基因组小 ( 约 16kb)、 没有重复序列、 生物个体内无组织特异性、 每个细胞中含有大量线粒体基因组 ( 哺 乳动物约 1000 ～ 2300 个拷贝 ) 等特点。因此， 用 mtDNA 分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料 动物源性成分与核 DNA 分子标记相比， 具有灵敏度高、 精确度好、 快速、 降解小 ( 加工过程中 mtDNA 保持较完整 )、 稳定易操作等优势。基于动物 mtDNA 的 PCR 分子标记技术的上述特 点， 加之实时荧光 PCR 的快速、 灵敏等特点， 因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广 阔的前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光 PCR 检测方法。 本发明的目的在于提供一种驴或驴源性成分的扩增引物和探针。 本发明的另一目的是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光 PCR 检测方法的扩增条件。 以解决准确、 快速、 可靠的用实时荧光 PCR 技术鉴定驴或驴源性成分。
本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 ：
(1) 设计引物 ： 一种用于实时荧光 PCR 检测驴或驴源性成分的特异性引物和探针， 其主要特点是上下游长度分别为 25bp 和 26bp 的核苷酸 ； 探针长度为 25bp 的核苷酸， 并在
5’ 端标记上 FAM 荧光基因， 3’ 端标记上 ECLIPSE 淬灭基因， 序列如下 ：
上游引物 F ： 5’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3’
下游引物 R ： 5’ -CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3’
探针序列 P ： 5’ (FAM)-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3’ (ECLIPSE)
(2) 提取样品 DNA。
(3) 采用步骤 (1) 设计的引物和探针进行实时荧光 PCR 检测。
步骤 (2) 具体为 ： 按 DNA 提取试剂盒说明提取样品 DNA。
步骤 (3) 中， 所述实时荧光 PCR 检测的反应体系为 20μL， 包括 10μL 2×real 2+ time PCR Buffer( 包含有 dNTP， Mg 以及 Taq 酶等 )， 步骤 (1) 设计的上下游引物 F/R 各 0.4μL( 终浓度为 0.2μM)， TaqMan 探针 P 0.4μL( 终浓度为 0.2μM)， DNA 模板 2μL， 超纯 水补至 20μL。
步骤 (3) 中， 所述实时荧光 PCR 检测的反应程序为 ： 预变性 95 ℃ 30sec ； 然后 95℃ 15sec， 60℃ 34sec 循环 40 次。
与现有技术相比， 本发明的有益效果在于 ： 近年来随着人们对身体保健需求的日 益增强， 餐桌上的驴肉， 以及阿胶等食品药品的需求不断增大， 商家出于经济利益驱使投放 大量非驴源性成分制成的商品， 导致各类产品真假难辨。 因此， 研究出准确、 快速、 可靠的鉴 定驴或驴源性成分的方法和技术， 对于有效抵御假冒驴源性成分产品， 使损害消费者利益 的事件得到遏制， 同时进一步完善了食品和药品检测体系， 加大了对消费者利益的保护力 度。 同时对于经驴传播的某些疾病也可通过该方法鉴定其成分， 从而控制其进出境， 来控制 这些疾病病原的传播与蔓延。本发明与现有技术相比， 其检测的灵敏度也大大提高。 附图说明 图 1 为驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测方法特异性实验图。
图中 ： A4 为驴 ； B4 为马 ； C4 为鸡 ； D4 为鸭 ； E4 为鹌鹑 ； F4 火鸡 ； G4 鸽 ； H4 ； 鸵鸟 ； A5 鹧鸪 ； B5 牛 ； C5 绵羊 ； D5 山羊 ； E5 猪 ； F5 兔 ； G5 鱼 ； H5 鹿 ； A6 鹅 ； B6 狗 ； C6 空白对照。
图 2 为驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测方法灵敏性实验图
图中 ： A8 为纯驴肉样品 ； B8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 A8 的样品 ； C8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 B8 的样品 ； D8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 C8 的样品 ； E8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 D8 的样 品； F8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 E8 的样品 ； G8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 F8 的样品 ； H8 为猪肉 DNA 样品。
具体实施方式 ：
以下对据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例 1 ： 对驴、 马、 鸡、 鸭、 鹌鹑、 火鸡、 鸽、 鸵鸟、 鹧鸪、 牛、 绵羊、 山羊、 猪、 兔、 鱼、 鹿、 鹅、 狗等动物的检测验证实验。
(1) 总 DNA 的提取
采用氯仿抽提法或商业 DNA 提取试剂盒， 提取驴、 马、 鸡、 鸭、 鹌鹑、 火鸡、 鸽、 鸵鸟、 鹧鸪、 牛、 绵羊、 山羊、 猪、 兔、 鱼、 鹿、 鹅、 狗动物的基因组 DNA， 提取基因组 DNA 均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定 OD260/OD280 值均为 1.8 左右， 说明 DNA 纯度较高符合 PCR 扩 增要求。
(2) 实时荧光 PCR 检测方法特异性引物的设计
比较 GenBank 中公布的各种动物线粒体基因序列， 依据其物种保守序列设计出鉴 别检测驴源性成分的荧光 PCR 特异性引物和探针 ( 只能扩增出驴 DNA 限制性片段， 而扩增 不出其它动物 DNA 限制性片段 )， 引物和探针分别如下 ：
上游引物 F ： 5’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3’
下游引物 R ： 5’ -CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3’
探针序列 P ： 5’ (FAM)-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3’ (ECLIPSE)
(3) 驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测
利用设计的特异性引物和探针， 以驴 DNA 为模板进行 PCR 扩增。
(3.1) 实时荧光 PCR 反应体系为 20μL， 包括 10μL 2×real time PCR Buffer( 包 含有 dNTP， Mg2+ 以及 Taq 酶等 )， 可采用商业化的实时荧光 PCR 反应母液。
(3.2)PCR 反应程序为 ： 预变性 95 ℃ 30sec ； 然后 95 ℃ 15sec， 60 ℃ 34sec 循环 40 次。
进行 PCR 反应， 反应结束后保存文件， 打开分析软件， 分析实验结果， 给出 ΔRn( 第 n 个循环时的荧光增加值 ) 与循环数图像。
(4) 引物与探针的特异性验证
利用所设计鉴别检测驴源性成分的特异性引物与探针， 分别以驴、 马、 鸡、 鸭、 鹌 鹑、 火鸡、 鸽、 鸵鸟、 鹧鸪、 牛、 绵羊、 山羊、 猪、 兔、 鱼、 鹿、 鹅、 狗等动物的总 DNA 为模板， 进行 实时荧光 PCR， 验证引物的特异性。检测结果如图 1 所示， A4 出现阳性扩增曲线， 其它样品 没有驴源性成分 DNA， 则没有信号， 显示上述引物和探针有良好的特异性。
(5) 实时荧光 PCR 的灵敏度验证
背景技术 目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别检测已涉及到肉食品的工业、 进出口贸 易、 市场及餐饮业等领域。国内外肉食品及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的 需求也越来越迫切。同时， 各类人畜共患病也困扰着人类的生存健康。因此， 研究出一种准 确、 快速、 可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法， 就非常有必要。
目前， 为了确定食物及饲料的真实成分， 已经开发了很多对动物源性成分鉴别的 方法， 有物理、 化学、 免疫学和分子生物学等方法。
在分子生物学方法中， 分子标记技术以其快速、 准确、 稳定、 高效等优点显示出巨 大的开发潜力和广阔的应用前景。 目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要 包括核 DNA、 RNA、 线粒体 DNA(mtDNA)、 和蛋白质分子标记等。PCR 分子标记鉴别检测技术， 具有特异性高、 针对性强、 灵敏度高、 简便快速、 对检测样品要求低 ( 几乎所有的样本都可 以作为 PCR 的材料， 它只要求样本中有完整的靶序列核酸 )， 因此， 无论是经过远途运输或 低温保存多年的陈旧样本， 都可以用于 PCR 扩增。
哺乳动物 mtDNA 在遗传上相对独立， 是双链的超螺旋环状分子， 具有基因组小 ( 约 16kb)、 没有重复序列、 生物个体内无组织特异性、 每个细胞中含有大量线粒体基因组 ( 哺 乳动物约 1000 ～ 2300 个拷贝 ) 等特点。因此， 用 mtDNA 分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料 动物源性成分与核 DNA 分子标记相比， 具有灵敏度高、 精确度好、 快速、 降解小 ( 加工过程中 mtDNA 保持较完整 )、 稳定易操作等优势。基于动物 mtDNA 的 PCR 分子标记技术的上述特 点， 加之实时荧光 PCR 的快速、 灵敏等特点， 因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广 阔的前景。
目前， 为了确定食物及饲料的真实成分， 已经开发了很多对动物源性成分鉴别的 方法， 有物理、 化学、 免疫学和分子生物学等方法。
在分子生物学方法中， 分子标记技术以其快速、 准确、 稳定、 高效等优点显示出巨 大的开发潜力和广阔的应用前景。 目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要 包括核 DNA、 RNA、 线粒体 DNA(mtDNA)、 和蛋白质分子标记等。PCR 分子标记鉴别检测技术， 具有特异性高、 针对性强、 灵敏度高、 简便快速、 对检测样品要求低 ( 几乎所有的样本都可 以作为 PCR 的材料， 它只要求样本中有完整的靶序列核酸 )， 因此， 无论是经过远途运输或 低温保存多年的陈旧样本， 都可以用于 PCR 扩增。
哺乳动物 mtDNA 在遗传上相对独立， 是双链的超螺旋环状分子， 具有基因组小 ( 约 16kb)、 没有重复序列、 生物个体内无组织特异性、 每个细胞中含有大量线粒体基因组 ( 哺 乳动物约 1000 ～ 2300 个拷贝 ) 等特点。因此， 用 mtDNA 分子标记鉴别畜禽肉食品及饲料 动物源性成分与核 DNA 分子标记相比， 具有灵敏度高、 精确度好、 快速、 降解小 ( 加工过程中 mtDNA 保持较完整 )、 稳定易操作等优势。基于动物 mtDNA 的 PCR 分子标记技术的上述特 点， 加之实时荧光 PCR 的快速、 灵敏等特点， 因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广 阔的前景。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光 PCR 检测方法。 本发明的目的在于提供一种驴或驴源性成分的扩增引物和探针。 本发明的另一目的是提供一种驴或驴源性成分的实时荧光 PCR 检测方法的扩增条件。 以解决准确、 快速、 可靠的用实时荧光 PCR 技术鉴定驴或驴源性成分。
本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 ：
(1) 设计引物 ： 一种用于实时荧光 PCR 检测驴或驴源性成分的特异性引物和探针， 其主要特点是上下游长度分别为 25bp 和 26bp 的核苷酸 ； 探针长度为 25bp 的核苷酸， 并在
本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 ：
(1) 设计引物 ： 一种用于实时荧光 PCR 检测驴或驴源性成分的特异性引物和探针， 其主要特点是上下游长度分别为 25bp 和 26bp 的核苷酸 ； 探针长度为 25bp 的核苷酸， 并在
5’ 端标记上 FAM 荧光基因， 3’ 端标记上 ECLIPSE 淬灭基因， 序列如下 ：
上游引物 F ： 5’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3’
下游引物 R ： 5’ -CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3’
探针序列 P ： 5’ (FAM)-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3’ (ECLIPSE)
(2) 提取样品 DNA。
(3) 采用步骤 (1) 设计的引物和探针进行实时荧光 PCR 检测。
步骤 (2) 具体为 ： 按 DNA 提取试剂盒说明提取样品 DNA。
步骤 (3) 中， 所述实时荧光 PCR 检测的反应体系为 20μL， 包括 10μL 2×real 2+ time PCR Buffer( 包含有 dNTP， Mg 以及 Taq 酶等 )， 步骤 (1) 设计的上下游引物 F/R 各 0.4μL( 终浓度为 0.2μM)， TaqMan 探针 P 0.4μL( 终浓度为 0.2μM)， DNA 模板 2μL， 超纯 水补至 20μL。
步骤 (3) 中， 所述实时荧光 PCR 检测的反应程序为 ： 预变性 95 ℃ 30sec ； 然后 95℃ 15sec， 60℃ 34sec 循环 40 次。
与现有技术相比， 本发明的有益效果在于 ： 近年来随着人们对身体保健需求的日 益增强， 餐桌上的驴肉， 以及阿胶等食品药品的需求不断增大， 商家出于经济利益驱使投放 大量非驴源性成分制成的商品， 导致各类产品真假难辨。 因此， 研究出准确、 快速、 可靠的鉴 定驴或驴源性成分的方法和技术， 对于有效抵御假冒驴源性成分产品， 使损害消费者利益 的事件得到遏制， 同时进一步完善了食品和药品检测体系， 加大了对消费者利益的保护力 度。 同时对于经驴传播的某些疾病也可通过该方法鉴定其成分， 从而控制其进出境， 来控制 这些疾病病原的传播与蔓延。本发明与现有技术相比， 其检测的灵敏度也大大提高。 附图说明 图 1 为驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测方法特异性实验图。
图中 ： A4 为驴 ； B4 为马 ； C4 为鸡 ； D4 为鸭 ； E4 为鹌鹑 ； F4 火鸡 ； G4 鸽 ； H4 ； 鸵鸟 ； A5 鹧鸪 ； B5 牛 ； C5 绵羊 ； D5 山羊 ； E5 猪 ； F5 兔 ； G5 鱼 ； H5 鹿 ； A6 鹅 ； B6 狗 ； C6 空白对照。
图 2 为驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测方法灵敏性实验图
图中 ： A8 为纯驴肉样品 ； B8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 A8 的样品 ； C8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 B8 的样品 ； D8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 C8 的样品 ； E8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 D8 的样 品； F8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 E8 的样品 ； G8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 F8 的样品 ； H8 为猪肉 DNA 样品。
图中 ： A4 为驴 ； B4 为马 ； C4 为鸡 ； D4 为鸭 ； E4 为鹌鹑 ； F4 火鸡 ； G4 鸽 ； H4 ； 鸵鸟 ； A5 鹧鸪 ； B5 牛 ； C5 绵羊 ； D5 山羊 ； E5 猪 ； F5 兔 ； G5 鱼 ； H5 鹿 ； A6 鹅 ； B6 狗 ； C6 空白对照。
图 2 为驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测方法灵敏性实验图
图中 ： A8 为纯驴肉样品 ； B8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 A8 的样品 ； C8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 B8 的样品 ； D8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 C8 的样品 ； E8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 D8 的样 品； F8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 E8 的样品 ； G8 为用猪肉 DNA10 倍稀释 F8 的样品 ； H8 为猪肉 DNA 样品。
具体实施方式 ：
以下对据所示最佳实施例对本发明作进一步详述。应理解， 这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例 1 ： 对驴、 马、 鸡、 鸭、 鹌鹑、 火鸡、 鸽、 鸵鸟、 鹧鸪、 牛、 绵羊、 山羊、 猪、 兔、 鱼、 鹿、 鹅、 狗等动物的检测验证实验。
(1) 总 DNA 的提取
采用氯仿抽提法或商业 DNA 提取试剂盒， 提取驴、 马、 鸡、 鸭、 鹌鹑、 火鸡、 鸽、 鸵鸟、 鹧鸪、 牛、 绵羊、 山羊、 猪、 兔、 鱼、 鹿、 鹅、 狗动物的基因组 DNA， 提取基因组 DNA 均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定 OD260/OD280 值均为 1.8 左右， 说明 DNA 纯度较高符合 PCR 扩 增要求。
(2) 实时荧光 PCR 检测方法特异性引物的设计
比较 GenBank 中公布的各种动物线粒体基因序列， 依据其物种保守序列设计出鉴 别检测驴源性成分的荧光 PCR 特异性引物和探针 ( 只能扩增出驴 DNA 限制性片段， 而扩增 不出其它动物 DNA 限制性片段 )， 引物和探针分别如下 ：
上游引物 F ： 5’ -AATAGCTCTAGCCGTACGGCTAACT-3’
下游引物 R ： 5’ -CAGGATAATGAATGTAATAAGGGCTG-3’
探针序列 P ： 5’ (FAM)-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3’ (ECLIPSE)
(3) 驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测
利用设计的特异性引物和探针， 以驴 DNA 为模板进行 PCR 扩增。
(3.1) 实时荧光 PCR 反应体系为 20μL， 包括 10μL 2×real time PCR Buffer( 包 含有 dNTP， Mg2+ 以及 Taq 酶等 )， 可采用商业化的实时荧光 PCR 反应母液。
(3.2)PCR 反应程序为 ： 预变性 95 ℃ 30sec ； 然后 95 ℃ 15sec， 60 ℃ 34sec 循环 40 次。
进行 PCR 反应， 反应结束后保存文件， 打开分析软件， 分析实验结果， 给出 ΔRn( 第 n 个循环时的荧光增加值 ) 与循环数图像。
(4) 引物与探针的特异性验证
利用所设计鉴别检测驴源性成分的特异性引物与探针， 分别以驴、 马、 鸡、 鸭、 鹌 鹑、 火鸡、 鸽、 鸵鸟、 鹧鸪、 牛、 绵羊、 山羊、 猪、 兔、 鱼、 鹿、 鹅、 狗等动物的总 DNA 为模板， 进行 实时荧光 PCR， 验证引物的特异性。检测结果如图 1 所示， A4 出现阳性扩增曲线， 其它样品 没有驴源性成分 DNA， 则没有信号， 显示上述引物和探针有良好的特异性。
(5) 实时荧光 PCR 的灵敏度验证
用裂解完全的猪肉样对裂解完全的纯驴肉样进行 10 倍梯度混合， 直至 10-7， 然后 按试剂盒说明提取 DNA 模板， 按上述 (3) 进行实时荧光 PCR， 结果如图 2。可知其检测低限 -6 -6 至少可达 10 纯驴肉样 DNA 浓度， 即该引物的灵敏度是 10 纯驴肉样品。5102311999 A CN 102312001序列 序列表表1/1 页
<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 <120> 驴或驴源性成分实时荧光 PCR 检测方法及检测用引物和探针 <130>33R <140>201110255683.1 <141>2011-08-31 <160>3 <170>PatentIn version 3.3 <210>1 <211>25 <212>DNA <213> 人工序列 <400>1 aatagctcta gccgtacggc taact <210>2 <211>26 <212>DNA <213> 人工序列 <400>2 caggataatg aatgtaataa gggctg <210>3 <211>25 <212>DNA <213> 人工序列 <400>3 tgccggacat cttctaatcc acctt 252625