有用的真菌菌株的选择.pdf

本发明提供了用于筛选理想的丝状真菌的方法，所述丝状真菌更有效的产生纤维素酶和/或具有增加的比活性。还提供了更有效的产生纤维素酶的丝状真菌。

1、  用于筛选理想的丝状真菌的方法，包括在测试的丝状真菌群体中筛选具有预定代谢速率的丝状真菌亚群，并基于预定的选择参数从丝状真菌亚群中选择理想的丝状真菌，其中所述选择参数表示测试的丝状真菌的碳利用效率。

2、  权利要求1的方法，其中通过基于底物的代谢速率选择丝状真菌来获得丝状真菌亚群，其中底物抗微生物的降解。

3、  权利要求1的方法，其中所述选择参数对应于相对于提供给测试的丝状真菌的预定碳量，测试的丝状真菌中的蛋白质产量。

4、  权利要求1的方法，其中所述选择参数对应于相对于提供给测试的丝状真菌的预定碳量，测试的丝状真菌所表达的纤维素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纤维素酶的产量。

5、  权利要求1的方法，其中所述选择参数对应于相对于测试的丝状真菌消耗的预定碳量，测试的丝状真菌中的蛋白质产量。

6、  权利要求1的方法，其中所述选择参数还包括与测试的丝状真菌中的蛋白质的生产力相对应的指标。

7、  权利要求1的方法，其中通过相对于预定量的测试丝状真菌，测试的丝状真菌在预定时间段内的蛋白质产量，来确定测试的丝状真菌中的蛋白质的生产力。

8、  权利要求1的方法，其中所述选择参数还包括相对于预定量的测试丝状真菌，与测试的丝状真菌表达的纤维素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纤维素酶的产量相对应的指标。

9、  权利要求1的方法，其中在固相测定中进行从测试的丝状真菌群体中筛选亚群。

10、  权利要求1的方法，其中测试的丝状真菌群体是针对抗生素预选择的丝状真菌群体。

11、  权利要求1的方法，其中测试的丝状真菌群体是针对多烯类抗生素预选择的丝状真菌群体。

12、  权利要求10的方法，其中所述抗生素选自制霉菌素、两性霉素B、双丙氨膦、cyclohexamidine、衣霉素、灰黄霉素、尼柯霉素Z、卡泊芬净、放线菌素D、布雷菲德菌素A和潮霉素。

13、  权利要求1的方法，其中测试的丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢属(Cephalosporium)、Ceriporiopsis、毛壳属(Chaetomium)、金小孢子属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌属(Magnaporthe)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、Phanerochaete、柄孢壳属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Pyricularia、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多孢属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、Thermomyces、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、发癣菌属(Trichophyton)、和栓菌属(Trametes)和侧耳属(pleurotus)。

14、  权利要求1的方法，其中测试的丝状真菌是里氏木霉，并且所述里氏木霉使用纤维素作为碳源。

15、  权利要求1的方法，其中测试的丝状真菌使用纤维素作为碳源。

16、  通过权利要求1的方法获得的丝状真菌。

17、  通过权利要求1的方法获得的丝状真菌，其中该丝状真菌是里氏木霉，并且它产生具有预定活性的纤维素酶的混合物。

18、  权利要求17的丝状真菌，其中所述活性是糖化作用。

19、  用于筛选理想的丝状真菌的方法，包括基于第一选择参数和第二选择参数来筛选测试的丝状真菌群体，其中第一选择参数表示测试的丝状真菌的代谢速率，第二选择参数表示测试的丝状真菌抗抗生素的能力。

20、  权利要求19的方法，其中第一选择参数表示代谢底物的速率，所述底物耐受微生物降解。

21、  用于筛选理想的丝状真菌的方法，包括基于预定的选择参数来筛选测试的丝状真菌群体，其中预定的选择参数表示测试的丝状真菌的代谢速率，并且其中测试的丝状真菌群体是针对抗生素预选择的丝状真菌群体。

22、  权利要求21的方法，其中所述预定的选择参数表示代谢底物的速率，所述底物耐受微生物降解。

有用的真菌菌株的选择
1.相关申请的引用
本申请要求于2007年6月15日提交的美国临时申请系列号US60/934,677的优先权，其全文并入到本文中作为参考。
2.政府资助
部分本工作得到隶属美国能源部基本合同No.DE-AC36-99GO10337的国立再生能源实验室的分包合同No.ZCO-30017-01的资助。因此，美国政府可以对本发明要求一定权利。
3.引言
丝状真菌是纤维素酶的有效生产菌，已探讨过它们生产纤维素酶的能力。纤维素酶是在纺织、洗涤剂和造纸业中具有经济价值的，并且对于生物燃料的生产日益重要，生物燃料的生产需要将植物物质水解为可发酵的糖。发现了三种主要类型的酶活性：外切葡聚糖酶或外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用，将纤维素转化为葡萄糖。需要鉴别理想的丝状真菌，特别是具有理想的蛋白质产率和产量，例如高纤维素酶产率和/或产量的丝状真菌。
4.概述
本文教导的内容至少部分基于这样的发现，即在筛选理想的丝状真菌的过程中可以组合一些参数。因此，本文教导的内容提供了基于至少两种参数来筛选理想的丝状真菌的方法，例如与代谢和碳利用相关的参数，及其获得的丝状真菌。
在一些实施方案中，本文教导的内容提供了用于筛选理想的丝状真菌的方法。本文中，在测试的丝状真菌群体中筛选具有预定的代谢速率的丝状真菌亚群。基于预定的选择参数，从丝状真菌亚群中选择理想的丝状真菌，所述预定的选择参数表示测试的丝状真菌的碳利用效率。在一些实施方案中，本发明提供了通过该筛选方法获得的丝状真菌。
在一些实施方案中，本文教导的内容提供了用于筛选理想的丝状真菌的方法。本文中，基于第一选择参数和第二选择参数来筛选测试的丝状真菌群体。第一选择参数表示测试的丝状真菌的代谢速率，第二选择参数表示测试的丝状真菌抵抗抗生素的能力。
在一些实施方案中，本文教导的内容提供了用于筛选理想的丝状真菌的方法。本文中，测试的丝状真菌群体是预选择抗抗生素的丝状真菌群体，并且基于预定的选择参数进行筛选，所述预定的选择参数表示测试的丝状真菌的代谢速率。
下文提出了本文教导的内容的各方面特征。
5.附图的简要说明
本领域技术人员可以理解附图仅用于示例目的。附图并非意在以任何方式限制本教导的范围。
图1显示与41G菌株相比，A83菌株的蛋白质产量的改善。
图2显示与A83菌株相比，41G菌株的比活性优势。
图3显示A83菌株的改进，以及产率(灰色框)和产量(白色框)的提高。
图4显示41G和A83在糖化作用测定中的性能。
6.不同实施方案的详细说明
仅利用下列定义和实例，通过参照详细的描述本文教导的内容。本文中除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员常规理解的相同含义。数值范围包含了定义该范围的数字。本文提供的标题不是各方面或实施方案的限制，可以通过参考说明书整体得出。因此，通过参考说明书整体更全面的定义了下文直接定义的术语。
本文中使用的术语“多肽”指由通过肽键连接的氨基酸残基单链组成的化合物。本文中使用的术语“蛋白质”与术语“多肽”可互换使用。
术语“核酸”与术语“多核苷酸”是可互换的使用的，涵盖了单链或双链DNA、RNA、cDNA及其化学修饰。因为遗传密码是简并的，可以使用一个以上的密码子编码特定的氨基酸，因此本发明涵盖了编码特定氨基酸序列的所有多核苷酸。
术语“回收的”、“分离的”和“分隔的”在本文中是可互换的使用的，指从中去除了与其天然相关的至少一种组分的蛋白质、细胞、核酸、氨基酸等。
如本文中使用的，术语“基因”指涉及生产多肽链的多核苷酸(例如，DNA片段)，可以包括或不包括在编码区前后的区域，例如，5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列，和3’UTR或“拖尾”序列，以及位于单个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文中使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
如本文中使用的，术语“表达”指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
术语“分泌蛋白”指在蛋白质分泌过程中从细胞释放的多肽的区域。在一些实施方案中，分泌蛋白是从本发明的重组融合多肽中释放或切割的蛋白质。
术语“分泌”指蛋白质在宿主细胞中跨过膜到胞外空间和周围基质中的选择性移动。
如本文中使用的，特别当涉及蛋白质或酶时，术语“生产”或“产生”指蛋白质或酶的表达和/或分泌。
如本文中使用的，术语“培养”指在液体、半固体或固体培养基的合适条件下生长细胞群体。
如本文中使用的，“取代”或“修饰”是可互换的使用的，指序列(例如氨基酸系列或核酸序列)，其包含天然发生序列的缺失、插入、取代或中断。通常，在本发明的上下文中，取代的序列应该指例如天然存在的残基的取代。
如本文中使用的，“修饰的酶”指酶，其包含天然发生序列的缺失、插入、取代或中断。
术语“变体”指蛋白质的区域，其与对照蛋白质例如天然存在的或野生型的蛋白质相比包含一个或多个不同的氨基酸。
如本文中使用的，术语“亲代菌株”指在暴露于产生遗传多样性的试剂前存在的真菌细胞株。在一些实施方案中，亲代菌株已经是高产菌株，或具有有利的或理想的特征。在暴露于试剂之后，“亲代细胞”成为遗传多样的测试细胞群体。由于产生遗传多样性的过程的随机本质，预期产生许多不同类型的细胞。因此，当使用选择技术时，大量不同的测试细胞处于选择中。
术语“测试细胞”或“测试的丝状真菌群体”在本文中可互换的使用，通常指从丝状真菌亲代菌株产生的遗传多样的真菌细胞。术语还涵盖了测试细胞的任何后代。
根据在上文描述的测定中确定的，根据生长特性、酶产量水平和/或其它选择标准，分离“改良的细胞”。该术语还涵盖了改良的细胞的任何后代。可以分离并增殖改良的细胞，来建立新的改良真菌菌株。改良细胞的非限制性实例表现出下列特征：(i)与亲代细胞相比增加的密码子利用效率；(ii)与亲代细胞相比，产生的一种或多种蛋白质或酶的改良的比活性；(iii)通过例如测量每克碳输入产生的蛋白质或酶的克数，确定的整体提高的产率；(iv)在正常温度下，一种或多种蛋白质或酶的较高的生产水平；和/或(v)在升高的温度下，比亲代细胞更好的维持蛋白质或酶产量的能力。
作为非限制性实例，里氏木霉(Trichoderma-reesei)生产纤维素酶的正常温度范围是24℃至28℃。根据本文教导的内容，用于里氏木霉的选择温度可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃或48℃。在一些实施方案中，在液相中实施培养。根据实验设计，可以使用一系列选择温度。选择用于培养的选择温度依赖于其它因素，例如但不限于生长速率、存活力和测试细胞产生的不同类型纤维素酶的分布，并且可以由本领域技术人员确定。
术语“纤维素酶”或“纤维素水解酶”可互换的使用，指能够将纤维素(β-1，4-葡聚糖或βD-糖苷键)多聚物水解为更短的纤维寡糖寡聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。通常，酶的种类包括但不限于，(i)内切葡聚糖酶(EG)或1，4-β-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC 3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，包括1，4-β-d-葡聚糖葡聚糖水解酶(也称为纤维糊精酶)(EC 3.2.1.74)和1，4-β-d-葡聚糖纤维二糖水解酶(外切-纤维二糖水解酶，CBH)(EC 3.2.1.91)，和(iii)β-葡糖苷酶(BG)或β-葡糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)。
术语“外切-纤维二糖水解酶”(CBH)指分类为EC 3.2.1.91和/或在一些GH家族中的纤维素酶，包括但不限于在GH家族5、6、7、9或48中的那些。这些酶也已知是外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶。CBH酶从纤维素的还原端或非还原端水解纤维素。通常，CBHI型的酶优先从纤维素的还原端水解纤维素，CBHII型的酶优先水解纤维素的非还原端。
术语“纤维二糖水解酶活性”在本文中定义为1，4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶活性，其催化纤维素、纤维四糖或任何含有β-1，4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β-D-糖苷键水解，从链的末端释放纤维二糖。如本文中使用的，通过Lever等人，1972，Anal.Biochem.47：273-279的PHBAH方法测量从纤维素释放的水溶性还原糖，来确定纤维素水解酶的活性。通过相似的测量从取代纤维素(例如，羧甲基纤维素或羟乙基纤维素)释放的还原糖来区分纤维二糖水解酶的外切葡聚糖酶攻击模式和内切葡聚糖酶攻击模式(Ghose，1987，Pure & Appl.Chem.59：257-268)。与取代的纤维素相比，真实的纤维二糖水解酶对未取代的纤维素将具有非常高的活性比例(Bailey等人，1993，Biotechnol.Appl.Biochem.17：65-76)。
术语“内切葡聚糖酶”(EG)指分类为EC 3.2.1.4和/或在一些GH家族中的纤维素酶组，包括但不限于在GH家族5、6、7、8、9、12、17、31、44、45、48、51、61、64、74或81中的那些。EG酶水解纤维素内部的β-1，4-糖苷键。术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内-1，4-(1，3；1，4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素)、地衣淀粉、混合了β-1，4键的β-1，3-葡聚糖(例如，谷β-D-葡聚糖或木聚糖)和含有纤维素组分的其他植物材料中的1，4-β-D-糖苷键的内水解。如本文中使用的，根据Ghose，1987，Pure and Appl.Chem.59：257-268的程序，利用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定内切葡聚糖酶活性。
术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为分类为EC 3.2.1.21和/或在一些GH家族中的β-D-葡糖苷葡糖水解酶，包括但不限于在GH家族1、3、9或48中的，其催化纤维二糖的水解，释放β-D-葡萄糖。如本文中使用的，可以通过本领域已知的方法，例如HPLC测量β-葡糖苷酶活性。“纤维素分解活性”涵盖了外切葡聚糖酶活性、内切葡聚糖酶活性或两类酶活性，以及β-葡糖苷酶活性。
术语“丝状真菌”意指本领域技术人员识别的任何的和所有的丝状真菌。通常，丝状真菌是真核微生物，包括真菌亚门的所有丝状形式。这些真菌的特征是具有包含几丁质、β-葡聚糖和其他复杂多糖的细胞壁的营养菌丝。在一些实施方案中，本文教导的丝状真菌与酵母是形态学、生理学和遗传学不同的。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于下列属：曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢属(Cephalosporium)、Ceriporiopsis、毛壳属(Chaetomium)、金小孢子属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌属(Magnaporthe)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、Phanerochaete、柄孢壳属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Pyricularia、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多孢属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、Thermomyces、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、发癣菌属(Trichophyton)、和栓菌属(Trametes)、侧耳属(pleurotus)。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于下列：构巢曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awomari)，例如NRRL 3112、ATCC22342(NRRL 3112)、ATCC 44733、ATCC 14331和菌株UVK 143f、米曲霉(A.oryzae)，例如ATCC 11490，粗糙链孢霉(N.crassa)、里氏木霉(Trichoderma reesei)，例如NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767和绿色木霉(Trichoderma viride)，例如ATCC 32098和32086。
本文中使用的术语“木霉”或“木霉种”指曾经分类为木霉种或菌株，或者目前分类为木霉种或菌种，或肉座菌属种或菌株的任何真菌生物。在一些实施方案中，种包括长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、绿色木霉或红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。还考虑用作原始菌株的是纤维素-过量生产菌株，例如长枝/里氏木霉RL-P37(Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology，20(1984)第46-53页；MontenecourtB.S.，Can.，1-20，1987)和RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。
在一些实施方案中，本文教导的内容提供了用于筛选理想的丝状真菌的方法，通过在测试的丝状真菌群体中基于预定的选择参数筛选具有预定的代谢速率的丝状真菌亚群，从丝状真菌亚群中选择理想的丝状真菌。测试的丝状真菌群体可以是从中可选择理想的丝状真菌的合适群体。在一些实施方案中，测试的丝状真菌群体是遗传多样的丝状真菌群体。获得遗传多样的测试丝状真菌群体的方法是本领域技术人员已知的，本文中描述了示例性的方法。在一些实施方案中，测试的丝状真菌群体是暴露于突变诱导条件之后的丝状真菌群体。
根据本文教导的内容，可以通过将丝状真菌群体暴露于在细胞基因组中产生遗传多样性的试剂下，来获得遗传多样的丝状真菌群体。在一个实施方案中，产生遗传多样性的试剂是导致基因组中局部核苷酸改变的诱变剂。可以通过此类诱变剂，利用本领域已知的任何方法，诱变亲代细胞和测试细胞。例如，可以通过辐射实现细胞诱变，例如紫外光、X-射线或γ辐射。可选的，可以通过用化学诱变剂处理来实现诱变，例如，亚硝酸、亚硝胺、甲基亚硝基胍、甲磺酸乙酯和碱基类似物例如5-溴尿嘧啶。在一个实施方案中，利用转座子、限制性酶介导的整合(REMI)或农杆菌-介导的转化，进行插入突变。
在一些实施方案中，在亲代细胞或测试细胞中产生遗传多样性的试剂是导致基因组总体改变的细胞遗传学剂，通常在细胞遗传学或染色体水平，例如但不限于同源多倍体形成、微核形成、多核体形成、染色体重排、染色体再分布、染色体畸变、染色单体缺失、大规模重组等。许多此类试剂是已知的，包括但不限于秋水仙碱(通常以0.1％v/v使用)。
在一些实施方案中，诱变剂用于亲代菌株或测试菌株的孢子，存活的孢子接种在固体培养基上。以不同的细胞密度接种细胞以有利于生长和通过视觉观察或其它方法鉴别。在其它实施方案中，在遗传多样化步骤中还可以使用除孢子以外的其它形式的真菌生物体。在一些实施方案中，试剂是诱变剂，其施用剂量是产生约1-99.9％致死率的剂量。在不同的实施方案中，试剂是诱变剂，其施用的剂量产生约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％的致死率。在一些实施方案中，诱变剂是亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍-MNNG)或甲磺酸乙酯(氮芥子气)。(参见Gerhardt等人，1994，Methods for general and molecular bacteriology，American Society for microbiology，第297-316页)。
可以通过任何目前已知的或本领域后来发现的方法，在测试的丝状真菌群体中筛选具有预定的代谢速率的丝状真菌亚群。在一些实施方案中，遗传多样的测试丝状真菌群体培养在包含丝状真菌代谢底物的培养基中，具有预定的代谢速率的丝状真菌亚群是表现出比剩余的丝状真菌群体更高生长速率的真菌。用于确定代谢速率的底物可以是本领域技术人员已知的允许代谢速率存在可区分的差异的任何底物。可以使用本领域用于培养丝状真菌的任何已知的基础培养基来制备培养基。在一些实施方案中，底物是耐受微生物降解的。在一些实施方案中，底物是纤维素。在一些实施方案中，培养基包含纤维素，且纤维素是唯一的碳源和能量来源。在一些实施方案中，培养基基本不含二糖和单糖。在一些实施方案中，在能够批量培养和筛选大群体测试细胞的固相中实施培养。在一些实施方案中，纤维素是纯化的纤维素，包括但不限于微晶纤维素，例如溶于水的(FMC Biopolymer，Philadelphia，PA)，剪切后形成三维基质，包含不可溶的微晶体，其形成特别稳定的触变凝胶。
在一些实施方案中，可以在固相测定中对测试的丝状真菌群体进行亚群体的筛选。固相测定的合适的、非限制性的实例是纤维素平板筛选(CPS)。测试的丝状真菌群体培养在两层固体培养基中，每层培养基包含纤维素作为能量或碳的唯一来源或有限来源。两层可以保护相同的成分，甚至相同浓度的成分，优选在平板中制备。固体培养基优选的包含琼脂，例如1.5％(w/v)琼脂。底层包含测试细胞群体，优选孢子，而顶层不包含任何真菌细胞。将包含顶层和位于底层的真菌细胞的平板在一定温度下孵育一定时间，使真菌细胞在固体培养基中生长。顶层的厚度在整个平板是均一并受控的，使得消耗纤维素的生长最快的真菌细胞出现在顶层的表面。在一些实施方案中，丝状真菌亚群的改进的细胞是表现出比所述测试细胞群体生长速率的50^th、60^th、70^th、80^th、90^th、95^th或98^th百分位更高的生长速率的细胞。突破顶层表面的测试细胞是可目测检测的，可以方便的通过本领域已知的技术分离。典型的，顶层的厚度范围从约2.5mm、5mm、7.5mm、10mm、12.5mm、15mm、17.5mm、20mm、25mm至约30mm。
在一些实施方案中，该固相测定可以独立的使用或在选择方案的结束时使用，以有利于分离改良的细胞和通过在纤维素中的生长速率来评定改良的细胞。在一些实施方案中，还可以在这样的温度下实施固相测定，所述温度高于测试的丝状真菌群体通常产生纤维素酶的温度。
本文教导的内容还提供了基于预定的选择参数，从丝状真菌亚群中选择理想的丝状真菌的方法。预定的选择参数可以是任何可测定的参数和指标，例如测试的丝状真菌的碳利用效率。可以通过多种参数测定碳利用效率，包括但不限于通过丝状真菌产生的一种或多种理想多肽或酶的产率，丝状真菌的生产力，和丝状真菌产生的酶的比活性。在一些实施方案中，预定的选择参数表示确定的热力学稳定性，例如，通过在普通温度下一种或多种蛋白质或酶的较高生产水平，或通过在较高温度下维持比亲代细胞更好的蛋白质或酶生产水平。
根据本文教导的内容，可以通过例如测量每克碳输入产生的多肽或酶的量(克)来确定产率。在一些实施方案中，碳输入对应于提供给丝状真菌的碳量，或者，它可以对应于测试的丝状真菌消耗的碳量。可以通过例如测量蛋白质的产量，例如相对于预定量的测试丝状真菌，在预定的时间段内产生的多肽或酶的量(克)，来确定产量。在一些实施方案中，本文教导的方法提供了丝状真菌的选择，所述丝状真菌产生具有增加的产率、增加的生产力、增加的比活性或其任意的组合的多肽或酶。在一些实施方案中，丝状真菌还产生具有改善的热稳定性的多肽或酶。
本文教导的理想的酶或多肽包括但不限于纤维素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纤维素酶。在一些实施方案中，选择参数表示产生纤维素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纤维素酶的丝状真菌的碳利用效率。在一些实施方案中，选择参数还包括与测试的丝状真菌中表达的纤维素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纤维素酶的产量相对应的指标。
在一些实施方案中，测试的丝状真菌群体是预选择的丝状真菌。预选择的标准可以是任何可测定的标准，包括但不限于对抗生素试剂的耐受性。抗生素可以是本领域已知的任何抗生素，包括但不限于双丙氨膦、cyclohexamidine、衣霉素、灰黄霉素、尼柯霉素Z、卡泊芬净、放线菌素D、布雷菲德菌素A和潮霉素，以及多烯类抗生素。多烯类抗生素的合适的非限制性实例包括制霉菌素和两性霉素B。
本文教导的方法可用于筛选丝状真菌的任何理想菌株。在一些实施方案中，测试的丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢属(Cephalosporium)、Ceriporiopsis、毛壳属(Chaetomium)、金小孢子属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、镰孢属(Fusarium)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌属(Magnaporthe)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、Phanerochaete、柄孢壳属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Pyricularia、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多孢属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、Thermomyces、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、发癣菌属(Trichophyton)、栓菌属(Trametes)和侧耳属(pleurotus)。在一些实施方案中，测试的丝状真菌是木霉。在一些实施方案中，测试的丝状真菌里氏木霉。在一些实施方案中，测试的丝状真菌是使用纤维素作为碳源的里氏木霉。
在一些实施方案中，本文教导的内容提供了通过上述方法获得的丝状真菌。在一些实施方案中，丝状真菌是木霉，例如里氏木霉。在一些实施方案中，通过本文教导的方法获得的丝状真菌是里氏木霉，其产生具有预定活性的纤维素酶混合物。活性可以是具有改良性质的菌株理想的任何活性。在一些实施方案中，活性是糖化作用。
在一些实施方案中，本文教导的内容提供了筛选理想的丝状真菌的方法，包括基于两种或多种选择参数的组合来筛选测试的丝状真菌群体。在一些实施方案中，基于两种选择参数，第一选择参数和第二选择参数来筛选测试的丝状真菌群体。可以选择选择参数的任意组合来获得理想的丝状真菌改良菌株。在一些实施方案中，第一选择参数表示测试的丝状真菌的代谢速率，第二选择参数表示测试的丝状真菌抵抗抗生素的能力。在一些实施方案中，第一选择参数表示代谢耐受微生物降解的底物的速率，例如纤维素。
在一些实施方案中，本文教导的内容提供了筛选理想的丝状真菌的方法，包括基于预定的选择参数来筛选测试的丝状真菌群体，所述选择参数表示测试的丝状真菌代谢例如耐受微生物降解的底物的速率。本文中，测试的丝状真菌群体已经针对抗生素进行预选择。
根据下列实施例可以进一步理解本文教导的各方面，所述实施例不应理解为对本文教导内容范围的限制。对本领域技术人员显而易见的是，可以在不脱离本文教导内容的条件下，对材料和方法实施许多修饰。
7.实施例
实施例7.1突变体制备，培养基和溶液
使用纤维素酶筛选培养基来分离具有改良的蛋白质产量的变体。纤维素酶筛选培养基包含20ml的50X Vogels母液，0.5g(FMCBiopolymer，Philadelphia，PA)，和20g的琼脂，980ml dH2O。50X Vogels母液是通过溶解以下物质制备的：(1)150g柠檬酸钠·2H₂O；10gMgSO₄·7H₂O；和溶于300ml的dH₂O中的5g CaCl₂·2H₂O；(2)溶于500dH₂O的250g KH₂PO₄；(3)溶于200ml dH₂O中的100g NH₄NO₃。一起加入溶液，并加入5ml的Vogels微量元素溶液和2.5ml的Vogels生物素溶液。Vogels微量元素溶液含有1升dH₂O，50g柠檬酸；50g ZnSO₄·7H₂O；10g Fe(NH₄)₂SO₄·6H₂O；2.5g CuSO₄·5H₂O；0.5g MnSO₄·4H₂O；0.5g H₃BO₃(硼酸)；和0.5g NaMoO₄·2H₂O。(参见Davis等人，1970，Methods inEnzymology 17A，79-143；和Davis等人，2000，Neurospora，Contributionsof a Model Organism，Oxford University Press，for information on Vogelsminimal medium)。Vogels生物素溶液包含溶于1升水中的0.1g d-生物素。通过在28℃下，250ml摇瓶中，150rpm孵育突变体96h，检测摇瓶中的总蛋白质产量，摇瓶含有50mL乳糖基本培养基，如Ilmen等人，1997，AppEnviron Microbiol 63，1298-1306中描述的，只是包含100mM哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)(PIPES；Calbiochem)用来维持pH在5.5。在TCA沉淀后，利用Pierce(Rockford，IL)提供的BCA测定法对上清液进行蛋白质测定。
可以使用本领域用于培养丝状真菌的任何已知的基本培养基来制备在培养步骤中使用的培养基。
用里氏木霉菌株A83开始下列实验，相对于菌株RL-P37，A83菌株是高产菌株。为了产生遗传多样性，用甲基化化合物N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)突变细胞。NTG是可使用的最有效的诱变剂之一；它主要诱导GC向AT型的碱基转换突变(但是也以低频率产生AT向GC的转变、颠换和移码)。当第一次突变菌株时，制备杀死曲线。从零时开始，每30分钟采样并进行活孢子计数。一旦建立了杀死曲线，仅进行零时和最终的活力计数，以保证获得正确的％杀死。例如，通过分别用NTG孵育孢子1.5小时和3小时，制备了50％杀死文库和99％杀死文库。从RL-P37衍生的改良菌株包括利用99％杀死文库获得的A83、T4、NY27和41G。在孵育后，通过在水中洗涤孢子至少3次去除NTG。制备突变孢子的等分试样，并在-70℃储存于甘油中。
制备新鲜的真菌平板，用于获得含有约1x10⁹孢子形成单位/ml的孢子悬浮液。利用血球计数器确定孢子形成单位数/ml。在DMSO中新鲜制备NTG(Aldrich-4991)的溶液，浓度为15mg/mL，并添加终浓度为1.0mg/mL的真菌孢子悬浮液。然后在室温下黑暗中孵育真菌孢子悬浮液，直到获得理想的99％杀死。
分离T4。制备纤维素酶筛选培养基，在水浴中冷却至55℃。在小的培养皿(82mm)中，在平板中心和边缘之间约1/2c处以圆圈分散含有约1百万突变孢子的等分试样，并加入10ml的纤维素酶筛选培养基(上述)。然后，旋转平板使孢子分散在平板的中央，但不分散至边缘，放置硬化约5-10分钟。加入25ml纤维素酶筛选培养基，使其硬化。然后加入另外10ml纤维素酶筛选培养基，在28℃孵育平板过夜。第二天，利用解剖显微镜每4小时检查平板的表面的生长情况。对于每个文库，确定菌落到达平板表面的大致时间。
利用无菌刀片收集到达琼脂表面的前1-3个分离株，忽略在边缘出现的菌落。在显微镜下观察菌落，使用刀片接触菌落的表面，注意不要挖入琼脂内。去除小片的菌丝体，并置于PDA上，在28℃孵育。一旦生长，在摇瓶中评估分离株的总蛋白产量。
在第一轮筛选后，发现T4产生比亲代A-83多25％的总蛋白(表1)。
表1.RL P-37、A-83、T4、NY27和41G在摇瓶中的蛋白质产量。