一种改善土壤连作障碍的微生物制剂及制作方法.pdf

本发明涉及一种改善土壤连作障碍的微生物制剂及制作方法，其特征是：目的菌种利用采样土壤的浸出液进行选育，通过液体高速培养和固体扩大培养的发酵技术，产品菌株主要选用温室土壤中缺乏的合成性合成型微生物组成，使用后可在土壤中形成稳定的系统，同时，特殊的基质载体可以保证土壤透气疏松，便于好气性的有益菌生长，可以从抑制土传病害、改善土壤其他交换及形成稳定的有益菌生态土壤系统等方面比较全面的解决或防治土壤连作障碍的难题，是一种新型的微生物农业技术产品。

1.  一种改善土壤连作障碍的微生物制剂，其特征在于，由以下重量份的由土壤浸泡液筛选出的菌种组成：荧光假单胞菌10-13份、原褐固氮菌20-23、枯草芽孢杆菌30-33份、甲基单胞菌10-13份、链霉菌18-30份。

2.  根据权利要求1所述的一种改善土壤连作障碍的微生物制剂的制备方法，其特征在于，其生产工艺为：
第一步：发酵菌株选育
a.菌种筛选：选用生长良好的种植土壤用常规方法进行微生物灭菌，将灭菌后的土壤加入10倍重量份的无菌水浸泡24-36小时，在浸出液中用光合细菌培养基筛选出红假单胞菌、用固氮培养基(AzotobacterMedium)筛选原褐固氮菌、用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(LB)筛选枯草芽孢杆菌、甲基单胞菌，利用马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基筛选链霉菌；
b.摇瓶计数筛选：将筛选到的以上菌种用浓度为0.9％的生理盐水稀释至10^-5-10^-7后的菌悬液在营养琼脂平板中35℃倒置培养48h，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，观察菌种生长速度，筛选数量高于50亿/ml的菌种；
C、生产菌种的制作：荧光假单胞菌、原褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、甲基单胞菌、链霉菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在35-40℃温度下培养45-50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2-6℃的冰箱中保存；
第二步：有益菌株的液体培养
a.按以下重量份称取各菌种：荧光假单胞菌10-13份、原褐固氮菌20-23份、枯草芽孢杆菌30-33份、甲基单胞菌10-13份、链霉菌18-30份；
b.菌种的液体培养：将称取以上菌种的混合菌苔按照1∶25-30的比例接种于经过120-130℃、30-45min高温灭菌的液体培养基中，在发酵罐中搅拌培养，其转速为220-240r/min，时间28-32小时，发酵通气量维持在1∶1，温度30-32℃；
C、发酵24小时后每隔2小时检测发酵液ph值和活菌总数，当活菌总数达到50亿/ml，Ph值达到7.5-8.0时停止发酵；
第三步：菌种的固体扩大培养
b.将步骤2复合培养的菌液混合后按1∶25-30的比例接入经过120-130℃、30-45min高温灭菌的固体扩大培养基中，搅拌30-45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度28-30℃，时间8-10天；
b、发酵7天后每隔4小时取样，测定水分和Ph值，测定水分为35-40％、Ph值为7.0-8.2时停止发酵；
第四步：粉碎添加基质载体
a.干燥：将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在42-45℃，时间14-16小时，干燥完成的物料水份控制在≤24％；
b.添加基质载体：将干燥后的培养物按照：菌种培养物45份-50份、基质载体50份-55份的比例混合添加，所述基质载体为灭菌木屑和灭菌秸秆粉；
c.过筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数：水份≤11.8％、活菌数25-30亿/g、物理性状：棕黄色粉末状固体。

3.  根据权利要求2所述的一种改善土壤连作障碍的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤2中的液体培养基为无菌水再加玉米浆、大麦淀粉、硫酸氢铵、糖蜜、磷酸钾、硫酸钾、微量元素溶液中至少三种混合物组成，其重量份为玉米浆2-3份、大麦淀粉1-2份、硫酸氢铵0.1-0.3份、糖蜜10-14份、磷酸钾1.2-2份、硫酸钾0-0.8份、微量元素溶液0.3-0.5份、无菌水77.4-85.4份。

4.  根据权利要求2所述的一种改善土壤连作障碍的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中的固体扩大培养基为无菌水再加清糠、豆粕粉、酵母粉、玉米粉、磷酸二氢钾、硫酸锰、大蒜汁中的至少四种混合物组成，其重量份为：清糠40-42份、豆粕粉10-12份、酵母粉1-1.2份、玉米粉8-10份、磷酸二氢钾0.8-1份、硫酸锰0-0.4份、大蒜汁1-1.2份、无菌水32.2-39.2份。

5.  根据权利要求2所述的一种改善土壤连作障碍的微生物制剂的制备方法，其特征在于，所述的基质载体由无菌木屑、无菌秸秆粉组成，其重量百分份为：木屑55-60、秸秆粉40-45。

一种改善土壤连作障碍的微生物制剂及制作方法
技术领域
本发明涉及一种改善土壤连作障碍的微生物制剂及制作方法，特别涉及一种改善土壤连作障碍的技术和产品，可以显著改善土壤团粒结构、减少土传病害，抑制土壤连作障碍的发生，属于微生物在农业生产应用技术领域。
背景技术
连作障碍是指在同一土壤中连续种植同一作物或近缘作物以后，产量降低、品质变劣、病害加重、生育状况变差、甚至无法生长的现象，俗称：“重茬病”
蔬菜、瓜果是高度集约化的作物，复种指数较高，现在一般都采用温室栽培，由于处于相对封闭的环境，因此连作障碍十分普遍，连作障碍涉及到土传病害、土壤肥力、复种指数、微生物群落、长期使用农药或管理不善等多种因素的影响，所以在世界范围内还没有找到解决的办法。
随着城市化进程的加速，蔬菜、瓜果的价格也在逐渐上升，受经济利益的驱动，以片面追求高产为首要目的，在土地有限的情况下，大量地使用化肥和农药，致使连作障碍的时间间隔越来越短，病害越来越严重，为了减轻连作效应，人们又不断的在使用大量的农药和化肥，形成了恶性循环，除了发生土壤酸化、板结，肥力下降、肥料利用率低等负面因素外，还存在着极为严重的安全隐患；长期形成的离子态物质、有机污染物质及重金属等有害物质的连作效应进行着恶性循环，减少栽培时的病原菌数量和提高植株抗病性是目前采用的防治主要策略，主要有：
1.用轮作减少病害；
2.采用土壤化学物理消毒法消灭病原菌；
3.采用拮抗微生物抑制病原菌。
但是由于轮作的蔬菜一般都是同科属因此病害相同，同时在温室中蔬菜的病原植株和土壤的病害菌不易清除，而土壤病害和温室环境下干湿交替不明显，使土壤长期处于一种厌氧环境中，有益的好氧菌难以繁殖增加，使土壤中拮抗的微生物抑制细菌难以存活。
目前公布的一项专利申请文件，名为“白腐菌剂在改善土壤连作障碍中的应用”，申请号：200610017969.5，是采用一种白腐菌剂在土壤中深层施用，改善土壤结构，抑制病害，由于采用菌种单一，无法对土壤中复杂的病害进行有效的抑制，因此防治作用有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制土传病害、改善土壤其他交换及形成稳定的有益菌生态土壤，解决或防治土壤连作障碍的微生物制剂及制作方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种改善土壤连作障碍的微生物制剂，其特征在于，由以下重量份的由土壤浸泡液筛选出的菌种组成：荧光假单胞菌10-13份、原褐固氮菌20-23份、枯草芽孢杆菌30-33份、甲基单胞菌10-13份、链霉菌18-30份。
一种改善土壤连作障碍的微生物制剂的制备方法，其特征在于，其生产工艺为：
第一步：发酵菌株选育
a.菌种筛选：选用生长良好的种植土壤用常规方法进行微生物灭菌，将灭菌后的土壤加入10倍重量份的无菌水浸泡24-36小时，在浸泡液分别采用以下方法进行菌株筛选：用光合细菌培养基筛选出红假单胞菌、用固氮培养基(Azotobacter Medium)筛选原褐固氮菌、用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(LB)筛选枯草芽孢杆菌、甲基单胞菌，利用马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基筛选链霉菌；
b.摇瓶计数筛选：将筛选到的以上菌种用浓度为0.9％的生理盐水稀释至10^-5-10^-7后的菌悬液在营养琼脂平板中35℃倒置培养48h，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，观察菌种生长速度，筛选数量高于50亿/ml的菌种；
C、生产菌种的制作：荧光假单胞菌、原褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、甲基单胞菌、链霉菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在35-40℃温度下培养45-50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2-6℃的冰箱中保存；
第二步：有益菌株的液体培养
a.按以下重量份称取各菌种：荧光假单胞菌10-13份、原褐固氮菌20-23份、枯草芽孢杆菌30-33份、甲基单胞菌10-13份、链霉菌18-30份；
b.菌种的液体培养：将称取以上菌种的混合菌苔按照1∶25-30的比例接种于120-130℃、30-45min高温灭菌的液体培养基中，在发酵罐中搅拌培养，其转速为220-240r/min，时间28-32小时，发酵通气量维持在1∶1，温度30-32℃；
C、发酵24小时后每隔2小时检测发酵液ph值和活菌总数，当活菌总数达到50亿/ml，Ph值达到7.5-8.0时停止发酵；
第三步：菌种的固体扩大培养
a.将步骤2培养的菌液混合后按1∶25-30的比例接入120-130℃、30-45min高温灭菌的固体扩大培养基中，搅拌30-45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度28-30℃，时间8-10天；
b、发酵7天后每隔4小时取样，测定水分和Ph值，测定水分为35-40％、Ph值为7.0-8.2时停止发酵；
第四步：粉碎添加基质载体
a.干燥：将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在42-45℃，时间14-16小时，干燥完成的物料水份控制在≤24％；
b.添加基质载体：将干燥后的培养物按照：菌种培养物45份-50份、基质载体50份-55份的比例混合添加，所述基质载体为灭菌木屑和灭菌秸秆粉。
c.过筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数：水份≤11.8％、活菌数25-30亿/g、物理性状：棕黄色粉末状固体。
所述的步骤2中的液体培养基为无菌水再加玉米浆、大麦淀粉、硫酸氢铵、糖蜜、磷酸钾、硫酸钾、微量元素溶液中至少三种混合物组成，其重量份为玉米浆2-3份、大麦淀粉1-2份、硫酸氢铵0.1-0.3份、糖蜜10-14份、磷酸钾1.2-2份、硫酸钾0-0.8份、微量元素溶液0.3-0.5份、无菌水77.4-85.4份。
所述的步骤3中的固体扩大培养基为无菌水再加清糠、豆粕粉、酵母粉、玉米粉、磷酸二氢钾、硫酸锰、大蒜汁中的至少四种混合物组成，其重量份为：清糠40-42份、豆粕粉10-12份、酵母粉1-1.2份、玉米粉8-10份、磷酸二氢钾0.8-1份、硫酸锰0-0.4份、大蒜汁1-1.2份、无菌水32.2-39.2份。
所述的基质载体由无菌木屑、无菌秸秆粉组成，其重量百分份为：木屑55-60、秸秆粉40-45。
本发明利用采样土壤的浸出液，对现有菌种进行驯化培养，优选出目标菌种；采用摇瓶计数方法，对优选菌种进行优化；同时选用温室土壤中缺乏的合成性合成型微生物组成，使用后可在土壤中形成稳定的系统，同时，特殊的基质载体可以保证土壤透气疏松，便于好气性的有益菌生长，可以从抑制土传病害、改善土壤形成稳定的有益菌生态土壤，解决或防治土壤连作障碍。
在土壤连作障碍的诸多问题中，作物根际的微生物系统失调是连作障碍发生的主要原因，由于根系是植物吸收各种土壤营养也是生产发育最快的植物组织，因此其细胞代谢十分旺盛，其代谢产物和土壤环境中的有益、有害的各种微生物的交互作用，直接影响了土壤环境中的土传病害、理化环境和土壤团粒结构，因此是在土壤连作障碍改良中重点改良的环境，而土壤中新鲜有机物质的分解通常以腐败型为主，特别是在温室环境下干湿交替不明显，造成大量腐败菌在耕作中富集并保存下来，因此，在考虑有机物质的有效利用时，仅仅依靠发酵型微生物是不够的，还必须结合合成型微生物形成互动，本发明通过大量筛选得到的发酵、合成型微生物，使用后可在土壤中形成稳定的系统，在这样的系统中产生的各种有机物质如氨基酸、糖类、维生素、酯类物质和生理活性物质等，不仅容易为植物所吸收，而且能够成为其它有益微生物的基质。
本发明的优点是：
1、直接从健康土壤环境中筛选有益细菌和真菌，保证了菌种在土壤环境中的兼容性，可以在土壤中迅速根植并持续作用于植物根系；
2、采用的菌种摇瓶技术选取高产菌种，可以显著增加其菌种的生长速度，有利于在土壤中迅速形成有益的根系微生物环境；
3、采用液体高速培养和固体扩大培养的发酵工艺，既可以保证产品活菌数量在一个作用的高位，又可以让菌种在发酵过程中相互驯化，增加其兼容性；
4、采用特色的基质载体可以保证施用后土壤处于相对通畅的生长环境，有利于土壤团粒结构的形成和根系的正常呼吸作用，同时可以保证土壤中大多数有益的好氧菌的生长。抑制厌氧病原菌的繁殖；
5、产品的中芽孢杆菌能产生特殊的微生物免疫物质——杆菌肽，可以有效抑制病原微生物的生长；
6、本产品生产过程中采用的培养基均为粮食及副产品为主要原料，降低了生产成本，便于推广和实施。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
第一步：发酵菌株选育
a.菌种筛选：选用生长良好的种植土壤用常规方法进行微生物灭菌，将灭菌后的土壤加入10倍重量份的无菌水浸泡24小时，在浸出液中用光合细菌培养基筛选出红假单胞菌、用固氮培养基(Azotobacter Medium)筛选原褐固氮菌、用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(LB)筛选枯草芽孢杆菌、甲基单胞菌，利用马铃薯蔗糖琼脂(PDA)培养基筛选链霉菌；
b.摇瓶计数筛选：将筛选到的以上菌种用浓度为0.9％的生理盐水稀释至10^-5-10^-7后的菌悬液在营养琼脂平板中35℃倒置培养48h，选出生长速度快的菌落进行摇瓶实验，观察菌种生长速度，筛选数量高于50亿/ml的菌种；
C、生产菌种的制作：将荧光假单胞菌、原褐固氮菌、枯草芽孢杆菌、甲基单胞菌、链霉菌分别转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，在35℃温度下培养45小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2℃的冰箱中保存；
第二步：有益菌株的液体培养
a.按以下重量份称取各菌种：荧光假单胞菌10份、原褐固氮菌20份、枯草芽孢杆菌30份、甲基单胞菌10份、链霉菌30份。
b.菌种的液体培养：将称取以上菌种的混合菌苔按照1∶25的比例接种于120℃、30min高温灭菌的液体培养基中，在发酵罐中搅拌培养，其转速为220r/min，时间28小时，发酵通气量维持在1∶1，温度30℃；
C、发酵24小时后每隔2小时检测发酵液ph值和活菌总数，当活菌总数达到50亿/ml，Ph值达到7.5-8.0时停止发酵。
液体培养基重量份为玉米浆2份、大麦淀粉1份、硫酸氢铵0.1份、糖蜜10份、磷酸钾1.2份、微量元素溶液0.3份、无菌水85.4份。
第三步：菌种的固体扩大培养
a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1∶25的比例接入经过120℃、30min高温灭菌的固体扩大培养基中，搅拌30min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度28℃，时间8天；
b、发酵7天后每隔4小时取样，测定水分和Ph值，测定水分为35％、Ph值为7.0时停止发酵。
固体扩大培养基重量份为：清糠40份、豆粕粉10份、酵母粉1份、玉米粉8份、磷酸二氢钾0.8份、硫酸锰份、大蒜汁1份、无菌水-39.2份
第四步：粉碎添加基质载体
a.干燥：将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在42℃，时间14小时，干燥完成的物料水份控制在≤24％；
b.添加基质载体：将干燥后的培养物按照：菌种培养物45份、基质载55份的比例混合添加，所述基质载体为灭菌木屑和灭菌秸秆粉，其重量份配比为55∶45；
c.过筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数：水份≤11.8％、活菌数25-30亿/g；物理性状：棕黄色粉末状固体。
实施例2
第一步：发酵菌株选育
同实施例1；
第二步：有益菌株的液体培养
a.按以下重量份称取各菌种：荧光假单胞菌13份、原褐固氮菌23份、枯草芽孢杆菌33份、甲基单胞菌13份、链霉菌18份；
b.菌种的液体培养：将称取以上菌种的混合菌苔按照1∶30的比例接种于经过125℃、40min高温灭菌的液体培养基中，其余同实施例1。
C、同实施例1。
液体培养基重量份为玉米浆3份、大麦淀粉2份、硫酸氢铵0.3份、糖蜜14份、磷酸钾2份、硫酸钾0.8份、微量元素溶液0.5份、无菌水77.4份；第三步：菌种的固体扩大培养
a.将步骤2复合培养的菌液混合后按1∶30的比例接入经过125℃、40min高温灭菌的固体扩大培养基中，其余同实施例1；
b、同实施例1；
固体扩大培养基的重量份为清糠42份、豆粕粉12份、酵母粉1.2份、玉米粉10份、磷酸二氢钾1份、硫酸锰0.4份、大蒜汁1.2份、无菌水32.2份；第四步：粉碎添加基质载体
a.同实施例1；
b.添加基质载体：将干燥后的培养物按照：菌种培养物50份、基质载50份的比例混合添加，所述基质载体为灭菌木屑和灭菌秸秆粉，其重量配比为60∶40。
c.同实施例1。
播种或移栽前，按每株植物约5克的数量将本品均匀置于条沟或穴坑底部，上覆松土约五公分，即可播种或移栽，也可以在作物施用基肥时按每亩5-10kg与基肥混合均匀后施入土壤中施肥深度20-30cm，施用前后6-7天要避免化肥的使用，本发明需存放于密封干燥处，避免与农药、强刺激物品等混合堆放，开封后三日内尽快使用，本产品在研发完成后在崇明前进农场进行对比试验发现，使用本产品的蔬菜、瓜果类的发生连作障碍的几率降低了60％以上，作物病虫害减少15-20％，基本不需要再进行轮作栽种。