罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列及其应用 技术领域 本发明属于病毒基因组学技术领域， 具体涉及罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组序 列及其应用。
背景技术 罗氏沼虾 ( Macrobrachium rosenbergii DeMan, 1879 ) ， 又称淡水长臂大虾， 属于沼虾属 ( Macrobrachium )， 是我国淡水甲壳类动物主要养殖品种。根据联合国粮农 组织 ( FAO ) 于 2009 �的统计资�， 罗氏沼虾的全球养殖总产� 2008 �达到了的 207749 吨， 其中亚洲产�则为 127627 吨， 占全球产� 98%， 中国是全球最大的养殖国。
病毒是罗氏沼虾育苗和养殖过程中的主要病原， 暴发于 2009 年和 2010 年的罗氏 沼虾幼体综合症 （Macrobrachium rosenbergii larval Syndrome， MRLS） ， 造成罗氏沼虾在 幼体期出现大量死亡， 特别是在幼体 6-9 日龄死亡尤为严重， 死亡率一般为 80-90%， 严重 的达到 100%， 涉及我国主要罗氏沼虾育苗区域， 给罗氏沼虾育苗产业造成的经济损失无法 估量。经研究发现其主要病原为一种新的双顺反子病毒， 暂命名为罗氏沼虾双顺反子病毒 （Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus， MRDV） ， MRDV 为单正链 RNA 病毒， 归为双顺 反子病毒科， 被发现以来， 因无该病毒基因组相关信息， 更缺少检测方法， 严重阻碍了该病 毒引起疾病的诊断和预防工作， 因此该病毒基因组全序列的解析及其相关应用显得尤为重 要。
发明内容 针对现有技术存在的问题， 本发明的目的在于设计提供罗氏沼虾双顺反子病毒的 基因组序列及其应用的技术方案， 本发明为检测 MRDV、 研究 MRDV 感染途径等目的奠定可靠 的基础。
所述的一种分离的核酸分子， 其特征在于所述的核酸分子含有 SEQ ID NO:1 所示 核苷酸序列或其反义序列。
所述的一种分离的核酸分子， 其特征在于所述的核酸分子为 DNA 或 RNA。
所述的一种分离的核酸分子用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引物、 探针或 试剂盒。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列中连续的 150-10300 个核苷酸。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列中连续的 300-10300 个核苷酸。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序
列中连续的 1000-10300 个核苷酸。
所述的一种引物， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序列中 15-100 个连续核苷酸。
所述的一种探针， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序列中 25-7000 个连续核苷酸。
所述的一种试剂盒， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序列中 50-500 个连续核苷酸。
本发明对罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组进行测序， 得到了罗氏沼虾双顺反子病 毒的基因组全序列， 并且本发明利用该全序列用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引 物、 探针或试剂盒， 为检测 MRDV、 研究 MRDV 感染途径等目的奠定可靠的基础。 具体实施方式
本发明中的核酸可以是 DNA 形式或 RNA 形式。DNA 形式包括 cDNA、 基因组 DNA 或 人工合成的 DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。DNA 可以是编码链或非编码链。
本发明的基因组全序列或其片段通常可以用 PCR 扩增法、 重组法或人工合成的方 法获得。对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是开放阅读框序列 来设计引物， 并按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA 库作为模板， 扩增而得有 关序列。当序列较长时， 常常需要进行两次或多次 PCR 扩增， 然后再将各次扩增出的片段按 正确次序拼接在一起。 一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得 到有关序列。 第 一 方 面， 本 发 明 提 供 了 一 核 酸， 该 核 酸 含 有 在 SEQ ID NO:l 所 示 的 罗 氏 沼 虾双顺反子病毒的基因组核苷酸序列。还提供了含有与本文所公开的核苷酸序列有 序 列 相 同 性 的 序 列 的 核 酸。 根 据 具 体 的 序 列， 序 列 相 同 性 的 程 度 宜 大 于 50%( 例 如 60%,70%,80%,90%,95%,99% 或更高 )。这些序列包括例如突变体和等位基因变体。
本发明还提供了包含本文所公开的一种或多种核苷酸序列片段的核酸。这些 片段应包含诸序列中至少 n 个连续的氨基酸， 并且根据具体的序列， n 为 10 或更高 ( 例 如， 11,12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 30， 35， 40， 45， 50， 60， 75， 100 或 更 高 )。较佳地， 该片段是罗氏沼虾双顺反子病毒基因组特有的， 换言之在其他生物体的基因 组中并不存在。更佳地， 该片段是罗氏沼虾双顺反子病毒毒株的基因组特有的。本发明还 提供了与本文所提供的核酸发生杂交的核酸。杂交条件如本文中所述。
本发明还提供了一核酸， 该核酸包含与上述序列互补的序列 ( 例如， 用于反义、 用 于探针、 或用于扩增引物 )。
当然， 本发明的核酸可以用多种方法制备 ( 例如， 化学合成、 从 DNA 文库、 或从生物 体本身制得等 )， 并可采用各种形式 ( 例如单链、 双链、 载体、 探针、 引物等 )。术语 “核酸” 包 括 DNA 和 RNA， 以及它们的类似物， 如含有修饰骨架的那些类似物， 还包括肽核酸 (PNA) 等。
应理解， 因为 SEQ ID NO:l 代表了罗氏沼虾双顺反子病毒的完整基因组。
本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列的载体 ( 如表达载体、 测序载体、 克隆 载体等 ) 以及用这些载体转化的宿主细胞。
第二方面， 本发明还提供了一种蛋白质， 该蛋白质含有本文所示的罗氏沼虾双顺 反子病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列。 还提供了含有与这些蛋白质有序列相同性的 序列的蛋白。
根据具体的序列， 序列相同性程度宜大于 50%( 例如 60%,70%,80%,90%,95%,99% 或 更高 )。序列相同性用如上所述的方法确定。这些同源蛋白包括本文所示的罗氏沼虾双顺 反子病毒核苷酸序列中所编码的突变体和等位基因变体。
本发明还提供了一种蛋白质， 该蛋白质含有序列表中所公开的罗氏沼虾双顺反子 病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列片段。这些片段应包含诸序列中至少 n 个连续的氨 基酸， 并且根据具体的序列， n 为 7 或更高 ( 例如， 8,10,12,14,16,18,20 或更高 )。这些片 段宜包含该序列的表位。
本发明还提供了编码本发明蛋白的核酸。
第三方面， 本发明还提供了含有本发明核酸的核苷酸序列的计算机、 计算机存储 器、 计算机存储介质 ( 如软盘、 硬盘、 CD-ROM 等 ) 和 / 或计算机数据库。较佳地， 它含有本 文列出的一种或多种罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列。
这可用于分析本文所列出罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列。例如， 可用于检索 以鉴别序列中的开放阅读框 (ORF) 或编码序列。
第四方面， 本发明提供了鉴别氨基酸序列的方法， 它包括步骤 : 检索本文所列出 的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中推定的开放阅读框或蛋白编码序列。类似地， 本发 明提供了此处所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列在检索推定的开放阅读框或蛋 白质编码序列中的用途。
开放阅读框或蛋白编码序列分析通常在计算机上用标准的生物信息技术进行。 用于分析的典型算法或程序包括 :ORFFINDER (NCBI)， GENMARK[Borodovsky &Mcininth (1993)Computers Chem 17:122-133〕 和 GLIMMER[Salzberg et al. (1998)Nucl Acids Res 26:544-548]。
对开放阅读框或蛋白编码序列的检索可包括步骤 : 检索此处所列出的罗氏沼虾 双顺反子病毒核苷酸序列中的起始密码子和检索上游序列中的处于读框中终止密码子。 中 间的密码子就代表了推定的蛋白编码序列。通常， 应检索一个序列中 6 种可能的读框。
用这种方法鉴别出的氨基酸序列可用任何合适的系统进行表达， 以获得蛋白。该 蛋白可用于产生抗体， 而该抗体识别在鉴别出的氨基酸序列中的表位。这些抗体可用于筛 选罗氏沼虾双顺反子病毒， 以检测是否存在含所鉴别氨基酸序列的蛋白质。
此 外， 一旦 鉴别出 ORF 或蛋白编码 序列， 那 么 就可 将该序 列 与序列 数 据库进 行 比 较。 序 列 分 析 工 具 可 在 NCB 工 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov) 处 找 到， 例 如 BLAST,BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx， 和 tBLASTx 算 法 [ 还 可 参 见 Altschul 等 人 .(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25:2289-3402]。用于比较的合 适数据库包括非冗余 GenBank, EMBL,DDBJ 和 PDB 序列， 以及非冗余 GenBank CDS 翻译物， PDB,SwissProt,Spupdate 和 PIR 序列。这种比较可给出蛋白质功能的指示。
氨基酸序列中的疏水区可用以上算法加以预测， 例如基于 Esposti 等人的统计学 研究的算法 [“膜蛋白亲水性的关键评价” (Critical cvaluation of the hydropathy ofmembrane proteins)(1990)Eur J Biochem 190:207-219]。 疏水区代表了潜在的跨膜区或 疏水性前导序列， 这暗示蛋白质可以被分泌或位于表面。这些特性通常是良好免疫原的标 志。
类似地， 可用 PSORT 算法 (http://www. psort. nibb. ac. jp) 来预测跨膜区或 前导序列， 以及用 MOTIFS 程序来预测功能区 (GCG Wisconsin&PROSITE)。
本发明还提供了一种核酸， 该核酸含有本文所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷 酸序列中的开放阅读框或蛋白编码序列。此外， 基于本发明所提供的基因组序列， 还提供 了若干种蛋白质， 该蛋白质含有所述开放阅读框或蛋白编码序列所编码的氨基酸序列。例 如， SEQ ID NO ： 1 中第 392-6589 位的 ORF 就编码一个长度为 2065 个氨基酸的病毒蛋白酶 和 RNA 聚合酶前体蛋白 (pre-proprotein)(SEQ ID NO:2), SEQ ID NO ： 1 中第 6961-10053 位的 ORF 就编码一个长度为 1030 个氨基酸的病毒衣壳前体蛋白 (pre-proprotein)(SEQ ID NO:3)。
第五方面， 本发明提供了结合这些蛋白的抗体。 它们可能是多克隆的或单克隆的， 可用本领域技术人员已知的任何合适方法制得。
本发明的抗体可以以各种不同方式使用， 例如用于证实蛋白质的表达， 或用于证 实蛋白质表达的场所。例如， 标记的抗体 ( 如荧光标记以用于 FACS( 流式细胞分选仪 )) 可 以与完整的病毒一起孵育， 而在病毒表面上存在标记就证实蛋白质的位置。 第六方面， 本发明提供了各种方法。
本发明提供了一种生产本发明的蛋白的方法， 该方法包括步骤 : 在诱导蛋白表达 的条件下， 培育本发明的宿主细胞。一种方法还可包括化学合成蛋白或化学合成 ( 至少部 分合成 ) 核苷酸。
本发明提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法， 该方法包括下列步骤 :(a) 在 杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触， 形成双链体 ； 和 (b) 检测所述双链体。
本发明提供了一种检测本发明的蛋白质的方法， 该方法包括下列步骤 :(a) 在适 合形成抗体一抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触 ； 和 (b) 检测所述复合 物。
第七方面， 本发明提供了检测选择性结合于抗原或多肽或蛋白质的抗体的方法， 这些抗原或多肽或蛋白质是对罗氏沼虾双顺反子病毒的任何毒种或毒株特异性的， 较佳地 是对罗氏沼虾双顺反子病毒毒株特异性的， 但更佳地是对罗氏沼虾双顺反子病毒特异的。 该方法包括步骤 :(a) 在适合形成抗体 - 抗原复合物的条件下， 使本发明抗原或多肽或蛋白 质与生物样品接触 ； 和 (b) 检测所述复合物。
方法综述 本发明提供了罗氏沼虾双顺反子病毒 MRDV 核苷酸序列、 和其所编码的氨基酸序列。利 用这些所公开的序列， 可以产生核酸探针试验和表达盒及载体。 蛋白质还可化学合成。 表达 载体可以转入宿主细胞以产生蛋白。纯化或分离的多肤可用于产生抗体以检测 MRDV 蛋白。 而且， 宿主细胞或提取物可用于生物试验以分离促效剂和拮抗剂。此外， 利用这些序列， 人 们可检索以鉴定开放读框 (ORF) 和鉴定氨基酸序列。蛋白质还可用于免疫原性组合物以及 用作疫苗组份。
除非另有描述， 本发明的实施将采用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 和免疫学的
常规技术， 这些均是本领域技术人员所知的。
在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。
免疫诊断试验 本发明的罗氏沼虾双顺反子病毒抗原或开发的重组抗原， 可用来制备相应的实验动物 抗体， 该类抗体可用于免疫试验来检测临床罗氏沼虾样品的病毒抗原水平。免疫试验的设 计可作很大变化， 其各种方案均是本领域中已知的。
将合适的材料 ( 包括本发明的组合物 ) 以及进行试验所需的其它试剂和材料 ( 例 如合适的缓冲液、 盐溶液等 ) 和合适的试验说明书包装到合适的容器中， 构成适用于免疫 诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。
核酸杂交 “杂交” 指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常， 一个序列固定于固体载体， 另 一个将游离于溶液内。然后， 在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响这种 结合的因素包括 ： 溶剂的类型和体积 ； 反应温度 ； 杂交时间 ； 搅拌 ； 封闭液相序列与固体载 体非特异性结合的试剂 (Denhardt's 试剂或 BLOTTO) ； 各序列的浓度 ； 是否使用化合物来增 加序列结合的速度 ( 硫酸葡聚糖或聚乙二醇 ) ； 以及杂交后洗涤条件的严谨程度。 核酸探针试验 采用本发明的核酸探针的方法 ( 如 PCR、 分支 DNA 探针试验或印迹技术 ) 能确定 cDNA 或 mRNA 的存在。如果探针和本发明的序列能形成稳定地足以被检测到的双链体或双链复 合物， 则称探针与本发明的序列 “杂交” 。
核酸探针将与本发明的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列 ( 包括有义和反义链 ) 杂交。尽管有许多不同的核苷酸序列编码该氨基酸序列， 但是天然的罗氏沼虾双顺反子病 毒序列是较佳的， 因为它是实际存在于细胞中的序列。 mRNA 代表一种编码序列， 因此探针应 与该编码序列互补 ； 单链 cDNA 与 mRNA 互补， 因此 cDNA 探针应与非编码序列互补。
探针的确切长度和序列将取决于杂交条件， 如温度、 盐浓度等。例如， 对于诊断应 用， 根据分析物序列的复杂程度， 核酸探针通常含有至少 10-20 个核苷酸， 较佳的 15-25 个， 更佳的至少 30 个核苷酸， 但是也可短于该长度。短的引物通常需要较低温度， 以便和模板 形成足够稳定的杂交复合物。
探针可用合成方法产生， 例如 Matteucci 等人 [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 :3185] 的方法或 Urdea 等人 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 :7461] 的方法， 或 用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。
可以根据偏好选择探针的化学特征。对于某些应用， DNA 或 RNA 是合适的。对 于其它的应用， 可以加入修饰， 例如骨架修饰， 如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯， 可用来增加 体内半衰期， 改变 RNA 亲和力， 增加核酸酶抗性等 「例如参见 Agrawal 和工 yer (1995) CurrOpin Biotechnol 6:12-19 ； Agrawal(1996)T 工 BTECH14:376-387] ； 还可采用类似物 如肤核酸 [ 例如参见 Corey (1997) T 工 BTECH15:224-229 ； Buchardt 等人 (1993) TIBTECH 11:384-386]。
另外， 聚合酶链反应 (PCR) 是另一个熟知的检测少量靶核酸的手段。该试验在 Mullis 等人 [Meth. Enzymol. (1987) 155 :335-350] ； 美国专利 4, 683, 195 和 4, 683, 202 中有所描述。用两个 “引物” 核苷酸与靶核酸杂交， 并用来引导反应。引物可包含不与
扩增靶序列 ( 或其互补序列 ) 杂交的序列， 以帮助双链体的稳定性， 或例如可插入一个简便 的限制性位点。这些序列通常侧接所需的罗氏沼虾双顺反子病毒序列。
利用最初的靶核酸作为模板， 热稳定的聚合酶能从引物产生靶核酸的拷贝。在聚 合酶产生临界量的靶核酸后， 它们可用较传统的方法 ( 如 Southern 印迹 ) 来检测。当采用 Southern 印迹方法时， 标记的探针将与罗氏沼虾双顺反子病毒序列 ( 如其互补序列 ) 杂交。
另外， mRNA 或 cDNA 也可用 Sambrook 等人 〔同上〕 描述的传统印迹技术来检测。用 凝胶电泳可纯化井分离利用聚合酶从 mRNA 产生的 mRNA 或 cDNA。然后， 将凝胶上的核酸印 迹到固体载体如硝酸纤维素上。使固体载体与标记的探针接触， 然后洗涤除去所有未杂交 的探针。然后， 检测含有标记探针的双链体。该探针通常用放射活性物质作标记。
基因组序列的应用 基于对罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列的测定， 可以了解与该病毒增殖及重要调 控功能有关的基因结构和功能， 找到其分子生理机制以及如何侵染宿主的关键点， 寻找病 毒致病甚至致死基因。
一种应用方法是， 用罗氏沼虾双顺反子病毒感染罗氏沼虾幼体， 建立 cDNA 文库。 用双向末端法测定 cDNA 克隆， 或直接对 MRDV cDNA 的文库用 PCR 扩增的方法进行序列测定。 基于本发明所提供的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组序列， 可以大大方便引物的设计以及克 隆的进程。 另一种直接的应用是使用本发明的引物或探针， 来检测样品中是否存在罗氏沼虾 双顺反子病毒或其遗传物质。
对于探针而言， 这种检测方法包括步骤 : 将 DNA 样品与本发明的探针接触， 观察是否形成 DNA- 探针复合物， 形成了复合物就表示样品中存在罗氏沼虾双顺反子 病毒或遗传物质。
对于引物而言， 这种检测方法包括步骤 : 用本发明的特异性引物， 对样品进行 PCR 反应， 观察是否扩增产生了特异性的扩增产物， 产生了特异性扩增产物就表示样品中存在罗 氏沼虾双顺反子病毒或遗传物质。
在本发明的一个实例中， 罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组序列是通过如下方法获 得的， 该方法包括步骤 : 1. 分离纯化 MRDV 病毒， 获取高纯度 RNA 样品。
2. 以此 RNA 样品为模板， 以带有锚定序列的随机引物进行反转录反应， 以合成单 链 cDNA。继续以此 cDNA 为模板， 利用锚定序列引物， 在 Taq 和 Deep Vent DNA 多聚酶的作 用下进行 PCR 扩增， 并将扩增产物克隆入 T 载体， 进行序列测定， 获得大部分病毒序列 3. 将得到的序列输入计算机， 利用软件 ( 如 Innerpeace 软件 ) 进行拼接， 再经后期工 作得到完整的病毒基因组全序列。
经过多次反复测序， 在平均每个碱基测序约 6 次的基础上获得了如 SEQ ID NO : l 所示的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条
件如 Sambrook 等人， 分子克隆 : 实验室手册 (New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press,l989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例 1 病毒 RNA 的提取 取罗氏沼虾双顺反子病毒株 CN-NTH 感染的罗氏沼虾幼体， 进行组织研磨， 以体积比 1 ： 10 加 PBS 缓冲液， 超声破碎 3-5 秒， 将细胞破碎。4℃ 6000rpm 离心 30min 后取上清液， 用 0.22um 滤膜过滤除菌， 再进行蔗糖 / 甘油非连续密度梯度离心， 获得高纯度 MRDV 病毒， 用病 毒 RNA 提取试剂盒提取病毒 RNA。
逆转录 PCR (RT-PCR) 设计并合成引物上 :5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3' (SEQ ID NO :4)。取前述 制备的 RNA 病毒 5uL 置于 200 u L 的 PCR 扩增专用小管中， 加入 100pmol 的引物 1， 置于 65℃变性 10min 后， 立即置于冰上， 加入 10× 逆转录缓冲液 2 uL, l mmol/L 4×dNTP,20U RNasin, 和 50U Expand Reverse Transcriptase， 加水至终体积 20 u L。混匀后 42 ℃温 育 1h。
PCR 扩增 设计并合成以下引物 2。
引物 2 :5’ -GCCGGAGCTCTGCAGAATTC -3' (SEQ ID NO :5)。
取上述逆转录产物 5uL 置于 200 u L 的 PCR 扩增专用小管内， 加入 10 × PCR 缓 冲液 2 u L, 350 nmol 4 × dNTP, 700nmol 引物 2,8U 含 Deep Vent 的 Taq DNA 聚合酶， 混匀后置 PCR 仪进行扩增， 循环参数 :95℃ 3min 1 个循环， 94℃ 30s, 54℃ 30s, 68℃ 3min 40 个循环。反应产物取 50uL 于 1% 琼脂糖凝胶电泳检测， 并将大小为 1-2Kb 的片段割 下回收纯化。
连接反应 按如下条件与 pMD20-T 质粒讲行连接 :10× 连接酶缓冲液 DNA pMD20-T T4 连接酶 1μL 7.5μL 0.5μL 1μL转化 取 50u1 的大肠杆菌 DH5α 感受态细胞， 加入连接反应产物， 在冰上放置 30 分钟。42℃ 条件下放置 1 分钟， 再进行冰浴 2 分钟。加入 500u1 37℃的 SOC 营养液， 37℃摇菌一小时， 涂板。
测序 然后， 挑取大肠杆菌阳性克隆进行 PCR。对 PCR 产物进行末端双脱氧法测序， 将获得的 序列进行序列拼接和比对， 并采用 PCR 方法进行补缺， 通过 RACE 法获得病毒末端序列。
经过多次反复测序， 在平均每个碱基测序约 6 次的基础上， 获得了如 SEQ ID NO : l 所示的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列。
实施例 2 对罗氏沼虾双顺反子病毒基因组序列的验证 根据 SEQ ID NO:l 所示的核苷酸序列， 按每 800bp 左右长度设计引物， 进行 PCR 反应，对 PCR 产物进行测序验证。结果表明 SEQ ID NO:l 的核苷酸序列是正确的。
实施例 3 检测罗氏沼虾双顺反子病毒病毒株的试剂盒 基于 SEQ ID NO:l 中所示的基因组序列， 合成以下 PCR 引物和探针 : 正义引物 1: 序列为 SEQ ID NO:l 中第 9625— 9644 位。
反义引物 2: 序列为 SEQ ID NO:l 中第 9755— 9774 位的互补序列。
探针 3: 序列为 SEQ ID NO:l 中第 9646-9667 位的互补序列。
制备一试剂盒 ( 检测 100 次 )， 它含有 :名称 有义引物 1 反义引物 2 探针 3 PCR 反应液 浓度 100pmol 100pmol 100pmol 含 Taq 酶 dNTP 镁离子 PCR 反应缓冲液取罗氏沼虾双顺反子病毒株 CN-NTH 感染罗氏沼虾幼体， 如实施例 1 获得罗氏沼虾双顺 反子病毒株并通过 RT-PCR 获得 cDNA 样品。将该 cDNA 样品稀释 104, 105, 106 和 107 倍 制得样品 A, B, C, D， 用上述试剂盒进行 PCR 扩增和杂交检测， 同时设置阳性对照和阴性对 照。
结果表明， 该试剂盒可以检测稀释度为 104, 105, 106 和 107 倍的 MRDV 样品。
背景技术 罗氏沼虾 ( Macrobrachium rosenbergii DeMan, 1879 ) ， 又称淡水长臂大虾， 属于沼虾属 ( Macrobrachium )， 是我国淡水甲壳类动物主要养殖品种。根据联合国粮农 组织 ( FAO ) 于 2009 �的统计资�， 罗氏沼虾的全球养殖总产� 2008 �达到了的 207749 吨， 其中亚洲产�则为 127627 吨， 占全球产� 98%， 中国是全球最大的养殖国。
病毒是罗氏沼虾育苗和养殖过程中的主要病原， 暴发于 2009 年和 2010 年的罗氏 沼虾幼体综合症 （Macrobrachium rosenbergii larval Syndrome， MRLS） ， 造成罗氏沼虾在 幼体期出现大量死亡， 特别是在幼体 6-9 日龄死亡尤为严重， 死亡率一般为 80-90%， 严重 的达到 100%， 涉及我国主要罗氏沼虾育苗区域， 给罗氏沼虾育苗产业造成的经济损失无法 估量。经研究发现其主要病原为一种新的双顺反子病毒， 暂命名为罗氏沼虾双顺反子病毒 （Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus， MRDV） ， MRDV 为单正链 RNA 病毒， 归为双顺 反子病毒科， 被发现以来， 因无该病毒基因组相关信息， 更缺少检测方法， 严重阻碍了该病 毒引起疾病的诊断和预防工作， 因此该病毒基因组全序列的解析及其相关应用显得尤为重 要。
病毒是罗氏沼虾育苗和养殖过程中的主要病原， 暴发于 2009 年和 2010 年的罗氏 沼虾幼体综合症 （Macrobrachium rosenbergii larval Syndrome， MRLS） ， 造成罗氏沼虾在 幼体期出现大量死亡， 特别是在幼体 6-9 日龄死亡尤为严重， 死亡率一般为 80-90%， 严重 的达到 100%， 涉及我国主要罗氏沼虾育苗区域， 给罗氏沼虾育苗产业造成的经济损失无法 估量。经研究发现其主要病原为一种新的双顺反子病毒， 暂命名为罗氏沼虾双顺反子病毒 （Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus， MRDV） ， MRDV 为单正链 RNA 病毒， 归为双顺 反子病毒科， 被发现以来， 因无该病毒基因组相关信息， 更缺少检测方法， 严重阻碍了该病 毒引起疾病的诊断和预防工作， 因此该病毒基因组全序列的解析及其相关应用显得尤为重 要。
发明内容 针对现有技术存在的问题， 本发明的目的在于设计提供罗氏沼虾双顺反子病毒的 基因组序列及其应用的技术方案， 本发明为检测 MRDV、 研究 MRDV 感染途径等目的奠定可靠 的基础。
所述的一种分离的核酸分子， 其特征在于所述的核酸分子含有 SEQ ID NO:1 所示 核苷酸序列或其反义序列。
所述的一种分离的核酸分子， 其特征在于所述的核酸分子为 DNA 或 RNA。
所述的一种分离的核酸分子用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引物、 探针或 试剂盒。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列中连续的 150-10300 个核苷酸。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列中连续的 300-10300 个核苷酸。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序
所述的一种分离的核酸分子， 其特征在于所述的核酸分子含有 SEQ ID NO:1 所示 核苷酸序列或其反义序列。
所述的一种分离的核酸分子， 其特征在于所述的核酸分子为 DNA 或 RNA。
所述的一种分离的核酸分子用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引物、 探针或 试剂盒。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列中连续的 150-10300 个核苷酸。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序 列中连续的 300-10300 个核苷酸。
所述的一种分离的 DNA 分子， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序
列中连续的 1000-10300 个核苷酸。
所述的一种引物， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序列中 15-100 个连续核苷酸。
所述的一种探针， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序列中 25-7000 个连续核苷酸。
所述的一种试剂盒， 其特征在于含有 SEQ ID NO:1 所示序列或其反义序列中 50-500 个连续核苷酸。
本发明对罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组进行测序， 得到了罗氏沼虾双顺反子病 毒的基因组全序列， 并且本发明利用该全序列用于制备检测罗氏沼虾双顺反子病毒的引 物、 探针或试剂盒， 为检测 MRDV、 研究 MRDV 感染途径等目的奠定可靠的基础。 具体实施方式
本发明中的核酸可以是 DNA 形式或 RNA 形式。DNA 形式包括 cDNA、 基因组 DNA 或 人工合成的 DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。DNA 可以是编码链或非编码链。
本发明的基因组全序列或其片段通常可以用 PCR 扩增法、 重组法或人工合成的方 法获得。对于 PCR 扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列， 尤其是开放阅读框序列 来设计引物， 并按本领域技术人员已知的常规方法所制备的 cDNA 库作为模板， 扩增而得有 关序列。当序列较长时， 常常需要进行两次或多次 PCR 扩增， 然后再将各次扩增出的片段按 正确次序拼接在一起。 一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得 到有关序列。 第 一 方 面， 本 发 明 提 供 了 一 核 酸， 该 核 酸 含 有 在 SEQ ID NO:l 所 示 的 罗 氏 沼 虾双顺反子病毒的基因组核苷酸序列。还提供了含有与本文所公开的核苷酸序列有 序 列 相 同 性 的 序 列 的 核 酸。 根 据 具 体 的 序 列， 序 列 相 同 性 的 程 度 宜 大 于 50%( 例 如 60%,70%,80%,90%,95%,99% 或更高 )。这些序列包括例如突变体和等位基因变体。
本发明还提供了包含本文所公开的一种或多种核苷酸序列片段的核酸。这些 片段应包含诸序列中至少 n 个连续的氨基酸， 并且根据具体的序列， n 为 10 或更高 ( 例 如， 11,12， 13， 14， 15， 16， 17， 18， 19， 20， 21， 22， 23， 24， 25， 30， 35， 40， 45， 50， 60， 75， 100 或 更 高 )。较佳地， 该片段是罗氏沼虾双顺反子病毒基因组特有的， 换言之在其他生物体的基因 组中并不存在。更佳地， 该片段是罗氏沼虾双顺反子病毒毒株的基因组特有的。本发明还 提供了与本文所提供的核酸发生杂交的核酸。杂交条件如本文中所述。
本发明还提供了一核酸， 该核酸包含与上述序列互补的序列 ( 例如， 用于反义、 用 于探针、 或用于扩增引物 )。
当然， 本发明的核酸可以用多种方法制备 ( 例如， 化学合成、 从 DNA 文库、 或从生物 体本身制得等 )， 并可采用各种形式 ( 例如单链、 双链、 载体、 探针、 引物等 )。术语 “核酸” 包 括 DNA 和 RNA， 以及它们的类似物， 如含有修饰骨架的那些类似物， 还包括肽核酸 (PNA) 等。
应理解， 因为 SEQ ID NO:l 代表了罗氏沼虾双顺反子病毒的完整基因组。
本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列的载体 ( 如表达载体、 测序载体、 克隆 载体等 ) 以及用这些载体转化的宿主细胞。
第二方面， 本发明还提供了一种蛋白质， 该蛋白质含有本文所示的罗氏沼虾双顺 反子病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列。 还提供了含有与这些蛋白质有序列相同性的 序列的蛋白。
根据具体的序列， 序列相同性程度宜大于 50%( 例如 60%,70%,80%,90%,95%,99% 或 更高 )。序列相同性用如上所述的方法确定。这些同源蛋白包括本文所示的罗氏沼虾双顺 反子病毒核苷酸序列中所编码的突变体和等位基因变体。
本发明还提供了一种蛋白质， 该蛋白质含有序列表中所公开的罗氏沼虾双顺反子 病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列片段。这些片段应包含诸序列中至少 n 个连续的氨 基酸， 并且根据具体的序列， n 为 7 或更高 ( 例如， 8,10,12,14,16,18,20 或更高 )。这些片 段宜包含该序列的表位。
本发明还提供了编码本发明蛋白的核酸。
第三方面， 本发明还提供了含有本发明核酸的核苷酸序列的计算机、 计算机存储 器、 计算机存储介质 ( 如软盘、 硬盘、 CD-ROM 等 ) 和 / 或计算机数据库。较佳地， 它含有本 文列出的一种或多种罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列。
这可用于分析本文所列出罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列。例如， 可用于检索 以鉴别序列中的开放阅读框 (ORF) 或编码序列。
第四方面， 本发明提供了鉴别氨基酸序列的方法， 它包括步骤 : 检索本文所列出 的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列中推定的开放阅读框或蛋白编码序列。类似地， 本发 明提供了此处所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列在检索推定的开放阅读框或蛋 白质编码序列中的用途。
开放阅读框或蛋白编码序列分析通常在计算机上用标准的生物信息技术进行。 用于分析的典型算法或程序包括 :ORFFINDER (NCBI)， GENMARK[Borodovsky &Mcininth (1993)Computers Chem 17:122-133〕 和 GLIMMER[Salzberg et al. (1998)Nucl Acids Res 26:544-548]。
对开放阅读框或蛋白编码序列的检索可包括步骤 : 检索此处所列出的罗氏沼虾 双顺反子病毒核苷酸序列中的起始密码子和检索上游序列中的处于读框中终止密码子。 中 间的密码子就代表了推定的蛋白编码序列。通常， 应检索一个序列中 6 种可能的读框。
用这种方法鉴别出的氨基酸序列可用任何合适的系统进行表达， 以获得蛋白。该 蛋白可用于产生抗体， 而该抗体识别在鉴别出的氨基酸序列中的表位。这些抗体可用于筛 选罗氏沼虾双顺反子病毒， 以检测是否存在含所鉴别氨基酸序列的蛋白质。
此 外， 一旦 鉴别出 ORF 或蛋白编码 序列， 那 么 就可 将该序 列 与序列 数 据库进 行 比 较。 序 列 分 析 工 具 可 在 NCB 工 (http://www. ncbi. nlm. nih. gov) 处 找 到， 例 如 BLAST,BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx， 和 tBLASTx 算 法 [ 还 可 参 见 Altschul 等 人 .(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25:2289-3402]。用于比较的合 适数据库包括非冗余 GenBank, EMBL,DDBJ 和 PDB 序列， 以及非冗余 GenBank CDS 翻译物， PDB,SwissProt,Spupdate 和 PIR 序列。这种比较可给出蛋白质功能的指示。
氨基酸序列中的疏水区可用以上算法加以预测， 例如基于 Esposti 等人的统计学 研究的算法 [“膜蛋白亲水性的关键评价” (Critical cvaluation of the hydropathy ofmembrane proteins)(1990)Eur J Biochem 190:207-219]。 疏水区代表了潜在的跨膜区或 疏水性前导序列， 这暗示蛋白质可以被分泌或位于表面。这些特性通常是良好免疫原的标 志。
类似地， 可用 PSORT 算法 (http://www. psort. nibb. ac. jp) 来预测跨膜区或 前导序列， 以及用 MOTIFS 程序来预测功能区 (GCG Wisconsin&PROSITE)。
本发明还提供了一种核酸， 该核酸含有本文所列出的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷 酸序列中的开放阅读框或蛋白编码序列。此外， 基于本发明所提供的基因组序列， 还提供 了若干种蛋白质， 该蛋白质含有所述开放阅读框或蛋白编码序列所编码的氨基酸序列。例 如， SEQ ID NO ： 1 中第 392-6589 位的 ORF 就编码一个长度为 2065 个氨基酸的病毒蛋白酶 和 RNA 聚合酶前体蛋白 (pre-proprotein)(SEQ ID NO:2), SEQ ID NO ： 1 中第 6961-10053 位的 ORF 就编码一个长度为 1030 个氨基酸的病毒衣壳前体蛋白 (pre-proprotein)(SEQ ID NO:3)。
第五方面， 本发明提供了结合这些蛋白的抗体。 它们可能是多克隆的或单克隆的， 可用本领域技术人员已知的任何合适方法制得。
本发明的抗体可以以各种不同方式使用， 例如用于证实蛋白质的表达， 或用于证 实蛋白质表达的场所。例如， 标记的抗体 ( 如荧光标记以用于 FACS( 流式细胞分选仪 )) 可 以与完整的病毒一起孵育， 而在病毒表面上存在标记就证实蛋白质的位置。 第六方面， 本发明提供了各种方法。
本发明提供了一种生产本发明的蛋白的方法， 该方法包括步骤 : 在诱导蛋白表达 的条件下， 培育本发明的宿主细胞。一种方法还可包括化学合成蛋白或化学合成 ( 至少部 分合成 ) 核苷酸。
本发明提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法， 该方法包括下列步骤 :(a) 在 杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触， 形成双链体 ； 和 (b) 检测所述双链体。
本发明提供了一种检测本发明的蛋白质的方法， 该方法包括下列步骤 :(a) 在适 合形成抗体一抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触 ； 和 (b) 检测所述复合 物。
第七方面， 本发明提供了检测选择性结合于抗原或多肽或蛋白质的抗体的方法， 这些抗原或多肽或蛋白质是对罗氏沼虾双顺反子病毒的任何毒种或毒株特异性的， 较佳地 是对罗氏沼虾双顺反子病毒毒株特异性的， 但更佳地是对罗氏沼虾双顺反子病毒特异的。 该方法包括步骤 :(a) 在适合形成抗体 - 抗原复合物的条件下， 使本发明抗原或多肽或蛋白 质与生物样品接触 ； 和 (b) 检测所述复合物。
方法综述 本发明提供了罗氏沼虾双顺反子病毒 MRDV 核苷酸序列、 和其所编码的氨基酸序列。利 用这些所公开的序列， 可以产生核酸探针试验和表达盒及载体。 蛋白质还可化学合成。 表达 载体可以转入宿主细胞以产生蛋白。纯化或分离的多肤可用于产生抗体以检测 MRDV 蛋白。 而且， 宿主细胞或提取物可用于生物试验以分离促效剂和拮抗剂。此外， 利用这些序列， 人 们可检索以鉴定开放读框 (ORF) 和鉴定氨基酸序列。蛋白质还可用于免疫原性组合物以及 用作疫苗组份。
除非另有描述， 本发明的实施将采用分子生物学、 微生物学、 重组 DNA 和免疫学的
常规技术， 这些均是本领域技术人员所知的。
在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。
免疫诊断试验 本发明的罗氏沼虾双顺反子病毒抗原或开发的重组抗原， 可用来制备相应的实验动物 抗体， 该类抗体可用于免疫试验来检测临床罗氏沼虾样品的病毒抗原水平。免疫试验的设 计可作很大变化， 其各种方案均是本领域中已知的。
将合适的材料 ( 包括本发明的组合物 ) 以及进行试验所需的其它试剂和材料 ( 例 如合适的缓冲液、 盐溶液等 ) 和合适的试验说明书包装到合适的容器中， 构成适用于免疫 诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。
核酸杂交 “杂交” 指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常， 一个序列固定于固体载体， 另 一个将游离于溶液内。然后， 在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响这种 结合的因素包括 ： 溶剂的类型和体积 ； 反应温度 ； 杂交时间 ； 搅拌 ； 封闭液相序列与固体载 体非特异性结合的试剂 (Denhardt's 试剂或 BLOTTO) ； 各序列的浓度 ； 是否使用化合物来增 加序列结合的速度 ( 硫酸葡聚糖或聚乙二醇 ) ； 以及杂交后洗涤条件的严谨程度。 核酸探针试验 采用本发明的核酸探针的方法 ( 如 PCR、 分支 DNA 探针试验或印迹技术 ) 能确定 cDNA 或 mRNA 的存在。如果探针和本发明的序列能形成稳定地足以被检测到的双链体或双链复 合物， 则称探针与本发明的序列 “杂交” 。
核酸探针将与本发明的罗氏沼虾双顺反子病毒核苷酸序列 ( 包括有义和反义链 ) 杂交。尽管有许多不同的核苷酸序列编码该氨基酸序列， 但是天然的罗氏沼虾双顺反子病 毒序列是较佳的， 因为它是实际存在于细胞中的序列。 mRNA 代表一种编码序列， 因此探针应 与该编码序列互补 ； 单链 cDNA 与 mRNA 互补， 因此 cDNA 探针应与非编码序列互补。
探针的确切长度和序列将取决于杂交条件， 如温度、 盐浓度等。例如， 对于诊断应 用， 根据分析物序列的复杂程度， 核酸探针通常含有至少 10-20 个核苷酸， 较佳的 15-25 个， 更佳的至少 30 个核苷酸， 但是也可短于该长度。短的引物通常需要较低温度， 以便和模板 形成足够稳定的杂交复合物。
探针可用合成方法产生， 例如 Matteucci 等人 [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103 :3185] 的方法或 Urdea 等人 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 :7461] 的方法， 或 用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。
可以根据偏好选择探针的化学特征。对于某些应用， DNA 或 RNA 是合适的。对 于其它的应用， 可以加入修饰， 例如骨架修饰， 如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯， 可用来增加 体内半衰期， 改变 RNA 亲和力， 增加核酸酶抗性等 「例如参见 Agrawal 和工 yer (1995) CurrOpin Biotechnol 6:12-19 ； Agrawal(1996)T 工 BTECH14:376-387] ； 还可采用类似物 如肤核酸 [ 例如参见 Corey (1997) T 工 BTECH15:224-229 ； Buchardt 等人 (1993) TIBTECH 11:384-386]。
另外， 聚合酶链反应 (PCR) 是另一个熟知的检测少量靶核酸的手段。该试验在 Mullis 等人 [Meth. Enzymol. (1987) 155 :335-350] ； 美国专利 4, 683, 195 和 4, 683, 202 中有所描述。用两个 “引物” 核苷酸与靶核酸杂交， 并用来引导反应。引物可包含不与
扩增靶序列 ( 或其互补序列 ) 杂交的序列， 以帮助双链体的稳定性， 或例如可插入一个简便 的限制性位点。这些序列通常侧接所需的罗氏沼虾双顺反子病毒序列。
利用最初的靶核酸作为模板， 热稳定的聚合酶能从引物产生靶核酸的拷贝。在聚 合酶产生临界量的靶核酸后， 它们可用较传统的方法 ( 如 Southern 印迹 ) 来检测。当采用 Southern 印迹方法时， 标记的探针将与罗氏沼虾双顺反子病毒序列 ( 如其互补序列 ) 杂交。
另外， mRNA 或 cDNA 也可用 Sambrook 等人 〔同上〕 描述的传统印迹技术来检测。用 凝胶电泳可纯化井分离利用聚合酶从 mRNA 产生的 mRNA 或 cDNA。然后， 将凝胶上的核酸印 迹到固体载体如硝酸纤维素上。使固体载体与标记的探针接触， 然后洗涤除去所有未杂交 的探针。然后， 检测含有标记探针的双链体。该探针通常用放射活性物质作标记。
基因组序列的应用 基于对罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列的测定， 可以了解与该病毒增殖及重要调 控功能有关的基因结构和功能， 找到其分子生理机制以及如何侵染宿主的关键点， 寻找病 毒致病甚至致死基因。
一种应用方法是， 用罗氏沼虾双顺反子病毒感染罗氏沼虾幼体， 建立 cDNA 文库。 用双向末端法测定 cDNA 克隆， 或直接对 MRDV cDNA 的文库用 PCR 扩增的方法进行序列测定。 基于本发明所提供的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组序列， 可以大大方便引物的设计以及克 隆的进程。 另一种直接的应用是使用本发明的引物或探针， 来检测样品中是否存在罗氏沼虾 双顺反子病毒或其遗传物质。
对于探针而言， 这种检测方法包括步骤 : 将 DNA 样品与本发明的探针接触， 观察是否形成 DNA- 探针复合物， 形成了复合物就表示样品中存在罗氏沼虾双顺反子 病毒或遗传物质。
对于引物而言， 这种检测方法包括步骤 : 用本发明的特异性引物， 对样品进行 PCR 反应， 观察是否扩增产生了特异性的扩增产物， 产生了特异性扩增产物就表示样品中存在罗 氏沼虾双顺反子病毒或遗传物质。
在本发明的一个实例中， 罗氏沼虾双顺反子病毒的基因组序列是通过如下方法获 得的， 该方法包括步骤 : 1. 分离纯化 MRDV 病毒， 获取高纯度 RNA 样品。
2. 以此 RNA 样品为模板， 以带有锚定序列的随机引物进行反转录反应， 以合成单 链 cDNA。继续以此 cDNA 为模板， 利用锚定序列引物， 在 Taq 和 Deep Vent DNA 多聚酶的作 用下进行 PCR 扩增， 并将扩增产物克隆入 T 载体， 进行序列测定， 获得大部分病毒序列 3. 将得到的序列输入计算机， 利用软件 ( 如 Innerpeace 软件 ) 进行拼接， 再经后期工 作得到完整的病毒基因组全序列。
经过多次反复测序， 在平均每个碱基测序约 6 次的基础上获得了如 SEQ ID NO : l 所示的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条
件如 Sambrook 等人， 分子克隆 : 实验室手册 (New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press,l989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例 1 病毒 RNA 的提取 取罗氏沼虾双顺反子病毒株 CN-NTH 感染的罗氏沼虾幼体， 进行组织研磨， 以体积比 1 ： 10 加 PBS 缓冲液， 超声破碎 3-5 秒， 将细胞破碎。4℃ 6000rpm 离心 30min 后取上清液， 用 0.22um 滤膜过滤除菌， 再进行蔗糖 / 甘油非连续密度梯度离心， 获得高纯度 MRDV 病毒， 用病 毒 RNA 提取试剂盒提取病毒 RNA。
逆转录 PCR (RT-PCR) 设计并合成引物上 :5'-GCCGGAGCTCTGCAGAATTCNNNNNN-3' (SEQ ID NO :4)。取前述 制备的 RNA 病毒 5uL 置于 200 u L 的 PCR 扩增专用小管中， 加入 100pmol 的引物 1， 置于 65℃变性 10min 后， 立即置于冰上， 加入 10× 逆转录缓冲液 2 uL, l mmol/L 4×dNTP,20U RNasin, 和 50U Expand Reverse Transcriptase， 加水至终体积 20 u L。混匀后 42 ℃温 育 1h。
PCR 扩增 设计并合成以下引物 2。
引物 2 :5’ -GCCGGAGCTCTGCAGAATTC -3' (SEQ ID NO :5)。
取上述逆转录产物 5uL 置于 200 u L 的 PCR 扩增专用小管内， 加入 10 × PCR 缓 冲液 2 u L, 350 nmol 4 × dNTP, 700nmol 引物 2,8U 含 Deep Vent 的 Taq DNA 聚合酶， 混匀后置 PCR 仪进行扩增， 循环参数 :95℃ 3min 1 个循环， 94℃ 30s, 54℃ 30s, 68℃ 3min 40 个循环。反应产物取 50uL 于 1% 琼脂糖凝胶电泳检测， 并将大小为 1-2Kb 的片段割 下回收纯化。
连接反应 按如下条件与 pMD20-T 质粒讲行连接 :10× 连接酶缓冲液 DNA pMD20-T T4 连接酶 1μL 7.5μL 0.5μL 1μL转化 取 50u1 的大肠杆菌 DH5α 感受态细胞， 加入连接反应产物， 在冰上放置 30 分钟。42℃ 条件下放置 1 分钟， 再进行冰浴 2 分钟。加入 500u1 37℃的 SOC 营养液， 37℃摇菌一小时， 涂板。
测序 然后， 挑取大肠杆菌阳性克隆进行 PCR。对 PCR 产物进行末端双脱氧法测序， 将获得的 序列进行序列拼接和比对， 并采用 PCR 方法进行补缺， 通过 RACE 法获得病毒末端序列。
经过多次反复测序， 在平均每个碱基测序约 6 次的基础上， 获得了如 SEQ ID NO : l 所示的罗氏沼虾双顺反子病毒基因组全序列。
实施例 2 对罗氏沼虾双顺反子病毒基因组序列的验证 根据 SEQ ID NO:l 所示的核苷酸序列， 按每 800bp 左右长度设计引物， 进行 PCR 反应，对 PCR 产物进行测序验证。结果表明 SEQ ID NO:l 的核苷酸序列是正确的。
实施例 3 检测罗氏沼虾双顺反子病毒病毒株的试剂盒 基于 SEQ ID NO:l 中所示的基因组序列， 合成以下 PCR 引物和探针 : 正义引物 1: 序列为 SEQ ID NO:l 中第 9625— 9644 位。
反义引物 2: 序列为 SEQ ID NO:l 中第 9755— 9774 位的互补序列。
探针 3: 序列为 SEQ ID NO:l 中第 9646-9667 位的互补序列。
制备一试剂盒 ( 检测 100 次 )， 它含有 :名称 有义引物 1 反义引物 2 探针 3 PCR 反应液 浓度 100pmol 100pmol 100pmol 含 Taq 酶 dNTP 镁离子 PCR 反应缓冲液取罗氏沼虾双顺反子病毒株 CN-NTH 感染罗氏沼虾幼体， 如实施例 1 获得罗氏沼虾双顺 反子病毒株并通过 RT-PCR 获得 cDNA 样品。将该 cDNA 样品稀释 104, 105, 106 和 107 倍 制得样品 A, B, C, D， 用上述试剂盒进行 PCR 扩增和杂交检测， 同时设置阳性对照和阴性对 照。
结果表明， 该试剂盒可以检测稀释度为 104, 105, 106 和 107 倍的 MRDV 样品。
此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。10102352366 A CN 102352373
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