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一种水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子的克隆方法
    技术领域 本发明涉及植物基因工程领域， 特别涉及一种水稻根特异性表达基因 EXP18D 启 动子的克隆方法。
     背景技术 启动子是基因表达调控因子中最重要的因子， 基本决定一个基因是否表达、 何时 表达和何处表达。 按作用方式和功能， 启动子大体可以分为组成型启动子、 特异性启动子和 诱导型启动子三大类。 目前， 组织特异性启动子的调控机制己进入深入研究阶段， 该类启动 子除具有基本结构外， 通常还有一些调控特异表达的序列， 这些序列为转录因子提供了结 合位点， 通过与蛋白质的相互作用来调节基因表达。 在组织特异性启动子的驱动下， 基因的 表达通常只发生在特定的组织或器官， 并往往表现出发育调节的特性。
     根是植物吸收水分和营养物质的重要器官， 根特异表达系统可用于研究植物的高 渗胁迫耐受、 植物修复和根际分泌等。拟南芥的磷酸转移酶基因 PHT1 启动子与 GUS 融合，
     在农杆菌介导下转化拟南芥和水稻， 组织化学分析显示蛋白只在拟南芥和水稻的根毛及根 表皮表达， 说明该启动子是根特异的。Borisjuk 等用根特异启动子 mas2、 GFP 和烟草钙网 蛋白基因 (calreticulin) 构建融合表达载体， 转基因烟草水培研究结果表明， 根细胞不仅 能高效产生某些目的蛋白质， 而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中。
     植物的根系在植物抗旱中起着重要的作用， 根系吸水力的提升和根系形态的建 成， 无疑对提高植物的吸水力， 增强其抗旱性具有重要的意义。 多数的植物功能基因如激素 合成、 代谢相关基因， 植物生长、 发育调控基因在植物的地上部分和地下部分均有表达， 通 过简单的转基因或者基因沉默的方式只能从整体上调节基因在植物体的表达， 不能特异性 的实现对植物根系功能和发育的调控。
     为了解决上述问题， 需要利用植物根系特异性表达的启动子驱动相关功能基因的 表达， 以达到既能提高植物吸水性、 增加植物根系长度和数量， 又不影响植物地上部生长、 不损害植物营养生长的目的， 由此通过转基因的手段能够获得相应的抗旱植株。目前的研 究中需要克隆得到根特异性表达基因启动子。
     发明内容 本发明提供一种水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子的克隆方法。
     该方法包括以下步骤 ： Ⅰ、 获取拟南芥根特异性基因 EXP18 ： A、 分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总 RNA 和拟南芥叶总 RNA， 再分别进行反转录 PCR 反应， 分别扩增得到拟南芥根 cNDA 序列和拟南芥叶 cNDA 序列 ； B、 分别以所述的拟南芥根 cNDA 序列和拟南芥叶 cNDA 序列为模板， 分别根据拟南芥根 特异性基因设计引物， 再分别进行半定量 PCR 反应， 筛选得到拟南芥根特异性基因 EXP18 ；
     Ⅱ、 获取水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子 ： A、 将所述的拟南芥根特异性基因 EXP18 的序列进行在线分析比对， 得到水稻根特异性 基因 ； B、 分别从水稻植株中提取水稻根总 RNA 和水稻叶总 RNA， 再分别进行反转录 PCR 反应， 分别扩增得到水稻根 cNDA 序列和水稻叶 cNDA 序列 ； C、 分别以所述的水稻根 cNDA 序列和水稻叶 cNDA 序列为模板， 分别以所述的水稻根特 异性基因设计引物， 进行半定量 PCR 反应， 筛选得到水稻根特异性表达基因 EXP18D ； D、 在线分析得到水稻根特异性表达基因 EXP18D 的启动子的序列信息， 再在水稻根基 因组 DNA 中进行克隆得到所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子。
     步骤Ⅰ -B 中所述的拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站的编号分别为 ： AT1G79580.1、 AT1G62980.1、 AT1G66470.1、 AT1G27740.1、 AT1G54970.1、 AT3G10710.1、 AT1G12560.1、 AT2G26420.1、 AT1G12040.1、 AT1G62440.1、 AT3G62680.1、 AT2G26290.1。
     步骤Ⅱ -A 中所述的水稻根特异性基因在日本水稻基因组数据库 （RGP） 的编号分 别为 ： os03g0377100、 os01g0249100、 os01g0248900、 os03g0156000、os01g0274500。
     所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子的序列为 SEQ ID No ： 1。
     在步骤Ⅱ之后， 进行所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子功能验证， 包括 以下步骤 ： A、 在线分析得到将所述的稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子的转录起始位点、 含有 的顺势作用元件 ； B. 将所述的稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子进行 5’ 端缺失处理， 经过 PCR 反应得 到 EXP18D 启动子缺失体片段 ； C. 将所述的 EXP18D 启动子缺失体片段分别构建 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体 ； D、 将所述的 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体转化拟南芥植株， 得到转化体植株， 再 进行检测。
     所述的 EXP18D 启动子缺失体片段的大小分别为 1957 bp、 1720 bp、 1066 bp、 954 bp、 776 bp、 432 bp。
     本发明的有益效果为 ： 因为本发明克隆到水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子， 该启动子为植物根系特异 性表达的启动子， 可以驱动相关功能基因的表达， 所以该启动子具有特定地改变植物的根 部形态、 获得相应的抗旱植株潜力 ： 转入该启动子的植株， 在同等干旱条件下， 存活率比相 比对照组的野生型植株高 60-70％。 附图说明
     图 1 ：实施例 1 中， 12 个拟南芥根特异性基因的扩增产物电泳结果。
     图 2 ：实施例 1 中， 5 个水稻根特异性基因的比对结果。
     图 3 ：实施例 1 中， 5 个水稻根特异性基因的同源树分析结果。
     图 4 ：实施例 1 中， 5 个水稻根特异性基因的扩增产物电泳结果。
     图5： 实施例 1 中， 水稻基因 EXP18-D 的基因图谱 ； 图6： 实施例 1 中， 水稻基因启动子 EXP18-D 的基因图谱 ；图7： 实施例 1 中， 水稻根特异性表达基 EXP18D 启动子序列中含有的顺式作用元件的 分析结果 ； 图8： 实施例 1 中，6 种 EXP18D 启动子缺失体的结构简图。
     图9： 实施例 1 中， 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体的结构简图。
     图 10 ： 实施例 1 中， 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体在拟南芥转化体植株 的表达量的 Gus 染色图。 具体实施方式
     实施例 1 ： 一种水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子的克隆方法， 该方法包括以下步骤 ： Ⅰ、 获取拟南芥根特异性基因 ： A、 分别从拟南芥植株中提取拟南芥根总 RNA 和拟南芥叶总 RNA， 再分别进行反转录 PCR 反应， 分别扩增得到拟南芥根 cNDA 序列和拟南芥叶 cNDA 序列 ； 具体的操作为 ： 分别取生长 20d 的拟南芥植株的根与叶为材料， 用 Trizol 法分别提取拟南芥根与叶的 总 RNA， 分别进行反转录 PCR 反应， 分别得到拟南芥根 cDNA 和拟南芥叶 cDNA ； 所述的反转录 PCR 反应的体系为 ： RNA ： 1.2μg， Oligo(dT)15 ： 2 μl， M-MLV buffer ： 5μl， dNTP Mix ： 1.25 μl， M-MLV ： 1μl， RNase inhibitor ： 0.6 μl， DEPC 处理后的 ddH2O ： 补足 25 μl ； 所述的反转录 PCR 反应的程序为 ： 加入上述 oligo(dT)15 后 70℃反应 5 分钟， 然后加入反转录 PCR 上述体系中的其他试 剂， 37℃反应 1 小时， 得到所述的拟南芥根 cNDA 序列和拟南芥叶 cNDA 序列。
     B、 分别以所述的拟南芥根 cNDA 序列和拟南芥叶 cNDA 序列为模板， 分别根据 12 个拟南芥根特异性基因设计引物， 再进行半定量 PCR 反应， 筛选得到拟南芥根特异性基因 EXP18 ； 所述的半定量 PCR. 反应体系为 ： Ex Taq buffer ： 2 μl， dNTP Mix (2.5 mM each) ： 1.6 μl， Primer Mix (5 μM each) ： 2.4 μl， cDNA ： 2.4 μl， Ex Taq ： 0.2 μl， ddH2O ： 11.4 μl ； 所述的半定量 PCR 反应程序为 ： 94℃预变性 5 min ； 94℃变性 45 s， 51℃退火 45 s， 72℃ 延伸 1 min， 共 30 个循环 ； 72℃ 延伸 7 min ； 4℃保存 ； 分别得到 12 个拟南芥根特异性基因的扩增产物 ； 所述的 12 个拟南芥根特异性基因在拟南芥信息资源网站 （TAIR） ， （网址为 http:// www.arabidopsis.org/） 的编号和记载该基因的文献来源如下 ： SMB（AT1G79580.1） ： Tom Bennett, Albert van den Toorn, Gabino F,(2010). SOMBRERO, BEARSKIN1, and BEARSKIN2 Regulate Root Cap Maturation in Arabidopsis . Plant Cell.22: 640–654 ； EXP18（AT1G62980.1） ： Hyung-Taeg Cho, Daniel J. Cosgrove,(2002). Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene Expression in Arabidopsis.Plant cell. 14:3237–3253 ；RHD6 （AT1G66470.1） ： Jill S. Parker,Alison C. Cavell,Liam Dolan,(2000). Genetic Interactions during Root Hair Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell. 12:1961–1974 ； RSL4 （ AT1G27740.1 ） ： Keke Yi, Beno??t Menand, Elizabeth Bell,Liam Dolan,(2009). A basic helix-loop-helix transcription factor controls cell growth and size in root hairs.nature genetics.10:1038 ； PRP1 （AT1G54970.1） ： Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho,(2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair-Speci??c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis.Plant Physiology.150:1459-1473 ； RHS12（AT3G10710.1） ： Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho,(2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair-Speci??c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis.Plant Physiology.150:1459-1473 ； EXP7 （AT1G12560.1） ： Hyung-Taeg Cho1,Daniel J. Cosgrove,( 2002).Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene. Plant Cell. 14:3237–3253 ； PIP5K3（AT2G26420.1） ： Irene Stenzel,Till Ischebeck,Sabine Konig,(2008). The Type B Phosphatidylinositol-4-Phosphate 5-Kinase 3 Is Essential for Root Hair Formation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 20: 124–141 ； LRX1 （ AT1G12040.1 ）： Nicolas Baumberger, Christoph Ringli , Beat Keller,(2001). The chimeric leucine-rich repeat/extensin cell wall protein LRX1 is required for root hair morphogenesis in Arabidopsis thaliana. Genes Dev. 15: 1128-1139 ； LRX2 （AT1G62440.1） ： N.Baumberger,M.Steiner,U.Ryser,(2003).Synergistic interaction of the two paralogous Arabidopsis genes LRX1and LRX2 in cell wall information duiing root hair development.Plant Journal,35:71-81 ； PRP3 （AT3G62680.1） ： Christine Bernhardt ,Mary L. Tierney,(2000). Expression of AtPRP3, a Proline-Rich Structural Cell Wall Protein from Arabidopsis, Is Regulated by Cell-Type-Specific Developmental Pathways Involved in Root Hair Formation1. Plant Physiology. 122: 705–714 ； ARSK1（AT2G26290.1） ： Inhwan Hwang,Howard M.Goodman,(1995).An Arabidopsis thaliana root-specific kinase homolog is induced by dehydration,ABA,and NaCl. Plant Journal.8(1):37-43 ； 利用 Oligo6.0 软件设计所述的 12 个拟南芥根特异性基因的半定量 PCR 反应引物 ； 由 于检测基因较多， 为提高实验效率， 在引物设计时应尽量使退火温度保持集中、 一致， 即退 火温度为 51℃ ； 具体引物序列如下 ： SMB ： Upper ： GGAGGAGGAGCTTCTTTAC， Lower ： CCAGAAACGACCAGTCTC CA ；EXP18 ： Upper ： CG CAAGTGCCTGGTTATTTTA， Lower ： CGG AGCAGCATTATAAGCGT ； RHD6 ： Upper ： GGCACTCGTTAATGACCATC， Lower ： G GTGATCAGATTCGAATTCC ； RSL4 ： Upper ： GGACGTTTTTGTTGATGGTG， Lower ： CG TACATCCATA GATCATCC ； PRP1 ： Upper ： GCTGATTATTACGCTCCCTC， Lower ： GTT GGATCACTGTAGATGAC ； RHS12 ： Upper ： CGC TGAGCTTCTTGACCTAAC， Lower ： CGGT AGAATTGGCGTTGTGC ； EXP7 ： Upper ： GTT CGTCGCTGGATACTATC， Lower ： GCAA CGTTCCAAGCATAGAT ； PIP5K3 ： Upper ： GCTGCCG AGATTAGAATAGT， Lower ： GCACCACCA CTCTCCAAAA G ； LRX1 ： Upper ： GGTTCAGATGTTTGCTCCT， Lower ： CTTCTAGGCTCTTCATGTTA C ； LRX2 ： Upper ： GGC TCTGATGTTTGTTCCTAC， Lower ： GG TTAGAGAGCTGACAAATGC ； PRP3 ： Upper ： CCACCCGTTT ACAAGCCTAC， Lower ： GAGCTCCAAGTTCTTGTCCG ； ARSK1 ： Upper ： CG CAAGCAAATACGAAGGAG， Lower ： CGTATGTTCGCCTTCAG GTC ； 所述的半定量 PCR 反应的体系为 ： Ex Taq buffer ： 2 μl， dNTP Mix (2.5 mM each) ： 1.6 μl， Primer Mix (5 μM each) ： 2.4 μl， cDNA ： 2.4 μl， Ex Taq ： 0.2 μl， ddH2O ： 11.4 μl ； 所述的半定量 PCR 反应的程序为 ： 94℃预变性 5 min ； 94℃变性 45 s， 55℃退火 45 s， 72℃ 延伸 1 min， 共 30 个循环 ； 72℃ 延伸 7 min ； 4℃保存。
     通过所述的半定量 PCR 反应分别得到 12 个拟南芥根特异性基因的扩增产物 ； 再将上述 12 个拟南芥根特异性基因的扩增产物进行检测， 筛选得到拟南芥根特异性基因 EXP18 ； 具体的操作为 ： 将上述 12 个拟南芥根特异性基因的扩增产物进行 1％琼脂糖凝胶上电泳 ； 电泳结果如 图 1 所示， 泳道 M 为 DNA marker Ⅱ， 泳道 1 为内参 actin， 泳道 2-13 分别为上述 12 个拟南 芥根特异性基因的扩增产物 ； 泳道 12 表明， 所述的拟南芥根特异性基因 EXP18 在拟南芥的 根中的表达量大， 在拟南芥的叶中几乎不表达。
     Ⅱ、 获取水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子 ： A、 将所述的拟南芥根特异性 EXP18 基因的序列在 NCBI 网站进行在线分析比对， 得 到相似性最高的前 5 个水稻根特异性基因 ： 水稻 EXP18-A 基因、 水稻 EXP18-B 基因、 水稻 EXP18-C 基因、 水稻 EXP18-D 基因、水稻 EXP18-E 基因 ； 以上 5 个水稻根特异性基因在日本水稻基因组数据库 （RGP） （网 址 为 ： http://rgp.dna.affrc.go.jp）的 编 号 分 别 为 ： 水 稻 EXP18-A 基 因 ： os03g0377100 ； 水稻 EXP18-B 基因 ： os01g0249100 ； 水稻 EXP18-C 基因 ： os01g0248900 ； 水稻 EXP18-D 基因 ： os03g0156000 ； 水稻 EXP18-E 基因 ： os01g0274500 ； 上 述 在 线 分 析 比 对 包 括 blast 比 对 和 同 源 树 分 析 ； 上 述 blast 比 对 的 网 址 为： http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_ PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome ； 图 2 为以上 5 个水稻根特异性基因的 blast 比对结果 ： 水稻 EXP18-A 基因， 相似度 93% ； 水稻 EXP18-B 基因， 相似度 91% ； 水稻 EXP18-C 基因， 相似度 88% ； 水稻 EXP18-D 基因， 相似度 85% ； 水稻 EXP18-E 基因， 相似度 84% ； 上述同源树分析采用 DNAMAN 软件， 图 3 为以上 5 个水稻根特异性基因同源树分析结 果。 通过比对得知， 水稻 EXP18-A 基因、 水稻 EXP18-B 基因、 水稻 EXP18-C 基因、 水稻 EXP18-D 基因、 水稻 EXP18-E 基因与拟南芥 EXP18 基因均具有较高的相似性。
     B、 分别从水稻植株中提取水稻根总 RNA 和水稻叶总 RNA， 再分别进行反转录 PCR 反 应， 分别扩增得到水稻根 cNDA 序列和水稻叶 cNDA 序列 ； 所述的水稻植株的品种为日本晴， 粳亚种 Oryza sativa ssp.japonica 。
     具体的操作为 ： 分别取生长 12-18d， 优选为 15d 的水稻植株的根与叶为材料， 用 Trizol 法分别提取水 稻根与叶的总 RNA， 分别进行反转录 PCR 反应， 分别得到水稻根 cDNA 和水稻叶 cDNA ； 所述的反转录 PCR 反应的体系为 ： RNA ： 1.2μg， Oligo(dT)15 ： 2 μl， M-MLV buffer ： 5μl， dNTP Mix ： 1.25 μl， M-MLV ： 1μl， RNase inhibitor ： 0.6 μl， DEPC 处理后的 ddH2O ： 补足 25 μl ； 所述的反转录 PCR 反应的程序为 ： 加入上述 oligo(dT)15 后 70℃反应 5 分钟， 然后加入反转录 PCR 上述体系中的其他试 剂， 37℃反应 1 小时， 得到所述的水稻根 cNDA 序列和水稻叶 cNDA 序列 ； C、 分别以所述的水稻根 cNDA 序列和水稻叶 cNDA 序列为模板， 分别以水稻 EXP18-A 基 因、 水稻 EXP18-B 基因、 水稻 EXP18-C 基因、 水稻 EXP18-D 基因、 水稻 EXP18-E 基因设计引 物， 进行半定量 PCR 反应， 选取得到水稻根特异性表达基因 EXP18D ；具体的操作为 ： 利用 Oligo6.0 软件设计以上 5 个基因的 PCR 引物 ； 由于检测基因较多， 为提高实验效 率， 在引物设计时应尽量使退火温度保持集中、 一致， 即退火温度为 53 摄氏度 ； 具体引物序 列如下 ： EXP18-A ： Upper ： TGATGTTCGGGGACGGGCTGAG， Lower ： CCGGCGCGACGTTGTACGACAC ； EXP18-B ： Upper ： CGGGTACGGGACGAACACGAC， Lower ： GGCCTGCACCCTGAACGACA ； EXP18-C ： Upper ： CGCCAGAATGCTCGTGCTCC， Lower ： CCATCCTATGCCACGTCGATCAAA ； EXP18-D ： Upper ： CGGGTACGGGAACCTGTACGA， Lower ： GGTGGTAGGTGCTGAATGTTTGGC ； EXP18-E ： Upper ： CGGGTACGGGACGAGCACGG， Lower ： GTCGCTGGCGGTGACCCTGA ； 所述的半定量 PCR 反应体系为 ： Ex Taq buffer ： 2 μl， dNTP Mix (2.5 mM each) ： 1.6 μl， Primer Mix (5 μM each) ： 2.4 μl， cDNA ： 2.4 μl， Ex Taq ： 0.2 μl， ddH2O ： 11.4 μl ； 所述的半定量 PCR 反应程序为 ： 94℃预变性 5 min ； 94℃变性 45 s， 51℃退火 45 s， 72℃ 延伸 1 min， 共 30 个循环 ； 72℃ 延伸 7 min ； 4℃保存 ； 通过所述的半定量 PCR 反应分别得到上述 5 个水稻根特异性基因的扩增产物 ； 将上述 5 个水稻根特异性基因的扩增产物进行检测 ； 将上述 5 个水稻根特异性基因的 扩增产物进行 1％琼脂糖凝胶上电泳 ； 电泳结果如图 4 所示， 泳道 M 中为 DNA marker Ⅱ， 泳 道 1 为 内参 actin， 泳道 2-6 中分别为上述 5 个水稻根特异性基因的扩增产物 ； 泳道 5 中 表明， 所述的水稻根特异性 EXP18-D 基因在拟水稻的根中的表达明显。
     D、 在线分析得到所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子， 再在水稻根 DNA 中 进行克隆得到所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子。
     具体的操作为 ： a. 在 NCBI 网站上分析获得水稻根特异性表达基因 EXP18D 的启动子 ： 在 NCBI 网站上找到水稻 EXP18-D 基因序列， 网址为 ： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/115450812?report=genbank&log$=nucl top&blast_rank=54&RID=2XABFGHC015 ； 在 NCBI 网站上分析 EXP18-D 基因的 map view， 网址为 ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=4530&chr=3&MAPS=rna-r &cmd=focus&fill=40&query=uid(1556461)&QSTR=NM%5F001055542%2E1 ； 图 5 为水稻基因 EXP18-D 的基因图谱， 由此可看出该基因含三个外显子， 两个内含子 ； 在 NCBI 网站上分析 EXP18-D 基因启动子的 map view， 网址为 ： http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/maps.cgi?TAXID=4530&CHR=3&MA PS=rna-r&QSTR=NM_001055542.1&QUERY=uid%281556461%29&BEG=3%2C005%2C820&END=3%2 C008%2C400 ； 图 6 为 EXP18-D 基因启动子的图谱， 第一个外显子前 2000bp 左右的片段即为 启动子区 ； 在 NCBI 网站上找到已公布的水稻 EXP18-D 基因上游的序列， 网址为 ： http://www. ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_008396.1?from=3005820&to=3008400&report=genbank， 以上网址链接的页面显示了水稻 EXP18D 基因第一个外显子前 2500bp 左右的序列， 本 实施例截取其中的 1957bp， 详见序列表 SEQ ID No ： 1， 作为最终需要克隆的出来的所述的水 稻根特异性表达基因 EXP18-D 启动子 ； b. 在水稻根 DNA 克隆得到所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子 ； 取生长 8-12d， 优选为 10d 的水稻植株， 采用 CTAB 法提取水稻根 DNA ； 以上述水稻根 DNA 为模板进行 PCR 反应， 得到水稻 EXP18-D 基因的启动子 ； 所述的 PCR 反应体系为 ： 5× buffer ： 5μl， dNTP Mix (2.5 mM each) ：2 μl， Primer Mix (5 μM each) ： 2 μl， cDNA ：1 μl， PrimeSTAR ： 0.25 μl， ddH2O ： 14.75 μl ； 所述的 PCR 反应的引物为序列 ： Upper ： 5-accaa ggcatgtcaa agtc-3， Lower ：5-gttccccatttcctcttag-3 ； 所述的 PCR 反应程序为 ： 94℃预变性 5 min ； 98℃变性 10s， 50℃退火 15 s， 72℃ 延伸 2 min， 共 30 个循环 ； 72℃ 延伸 10min ； 4℃保存 ； Ⅲ、 水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子功能验证 ： A、 在线分析得到将所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子的转录起始位点、 含 有的顺势作用元件 ； 在 Softberry 网站在线分析预测所述的稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子的转录起 始位点， 上述 Softberry 在线分析网址为 ： http://linux1.softberry.com/berry.phtml?t opic=fgenesh&group=programs&subgroup=gfind， 分析结果表明 ： 所述的水稻根特异性表 达基因 EXP18D 启动子的转录起始位点可能位于自序列表 SEQ ID No ： 1 中的 5′端第 1849 位的碱基 T ； 在 PlantCARE 网站在线分析预测所述的水稻根特异性表达基 EXP18D 启动子含有的顺 势作用元件 ： 上述 PlantCARE 在线分析网址为 ： http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/ ； 图 7 为所述的水稻根特异性表达基 EXP18D 启动子序列中含有的顺式作 用元件的分析结果 ： 所述的水稻根特异性表达基 EXP18D 启动子序列 （序列表中序列 1） 的自 5′端第 402 － 408 位核苷酸为光响应元件 G-Box， 自 5′端第 291 － 295 位核苷酸为胚乳表 达所需的顺势作用元件 SKn-1 motif， 自 5′端第 1294 － 1300 位胚乳表达所需的顺势作用元件 GCN4 motif， 自 5′端第 228-232 位、 820 － 824 位、 925-929 位、 994-998 位、 1130-1134 位核苷酸为根特异表达相关元件 ROOTMOTIFTAPOX1 ； B. 将所述的水稻根特异性表达基因 EXP18D 启动子进行 5’ 端缺失处理， 经过 PCR 反应得到 6 种 EXP18D 启动子缺失体 P1、 P2、 P3、 P4、 P5、 P6 片段 ； 具体的操作为 ： 以水稻根 cNDA 序列为模板， 分别根据上述 6 种 EXP18D 启动子缺失体 P1、 P2、 P3、 P4、 P5、 P6 设计引物， 再进行 PCR 反应， 分别得到以上 6 种 EXP18D 启动子缺失体的扩增产物， 再 进行回收处理， 得到 6 种 EXP18D 启动子缺失体片段 ； 下表中为以上 6 种 EXP18D 启动子缺失 体的详细信息， 图 8 为以上 6 种 EXP18D 启动子缺失体的结构简图。
     所述的 PCR 反应的体系为 ： 5× buffer ： 5μl， dNTP Mix (2.5 mM each) ： 2 μl， Primer Mix (5 μM each) ： 2 μl， 水稻根 cDNA ： 1 μl， PrimeSTAR ：0.25 μl， ddH2O ： 14.75 μl ； 所述的 PCR 反应的程序为 ： 94℃预变性 5 min ； 98℃变性 10 s， 50℃退火 15 s， 72℃ 延伸 2 min， 共 30 个循环 ； 72℃ 延伸 10min ； 4℃保存 ； C. 将上述 6 种 EXP18D 启动子缺失体 P1、 P2、 P3、 P4、 P5、 P6 片段分别构建 EXP18D 启动 子缺失体 GUS 表达载体 ： a. 分别将上述 6 种 EXP18D 启动子缺失体片段连接到 PMD18-T 质粒载体上， 再进行转化 处理、 振荡培养处理、 质粒提取处理， 得到 6 种 EXP18D 启动子缺失体片段 -PMD18-T 质粒载 体： P1-PMD18-T 质粒载体、 P2-PMD18-T 质粒载体、 P3-PMD18-T 质粒载体、 P4-PMD18-T 质粒 载体、 P5-PMD18-T 质粒载体、 P6-PMD18-T 质粒载体 ； 所述的连接中的连接体系为 ： solution Ⅰ ： 1μl， PMD18-T 质 粒 载 体 ： 0.5μl， 6种 EXP18D 启动子缺失体片段 ： 4.5μl ； 该连接体系 16℃连接过夜， 分别得到 6 种连接产物 ； 所述的转化处理为 ： 将上述每种连接产物 5μl 加入 100μl 大肠杆菌感受态细胞DH5α 感受态细胞中， 轻轻混匀， 冰上放置 30 分钟 ； 再 42℃热激 45 秒， 冰上放置 2 分钟 ； 再 加入 500μlLB 无抗培养基， 于 37℃ 转速 150rpm 振荡培养 1 小时 ； 再以转速 4000rpm 离心 5 分钟， 用枪吸掉 400μl 左右上清液， 余下的用涂布棒涂布在含氨苄青霉素的养基上 ； 再于 37℃过夜培养， 得到单菌落 ； 所述的振荡培养处理为 ： 挑取分别上述生长出的单菌落， 加入 LB 液体培养基， 37℃过 夜振荡培养 ； 再分别取菌液进行菌液 PCR， 选出验证正确的菌液 ； 所述的质粒提取处理为 ： 将上述验证正确的菌液用宝生物工程 （大连）有限公司的 DV801A 型质粒 DNA 小量纯化试剂盒进行质粒提取处理， 得到 6 种 EXP18D 启动子缺失体片 段 -PMD18-T 质粒载体 ： P1-PMD18-T 质粒载体、 P2-PMD18-T 质粒载体、 P3-PMD18-T 质粒载 体、 P4-PMD18-T 质粒载体、 P5-PMD18-T 质粒载体、 P6-PMD18-T 质粒载体 ； 。
     b. 分别将上述 6 种 EXP18D 启动子缺失体片段 -PMD18-T 质粒载体分别用内切酶 Hind Ⅲ、 Nco Ⅰ进行酶切处理， 得到 6 种 EXP18D 启动子缺失体酶切小片段， 分子量 （不包括 Hind Ⅲ、 Nco Ⅰ酶切位点） 分别约为 ： P1 为 1957bp， P2 为 1720 bp， P3 为 1066 bp, P4 为 954 bp， P5 为 776 bp， P6 为 432 bp ； c．将表达载体 PCAMBIA1391 用内切酶 Hind Ⅲ、 Nco Ⅰ进行酶切处理， 得到分子量为 10780bp 左右的载体大片段 ； 上述酶切处理中， 酶切体系为 ： 10×buffer ： 2μl ； Hind Ⅲ ： 1μl， Nco Ⅰ ： 1μl， 质 粒： 10μl， ddH2O ； 6μl ； 于 37℃反应 3 小时 ； d. 分别对上述 6 种 EXP18D 启动子缺失体酶切小片段、 分子量为 10780bp 左右的载体 大片段进行回收处理， 再分别进行连接反应， 分别得到连接产物 ； 上述连接反应中， 连接体系为 ： 10×buffer ： 1μl， 载体大片段 ： 1μl， 每种 EXP18D 启动子缺失体酶切小片段 ： 7μl， T4DNA 连接酶 ： 1μl ； 16℃连接过夜 ； 参考Ⅲ -C-a 中的方法将 6 种连接产物分别进行转化处理、 振荡培养处理、 质粒提取 处理， 得到 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体 ： 质粒载体 PCAMBIA-GUS-EXP18D-P1、 质 粒 载 体 PCAMBIA-GUS-EXP18D-P2、 质 粒 载 体 PCAMBIA-GUS-EXP18D-P5、 质 粒 载 体 PCAMBIA-GUS-EXP18D-P4、 质 粒 载 体 PCAMBIA-GUS-EXP18D-P5、 质 粒 载 体 PCAMBIA-GUS-EXP18D-P6 ； 图 9 中为以上 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体的结构简图。
     D、 将所述的 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体转化拟南芥植株， 得到 T3 代 转化体植株， 再进行检测。
     a. 将所述的 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体转入拟南芥， 得到 T3 代拟南 芥植株转化体 ； 试验材料 ： 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana) 为 Columbia-0 野 生 型， 菌株与质粒 ： 大肠杆菌 (Esche-richia coli)DH5a 菌株、 农杆菌 (Agrobacterium turnefaciens)EHA105 （GV3101） 菌株 ； 主要试剂 ： 70% 消毒酒精、 漂白消毒剂 (50% 家用漂白剂、 50％无菌水、 0.05% Tween-20)、 Silwet L-77、 蔗糖 ( 试剂级 )、 葡萄糖 ( 试剂级 )、 食用蔗糖、 甘露醇等 ；培养基 ： LB 培 养 基 1L ： 10 g 胰 蛋 白 胨 (Tryptone) ； 5 g 酵 母 提 取 物 (Yeast Extract) ； 5 g NaC1 ； 渗透培养基 ： 5% 蔗糖， 0.3%-0.5% Silwet L-77， PH 5.7 ； 筛选培养基 ： 1 ／ 2MS ； 8 g ／ L 琼脂 ； 50 μg Kan ； pH 5.8。
     （a） ．拟南芥的培养与处理 ： 将春化 3 ～ 4 d 的拟南芥种子播种于用 PNS(Plant Nutrition Solution) 培养液浸湿 的人工土中 ( 腐殖土 ： 蛭石 =1 ： 1)， 并用保鲜膜罩上， 置于人工培养室中光照培养， 1 个月后 揭膜 ( 培养室条件 ： 相对湿度 70% ， 恒温 (23±2)℃ ， 光照强度 4 000 lx， 光照周期为黑暗 8 h、 光照 16 h) ； 待植物培养至初生花序约 5 ～ 15 cm、 次生花序刚刚形成花芽状时， 去除初 生花序， 有益于次生花序的生长发育， 便于渗透转化 ； 渗透转化处理应在去除初生花序 3 ～ 5 d 内完成 ； 并且在渗透转化的前 1 d 植物需充分浇水， 以便植物气孔在转化时充分张开 ； （b） . 菌液的培养 ： 将制备好的已转化了 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体的农 杆菌菌液 10mL， 在转化前 1 d 晚上， 转入大瓶过夜培养 ； 第 2 天取出使用时农杆菌液 OD600 为约 2.0 ； 于室温离心处理 （5000rpm， 15 min） ， 弃上清液， 将农杆菌沉淀悬浮于约 3 倍体积 的渗透培养液中， 使 OD600 在 0.8 左右 ； （c） . 农杆菌侵染拟南芥花序 ： 将植物的地上部分浸入农杆菌悬浮液中侵染 15 秒 ； 或 用胶头滴管吸取农杆菌悬浮液一滴一滴对每朵花进行侵染 ； 再用保鲜膜将侵染过的植物 (T0 代植物 ) 罩起来以保持湿度， 置人培养室中暗培养 10 h， 然后置于正常培养条件， 2～3 d 后可去掉保鲜膜 ； 转化后 1 周左右方可浇水， 并定期继续侵染几次， 继续培养至植物成熟， 收种子 (T1 代 ) 放在干燥环境中 1 周左右， 即可筛选到转化子 ； （d） . 拟南芥 T1 代种子的筛选 ： 将 T1 代种子先用 70% 的酒精浸泡消毒， 再用漂白消毒 剂溶液处理 ； 消毒后的种子均匀地涂布在筛选培养基表面， 于 4℃放置 2 ～ 3 d 后， 移至人 工培养室中培养 ； 然后将确定的转化子转入土壤中培养至成熟， 收获种子 （T2 代种子） ； （e） . 将上述 T2 代种子按照 d 中的方法进行筛选、 培养， 收获 T3 代种子 ； （f） . 将上述 T3 代种子经过两次筛选得到 T3 代纯合种子， 消毒后在 MS 培养基培养， 得 到 T3 代拟南芥转化体植株 ； b. 将所述的 T3 代拟南芥转化体植株进行 GUS 组织化学染色处理， 观察染色结果 ； （a） ．配制 GUS 染色液和脱色液 ： 配制所述的 GUS 染色液 ： 取 5 mg X-gluc 溶于 410 μl 二甲甲酰胺， 分装成 20 uL/ 管， 置于 -20℃ 冰箱中储存， 用时取一管加下述溶液配成染色液 （现配现用） ： 50 mM 磷酸钠缓冲液 (pH7.0) ： 760 ul（高压灭菌） ， 50 mM K3[Fe(CN)6] ：10 μl（过 滤灭菌） ， 50 mM K4[Fe(CN)6] ： 10 μl（过滤灭菌） ， 0.5 M EDTA ： 10 μl（高压灭菌） ， Triton X-100 ：1 μl， 甲醇 ： 200 ul ； 所述的脱色液为浓度 70％的乙醇溶液 ； (b). 取 a-（f） 步骤培养十天的拟南芥植株转化体放入所述的 GUS 染色液中进行染色 处理， 温度为 37℃， 时间为 3 小时以上 ； (c). 用脱色液进行脱色处理 12-24 小时， 在显微镜下进行观察， 拍照 ； 结果如下 ： 图 10 为以上 6 种 EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体在拟南芥转化体植株的表达量的 Gus 染色图 ； 图 10 包括 P1-P6 共 6 部分， 每部分的左侧的植株为转入相应的 EXP18D 启动 子缺失体 GUS 表达载体的拟南芥植株转化体， 右侧为野生型植株作为对照 ； 由 P1-P3 部分 可见， EXP18D 启动子缺失体 GUS 表达载体特异性地在拟南芥植株的根部表达 ； 由 P1-P6 部 分可见， 随着启动子序列长度的缩短， gus 基因在根中的表达量逐渐降低 ； 当启动子缩短为 954bp 时不再具有活性， 说明在 -967~ -855 区域可能存在与根特异表达相关的调控元件。
     本实施例中， 使用各种限制性内切酶、 T4DNA 连接酶、PrimeSTAR 酶均购自 Takara 公司 ； 各种 Marker 购自 Takara 公司 ； 各种 PCR 反应试剂盒购自 Takara 公司 ； DNA 纯化试 剂盒、 PMD18-T 质粒载体试剂盒、 表达载体 PCAMBIA1391 试剂盒均购自 Promega 公司 ； DNA 凝 胶回收试剂盒型号为 DV805A， 购自宝生物工程 （大连） 有限公司 ； CTAB、 Trizol 等其他常规 生化试剂和试剂盒购自北京经科宏达生物技术公司和北京欣经科生物技术公司。
     本实施例中， 各种 PCR 引物合成和 DNA 测序工作均由上海生工生物工程技术服务 有限公司完成。
     本实施例中， 各种 PCR 反应使用 PTC-100 Peltier Thermal Cycler 基因扩增仪， 购自 MJ Research Inc 公司 ； 所述的琼脂糖凝胶电泳使用 UVP Gel Documentation 凝胶分 析系统， 购自基因公司 ； 所述的琼脂糖凝胶电泳使用 DYCP-31DN 电泳仪， 购自北京六一仪器 公司。 本实施例中， 采用的 DNA 提取、 PCR、 酶切、 连接、 转化等基因工程基本操作方法记 载于各个试剂盒的说明书中 ； 上述基本操作方法也可以参考 《分子克隆实验指南第三版》 中 （ （美〕 J. 萨姆布鲁克 等著， 科学出版社， 2002 年出版） ， 和 《植物基因工程原理与技术》 中 （王 关林 , 方宏筠 著， 科学出版社， 1998） 。
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