一种检测秦川牛 AMPD1 基因连锁突变的方法 技术领域 本发明属于分子生物学领域， 具体涉及基因单核苷酸多态性 (SNPs) 的检测， 特别 涉及一种快速检测秦川牛腺苷一磷酸脱氨酶 1(AMPD1) 基因内含子 11 区域第 19416 位和第 19421 位单核苷酸多态性的 PCR-SSCP(PCR- 单链构象多态性 ) 方法， 该方法利用聚丙烯酰胺 凝胶电泳对包含该单核苷酸多态性位点的基因序列进行检测， 并对其进行片段分离， 利用 凝胶成像系统分析其片段多态性， 再结合测序技术， 从而准确确定其 SNPs。
背景技术
通过对 SNP 进行分析， 我们可以从遗传学的角度来很好的解释个体表型所造成的 差异。SNP 和其他分子标记相比较而言， 分辨率最高也最为丰富， 几乎可以覆盖到整个基因 组范围， 遗传上相对比较稳定。在动物基因组中 SNP 分布广泛， 每一个核苷酸发生突变的概 -9 率大约为 10 ， 编码区位置可发生突变， 5′端、 3′端、 非编码区以及内含子区域也可以发生 突变。
虽然 SNP 的检测方法有很多种， 但是各有其自身的特点， 而且大多数方法以聚合 酶链式反应为主要基础， 利用碱基差异造成的 DNA 片段的各种差异来进行 SNP 检测和分析。
目前， 实验室工作人员主要采用以下几种不同的方法来发现 SNPs ： 即直接测序 法、 PCR-RFLP 法、 AS-PCR 方法、 引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。
在这些 SNPs 检测技术中， 直接测序法是最为准确的 SNPs 检测方法， 测序法检测单 核苷酸多态性的效率可以达到 100％。 但是， 因为需要用到专门的 大型测序仪器， 而且需要 有熟练操作仪器的技术工作人员， 还需要有丰富的测序经验， 更为重要的是直接测序的检 测费用极其昂贵， 对实验人员来说， 直接测序无疑不是一种应用于生产实际的理想 SNPs 检 测方法 ； PCR-RFLP 法是利用限制性内切酶可以识别 DNA 特异位点， 并可在特异位点进行识 别切割的特点， 将其切割成不同大小的片段， 从而来判断其多态性。这种检测方法准确， 重 复性高， 但是碱基的替换、 插入、 缺失可以产生或者消除一个特定的酶切位点， 从而改变了 用这种酶切割之后产生片段的大小和数目， 所以当遇到没有合适的内切酶可以直接切割特 异位点时， 这种方法就显得无能为力 ； AS-PCR 方法作为一种新型的 SNPs 检测方法， 在未来 的应用领域中具有非常的前景， 但是， 该方法需要设计特别的引物， 且只能针对特定的基因 位点， 同时， 检测过程中还存在误检的概率， 因此， 目前不具有普遍应用的特点 ； 而引物延伸 法和寡核苷酸连接反应技术检测 SNPs 位点， 需要平板读数仪、 基因芯片、 微球阵列技术和 质谱仪等检测平台， 对于一般的分子实验室来说可实施性不强。
综上所述， 现有的几种方法均不是一种检测 SNPs 的理想的遗传标记方法。而基于 PCR 的单链构象多态性是以构象为基础的检测基因组中单核苷酸突变的方法。它的基本原 理是 ： 单链 DNA 片段呈现复杂的空间折叠构象， 当有一个碱基发生改变时， 会或多或少地影 响其空间构象， 使构象发生改变， 空间构象有差异的单链 DNA 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受 到的阻力大小不同。 因此， 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 可以非常敏锐地将构象上有差 异的分子分离开。该技术以其高度的灵敏性 ( 甚至一个碱基的改变也可通过不同的带型检测出来 )、 操作的简便性 ( 整个实验过程在 1 ～ 2 小时内就能完成 ) 和应用范围的广泛性， 已成为人类和动物遗传育种中快速、 灵敏探测已知基因突变位点， 识别未知基因突变的一 项新技术。
AMPD 属于多基因家族， 其成员有三个， AMPD1 是家族成员之一。AMPD1 基因存在于 所有的真核生物中， 但主要是在肌肉中表达， 特别是在骨骼肌中高水平的进行表达， 并且与 肌肉中肌苷酸代谢有关。目前， 关于动物 AMPD1 基因遗传变异的研究国内外主要集中在鼠、 鸡和猪等动物上， 未见牛 AMPD1 基因遗传变异或 SNPs 研究的相关报道。 目前中国地方黄牛， 特别是秦川牛 AMPD1 基因遗传变异领域的研究匮乏， 该基因的功能研究及其遗传变异与生 长和胴体性状 ( 如 ： 体高、 体斜长、 腰角宽、 空腹 24h 宰前活重、 胴体重、 屠宰率等性状 ) 关联 的研究仍是空白。 发明内容
针对上述现有技术中存在的问题和缺点， 本发明的目的在于提供一种检测秦川牛 AMPD1 基因连锁突变的 PCR-SSCP 方法， 该检测方法操作简单、 快速、 成本低， 而且检测的精 确度高， 便于推广应用。 为了实现上述发明目的， 本发明是通过以下技术方案来实现 ：
一种检测秦川牛 AMPD1 基因连锁突变的 PCR-SSCP 方法， 以包含 AMPD1 基因的待 测秦川牛全基因组 DNA 序列为模板， 在 2×Reaction Mix、 ddH2O、 Forward primer、 Reverse primer、 Golden DNA polymerase、 DNA 模板存在的情况下， 设计聚合酶链式反应引物， 在 PCR 反应程序下进行扩增， 扩增后将 PCR 产物放于 98℃高温下变性 10min， 从而使 DNA 双链充分 变性为 DNA 单链。然后再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 利用凝胶成像系 统分析， 并鉴定其多态片段， 得秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子区域 第 19416 位和第 19421 位分别发生了 T ＞ C 和 A ＞ G 的单核苷酸多态性。
所述的聚合酶链式反应引物为 ：
上游引物 ： 5′ -AACCCTCAGGCTCACCCA-3′ 18bp ；
下游引物 ： 5′ -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3′ 18bp。
所述的 PCR 反应程序为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 60℃ 40s， 72℃ 40s， 共 36 个 循环， 最后 72℃延伸 10min， 4℃保存。
所述的 PCR 反应体系是 ： 15μL 反应体系包括 ddH2O 6.1μL， 2×Reaction Mix 7.5μL， 上游引物 0.3μL， 下游引物 0.3μL， Golden DNA polymerase 0.2μL， 含 AMPD1 基 因序列的 DNA 模板 0.6μL。
所述的检测 AMPD1 基因单核苷酸多态性的方法， 聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为 10％。
本发明根据 AMPD1 基因的序列设计引物， 以秦川牛的基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增， 并对 PCR 产物进行测序， 测序后得到秦川牛的 AMPD1 基因的部分序列。与 NCBI 公布 的序列进行比较发现在 g.19416T ＞ C 和 g.19421A ＞ G 两个位置存在 SNPs 多态性。
针对上述的 SNPs 多态性， 本发明还公开了其筛查和检测方法， 通过设计特定的引 物， 构建混合 DNA 样品池， PCR 扩增， 扩增产物直接测序， 特定的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定， 能够简单、 快速、 低成本、 精确的检测其单核苷酸的多态性。
本发明对秦川牛的 SNPs 基因型进行了检测和基因频率分析， 对上述 SNPs 位点与 秦川牛生长和胴体性状进行关联分析， 结果表明该连锁突变位点能够作为秦川牛生长和胴 体性状的分子标记。 附图说明 图 1 为秦川牛血样基因组 DNA 电泳检测图。
图 2 为秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子 299bp PCR 产物 1.5％琼脂糖凝胶电泳图。
图 3 为秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子 299bp PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
下面结合附图说明和发明人给出的最佳实施方式对本发明做进一步的详细说明， 以使公众对发明内容从整体上得到充分的理解， 而并非对本发明保护范围的限定。
具体实施方式
以下实施例中所用的主要试剂来源 ：
一、 常用实验试剂
柠檬酸， 柠檬酸钠， 葡萄糖， 氯化钠， 氯化钾， 磷酸氢二钠， 磷酸二氢钾， 乙二氨四乙 酸二钠， 琼脂糖， 盐酸， 硼酸， 氢氧化钠， 蔗糖， 氯仿， 硝酸银， 丙烯酰胺， 甲醛， Tris 饱和酚， 二 甲基苯青 FF， Tris， 十二烷基磺酸钠， 无水乙醇， 溴酚蓝， N， N’ - 亚甲双丙烯酰胺， 去离子甲 酰胺， TEMED， 核酸染料， 蛋白酶 K， DNA 聚合酶， DNA Marker I， PCR 产物胶回收试剂盒 等， 均 购自北京天根生化科技有限公司。
二、 试剂和溶液的配制
试剂和溶液的配制方法具体如下 ：
(1)ACD 抗凝剂
柠檬酸 2.4g， 柠檬酸钠 6.6g， 葡萄糖 7.35g， 加水定容至 50mL 蒸馏水中， 采集血样 时， 在新鲜血液中按一定比例加入 ACD。ACD 在血液贮存过程中能更好地保存 DNA 的天然状 态。
(2)PBS 缓冲液
NaCl 4g， KCl 0.1g， Na2HPO40.72g， KH2PO40.12g， 加灭菌过的蒸馏水定容至 500mL， 用 pH 试纸调 pH 至 7.4， 120℃高压灭菌 20min。
(3)0.5mol/L EDTA
称量 186.1g 乙二胺四乙酸二钠倒入 500mL 灭菌蒸馏水中， 在磁力搅拌器上搅拌使 其溶解， 溶解后定容至 1000mL， 用 NaOH 溶液调节 pH 值到 8.0， 120℃高压灭菌 20min。
(4)DNA 抽提液
分别量取 1mmol/L Tris·Cl 100mL， 5mmol/L NaCl 40mL， 0.5mmol/LEDTA 400mL， 10％十二烷基磺酸钠 100mL， 定容至 1000mL。pH 值用 NaOH 调为 8.0。
(5) 蛋白酶 K
加 5mL 灭菌蒸馏水， 稀释成 20mg/mL， 放入 -20℃保存备用。
(6)70％乙醇无水乙醇 350mL， 加蒸馏水 150mL 定容至 500mL。
(7)10×TBE 缓冲液
称取 Tris 54g， 硼酸 27.5g， EDTA·Na23.72g， 加热混匀， 保存备用。
(8)40％的蔗糖水溶液
40g 蔗糖加入 60g 灭菌水中溶解， 保存于 4℃冰箱。
(9)SSCP 垂直电泳上样缓冲液 ：
0.025％溴酚蓝， 0.025％二甲基苯青 FF， 40％的蔗糖水溶液。
(10)SSCP 变性剂
95 ％的去离子甲酰胺 9.8mL， 0.5mol/L EDTA( 调 pH ＝ 8.0)200μL， 二甲苯青 FF 100μL， 溴酚蓝 100μL。
(11)30％丙烯酰胺
称取丙烯酰胺 29g 和 N， N’ - 亚甲基双丙烯酰胺 1g 加水至 100mL， 加热使完全溶 解， 置于棕色瓶中 4℃条件下保存备用。配溶液时需戴手套， 以防止丙烯酰胺的神经毒性作 用。
(12)10％过硫酸铵
10g 过硫酸铵放入 100mL 灭菌水中， 充分溶解后放入 4℃储存。最好现用现配。 (13) 染色液 称取 0.5g 硝酸银溶于 500mL 双蒸水中， 棕色瓶保存以避免硝酸银发生氧化。 (14) 显色液 称 10g 氢氧化钠， 0.2g 无水碳酸钠溶解于 500mL 双蒸水中， 用前加 750μL 甲醛。 三、 软件工具 (1) 引物设计软件 Primer Premier 5.0 软件结合 Oligo 6.0 软件自行设计引物 ； (2) 序列分析软件 BioXM(Version 2.6) 软件和 DNA Star 7.10 软件进行序列比对和突变位点分析 ； (3) 统计分析软件 EXCELL 用于数据统计 ； SPASS 16.0 进行各性状指标的统计和分析， 以及差异显著性检验。 实施例 1 ： 秦川牛样本采集、 基因组 DNA 提取以及 DNA 样品池的构建
一、 实验动物的采集
2008 年 9 月至 11 月在陕西省秦宝牧业发展有限公司， 从秦川牛群体中随机选取 30±2 月龄的公牛屠宰， 共采集秦川牛血样 215 份。15mL 全血中加入 0.5mL 的 ACD 抗凝剂， 上下颠倒混匀后置于冰盒中带回实验室， 样品放于 -80℃保存备用。
二、 牛血样基因组 DNA 的提取过程
血样基因组 DNA 的提取， 具体操作如下 ：
(1) 将血样从 -80℃取出后， 放于常温下让其慢慢的融化 ； 在半冻融状态下开始吸 取 800μL 的血液于 2mL 的灭过菌的离心管中 ；
(2) 再从 PBS 缓冲液中吸取 800μL， 使总体积达到 1600μL， 轻轻摇动 10min ；
(3) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(4) 弃上清， 重复上面的步骤， 直到上清液变的清亮 ；
(5) 加入 DNA 抽提液 800μL， 缓慢摇动 10min， 于 37℃水浴 1.5h ；
(6) 加蛋白酶 K 5μL， 混匀后在恒温水浴箱中 57℃过夜消化蛋白质等， 当溶液变 得澄清透明时， 便可拿出 ；
(7) 加入 800μL 的 Tris 饱和酚， 放在冰上温和摇动 15min ；
(8) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(9) 用大口径枪头小心吸取上清液到灭菌的离心管中 ；
(10) 加入 400μL 的 Tris 饱和酚和 400μL 的氯仿， 放在冰上温和摇动 15min ；
(11) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(12) 用大口径枪头小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中 ；
(13) 加入 800μL 的氯仿， 放在冰上温和摇动 15min ；
(14) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(15) 用大口径枪头小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中 ；
(16) 加入至少 2 倍体积的无水乙醇， 上下颠倒数次使 DNA 析出 ；
(17) 低温下， 12000rpm 离心 10min， 弃去乙醇 ；
(18) 加入 70％的乙醇 1mL， 温和摇动 10min ； (19) 低温下， 12000rpm 离心 10min， 如有需要视情况可重复漂洗一次 ； (20) 室温下让乙醇挥发干净， 加入一定量灭菌水溶解 DNA， 完全溶解后测定浓度和纯度。 三、 紫外分光光度计测定 DNA 浓度和纯度
以 50ng/μL 作为标准 DNA 浓度， 若测得的 DNA 浓度在 50ng/μL 左右， 说明 DNA 浓度符合实验要求 ； 浓度过高的需要稀释成标准浓度 ； 浓度过低的需重新提取 DNA。
若 A260nm/A280nm 比值在 1.6-2.0 之间时， 可判定 DNA 的纯度基本符合要求。若 A260nm/A280nm 比值小于 1.6 或者大于 2.0 时， 可判定纯度不符合要求。必须对样品 DNA 做进 一步的纯化， 或重新提取 DNA。
四、 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量
(1) 将凝胶电泳槽洗干净， 插上梳子。
(2) 称取 0.5g 的琼脂糖， 转入三角瓶中， 加入 1×TBE 20mL 使其悬浮， 微波炉加热 70 秒， 待溶液沸腾呈透明状时拿出。
(3) 待三角瓶内液体温度不烫手时， 按 10 ∶ 1 的比例加入 2μL 核酸染料， 轻微摇 动， 防止出现气泡。
(4) 混匀后， 立即将琼脂糖溶液倒入槽内。如出现气泡， 立即用针头或干净的小枪 头将气泡挑破。
(5) 放置一段时间后， 用手触摸 ( 戴手套 ) 如果完全冷却凝固， 拔掉梳子， 将凝胶移 入电泳槽中。
(6) 向电泳槽中加入 1×TBE 缓冲液， 使液面高出胶面 5mm。
(7) 取 DNA 样品 3μL， 加 3μL 上样缓冲液后， 混匀上样。
(8)100V 电压电泳 1h。
(9) 在凝胶成像系统上观察， 如果电泳条带清晰而规则， 没有明显拖尾现象， 说明
提取的 DNA 效果较好， 可以满足实验需要， 否则需重新提取相应样品的 DNA。
五、 混合 DNA 样品池的构建
本实验混合 DNA 样品池的构建方法如下 ： 将提取的基因组 DNA， 用紫外分光光度计 测量每个 DNA 样品浓度各 3 次， 取平均值， 再将样品稀释到终浓度为 50ng/μL， 10 个 DNA 样 品中各取 2μL 快速构建成 DNA 池。以池中 DNA 样品为模板进行扩增， 并送去测序， 快速筛 查基因的 SNPs。
结果 ： 秦川牛血样基因组 DNA 的检测结果见图 1。
实施例 2 ： 秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子的 PCR 扩增
一、 秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子 PCR 引物的设计
以 NCBI 数 据 库 中 GenBank 公 布 的 牛 ( 登 录 号 ： NC_007301) 序 列 为 参 考， 利用 Premier 5.0 软件结合 Oligo 6.0 软件设计秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子的 PCR 引物 ( 片 段大小为 299bp)， 其引物序列如下 ：
上游引物 ：
5′ -AACCCTCAGGCTCACCCA-3′ 18bp ；
下游引物 ： 5′ -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3′ 18bp。
该引物对扩增了秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子区域。
二、 PCR 扩增
(1)PCR 反应体系
PCR 反应体系采用混合加样法， 实验中我们通常是先计算出每一种成份所需要的 量， 然后再算出加样总量， 之后均等分装到每一个 PCR 管， 然后加入模板 DNA， 再瞬时离心后 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系如表 1。
表 1PCR 反应体系
(2)PCR 反应程序 PCR 反应程序见表 2 ： 表 2PCR 反应程序结果 ： PCR 扩增结果见图 2， 图中泳道 1 ～ 10 为秦川牛不同个体扩增的 PCR 产物， 片段大小为 299bp ； M 为 Marker I(600bp， 500bp， 400bp， 300bp， 200bp， 100bp)。
电泳结果表明 ： PCR 片段的大小为 299bp， 与理论设计的大小完全一致。 故此， 成功 扩增出秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子区域 DNA 片段。
三、 目的片段胶回收和测序
PCR 产物点样于 1％的琼脂糖凝胶， 100V 电压电泳 30min， 核酸燃料染色， 然后进行 切胶回收， 详细步骤如下 ：
第一次使用前先在 15mL 漂洗液 PW 中加入 60mL 无水乙醇！
(1) 吸附柱放入收集管中， 向吸附柱 CA2 中加入 500μL 平衡液 BL， 12000 rpm 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中 ；
(2) 将目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中， 称重 ；
(3) 向胶块中加入 3 倍体积溶胶液 PN ； 如凝胶重为 0.1g， 使其体积为 100μL， 依此 类推。50℃水浴放置 10min， 其间不停翻转离心管， 以保证胶块充分溶解。
(4) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱 CA2 中， 室温放置 2min， 12000rpm 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱 CA2 放入收集管中 ；
(5) 向吸附柱 CA2 中加入 600μL 漂洗液 PW， 12000rpm 离心 1min， 倒掉收集管中的 废液， 将吸附柱 CA2 放入收集管中 ；
(6) 重复上述步骤 (5) ；
(7)12000rpm 离心 2min， 尽量除尽漂洗液。将吸附柱 CA2 置于室温放置数分钟， 彻 底晾干， 以防止残留的漂洗液影响下一步实验 ；
(8) 将吸附柱 CA2 放入一个干净的离心管中， 向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗 脱缓冲液 EB， 室温放置 2min， 12000rpm 离心 2min 收集 DNA 溶液。
回收后的产物送南京金斯瑞生物科技公司进行正、 反双向测序， 测序使用的是 ABI 3730 型全自动序列分析仪。
实施例 3 ： 生物信息学分析
根据个体和混合 DNA 模板测序后的峰图结果， 以 NCBI 数据库中 GenBank 公布的牛 NC_007301 序列为参考， 利用 BioXM(Version 2.6) 软件和 DNA Star 7.10 软件将测序后序 列与公布的参考序列进行 DNA 序列比对和突变位点分析， 结果发现快速筛查到碱基突变位 点， 为进一步验证碱基突 变位点的变异情况， 在整个秦川牛群体中进行了下一步的实验。
实施例 4 ： 秦川牛 AMPD1 基因的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
利用实施例 2 中的引物和 PCR 扩增条件， 对实施例 1 中秦川牛的 215 份基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 获得 215 份个体的秦川牛 AMPD1 基因中包含 SNPs 位点的 DNA 片段， 然后利
用如下方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 具体方法如下 ：
( 一 )10％聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1) 装板
事先将洗干净、 晾干的每一套玻璃板的两边及底部装上垫片， 尽量使底边及侧边 紧密接触， 夹子固定好， 用 0.8 ～ 1％的废弃琼脂糖封边， 确保接头处都封上以免漏胶。
(2) 配胶
根据不同长度的 PCR 扩增片段配制适合浓度的胶。最适合的胶浓度是经过多次的 摸索条件得来的， 根据实验经验， 此实验中 299bp 长度的片段适合的胶浓度和胶成份见表 3。
表 3 中性聚丙烯酰胺凝胶的成份
(3) 灌胶
配好胶后搅匀， 灌入装好的玻璃板中， 注意不能产生气泡， 如果产生气泡把玻璃板 立起， 轻轻敲打可使气泡升出胶面， 胶面与凹板上沿大约差 0.5cm 时插上梳子， 要保证梳子 齿和液面接触处没有气泡， 一旦产生气泡要拔出重插。
(4) 静置
灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度， 静置水平桌面上 30min 左右使之充分 聚合。
(5) 点样
A. 安装板子
聚丙烯酰胺凝胶聚合好后要及时拔出梳子 ( 时间耽搁长后会使梳子很难拔出 )， 拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。将玻璃板放入电泳槽中固定好， 倒入缓冲液与液 面齐平， 速度要慢， 以免梳子孔中进入气泡， 产生的大气泡会使电泳条带弯曲。
B.PCR 产物的高温变性
取 4μL PCR 产物， 加入 8μL SSCP 变性剂， 混匀后， 在 98℃条件下充分变性 10min， 取出立刻放入碎冰块中冰浴 10min 以上。
C. 点样
用微量加样器把变性产物按顺序加到点样孔中。由于边缘效应带型不整齐， 每块 板中最边上的两个孔最好不要点样。
(6) 电泳
A. 预电泳
打开电源， 电压调到 290V， 预电泳 10min 左右。
B. 正式电泳
电压调至 205V， 在 4℃条件下， 恒温电泳 1 ～ 2 个小时。
(7) 染色
A. 银染
电泳结束， 把胶卸下， 做好起始记号， 再浸入 0.1％ AgNO3 溶液中染色 10 ～ 15min， 染色液同时染两块胶要适当增加时间。倒掉染色液， 用去离子水冲洗 3 遍。
B. 显色
然后浸入 2％ NaOH( 含 750μL 甲醛溶液 ) 中显色 10 ～ 15min。显色液中可以看 到清晰的条带时， 倒掉显色液， 加适量蒸馏水， 用凝胶成像系统照相。
( 二 ) 凝胶成像系统照相分析
银染后， 利用北京伯乐公司 T2A 型凝胶成像系统照相分析， 判断 SNPs 的多态性， 并 做好记录和带型统计。
AMPD1 基因的第 19416 位和第 19421 位分别发生 T ＞ C 和 A ＞ G 时， PCR 扩增的 AMPD1 基因产物产生不同的带型。由于牛为二倍体， 所以牛基因组的 AMPD1 基因的第 19416 位和第 19421 位的 SNPs 多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为 ： 如图 3 所示， 其中， 泳道 1 为 AC 基因型个体 ； 泳道 2 为 CC 基因型个体 ； 泳道 4 为 BC 基因型个体 ； 泳道 5 为 AA 基因型个 体； 泳道 6 为 CD 基因型个体。
( 三 ) 不同带型个体 PCR 产物的测序验证
利用 ABI 3730 型测序仪对不同带型个体的 PCR 产物分别进行正反双向测序， 测序 后将结果拼接成完整的序列。 同时， 进行秦川牛 AMPD1 基因 SNPs 分析。 测序结果如图 4A ～ 图 4E 所示。图 4A ～图 4E 中， 左侧箭头的指示位置均表示第 19416 位发生 T 和 C 之间的碱 基突变， 相隔 4bp 后， 右侧箭头指示位置均表示第 19421 位发生 A 和 G 的碱基突变。图 4A 为 AA 基因型测序结果， 对应着单倍型 A ； 图 4B 为 BC 基因型测序结果， 对应着单倍型 B ； 图 4C 为 AC 基因型测序结果， 对应着单倍型 C ； 图 4D 为 CC 基因型测序结果， 也对应着单倍型 C； 图 4E 为 CD 基因型测序结果， 对应着单倍型 D。 实施例 5 ： 不同基因型与生长和胴体性状的关联分析
基因型统计 ： 秦川牛群体中出现 AA， BC， AC， CC， CD 共 5 种不同的基因型。
相关性状数据 ：
生长指标包括 ： 体高， 体斜长， 腰角宽 ； 此数据资料在秦川牛屠宰前， 由本实验室 人员进行当天测量并记录。测量工具为测杖、 卷尺和钢尺。严格按照如下要求测量 ：
(1) 体高 ： 鬐甲最高点至地面的垂直距离。
(2) 体斜长 ： 肩端前缘到臀端后缘的直线距离。
(3) 腰角宽 ： 两侧腰角外缘间的距离。
胴体性状指标包括 ： 空腹 24h 宰前活重， 胴体重， 屠宰率 ； 此数据资料由陕西省秦 宝牧业发展有限公司在牛屠宰后由实验室人员和公司工人当天测量和记录。 严格按照如下 要求测定 ：
(1) 空腹 24h 宰前活重 ： 屠宰前禁食 24 小时， 但可以自由饮水， 屠宰前用电子秤进 行称重并做好记录。
(2) 胴体重 ： 每头牛经宰杀、 放血、 去头、 蹄、 内脏、 剥皮、 劈半、 冲洗后称重。
按照如下公式计算屠宰率 ：
关联分析结果见表 4， 实验采用 SPSS 16.0 软件对不同基因型与各性状指 标进行 统计和分析， 以及差异显著性检验。
关联结果表明， 在体高和腰角宽两个体尺性状指标上， 五种基因型之间无显著差 异 (P ＞ 0.05) ； 体斜长指标上， BC 基因型个体与 AA 和 CD 基因型个体达到差异显著水平 (P ＜ 0.05)。空腹 24h 宰前活重指标上， BC 型个体与 CD 型个体达到了统计学的差异显著水平 (P ＜ 0.05) ； 胴体重上， BC 型个体与 AA、 CC、 CD 型个体达到了统计学的显著水平 (P ＜ 0.05) ； 屠宰率指标上， BC 型个体与 AA 型个体达到了统计学的显著水平 (P ＜ 0.05)。在这几项指 标中， BC 基因型的值普遍地高于其它基因型， 这说明 BC 基因型在整个秦川牛群体中处于优 势地位， 是优势基因型， 所以在牛的早期生长发育期， 我们应尽可能的选择 BC 基因型个体 留作种用。同时， BC 型个体也具有较好的胴体品质， 所以多选留 BC 基因型的个体， 可加快 具有优质经济性状牛种群的建立。
表 4 秦川牛 AMPD1 基因不同基因型与生长和胴体性状间的关联分析
注： 同一行中肩标字母相同者表示差异不显著 (P ＞ 0.05)， 不同字母表示差异显 著 (P ＜ 0.05)
背景技术
通过对 SNP 进行分析， 我们可以从遗传学的角度来很好的解释个体表型所造成的 差异。SNP 和其他分子标记相比较而言， 分辨率最高也最为丰富， 几乎可以覆盖到整个基因 组范围， 遗传上相对比较稳定。在动物基因组中 SNP 分布广泛， 每一个核苷酸发生突变的概 -9 率大约为 10 ， 编码区位置可发生突变， 5′端、 3′端、 非编码区以及内含子区域也可以发生 突变。
虽然 SNP 的检测方法有很多种， 但是各有其自身的特点， 而且大多数方法以聚合 酶链式反应为主要基础， 利用碱基差异造成的 DNA 片段的各种差异来进行 SNP 检测和分析。
目前， 实验室工作人员主要采用以下几种不同的方法来发现 SNPs ： 即直接测序 法、 PCR-RFLP 法、 AS-PCR 方法、 引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。
在这些 SNPs 检测技术中， 直接测序法是最为准确的 SNPs 检测方法， 测序法检测单 核苷酸多态性的效率可以达到 100％。 但是， 因为需要用到专门的 大型测序仪器， 而且需要 有熟练操作仪器的技术工作人员， 还需要有丰富的测序经验， 更为重要的是直接测序的检 测费用极其昂贵， 对实验人员来说， 直接测序无疑不是一种应用于生产实际的理想 SNPs 检 测方法 ； PCR-RFLP 法是利用限制性内切酶可以识别 DNA 特异位点， 并可在特异位点进行识 别切割的特点， 将其切割成不同大小的片段， 从而来判断其多态性。这种检测方法准确， 重 复性高， 但是碱基的替换、 插入、 缺失可以产生或者消除一个特定的酶切位点， 从而改变了 用这种酶切割之后产生片段的大小和数目， 所以当遇到没有合适的内切酶可以直接切割特 异位点时， 这种方法就显得无能为力 ； AS-PCR 方法作为一种新型的 SNPs 检测方法， 在未来 的应用领域中具有非常的前景， 但是， 该方法需要设计特别的引物， 且只能针对特定的基因 位点， 同时， 检测过程中还存在误检的概率， 因此， 目前不具有普遍应用的特点 ； 而引物延伸 法和寡核苷酸连接反应技术检测 SNPs 位点， 需要平板读数仪、 基因芯片、 微球阵列技术和 质谱仪等检测平台， 对于一般的分子实验室来说可实施性不强。
综上所述， 现有的几种方法均不是一种检测 SNPs 的理想的遗传标记方法。而基于 PCR 的单链构象多态性是以构象为基础的检测基因组中单核苷酸突变的方法。它的基本原 理是 ： 单链 DNA 片段呈现复杂的空间折叠构象， 当有一个碱基发生改变时， 会或多或少地影 响其空间构象， 使构象发生改变， 空间构象有差异的单链 DNA 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受 到的阻力大小不同。 因此， 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳， 可以非常敏锐地将构象上有差 异的分子分离开。该技术以其高度的灵敏性 ( 甚至一个碱基的改变也可通过不同的带型检测出来 )、 操作的简便性 ( 整个实验过程在 1 ～ 2 小时内就能完成 ) 和应用范围的广泛性， 已成为人类和动物遗传育种中快速、 灵敏探测已知基因突变位点， 识别未知基因突变的一 项新技术。
AMPD 属于多基因家族， 其成员有三个， AMPD1 是家族成员之一。AMPD1 基因存在于 所有的真核生物中， 但主要是在肌肉中表达， 特别是在骨骼肌中高水平的进行表达， 并且与 肌肉中肌苷酸代谢有关。目前， 关于动物 AMPD1 基因遗传变异的研究国内外主要集中在鼠、 鸡和猪等动物上， 未见牛 AMPD1 基因遗传变异或 SNPs 研究的相关报道。 目前中国地方黄牛， 特别是秦川牛 AMPD1 基因遗传变异领域的研究匮乏， 该基因的功能研究及其遗传变异与生 长和胴体性状 ( 如 ： 体高、 体斜长、 腰角宽、 空腹 24h 宰前活重、 胴体重、 屠宰率等性状 ) 关联 的研究仍是空白。 发明内容
针对上述现有技术中存在的问题和缺点， 本发明的目的在于提供一种检测秦川牛 AMPD1 基因连锁突变的 PCR-SSCP 方法， 该检测方法操作简单、 快速、 成本低， 而且检测的精 确度高， 便于推广应用。 为了实现上述发明目的， 本发明是通过以下技术方案来实现 ：
一种检测秦川牛 AMPD1 基因连锁突变的 PCR-SSCP 方法， 以包含 AMPD1 基因的待 测秦川牛全基因组 DNA 序列为模板， 在 2×Reaction Mix、 ddH2O、 Forward primer、 Reverse primer、 Golden DNA polymerase、 DNA 模板存在的情况下， 设计聚合酶链式反应引物， 在 PCR 反应程序下进行扩增， 扩增后将 PCR 产物放于 98℃高温下变性 10min， 从而使 DNA 双链充分 变性为 DNA 单链。然后再对变性后的扩增片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 利用凝胶成像系 统分析， 并鉴定其多态片段， 得秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子区域 第 19416 位和第 19421 位分别发生了 T ＞ C 和 A ＞ G 的单核苷酸多态性。
所述的聚合酶链式反应引物为 ：
上游引物 ： 5′ -AACCCTCAGGCTCACCCA-3′ 18bp ；
下游引物 ： 5′ -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3′ 18bp。
所述的 PCR 反应程序为 ： 95℃预变性 5min， 94℃ 30s， 60℃ 40s， 72℃ 40s， 共 36 个 循环， 最后 72℃延伸 10min， 4℃保存。
所述的 PCR 反应体系是 ： 15μL 反应体系包括 ddH2O 6.1μL， 2×Reaction Mix 7.5μL， 上游引物 0.3μL， 下游引物 0.3μL， Golden DNA polymerase 0.2μL， 含 AMPD1 基 因序列的 DNA 模板 0.6μL。
所述的检测 AMPD1 基因单核苷酸多态性的方法， 聚丙烯酰胺凝胶的质量浓度为 10％。
本发明根据 AMPD1 基因的序列设计引物， 以秦川牛的基因组 DNA 为模板， 进行 PCR 扩增， 并对 PCR 产物进行测序， 测序后得到秦川牛的 AMPD1 基因的部分序列。与 NCBI 公布 的序列进行比较发现在 g.19416T ＞ C 和 g.19421A ＞ G 两个位置存在 SNPs 多态性。
针对上述的 SNPs 多态性， 本发明还公开了其筛查和检测方法， 通过设计特定的引 物， 构建混合 DNA 样品池， PCR 扩增， 扩增产物直接测序， 特定的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定， 能够简单、 快速、 低成本、 精确的检测其单核苷酸的多态性。
本发明对秦川牛的 SNPs 基因型进行了检测和基因频率分析， 对上述 SNPs 位点与 秦川牛生长和胴体性状进行关联分析， 结果表明该连锁突变位点能够作为秦川牛生长和胴 体性状的分子标记。 附图说明 图 1 为秦川牛血样基因组 DNA 电泳检测图。
图 2 为秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子 299bp PCR 产物 1.5％琼脂糖凝胶电泳图。
图 3 为秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子 299bp PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
下面结合附图说明和发明人给出的最佳实施方式对本发明做进一步的详细说明， 以使公众对发明内容从整体上得到充分的理解， 而并非对本发明保护范围的限定。
具体实施方式
以下实施例中所用的主要试剂来源 ：
一、 常用实验试剂
柠檬酸， 柠檬酸钠， 葡萄糖， 氯化钠， 氯化钾， 磷酸氢二钠， 磷酸二氢钾， 乙二氨四乙 酸二钠， 琼脂糖， 盐酸， 硼酸， 氢氧化钠， 蔗糖， 氯仿， 硝酸银， 丙烯酰胺， 甲醛， Tris 饱和酚， 二 甲基苯青 FF， Tris， 十二烷基磺酸钠， 无水乙醇， 溴酚蓝， N， N’ - 亚甲双丙烯酰胺， 去离子甲 酰胺， TEMED， 核酸染料， 蛋白酶 K， DNA 聚合酶， DNA Marker I， PCR 产物胶回收试剂盒 等， 均 购自北京天根生化科技有限公司。
二、 试剂和溶液的配制
试剂和溶液的配制方法具体如下 ：
(1)ACD 抗凝剂
柠檬酸 2.4g， 柠檬酸钠 6.6g， 葡萄糖 7.35g， 加水定容至 50mL 蒸馏水中， 采集血样 时， 在新鲜血液中按一定比例加入 ACD。ACD 在血液贮存过程中能更好地保存 DNA 的天然状 态。
(2)PBS 缓冲液
NaCl 4g， KCl 0.1g， Na2HPO40.72g， KH2PO40.12g， 加灭菌过的蒸馏水定容至 500mL， 用 pH 试纸调 pH 至 7.4， 120℃高压灭菌 20min。
(3)0.5mol/L EDTA
称量 186.1g 乙二胺四乙酸二钠倒入 500mL 灭菌蒸馏水中， 在磁力搅拌器上搅拌使 其溶解， 溶解后定容至 1000mL， 用 NaOH 溶液调节 pH 值到 8.0， 120℃高压灭菌 20min。
(4)DNA 抽提液
分别量取 1mmol/L Tris·Cl 100mL， 5mmol/L NaCl 40mL， 0.5mmol/LEDTA 400mL， 10％十二烷基磺酸钠 100mL， 定容至 1000mL。pH 值用 NaOH 调为 8.0。
(5) 蛋白酶 K
加 5mL 灭菌蒸馏水， 稀释成 20mg/mL， 放入 -20℃保存备用。
(6)70％乙醇无水乙醇 350mL， 加蒸馏水 150mL 定容至 500mL。
(7)10×TBE 缓冲液
称取 Tris 54g， 硼酸 27.5g， EDTA·Na23.72g， 加热混匀， 保存备用。
(8)40％的蔗糖水溶液
40g 蔗糖加入 60g 灭菌水中溶解， 保存于 4℃冰箱。
(9)SSCP 垂直电泳上样缓冲液 ：
0.025％溴酚蓝， 0.025％二甲基苯青 FF， 40％的蔗糖水溶液。
(10)SSCP 变性剂
95 ％的去离子甲酰胺 9.8mL， 0.5mol/L EDTA( 调 pH ＝ 8.0)200μL， 二甲苯青 FF 100μL， 溴酚蓝 100μL。
(11)30％丙烯酰胺
称取丙烯酰胺 29g 和 N， N’ - 亚甲基双丙烯酰胺 1g 加水至 100mL， 加热使完全溶 解， 置于棕色瓶中 4℃条件下保存备用。配溶液时需戴手套， 以防止丙烯酰胺的神经毒性作 用。
(12)10％过硫酸铵
10g 过硫酸铵放入 100mL 灭菌水中， 充分溶解后放入 4℃储存。最好现用现配。 (13) 染色液 称取 0.5g 硝酸银溶于 500mL 双蒸水中， 棕色瓶保存以避免硝酸银发生氧化。 (14) 显色液 称 10g 氢氧化钠， 0.2g 无水碳酸钠溶解于 500mL 双蒸水中， 用前加 750μL 甲醛。 三、 软件工具 (1) 引物设计软件 Primer Premier 5.0 软件结合 Oligo 6.0 软件自行设计引物 ； (2) 序列分析软件 BioXM(Version 2.6) 软件和 DNA Star 7.10 软件进行序列比对和突变位点分析 ； (3) 统计分析软件 EXCELL 用于数据统计 ； SPASS 16.0 进行各性状指标的统计和分析， 以及差异显著性检验。 实施例 1 ： 秦川牛样本采集、 基因组 DNA 提取以及 DNA 样品池的构建
一、 实验动物的采集
2008 年 9 月至 11 月在陕西省秦宝牧业发展有限公司， 从秦川牛群体中随机选取 30±2 月龄的公牛屠宰， 共采集秦川牛血样 215 份。15mL 全血中加入 0.5mL 的 ACD 抗凝剂， 上下颠倒混匀后置于冰盒中带回实验室， 样品放于 -80℃保存备用。
二、 牛血样基因组 DNA 的提取过程
血样基因组 DNA 的提取， 具体操作如下 ：
(1) 将血样从 -80℃取出后， 放于常温下让其慢慢的融化 ； 在半冻融状态下开始吸 取 800μL 的血液于 2mL 的灭过菌的离心管中 ；
(2) 再从 PBS 缓冲液中吸取 800μL， 使总体积达到 1600μL， 轻轻摇动 10min ；
(3) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(4) 弃上清， 重复上面的步骤， 直到上清液变的清亮 ；
(5) 加入 DNA 抽提液 800μL， 缓慢摇动 10min， 于 37℃水浴 1.5h ；
(6) 加蛋白酶 K 5μL， 混匀后在恒温水浴箱中 57℃过夜消化蛋白质等， 当溶液变 得澄清透明时， 便可拿出 ；
(7) 加入 800μL 的 Tris 饱和酚， 放在冰上温和摇动 15min ；
(8) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(9) 用大口径枪头小心吸取上清液到灭菌的离心管中 ；
(10) 加入 400μL 的 Tris 饱和酚和 400μL 的氯仿， 放在冰上温和摇动 15min ；
(11) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(12) 用大口径枪头小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中 ；
(13) 加入 800μL 的氯仿， 放在冰上温和摇动 15min ；
(14) 低温下， 12000rpm 离心 10min ；
(15) 用大口径枪头小心吸取上清液到另一个灭菌的离心管中 ；
(16) 加入至少 2 倍体积的无水乙醇， 上下颠倒数次使 DNA 析出 ；
(17) 低温下， 12000rpm 离心 10min， 弃去乙醇 ；
(18) 加入 70％的乙醇 1mL， 温和摇动 10min ； (19) 低温下， 12000rpm 离心 10min， 如有需要视情况可重复漂洗一次 ； (20) 室温下让乙醇挥发干净， 加入一定量灭菌水溶解 DNA， 完全溶解后测定浓度和纯度。 三、 紫外分光光度计测定 DNA 浓度和纯度
以 50ng/μL 作为标准 DNA 浓度， 若测得的 DNA 浓度在 50ng/μL 左右， 说明 DNA 浓度符合实验要求 ； 浓度过高的需要稀释成标准浓度 ； 浓度过低的需重新提取 DNA。
若 A260nm/A280nm 比值在 1.6-2.0 之间时， 可判定 DNA 的纯度基本符合要求。若 A260nm/A280nm 比值小于 1.6 或者大于 2.0 时， 可判定纯度不符合要求。必须对样品 DNA 做进 一步的纯化， 或重新提取 DNA。
四、 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量
(1) 将凝胶电泳槽洗干净， 插上梳子。
(2) 称取 0.5g 的琼脂糖， 转入三角瓶中， 加入 1×TBE 20mL 使其悬浮， 微波炉加热 70 秒， 待溶液沸腾呈透明状时拿出。
(3) 待三角瓶内液体温度不烫手时， 按 10 ∶ 1 的比例加入 2μL 核酸染料， 轻微摇 动， 防止出现气泡。
(4) 混匀后， 立即将琼脂糖溶液倒入槽内。如出现气泡， 立即用针头或干净的小枪 头将气泡挑破。
(5) 放置一段时间后， 用手触摸 ( 戴手套 ) 如果完全冷却凝固， 拔掉梳子， 将凝胶移 入电泳槽中。
(6) 向电泳槽中加入 1×TBE 缓冲液， 使液面高出胶面 5mm。
(7) 取 DNA 样品 3μL， 加 3μL 上样缓冲液后， 混匀上样。
(8)100V 电压电泳 1h。
(9) 在凝胶成像系统上观察， 如果电泳条带清晰而规则， 没有明显拖尾现象， 说明
提取的 DNA 效果较好， 可以满足实验需要， 否则需重新提取相应样品的 DNA。
五、 混合 DNA 样品池的构建
本实验混合 DNA 样品池的构建方法如下 ： 将提取的基因组 DNA， 用紫外分光光度计 测量每个 DNA 样品浓度各 3 次， 取平均值， 再将样品稀释到终浓度为 50ng/μL， 10 个 DNA 样 品中各取 2μL 快速构建成 DNA 池。以池中 DNA 样品为模板进行扩增， 并送去测序， 快速筛 查基因的 SNPs。
结果 ： 秦川牛血样基因组 DNA 的检测结果见图 1。
实施例 2 ： 秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子的 PCR 扩增
一、 秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子 PCR 引物的设计
以 NCBI 数 据 库 中 GenBank 公 布 的 牛 ( 登 录 号 ： NC_007301) 序 列 为 参 考， 利用 Premier 5.0 软件结合 Oligo 6.0 软件设计秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子的 PCR 引物 ( 片 段大小为 299bp)， 其引物序列如下 ：
上游引物 ：
5′ -AACCCTCAGGCTCACCCA-3′ 18bp ；
下游引物 ： 5′ -GGGCTTAGGGCTCTTGGA-3′ 18bp。
该引物对扩增了秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子区域。
二、 PCR 扩增
(1)PCR 反应体系
PCR 反应体系采用混合加样法， 实验中我们通常是先计算出每一种成份所需要的 量， 然后再算出加样总量， 之后均等分装到每一个 PCR 管， 然后加入模板 DNA， 再瞬时离心后 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系如表 1。
表 1PCR 反应体系
(2)PCR 反应程序 PCR 反应程序见表 2 ： 表 2PCR 反应程序结果 ： PCR 扩增结果见图 2， 图中泳道 1 ～ 10 为秦川牛不同个体扩增的 PCR 产物， 片段大小为 299bp ； M 为 Marker I(600bp， 500bp， 400bp， 300bp， 200bp， 100bp)。
电泳结果表明 ： PCR 片段的大小为 299bp， 与理论设计的大小完全一致。 故此， 成功 扩增出秦川牛 AMPD1 基因第 11 内含子区域 DNA 片段。
三、 目的片段胶回收和测序
PCR 产物点样于 1％的琼脂糖凝胶， 100V 电压电泳 30min， 核酸燃料染色， 然后进行 切胶回收， 详细步骤如下 ：
第一次使用前先在 15mL 漂洗液 PW 中加入 60mL 无水乙醇！
(1) 吸附柱放入收集管中， 向吸附柱 CA2 中加入 500μL 平衡液 BL， 12000 rpm 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中 ；
(2) 将目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中， 称重 ；
(3) 向胶块中加入 3 倍体积溶胶液 PN ； 如凝胶重为 0.1g， 使其体积为 100μL， 依此 类推。50℃水浴放置 10min， 其间不停翻转离心管， 以保证胶块充分溶解。
(4) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱 CA2 中， 室温放置 2min， 12000rpm 离心 1min， 倒掉收集管中的废液， 将吸附柱 CA2 放入收集管中 ；
(5) 向吸附柱 CA2 中加入 600μL 漂洗液 PW， 12000rpm 离心 1min， 倒掉收集管中的 废液， 将吸附柱 CA2 放入收集管中 ；
(6) 重复上述步骤 (5) ；
(7)12000rpm 离心 2min， 尽量除尽漂洗液。将吸附柱 CA2 置于室温放置数分钟， 彻 底晾干， 以防止残留的漂洗液影响下一步实验 ；
(8) 将吸附柱 CA2 放入一个干净的离心管中， 向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗 脱缓冲液 EB， 室温放置 2min， 12000rpm 离心 2min 收集 DNA 溶液。
回收后的产物送南京金斯瑞生物科技公司进行正、 反双向测序， 测序使用的是 ABI 3730 型全自动序列分析仪。
实施例 3 ： 生物信息学分析
根据个体和混合 DNA 模板测序后的峰图结果， 以 NCBI 数据库中 GenBank 公布的牛 NC_007301 序列为参考， 利用 BioXM(Version 2.6) 软件和 DNA Star 7.10 软件将测序后序 列与公布的参考序列进行 DNA 序列比对和突变位点分析， 结果发现快速筛查到碱基突变位 点， 为进一步验证碱基突 变位点的变异情况， 在整个秦川牛群体中进行了下一步的实验。
实施例 4 ： 秦川牛 AMPD1 基因的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
利用实施例 2 中的引物和 PCR 扩增条件， 对实施例 1 中秦川牛的 215 份基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 获得 215 份个体的秦川牛 AMPD1 基因中包含 SNPs 位点的 DNA 片段， 然后利
用如下方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 具体方法如下 ：
( 一 )10％聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1) 装板
事先将洗干净、 晾干的每一套玻璃板的两边及底部装上垫片， 尽量使底边及侧边 紧密接触， 夹子固定好， 用 0.8 ～ 1％的废弃琼脂糖封边， 确保接头处都封上以免漏胶。
(2) 配胶
根据不同长度的 PCR 扩增片段配制适合浓度的胶。最适合的胶浓度是经过多次的 摸索条件得来的， 根据实验经验， 此实验中 299bp 长度的片段适合的胶浓度和胶成份见表 3。
表 3 中性聚丙烯酰胺凝胶的成份
(3) 灌胶
配好胶后搅匀， 灌入装好的玻璃板中， 注意不能产生气泡， 如果产生气泡把玻璃板 立起， 轻轻敲打可使气泡升出胶面， 胶面与凹板上沿大约差 0.5cm 时插上梳子， 要保证梳子 齿和液面接触处没有气泡， 一旦产生气泡要拔出重插。
(4) 静置
灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度， 静置水平桌面上 30min 左右使之充分 聚合。
(5) 点样
A. 安装板子
聚丙烯酰胺凝胶聚合好后要及时拔出梳子 ( 时间耽搁长后会使梳子很难拔出 )， 拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。将玻璃板放入电泳槽中固定好， 倒入缓冲液与液 面齐平， 速度要慢， 以免梳子孔中进入气泡， 产生的大气泡会使电泳条带弯曲。
B.PCR 产物的高温变性
取 4μL PCR 产物， 加入 8μL SSCP 变性剂， 混匀后， 在 98℃条件下充分变性 10min， 取出立刻放入碎冰块中冰浴 10min 以上。
C. 点样
用微量加样器把变性产物按顺序加到点样孔中。由于边缘效应带型不整齐， 每块 板中最边上的两个孔最好不要点样。
(6) 电泳
A. 预电泳
打开电源， 电压调到 290V， 预电泳 10min 左右。
B. 正式电泳
电压调至 205V， 在 4℃条件下， 恒温电泳 1 ～ 2 个小时。
(7) 染色
A. 银染
电泳结束， 把胶卸下， 做好起始记号， 再浸入 0.1％ AgNO3 溶液中染色 10 ～ 15min， 染色液同时染两块胶要适当增加时间。倒掉染色液， 用去离子水冲洗 3 遍。
B. 显色
然后浸入 2％ NaOH( 含 750μL 甲醛溶液 ) 中显色 10 ～ 15min。显色液中可以看 到清晰的条带时， 倒掉显色液， 加适量蒸馏水， 用凝胶成像系统照相。
( 二 ) 凝胶成像系统照相分析
银染后， 利用北京伯乐公司 T2A 型凝胶成像系统照相分析， 判断 SNPs 的多态性， 并 做好记录和带型统计。
AMPD1 基因的第 19416 位和第 19421 位分别发生 T ＞ C 和 A ＞ G 时， PCR 扩增的 AMPD1 基因产物产生不同的带型。由于牛为二倍体， 所以牛基因组的 AMPD1 基因的第 19416 位和第 19421 位的 SNPs 多态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为 ： 如图 3 所示， 其中， 泳道 1 为 AC 基因型个体 ； 泳道 2 为 CC 基因型个体 ； 泳道 4 为 BC 基因型个体 ； 泳道 5 为 AA 基因型个 体； 泳道 6 为 CD 基因型个体。
( 三 ) 不同带型个体 PCR 产物的测序验证
利用 ABI 3730 型测序仪对不同带型个体的 PCR 产物分别进行正反双向测序， 测序 后将结果拼接成完整的序列。 同时， 进行秦川牛 AMPD1 基因 SNPs 分析。 测序结果如图 4A ～ 图 4E 所示。图 4A ～图 4E 中， 左侧箭头的指示位置均表示第 19416 位发生 T 和 C 之间的碱 基突变， 相隔 4bp 后， 右侧箭头指示位置均表示第 19421 位发生 A 和 G 的碱基突变。图 4A 为 AA 基因型测序结果， 对应着单倍型 A ； 图 4B 为 BC 基因型测序结果， 对应着单倍型 B ； 图 4C 为 AC 基因型测序结果， 对应着单倍型 C ； 图 4D 为 CC 基因型测序结果， 也对应着单倍型 C； 图 4E 为 CD 基因型测序结果， 对应着单倍型 D。 实施例 5 ： 不同基因型与生长和胴体性状的关联分析
基因型统计 ： 秦川牛群体中出现 AA， BC， AC， CC， CD 共 5 种不同的基因型。
相关性状数据 ：
生长指标包括 ： 体高， 体斜长， 腰角宽 ； 此数据资料在秦川牛屠宰前， 由本实验室 人员进行当天测量并记录。测量工具为测杖、 卷尺和钢尺。严格按照如下要求测量 ：
(1) 体高 ： 鬐甲最高点至地面的垂直距离。
(2) 体斜长 ： 肩端前缘到臀端后缘的直线距离。
(3) 腰角宽 ： 两侧腰角外缘间的距离。
胴体性状指标包括 ： 空腹 24h 宰前活重， 胴体重， 屠宰率 ； 此数据资料由陕西省秦 宝牧业发展有限公司在牛屠宰后由实验室人员和公司工人当天测量和记录。 严格按照如下 要求测定 ：
(1) 空腹 24h 宰前活重 ： 屠宰前禁食 24 小时， 但可以自由饮水， 屠宰前用电子秤进 行称重并做好记录。
(2) 胴体重 ： 每头牛经宰杀、 放血、 去头、 蹄、 内脏、 剥皮、 劈半、 冲洗后称重。
按照如下公式计算屠宰率 ：
关联分析结果见表 4， 实验采用 SPSS 16.0 软件对不同基因型与各性状指 标进行 统计和分析， 以及差异显著性检验。
关联结果表明， 在体高和腰角宽两个体尺性状指标上， 五种基因型之间无显著差 异 (P ＞ 0.05) ； 体斜长指标上， BC 基因型个体与 AA 和 CD 基因型个体达到差异显著水平 (P ＜ 0.05)。空腹 24h 宰前活重指标上， BC 型个体与 CD 型个体达到了统计学的差异显著水平 (P ＜ 0.05) ； 胴体重上， BC 型个体与 AA、 CC、 CD 型个体达到了统计学的显著水平 (P ＜ 0.05) ； 屠宰率指标上， BC 型个体与 AA 型个体达到了统计学的显著水平 (P ＜ 0.05)。在这几项指 标中， BC 基因型的值普遍地高于其它基因型， 这说明 BC 基因型在整个秦川牛群体中处于优 势地位， 是优势基因型， 所以在牛的早期生长发育期， 我们应尽可能的选择 BC 基因型个体 留作种用。同时， BC 型个体也具有较好的胴体品质， 所以多选留 BC 基因型的个体， 可加快 具有优质经济性状牛种群的建立。
表 4 秦川牛 AMPD1 基因不同基因型与生长和胴体性状间的关联分析
注： 同一行中肩标字母相同者表示差异不显著 (P ＞ 0.05)， 不同字母表示差异显 著 (P ＜ 0.05)
12102363803 A CN 102363821
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