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1、10申请公布号CN102363765A43申请公布日20120229CN102363765ACN102363765A21申请号201110341752022申请日20111102C12N5/07520100171申请人青岛农业大学地址266109山东省青岛市城阳区春阳路青岛农业大学72发明人张西锋李兰张志鹏沈伟74专利代理机构青岛高晓专利事务所37104代理人隋臻玮54发明名称ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法57摘要本发明涉及一种ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法。利用机械法分离125DPC雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将125DPC减。
2、数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成GV期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，可获得早期发育的体外受精后代。本发明方法建立了ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，简便易行，从理论上探索原始生殖细胞的体外发生与卵泡的体外发育的细胞分子机制，并为卵巢性不孕症病人提供优质的卵母细胞，创造巨大的社会和经济价值。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页CN102363783A1/1页21一种ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于利用机械法分离12。
3、5DPC雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将125DPC减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成生发泡期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，获得早期发育的体外受精后代。2根据权利要求1所述的ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于胎鼠生殖嵴的分离按照如下步骤操作胎鼠卵巢来源于125DPC的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为05DPC，出生后小鼠的卵巢来源于1214DPP的小鼠，利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液10胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在。
4、一起的中肾组织，在由密理博高糖培养基；5胎牛血清；1丙酮酸钠；1青链霉素；10MIU促卵泡素配制成的新鲜培养液中将卵巢洗3次。3根据权利要求1所述的ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作生殖嵴分离出来培养的当天定为0天，分离出的125DPC胎鼠生殖嵴，一分为二，并在培养液中贴壁培养28天，组织在37、5CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含密理博高糖培养基；10胎牛血清；1丙酮酸钠；1青链霉素；10MIU促卵泡素；100NG/MLACTA；培养液B包含密理博高糖培养基；5胎牛血清；1胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复。
5、合物；1丙酮酸钠；1青链霉素；100MIU/ML促卵泡素；1NG/ML上皮生长因子；100NG/MLACTA。4根据权利要求1所述的ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于卵母细胞的收集按照如下步骤操作收集添加ACTA体外培养到28天的小鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，025胰酶，02胶原酶IV和002DNASEI消化，37处理10MIN，加入胶原酶等体积的胎牛血清终止消化，洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞。5根据权利要求1所述的ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，其特征在于卵母细胞的培养及成熟诱导按。
6、照如下步骤操作使用口吸管吸出卵母细胞，然后挑出直径在75M以上的卵母细胞，每个液滴20个卵母细胞放入培养24H后的颗粒细胞层上，1214DPP腔前卵泡颗粒细胞收集后放入提前做好的培养液滴中，培养液配方密理博高糖培养基；10胎牛血清；1胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素10MIU/ML；上皮生长因子5NG/ML；ACTA100NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素；6CM培养皿，每个液滴100L，37，5CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜；共培养7天后，取出卵母细胞，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前做好的成熟培养液培养滴中，6CM培养皿，每个液滴100L，37，5CO2、饱和湿。
7、度的培养箱里培养过夜，在37，5CO2，饱和湿度的培养箱里培养18小时，统计卵母细胞成熟的比例；成熟培养液的配方为密理博高糖培养基；10胎牛血清；1胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物；促卵泡素100MIU/ML；上皮生长因子1NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素。权利要求书CN102363765ACN102363783A1/7页3ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法技术领域0001本发明涉及一种激活素AACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，特别是涉及一种将125DPC交配后的天数减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成生发泡GV期卵母细胞并诱导成熟，利用体外受精。
8、技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，获得早期发育的体外受精后代的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。背景技术0002在先前的研究中，来源于小鼠减数分裂前的生殖细胞不能恢复减数分裂并发育到MII期。在雌性小鼠胚胎中，135DPC生殖细胞经历了进一步的DNA复制，并且进入第一次减数分裂的前期。然而，来源于胎儿生殖细胞的卵母细胞体外生长仅仅能进入到第一次减数分裂的双线期，并停滞在这一时期。研究人员发现，小鼠115125DPC的生殖嵴分离获得的PGCS在没有体细胞的支持下不能存活，而是快速的凋亡，而利用小鼠胎儿肺细胞与生殖细胞聚合后体外培养，生殖细胞可以像在卵巢里的发育进程一样进入第一次减数分裂。如。
9、果进入雌性生殖嵴的生殖细胞数量过少，颗粒细胞的分化可以被启动，但是很快就失去了分化能力，卵母细胞也随后死亡或数量减少。卵母细胞与颗粒细胞间的的互作是双向的，这种互作调控了这两种类型细胞的发育，它不仅是卵母细胞发育必需的，也是卵泡发育所必需的，从原始卵泡的形成到成熟卵泡的排卵始终都有互作的存在。最近，科学家建立了一种生殖细胞与体细胞的共培养方法，并结合KITL、BFGF和LIF等因子的作用，可以使从雌性胎鼠生殖嵴中分离出来的PGC体外发育到卵母细胞第一次减数分裂的双线期，但这种卵母细胞不能成熟和受精。0003OBATA和NIWA等利用125DPC胎鼠完整的卵巢进行体外培养28D，但获得的卵母细胞。
10、不能完成第二次减数分裂。可能是多种因素制约了卵母细胞的体外发生。一种原因可能是卵母细胞核、质发育不同步，而核质同步发育成熟又是卵母细胞恢复减数分裂成熟必需的。另一方面，卵泡颗粒细胞与卵母细胞间的间隙连接也影响着卵母细胞的发育，间隙连接形成不完全会阻碍卵母细胞的减数分裂恢复。还有一种原因就是体外发育的卵母细胞不能达到最大直径的80，而这是卵母细胞成熟发育所需的。利用生殖细胞体外培养的方法难以克服这些问题，因为至今对卵母细胞生长、卵泡内颗粒细胞与卵母细胞间隙连接的形成、卵母细胞的减数分裂启动等调控机理知之甚少。发明内容0004本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种ACTA促进减数分裂前雌性生。
11、殖细胞体外发育的技术方法。0005为了实现上述发明目的，本发明利用机械法分离125DPC雌性胎鼠生殖嵴，体外培养胎鼠生殖嵴后收集卵母细胞，将125DPC减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成GV期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体说明书CN102363765ACN102363783A2/7页4外发育形成的卵母细胞质量，可获得早期发育的体外受精后代。0006所述胎鼠生殖嵴的分离按照如下步骤操作胎鼠卵巢来源于125DPC的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为05DPC。出生后小鼠的卵巢来源于1214DPP的小鼠。利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液P。
12、BS10FCS的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在新鲜培养液密理博高糖培养基MEM；5胎牛血清FCS；1丙酮酸钠；1青链霉素；10MIU促卵泡素FSH中将卵巢洗3次。0007所述胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作生殖嵴分离出来培养的当天定为0天。分离出的125DPC胎鼠生殖嵴，一分为二，并在培养液中贴壁培养28天。组织在37、5CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，换液时观察卵母细胞的发育情况等。此处所用的培养基分为两种培养液，培养液的配方如下0008培养液培养液A包含密理博高糖培养基MEM；10胎牛血清FCS；1丙酮酸钠；1青链霉素；。
13、10MIU促卵泡素FSH；100NG/ML激活素AACTA；培养液B包含MEM；5FCS；1胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物ITSMIX；1丙酮酸钠；1青链霉素；100MIU/MLFSH；1NG/ML上皮生长因子EGF；100NG/MLACTA。0009所述卵母细胞的收集按照如下步骤操作收集添加ACTA体外培养到28天的小鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，025胰酶GIBCOBRL，02胶原酶IVGIBCOBRL和002DNASEISIGMA消化，37处理10MIN。加入胶原酶等体积的胎牛血清终止消化，洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液PBS中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞，根据试。
14、验需要将收集的卵母细胞进行分类。0010所述卵母细胞的培养及成熟诱导按照如下步骤操作使用口吸管吸出卵母细胞，然后挑出直径在75M以上的卵母细胞，每个液滴20个卵母细胞放入培养24H后的颗粒细胞层上1214DPP腔前卵泡颗粒细胞收集后放入提前做好的培养液滴中。6CM培养皿，每个液滴100L，37，5CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜，进行共培养。此处培养卵母细胞分为对照组和实验组，对照组和实验组培养液的配方如下0011对照组培养液MEM；10FCS；1ITSMIX；FSH10MIU/ML；EGF5NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素。0012实验组培养液MEM；10FCS；1ITSMIX；FSH1。
15、0MIU/ML；EGF5NG/ML；ACTA100NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素。0013共培养7天后，取出卵母细胞，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前做好的成熟培养液培养滴中6CM培养皿，每个液滴100L，37，5CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜，在37，5CO2，饱和湿度的培养箱里培养18H，统计卵母细胞成熟的比例。成熟培养液的配方如下0014成熟培养液MEM；10FCS；1ITSMIX；FSH100MIU/ML；EGF1NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素。0015本发明方法建立了ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法，将从理论上探索原始生殖细胞的体外发。
16、生与卵泡的体外发育的细胞分子机制，并为卵巢性不孕症病人提供优质的卵母细胞，创造巨大的社会和经济价值。说明书CN102363765ACN102363783A3/7页5附图说明0016图1为125DPC胎鼠生殖嵴的分离显微图。0017图2为小鼠卵巢卵母细胞的体外发生过程显微图。0018图3为卵母细胞数量和直径统计图。0019图4为体外发生的卵巢卵母细胞的成熟显微图。0020图5为来源于125DPC胎鼠卵巢卵母细胞体外培养得到的卵母细胞质量的检测图。0021图6为小鼠不同时期卵母细胞纺锤体的检测图。0022图7为胎鼠卵巢卵母细胞发育成熟后支持胚胎发育到期图。具体实施方式0023下面通过具体实施例对本。
17、发明方法做进一步阐述。0024实施例1、0025一材料与方法00261胎鼠生殖嵴的分离0027胎鼠卵巢来源于125DPC的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为05DPC。出生后小鼠的卵巢来源于1214DPP的小鼠。利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液PBS，PH7210胎牛血清FCS的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在新鲜培养液密理博高糖培养基MEM，HYCLONE公司；5胎牛血清FCS，HYCLONE公司；1丙酮酸钠HYCLONE公司；1青链霉素；10MIU/ML的促卵泡素FSH，SIGMA公司中将卵巢洗3次。00282胎鼠生殖嵴的体外培养0。
18、029生殖嵴分离出来培养的当天定为0天。分离出的125DPC胎鼠生殖嵴，一分为二，并在培养液中贴壁培养28天。组织在37、5CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，换液时观察卵母细胞的发育情况等。试验分为两组，对照组和试验组，两个组除了培养液成分不同之外其它的均相同。0030对照组培养液培养液A包含密理博高糖培养基MEM，HYCLONE公司；10胎牛血清FCS，HYCLONE公司；1丙酮酸钠；1青链霉素；10MIU促卵泡素FSH，SIGMA公司。培养液B包含MEM；5FCS；1胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物ITSMIX；1丙酮酸钠；1青链霉素；100MIU/MLFSH；1NG/ML上。
19、皮生长因子EGF，SIGMA公司。0031试验组培养液培养液A包含MEM；10胎牛血清FCS，HYCLONE公司；1丙酮酸钠；1青链霉素；10MIU促卵泡素FSH，SIGMA公司；100NG/MLACTA。培养液B包含MEM；5胎牛血清FCS，HYCLONE公司；1胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠复合物ITSMIX；1丙酮酸钠；1青链霉素；100MIU/ML促卵泡素FSH，SIGMA公司；1NG/ML上皮生长因子EGF，SIGMA公司；100NG/MLACTA。0032天根生化科技北京有限公司00333卵母细胞的收集0034收集未添加和添加ACTA体外培养到28天的小鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，025胰。
20、酶GIBCOBRL，02胶原酶IVGIBCOBRL和002DNASEISIGMA消化，说明书CN102363765ACN102363783A4/7页637处理10MIN。加入与胶原酶等体积的胎牛血清终止消化，洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在PBS中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞，根据试验需要将收集的卵母细胞进行分类。00354卵母细胞的培养及成熟诱导0036使用口吸管吸出卵母细胞，然后挑出直径在75M以上的卵母细胞，每个液滴20个卵母细胞放入培养24H后的颗粒细胞层上1214DPP腔前卵泡颗粒细胞收集后放入提前做好的培养液滴中。6CM培养皿，每个液滴100L，37，5CO2、饱和湿。
21、度的培养箱里培养过夜，进行共培养。处培养卵母细胞分为对照组和实验组，对照组和实验组培养液的配方如下0037对照组培养液MEM；10FCS；1ITSMIX；FSH10MIU/ML；EGF5NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素。0038实验组培养液MEM；10FCS；1ITSMIX；FSH10MIU/ML；EGF5NG/ML；ACTA100NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素。0039共培养7天后，取出卵母细胞，挑出没有凋亡的卵母细胞，以每个液滴20个，放入提前做好的成熟培养液培养滴中6CM培养皿，每个液滴100L，37，5CO2、饱和湿度的培养箱里培养过夜，在37，5CO2，饱和湿度的培养箱里培养1。
22、8H，统计卵母细胞成熟的比例。成熟培养液的配方如下0040成熟培养液MEM；10FCS；1ITSMIX；FSH100MIU/ML；EGF1NG/ML；1丙酮酸钠；1青链霉素。00415卵母细胞细胞质谷胱甘肽GSH分析0042卵母细胞细胞质谷胱甘肽GSH的分析采用上海碧云天生物技术有限公司生产的总谷胱甘肽检测试剂盒，具体实验步骤和方法可参考其说明书。0043收集体外培养28D的小鼠卵母细胞/ACTA，14DPP和21DPP小鼠卵母细胞作为对照，进行GSH的检测。收集新鲜的细胞，PBS洗涤细胞一次，离心收集细胞，吸尽上清。加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂溶液，充分VORTEX细胞沉淀的体积可以。
23、根据细胞沉淀的重量进行估算。收集细胞前后分别对离心管进行称重，从而就可以计算出细胞沉淀的重量。10MG细胞沉淀的体积可以粗略地看做10L。然后利用液氮和37水浴对样品进行两次快速的冻融。4或冰浴放置5MIN。4，10000RPM离心10MIN。取上清用于总谷胱甘肽的测定。具体步骤如下00441参考表1，本实验利用96孔板，参照碧云天的总谷胱甘肽检测试剂盒TOTALGLUTATHIONEASSAYKIT依次加入样品或标准品，混匀。加入150L总谷胱甘肽检测工作液后，混匀，室温孵育5MIN。00452加入50微升016MG/MLNADPH溶液，混匀。00463立即用酶标仪测定A412，每5分钟测定。
24、一次或实时测定，共测定25分钟，测得5个数据。为了简化实验步骤，可以在加入NADPH溶液混匀后25分钟，仅测定一次A412。0047表1GSH的检测体系0048说明书CN102363765ACN102363783A5/7页700496纺锤体的组装0050125DPC胎鼠卵巢的卵母细胞，添加和未添加ACTA，体外培养28天，收集卵母细胞并与颗粒细胞共培养7天，然后GV期的卵母细胞成熟诱导1618H，收集到达GVBD和MII期的卵母细胞。来源于21DPP的卵母细胞成熟诱导后的GVBD和MII期的卵母细胞作为对照。0051二结果分析0052本发明建立了ACTA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术。
25、方法，将125DPC减数分裂前的生殖细胞利用体外培养的方法分化发育成GV期卵母细胞并诱导成熟，得到成熟的卵母细胞；并利用体外受精技术检测体外发育形成的卵母细胞质量，可获得早期发育的体外受精后代。00531胎鼠生殖嵴的获取0054成年公母鼠合笼后，次日检查到有阴道栓的定为05DPC，到125DPC时用颈部脱臼法处死小鼠，取出胎鼠。PBS洗净后，利用机械分离法获得胎鼠生殖嵴及中肾复合体，图1中1所示，左边为中肾，右边为胎鼠生殖嵴，中间有一较为明显的膜分隔。在体外去掉中肾组织，获得完整的生殖嵴组织图1中2所示。然后将完整的生殖嵴一分为二图1中3所示，并将其转移到24孔板中进行培养。00552胎鼠生殖。
26、嵴的体外培养0056图2表示125DPC卵巢卵母细胞体外培养0、5、10、14、21和28天的过程中，添加和未添加ACTA，卵母细胞发育的状态；体外培养28D后，收集卵母细胞，并与腔前卵泡颗粒细胞进行共培养7天，然后成熟诱导。0057如图2所示，一天后胎鼠卵巢会贴壁，并开始变得扁平，第2天卵巢就会变成较薄的一个扁平组织。卵巢组织体外培养的第4天，圆形的生殖细胞就会开始出现，并且边缘越发清晰。第8天时，可以在卵巢组织中发现一个大的卵母细胞周围包围着扁平的体细胞，形成了典型的原始卵泡结构。第12天时，卵母细胞的直径明显增大，平均可以达到40M左右，并且卵泡结构明显。第16天时，卵母细胞进一步增大到。
27、5060M，个别大的卵母细胞可以观察到生发泡结构。第20天时，大的卵母细胞可以达到7075M，卵泡和卵泡膜结构明显，但颗粒细胞的增殖不明显，一直为23层颗粒细胞，卵泡腔无法形成。第24天，卵母细胞直径平均增大到70M以上，卵泡结构变得模糊，卵泡膜消失。0058比较未添加ACTA与添加ACTA获得卵母细胞的情况可以发现，添加ACTA中的卵母细胞生长速度比较快，并且卵泡的数量也是显著的增多。图3中1表示125DPC小鼠卵巢体外培养的过程中/ACTA卵母细胞数量的变化情况，如图3中1所示，未添加ACTA的数说明书CN102363765ACN102363783A6/7页8量10天，146877；14天。
28、，829589；21天，7613；28天，595714。而添加ACTA的数量分别是10天，1685713；14天，1318865；21天，120898；28天，896638。图3中2表示来源于125DPC减数分裂前的生殖细胞体外培养28天后，得到的卵母细胞直径分布。代表差异显著P005，代表差异极显著P001。0059在减数分裂前的雌性胎鼠生殖细胞的体外培养过程中，添加ACTA，28天后，收集卵母细胞，与1214DPP腔前颗粒细胞共培养7天，卵母细胞直径可以达到72934M，最大的卵母细胞直径可以达到9763M，而对照组的为63327MP005。00603ACTA促进125DPC胎鼠卵母细胞减。
29、数分裂的成熟0061本实验中，添加ACTA试验组的平均每个卵巢可以得到70100个较大的卵母细胞70M，这些GV期的卵母细胞，经成熟诱导，都可以发生生发泡破裂图4，图4表示体外培养1214DPP卵巢卵母细胞成熟诱导后到达GVBD和MII期的卵母细胞。经HOCHEST染色后，细胞核表现出GVBD和MII期的形态。0062这些成熟诱导后的GVBD和MII的卵母细胞在HOECHST33342染色后发现，这些卵母细胞的细胞核获得真正的成熟。这些MII期的卵母细胞得到的比例非常低，并且，这些卵母细胞的形态异常，细胞质有碎裂小球出现。图5中1和2分别表示GVBD和MII发生比例；3是卵母细胞胞质GSH检测。
30、的结果；4是卵母细胞凋亡比例。代表差异显著P005，代表差异极显著P001。如图5中1、2所示，体外培养的过程中未添加与添加ACTA的GVBD发生比例分别是82255和163293；MII的比例分别是0和171755。0063本实验在体外培养的条件下，得到成熟的卵母细胞。这说明体外培养28天后，在培养液中添加ACTA组的卵母细胞有继续发育的潜能，但未添加ACTA的并没有到达成熟，我们分析其原因可能是卵母细胞胞质发育不好，因此，我们对得到的卵母细胞进行GSH表达量检测，探讨其卵母细胞胞质是否到达成熟。结果如图5中3所示，添加ACTA的显著高于未添加ACTA试验组994147VS553076，P0。
31、05，虽然添加ACTA组的GSH表达量显著高于未添加ACTA组的，任然显著的低于体内21天小鼠卵母细胞的表达量，并且，卵母细胞的凋亡情况也有显著的差异，结果表明图5中4所示，添加ACTA的和未添加ACTA分别为2851375和34511P005，这说明卵母细胞胞质的发育情况在很大程度上决定卵母细胞的发育能力。00644卵母细胞减数分裂过程中纺锤体组装分析0065为了进一步分析体外发生的卵母细胞不能正常恢复并完成减数分裂的原因，我们检测了这些卵母细胞的微管组装和纺锤体形成情况。0066图6中1和2分别表示来源于125DPC胎鼠卵巢体外培养28天，共培养7天并进行成熟诱导后，GV和MI期的卵母细胞。
32、纺锤体状态，3和4分别表示来源于125DPC胎鼠卵巢体外添加100NG/MLACTA培养28天，共培养7天并进行成熟诱导后，MI第一次减数分裂中期和MII期第二次减数分裂中期的卵母细胞纺锤体状态，5和6来源于21DPP小鼠MI和MII期的卵母细胞纺锤体状态。0067未添加ACTA体外发育的GV期卵母细胞在成熟培养液的诱导下，可以发生GVBD生发泡破裂。通过微管染色分析发现，在这些GVBD卵母细胞的核区附近可以观察到极少量的微管出现，但没有形成完整的纺锤体结构图6中1、2所示。而添加ACTA体说明书CN102363765ACN102363783A7/7页9外发育的GV期卵母细胞在成熟培养液的诱导。
33、下，可以发生GVBD，并且发育到MII期。如图6中3、4所示，卵母细胞可以清晰观察到纺锤体的变化，以及细胞染色体的分离等。对照组的卵母细胞，从MI到MII期，都可以清晰观察到纺锤体的变化，以及细胞染色体的分离等图6中5、6所示。这表明体外发育的卵母细胞由于某些因子的活化状态不正常，纺锤体不能进入正常组装和下一步的卵母细胞减数分裂过程。体外培养过程中添加ACTA，能够促使卵母细胞到达成熟，但受到的外界影响因素很多，致使很多卵母细胞发生了异常的纺锤体组装。00685卵母细胞的体外受精与胚胎培养0069为了检测减数分裂前生殖细胞发育而来的卵母细胞支持胚胎全程发育的功能，我们利用卵母细胞成熟培养液对体。
34、外获得的GV期的卵母细胞进行体外诱导成熟，1618H后成熟的卵母细胞用于体外受精。0070如表2所示，体外培养的过程中，添加ACTA得到的GV期卵母细胞在成熟培养液的诱导下，可以发生GVBD，到达MII期。我们收集了533个成熟的卵母细胞，用于体外受精表2。图7中1、2、3、4、5和6分别表示受精卵发育到2细胞期、4细胞期、8细胞期、桑葚胚、囊胚和囊胚后期。如图7中16所示，得到的成熟的卵母细胞具有体外受精发育到囊胚的能力。但是，受精发育到囊胚的比例非常的低，仅为297。影响胚胎发育比例的因素很多，包括我们试验中分析的卵母细胞细胞发育的情况不好，这是影响胚胎进一步发育的重要因素。0071表2体外成熟卵母细胞IVF胚胎的体外发育00720073本发明已经试验实施了多次，试验的结果是成功的，实现了发明的目的。说明书CN102363765ACN102363783A1/4页10图1图2说明书附图CN102363765ACN102363783A2/4页11图3图4说明书附图CN102363765ACN102363783A3/4页12图5图6说明书附图CN102363765ACN102363783A4/4页13图7说明书附图CN102363765A。