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固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法
    技术领域 本发明属于制药工业生物技术领域， 涉及一种固定化全细胞催化剂合成非天然氨 基酸的方法。
     背景技术
     非天然氨基酸结构和功能多样， 是很多药物合成中常用的中间体， 例如 L- 叔亮氨 α- 酮酸 ( 化合物式 1) 通过生物催化可生成非天然氨基酸 ( 化合物 2 和化合物酸。
     3)。
     R 代表脂肪侧链如 ： -(CH2)nCH3 或 -C(CH3)3 等 ； 或芳香侧链如 ： Ph( 苯基 ) 或 Bn( 苄基 )。 生物催化法中使用的辅酶 NAD+ 可用于底物转化， 但不可再生， 需要补充入新的辅 酶。因此， 若能使反应过程中辅酶再生， 则可以大大降低成本。以三甲基丙酮酸为底物酶法 合成 L- 叔亮氨酸需要亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶， 其中甲酸脱氢酶用于再生辅酶。
     发明内容 本发明旨在提供一种固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法。
     技术方案为， 包括以下步骤 ：
     (1) 将固定化全细胞催化剂、 α- 酮酸盐、 甲酸铵及磷酸缓冲液混合， 在 pH6.0 ～ 9.0、 25 ～ 40℃条件下反应 5 ～ 20 小时 ( 优选 ph ＝ 8.0， 温度 30℃ ) ； 反应混合液中固定 化全细胞催化剂湿重浓度为 10 ～ 200g/L， α- 酮酸盐浓度为 100 ～ 1000mmol/L， 甲酸铵浓 度为 500 ～ 1500mmol/L ；
     所述的固定化全细胞催化剂中含有重组细胞， 重组细胞中含有甲酸脱氢酶基因和 亮氨酸脱氢酶基因。
     (2) 回收固定化全细胞催化剂， 反应液降温至 5 ～ 15℃， ph 调节至 13 ～ 14 ； 5～ 15℃下， 滴加氯甲酸甲酯， 搅拌反应 8 ～ 16 小时 ； ph 调节至 1.5 ～ 3， 5 ～ 15℃下， 萃取洗涤 干燥。
     步骤 (1) 中还加入 NAD+， 浓度为 0.05 ～ 0.5g/L。
     所述 α- 酮酸盐结构如式 1 所示，
     R 为脂肪侧链、 苯基或苄基。
     优选为三甲基丙酮酸钠盐。
     所述亮氨酸脱氢酶基因序列和甲酸脱氢酶基因序列分别如 SEQID No.1 及 SEQ ID No.2 所示 ； 亮氨酸脱氢酶基因选自球形芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌 ； 甲 酸脱氢酶基因选自路德酵母或博伊丁假丝酵母。
     亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶氨基酸序列 SEQ ID No.3 及 SEQ IDNo.4 所示。
     固定化全细胞催化剂包含亮氨酸脱氢酶及能使辅因子再生的甲酸脱氢酶， 制备方 法为 ：
     (1) 将含有亮氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因的重组质粒转入大肠杆菌宿主 菌， 得到重组细胞 ；
     (2) 将重组细胞与固定剂溶液混合， 铺于平面上， 25 ～ 35℃下保温 1 ～ 1.5 小时， 并用盐溶液稳定后洗涤 ；
     固定剂为聚乙二醇与聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇或海藻酸钙中至少一种的混合物 ；
     聚乙二醇的浓度为 0.08 ～ 0.1g/ml ； 聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇或海藻酸钙浓度为 0.1 ～ 0.2g/ml。
     本发明利用包含亮氨酸脱氢酶及能使辅因子再生的甲酸脱氢酶的全细胞催化剂 还原 α- 酮酸 ( 化合物 1) 制备非天然氨基酸 ( 化合物 2 和化合物 3)。
     优选的， 以三甲基丙酮酸为底物酶法合成 L- 叔亮氨酸需要亮氨酸脱氢酶和甲酸 脱氢酶 ( 用于辅酶再生 )， 将不同来源的亮氨酸脱氢酶 (Leucine dehydrogenase， LeuDH) 和 甲酸脱氢酶 (Formate dehydrogenase， FDH， 辅酶再生用 ) 克隆到重组大肠杆菌中共表达， 并将细胞固定化。
     本发明利用固定化重组全细胞催化合成非天然氨基酸， 如 L- 叔亮氨酸， 不用加入 “外来” 辅因子而对底物进行转化。且固定化全细胞催化具有成本低， 操作方便的优点，
     这种非天然氨基酸的合成方法属于生物合成法， 反应条件温和， 作用专一， 无副产 物， 在医药及食品等行业中均有应用价值。
     附图说明
     图 1 是质粒 pACYCDuet-1-BsLeuDH 的图谱。
     图 2 是质粒 pET21a-LeFDH 的图谱。
     图 3 为实施例 7 核磁共振检测结果。 具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步详细、 完整地说明 ：
     实施例 1 重组质粒 pACYCDuet-1-BsLeuDH 的制备 ：
     包 含 来 自 球 形 芽 孢 杆 菌 (Bacillus sphaericus IFO 3525) 的 亮 氨 酸 脱 氢 酶 (Leucine dehydrogenase) 和来自路德酵母 (Lodderomyceselongisporus NRRL YB-4239) 的甲酸脱氢酶的全细胞催化剂的制备 ：
     ( 一 ) 重组质粒 pACYCDuet-1-BsLeuDH 的制备 ：
     按照本领域通用的方法 (《分子克隆实验指南》 ， 科学出版社， 第 3 版 ) 提取球形 芽孢杆菌的基因组 DNA， 利用特异性引物扩增出亮氨酸脱氢酶基因片段， 将此片段用限制性 内切酶 NcoI 和 BamHI 做双酶切， 用琼脂糖凝胶电泳纯化基因片段， 与经相同限制酶消化的 pACYCDuet-1 连接并转化大肠杆菌宿主菌 Top10 细胞。 挑取转化子接种 LB 液体培养基， 37℃ 培养 20 小时， 用质粒提取试剂盒 ( 博大泰克 ) 提取重组质粒。重组质粒图谱如图 1 所示。
     ( 二 ) 重组质粒 pET21a-LeFDH 的制备 ：
     按照上述方法提取路德酵母的基因组 DNA， 利用特异性引物扩增出甲酸脱氢酶基 因片段， 将此片段用限制性内切酶 NdeI 和 BamHI 做双酶切， 用琼脂糖凝胶电泳纯化基因片 段， 与经相同限制酶消化的 pET-21a 连接并转化大肠杆菌宿主菌 Top10 细胞。挑取转化子 接种 LB 液体培养基， 37℃培养 20 小时， 用质粒提取试剂盒 ( 博大泰克 ) 提取重组质粒。重 组质粒图谱如图 2 所示。
     ( 三 ) 重组菌株的制备 ：
     将重组质粒 pET21a-LeFDH 转化大肠杆菌表达宿主 BL21(DE3) 的化学感受态细 胞。这一质粒含有编码来自路德酵母的甲酸脱氢酶的基因。将此重组大肠杆菌 BL21(DE3) (pET21a-LeFDH) 制成化学感受态细胞， 用重组质粒 pACYCDuet-1-BsLeuDH 转化上述重组 菌。该质粒含有来自球形芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶基因。这两个基因均在 T7 启动子的控 制下表达， 亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶基因核苷酸序列分别如序列表 SEQ ID No.1 及 SEQ ID No.2 所示。亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶氨基酸序列分别如序列表 SEQ ID No.3 及 SEQ ID No.4 所示。
     ( 四 ) 活性细胞的制备 ：
     将大肠杆菌 BL21(DE3)(pACYCDuet-1-BsLeuDH， pET21a-LeFDH) 的一个菌落在加 入了抗生素 (100μg/ml 氨苄青霉素和 34μg/ml 氯霉素 ) 的 5ml LB 培养基中在 37℃振荡 (160rpm) 培养过夜。以 1 ∶ 100 的接种量转接该菌到 100ml 新鲜 LB 培养基 ( 含 100μg/ ml 氨苄青霉素和 34μg/ml 氯霉素 ) 中， 37℃培养到 OD600 到达 0.8 左右， 加入 0.1mM IPTG 诱导剂， 在 20℃振荡培养 20 小时。通过离心 (10,000g， 10 分钟， 4℃ ) 收获细胞， 弃去上清， 将细胞用于生物转化实验或储存于 -20℃。
     实施例 2 固定化全细胞制备
     将 3.0 克聚乙二醇溶解在 35ml 的水中， 加入 5.0 克聚乙烯醇 (PVA) 并将温度升到 90-95℃溶解。 待聚乙烯醇完全溶解后， 将温度降至 25℃ -30℃， 加入 4 克重组细胞 ( 湿重 )， 混合均匀， 用一次性吸管吸取混合液， 并注在平面上形成圆片状， 并在 30℃温浴 1 到 1.5 小 时。移入 0.1M 硫酸钠溶液稳定 2 小时， 滤干并用清水洗涤两次， 置于 10mM 磷酸钠缓冲液中 待用。
     细胞固定化试剂聚乙烯醇也可以用聚丙烯酰胺或海藻酸钙代替， 效果相同。实施例 3
     使用包含亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞催化剂合成 L- 叔亮氨酸 ：
     在 30 ℃ 向 反 应 容 器 中 加 入 100mM 磷 酸 缓 冲 液 (pH 值 调 节 至 8.0)， 加入终浓 度 为 100g/L( 细 胞 湿 重 ) 实 施 例 2 制 备 的 全 细 胞 催 化 剂 BL21(DE3)(pET21a-LeFDH、 pACYCDuet-1-BsLDH)( 包含来自球形芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶和路德酵母的甲酸脱氢 酶 )， 终浓度为 300mM 的三甲基丙酮酸钠盐和终浓度为 750mM 的甲酸铵。
     将反应混合物在 30℃搅拌 16 小时。 在一定的时间间隔取样， 产物的生成量用 HPLC 确定。在反应 16 小时后转化率大于 99％。产物经实施例 7 的方法加上 N- 甲氧羰基保护基 团， 并提纯， 其结构通过核磁共振检测确定 ( 图 3)。
     实施例 4 ： 使用包含亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的全细胞催化剂合成 L- 叔亮氨酸 + ( 补加 NAD )
     在 30 ℃ 向 反 应 容 器 中 加 入 100mM 磷 酸 缓 冲 液 (pH 值 调 节 至 8.0)、 终浓度 为 100g/L( 细 胞 湿 重 ) 实 施 例 2 制 备 的 全 细 胞 催 化 剂 BL21(DE3)(pET21a-LeFDH、 pACYCDuet-1-BsLDH)( 包含来自球形芽孢杆菌的亮氨酸脱氢酶和路德酵母的甲酸脱氢 酶 )、 终浓度为 0.4g/L 的 NAD+、 终浓度为 800mM 的三甲基丙酮酸钠盐和终浓度为 1200mM 的 甲酸铵。 将反应混合物在 30℃搅拌 16 小时。 在一定的时间间隔取样， 产物的生成量用 HPLC 确定。在反应 16 小时后转化率大于 99％。产物经实施例 7 的方法加上 N- 甲氧羰基保护基 团， 并提纯， 其结构通过核磁共振检测确定。
     实施例 5 ： 使用包含亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的固定化全细胞催化剂合成 L- 叔亮氨酸 在 30℃向反应容器中加入 100mM 磷酸缓冲液 (pH 值调节至 8.0)、 终浓度为 600mM + 的三甲基丙酮酸钠盐， 终浓度为 1500mM 的甲酸铵和终浓度为 0.4g/L 的 NAD ， 使得液体总体 积为 5ml)。在体系中加入实施例 2 制备的 4 克固定化重组细胞催化剂后反应开始进行， 将 反应混合物在 30℃搅拌。在一定的时间间隔取样， 产物的生成量用 HPLC 确定。在反应 6 小 时后转化率大于 98％。产物经实施例 7 的方法加上 N- 甲氧羰基保护基团， 并提纯， 其结构 通过核磁共振检测确定。
     实施例 6 ： 重复利用包含亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的固定化全细胞催化剂合成 L- 叔亮氨酸
     在实施例 5 中使用完毕的固定化全细胞催化剂经离心回收。在 30℃向反应容器 中加入 100mM 磷酸缓冲液 (pH 值调节至 8.0)、 终浓度为 600mM 的三甲基丙酮酸钠盐， 终浓 + 度为 1500mM 的甲酸铵和终浓度为 0.4g/L 的 NAD ， 使得液体总体积为 5ml)。在加入 4 克固 定化重组细胞催化剂后反应开始进行， 将反应混合物在 30℃搅拌。 在一定的时间间隔取样， 产物的生成量用 HPLC 确定。在反应 6 小时后转化率大于 98％。产物经实施例 7 的方法加 上 N- 甲氧羰基保护基团， 并提纯， 其结构通过核磁共振检测确定。固定化全细胞催化剂至 少可以重复使用 6 次以上。
     实施例 7 ： 合成 L- 叔亮氨酸酶反应液后处理
     在合成实施例 3 ～ 6 的催化反应完成后， 待酶反应液 (1260ml) 降温至 10℃， 加入 氢氧化钠水溶液 ( 温度低于 30℃ ) 调至 pH 大于 13， 继续降温。待温度降至 10℃， 开始滴 加氯甲酸甲酯， 时间 6 小时， 温度 10 ～ 15℃， 体系中 pH ＞ 13。搅拌过夜 (8 ～ 15 小时 )，
     经 HPLC 检测原料反应完全后加入浓盐酸调节至 pH ＝ 2， 体系温度 10 ～ 15℃， 用二氯甲烷 萃取 3 次 (1000ml×3)， 静置分层， 二氯甲烷相经过滤除酶后， 用饱和亚硫酸氢钠 300ml 洗涤 一次， 饱和食盐水 300ml 洗涤一次， 静置分层， 有机相于外温 45℃， 真空度 0.09MPa， 蒸干得 粗品 115g， 纯度 94.5％， 最大单杂 1.5％。加入水 260ml， 升温至 75℃， 观察固体完全溶解 后， 搅拌 15min， 撤去油浴， 搅拌过夜自然降温析晶， 过滤得产品。产品干燥 ： 50℃， 真空度＞ 0.09MPa， 烘 4 小时， 称重 85g。滤液用乙酸乙酯萃取两次 (500ml×2)， 蒸干溶剂得粗产品， 可再次进行结晶， 以回收产品。核磁共振检测结果如图 3。7102352387 A CN 102352394序列表1/7 页序列表 SEQUENCE LISTING <110> <120> <130> <160> <170> <210> <211> <212> <213> 尚科生物医药 （上海） 有限公司 固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法 固定化全细胞催化剂合成非天然氨基酸的方法 4 PatentIn version 3.3 1 1095 DNA 球形芽孢杆菌、 蜡状芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌<400> 1 atggaaatct tcaagtatat ggaaaagtat gattatgaac aattggtatt ttgccaagac gaagcatctg ggttaaaagc gattatcgct atccatgaca caacacttgg accagcatta ggtggtgctc gtatgtggac ctacgcgaca gaagaaaatg cgattgagga tgcattaaga ttagcacgcg ggatgacata taaaaatgca gctgctggtt taaaccttgg cggtggaaaa acggtcatta ttggggaccc atttaaagat aaaaacgaag aaatgttccg tgctttaggt cgtttcattc aaggattaaa cggtcgctat attaccgctg aagatgttgg tacaaccgta 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Phe Asp Lys 340 345 350 Thr Tyr Asn Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Cys Ile Asp Gly Asp Tyr 355 360 365 Ala Thr Lys Ala Tyr Gly Gln Arg Ala Lys Lys Glu Gln Thr Glu Ala 370 375 380 Gly Asn Val Tyr Lys 385