一种以纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的方法及金纳米粒子的用途及分化剂.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110219693.X	申请日：	2011.08.02
公开号：	CN102329772A	公开日：	2012.01.25
当前法律状态：	撤回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):C12N 5/0775申请公布日:20120125\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N5/0775(2010.01)I	主分类号：	C12N5/0775
申请人：	港龙生物科技有限公司
发明人：	梁文瑛
地址：	中国香港特别行政区九龙新蒲岗大有街34号新科技广场1101室
优先权：
专利代理机构：	广州粤高专利商标代理有限公司 44102	代理人：	禹小明
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内容摘要

本发明涉及金纳米粒子在诱导间充质干细胞（MSC）体外定向分化方面的用途，利用纳米材料对间充质干细胞进行体外诱导分化，以不同粒径及浓度的金纳米粒子材料对间充质干细胞进行体外诱导定向分化为成骨细胞。

权利要求书

1：一种以纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）骨髓间充质干细胞的分离纯化；（2）扩充间充质干细胞，培养至 80-90% 融合时，更换含胎牛血清的 DMEM 培养液，加入 β- 甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松，同时加入纳米材料进行诱导。
2：根据权利要求 1 所述的的方法，其特征在于：所述的诱导采用的胎牛血清的浓度不低于 10%。
3：根据权利要求 1 所述的的方法，其特征在于：所述的诱导采用 β- 甘油磷酸钠，抗坏 −8 血酸和地塞米松的浓度分别为 10 mmol/L， 0.15 mmol/L 及 1×10 mol/L。
4：根据权利要求 1 所述的的方法，其特征在于：所述的诱导采用纳米材料为金纳米粒子。
5：根据权利要求 4 所述的的方法，其特征在于：所述的诱导采用金纳米粒子粒经为 20nm 至 40nm。
6：根据权利要求 4 所述的的方法，其特征在于：所述的诱导采用金纳米粒子浓度为 −4 −5 −5 1.5×10 , 3.0×10 或 1.5×10 µmol/L。
7：根据权利要求 1 所述的的方法，其特征在于：所述的诱导时间为 7 至 21 天。
8：一种金纳米粒子的用途，其特征在于金纳米粒子用于纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化中，具体包括以下步骤：（1）骨髓间充质干细胞的分离纯化；（2）扩充间充质干细胞，培养至 80-90% 融合时，更换含胎牛血清的 DMEM 培养液，加入 β- 甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松，同时加入金纳米粒子进行诱导。
9：一种促细胞分化剂，其特征在于包括 β- 甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松和纳米材料。
10：根据权利要求 9 所述的分化剂，其特征在于： β- 甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米 −8 松的浓度分别为 10 mmol/L， 0.15 mmol/L 及 1×10 mol/L ；纳米材料为金纳米粒子 , 浓 −4 −5 −5 度为 1.5×10 , 3.0×10 或 1.5×10 µmol/L。

说明书

一种以纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的方法及金纳米粒子的用途及分化剂
    技术领域本发明涉及一种纳米材料的用途，具体的涉及金纳米粒子在诱导间充质干细胞（MSC）体外定向分化方面的用途，可用于干细胞治疗骨组织中成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡的促细胞分化剂。
     技术背景
     人体的骨量依赖成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，此种平衡一旦打破会导致骨代谢性疾病 , 如骨质疏松，石骨症等。通过对骨祖细胞的刺激可调控骨细胞之间的动态平衡。
     成骨细胞源于骨髓基质细胞 , 能够合成和矿化骨胶原和细胞外基质。间充质干细胞是一种具有多潜能分化的细胞，它能够定向诱导为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等多种細胞。通過对间充质干细胞的定向诱导分化为成骨细胞可为临床治疗骨组织疾病提供新的技术方法。
     近年来随着纳米技术的发展，越来越多的纳米材料应用到生物工程的领域，如诊断、药物输送、组织工程等方面。纳米材料通过刺激基质环境促进细胞增殖及分化可应用于临床于干细胞治疗。金纳米粒子 (AuNP) 纳米材料中的一种 , 具有独特的物理性质和生物相容性，在生物领域 , 如药物载体、癌症诊断和基因治疗等方面也展现了其多样性的特点。由于其独特的粒径 , 纳米粒子能够通过多种途径进入人体，可通过肺部而迅速转移到其他重要器官中 , 包括血液、肝、脾、肾、睾丸、胸腺、心、肺、脑及骨髓。发明内容本发明利用金纳米粒子的特性对骨髓间充质干细胞进行定向分化，为骨髓间充质干细胞应用于临床治疗骨组织疾病提供了技术方法。
     本发明的目的是提供一种金纳米粒子于生物医药领域的新用途，用于定向诱导分化骨髓间充质干细胞。
     本发明的另一目的是提供一种用于干细胞治疗骨组织中成骨细胞和破骨细胞之间动态平衡的促细胞分化剂。
     本发明的另一目的是提供一种骨髓间充质干细胞定向分化的方法。具体包括以下步骤：（1）骨髓间充质干细胞的分离纯化；（2）扩充间充质干细胞，培养至 80%-90% 融合时，更换含胎牛血清的 DMEM 培养液，加入 β- 甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松，同时加入纳米材料进行诱导。
     由于 70％的骨基质是由 10-50 nm 纳米晶体结构的羟基磷灰石组成的，本发明采用了 20nm-40nm 的金纳米粒子材料对人骨髓间充质干细胞进行体外定向分化。
     本发明的另一目的是提供一种骨髓间充质干细胞定向分化的鉴定方法。
     利用扫描电镜（SEM），对 MSC 细胞形态进行观察。MSC 细胞在无金纳米粒子培养条件下呈梭形，纤维状细胞簇。经金纳米粒子作用后， MSC 细胞表面开始沉淀基质，细胞呈多角形结构并形成网状引致结节。 MSC 细胞高密度网状结构说明 MSC 细胞处于成骨分化期间，证明了金纳米粒子能够提高 MSC 成骨分化的能力。相对于现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步。
     金纳米粒子 (AuNP) 是纳米材料中的一种 , 具有独特的物理性质和生物相容性，由于其独特的粒径 , 纳米粒子能够通过多种途径进入人体，可通过肺部而迅速转移到其他重要器官中 , 包括血液、肝、脾、肾、睾丸、胸腺、心、肺、脑及骨髓。对目的细胞进行分化诱导。附图说明
     图 1 为金纳米粒子诱导骨髓间充质干细胞的定向分化碱性磷酸酶活性的量效关图 2 为金纳米粒子诱导骨髓间充质干细胞的定向分化矿化结节的量效关系图。系图。
     具体实施方式下面用实施例对本发明作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
     实施例 1 ：骨髓间充质干细胞的分离，纯化和扩增培养无菌条件下采集非血液系统疾病的人骨髓，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液 3 倍稀释，400g 离心 5 分钟，弃上清，加入含 10% 胎牛血清， 100 U/ mL 青霉素及 100g/mL 链霉素的 DMEM 培养液置于 37℃ , 5% CO2 的孵育箱内培养。培养 3 天后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每 3 天更换一次培养基。待细胞 80% 汇合后 , 用 0.25% 胰蛋白酶加 0.02% 的乙二胺四乙酸 (EDTA) 消化传代。
     实施例 2 ：金纳米粒子（AuNP）的制备以化学方法制备金纳米粒子。即在 100ºC 下，通过改变还原剂（柠檬酸钠）和三价金的化合物（氯金酸或氯金酸钠）的比例来控制还原反应生成金纳米粒子以及控制粒径的大小，从而获得粒径在 20 - 40 nm 范围内，分散性较好的 AuNP。通过动态光散射法验证 AuNP 的大小。实施例 3 ：金纳米粒子于骨髓间充质干细胞的定向分化具有多潜能分化的 MSC 向成骨方向的分化是骨生成的关键。碱性磷酸酶（ALP）的活性是 MSC 成骨分化的早期标志，而矿化结节的形成则是成骨分化的晚期标志。由实施 1 例获得的骨髓间充质干细胞，经实施例 2 获得的金纳米粒子作用后，碱性磷酸酶活性，及矿化结节的增加可作为定向分化为成骨细胞的指标。
     碱性磷酸酶 (ALP) 活性的测定（1） MSC 细胞 (5×106 个 / 孔 ) 接种于 48 孔板中培养。待细胞贴壁后更换含有成骨诱导剂（10 mmol/L β- 甘油磷酸钠 , 0.15 mmol/L 抗坏血酸和 10 − 8 mol/L 地塞米松 ) 的培养基 , 同时 , 加入不同粒径（20-40nm），不同浓度的金纳米粒子使其终浓度达到 1.5×10 − 4 , 3.0×10 − 5 或 1.5×10 − 5μmol/L。
     （2）培养 7 至 14 天后 , 培养板用冷的 D-Hank’ s 洗两次 , 两次冻融裂解 . 用细胞碱性磷酸酶测定试剂盒和蛋白含量测定试剂盒分别测定上层清液的碱性磷酸酶活性和蛋白量 , 所有的结果通过蛋白的含量归一化。
     （3） ALP 的活性参见图 1，金纳米粒子对骨髓间充质干细胞 ALP 的活性影响 ALP 活性是成骨分化的一个早期标志，一般会于 MSC 体外培养 7 天后开始表达。经不同粒径金纳米粒子作用的 MSC，培养 7、 10 和 14 天后， ALP 活性检测结果显示，不同浓度、不同粒径的金纳米粒子均能促进 MSC 的成骨分化。特别是高浓度金纳米粒子作用下的 MSC 呈现出了高 ALP 活性，并于培养 14 天达至峰值， ALP 活性明显高于培养 7 天和 10 天。而同浓度下， 20nm 的金纳米粒子又较 40nm 的金纳米粒子作用明显。同时于此浓度下的金纳米粒子并未对细胞产生急性毒性。此结果表明， MSC 的成骨分化可以通过金纳米粒子的大小，剂量及作用时间调控。
     矿化结节染色及定量测定（1） MSC 细胞 (5×106 个 / 孔 ) 接种于 48 孔板中 , 在 37℃ , 5% CO2 孵育箱中培养过夜 , 加入矿化诱导剂 (10 mmol/L β- 甘油磷酸钠和 50μg/mL 抗坏血酸 ) 和终浓度为 1.5×10 − 4, 3.0×10 − 5, 或 1.0×10 − 5μmol/L 的不同粒径（20-40nm）的金纳米粒子 , 培养 9 至 21 天。采用茜素红 (ARS) 对矿化结节染色，实验结果以矿化促进率 (100%) 表示 [OD 样品 -OD 对照 ]/[OD 对照 ]×100。
     （2）矿化结节参见图 2，金纳米粒子对骨髓间充质干细胞矿化结节的影响。
     矿化结节的形成是 MSC 成骨分化成熟的晚期标志，矿化结节一般于 MSC 培养 2-3 周后形成。经不同粒径金纳米粒子作用的 MSC，培养 9、 15 和 21 天后，矿化结节检测结果显示不同浓度、不同粒径的金纳米粒子均能促进 MSC 的矿化结节，其对 MSC 矿化结节的的促进率与阳性对照一致， 21 天达至峰值，高浓度金纳米粒子对 MSC 矿化结节的的促进率大于 45%。而同浓度下， 20nm 的金纳米粒子又较 40nm 的金纳米粒子作用明显。同时于此浓度下的金纳米粒子并未对细胞产生急性毒性。此结果表明， MSC 的成骨分化可以通过金纳米粒子的大小，剂量及作用时间调控。
     MSC 细胞形态（1） MSC 细胞 (5×106 个 / 孔 ) 接种于 48 孔板中培养。待细胞贴壁后更换含有成骨诱导剂（10mmol/L β- 甘油磷酸钠 , 0.15 mmol/L 抗坏血酸和 1×10 − 8 地塞米松 ) 的培养基，同时，加入 20nm， 1.510 − 4μmol/L，金纳米粒子。
     （2）培养 7 天后，将细胞固定，脱水，干燥后，镀碳后于扫描电镜（SEM）下观察经金纳米粒子作用前后 MSC 细胞的形态。
     （3）细胞的形态利用扫描电镜（SEM），对 MSC 细胞形态进行观察。MSC 细胞在无金纳米粒子培养条件下呈梭形，纤维状细胞簇。经金纳米粒子作用后， MSC 细胞表面开始沉淀基质，细胞呈多角形结构并形成网状引致结节。 MSC 细胞高密度网状结构说明 MSC 细胞处于成骨分化期间，证明了金纳米粒子能够提高 MSC 成骨分化的能力。
     上述发明不局限于上述实施例中的最优技术方案，在扩充间充质干细胞，培养至80-90% 融合的范围区间内以及胎牛血清的浓度高于 10% 时，同样可以达到相同或相似的技术效果。任何基于本发明的中心思想，或基于权利要求书，或基于说明书的技术方案做作出的改进或改良或采用的等同的技术手段，均为本发明所要求保护的技术方案。
     本发明涉及的部分参考文献 1.Paciotti G F, Myer L, Weinreich D, et al. Colloidal gold: a novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery. Drug Delivery, 2004, 11: 169— 183. 2.Yang N, Sun W H. Gene gun and other non-viral approaches for cancer gene therapy. Nat Med, 1995, 1: 481— 483. 3.De Jong W H, Hagens W I, Krystek P, et al. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration. Biomaterials, 2008, 29: 1912— 1919. 4.Kaplan F S, Hayes W C, Keaveny T M, et al. In: Simon S R, ed. Orthopedic Basic Science. Rosemont: American Academy of Orthopaedic Surgeons, 1994. 127— 185 5.Grislain L, Couvreur P, Lenaerts V, et al. Pharmacokinetics and distribution of a biodegradable drug-carrier. Int J Pharm, 1983, 15:335— 345. 6.Tsai CY, Shiau AL, Chen SY, Chen YH, Cheng PC, Chang MY, Chen DH, Chou CH, Wang CR, Wu CL. Amelioration of collagen-induced arthritis in rats by nanogold Arthritis Rheum. 2007 Feb;56(2):544-54. 7.Jaeger GT, Larsen S, Søli N, Moe L. Two years follow-up study of the pain-relieving effect of gold bead implantation in dogs with hip-joint arthritis. arthritis. Acta Vet Scand. 2007 Mar 23;49:9. 8.Pissuwan D, Valenzuela SM, Cortie MB. Therapeutic possibilities of plasmonically heated gold nanoparticles. Trends Biotechnol. 2006 Feb; 24(2):62-7. Epub 2005 Dec 27. 9.Jacob D. Gibson, Bishnu P. Khanal, and Eugene R. Zubarev Paclitaxel-Functionalized Gold Nanoparticles J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 11653-11661 doi:10.1021/ja075181k 10.Qian, Ximei. "In vivo tumor targeting and spectroscopic detection with surface-enhanced Raman nanoparticle tags." Nature Biotechnology. 2008. Vol 26 No 1. 11.Chow, M. K.; Zukoski, C. F. Gold Sol Formation Mechanisms: Role of colloidal Stability. J. Colloid Interface Sci. 1994, 165, 97–109. 12.Pockwinse, S.; Wilming, L.; Conlon, D.; Stein, G. S.; Lian, J. B. Expression of Cell-Growth and Bone Specific Genes at Single Cell Resolution during Development of Bone Tissue-Like Organization in Primary Osteoblast Cultures. J. Cell. Biochem. 1992, 49, 310–323. 13.Abdallah, B. M.; Jensen, C. H.; Gutierrez, G.; Leslie, R. G. Q.; Jensen,T. G.; Kassem, M. Regulation of Human Skeletal Stem Cells Differentiation by Dlk1/Pref-1. J. Bone. Miner. Res. 2004, 19, 841–852. 14.Stein, G. S.; Lian, J. B. Molecular Mechanisms Mediating Proliferation / Differentiation Interrelationships during Progressive Development of the Osteoblast Phenotype. Endocr. Rev. 1993, 14, 424–442. 15.Prabhakaran, M. P.; Venugopal, J. R.; Ramakrishna, S. Mesenchymal Stem Cell Differentiation to Neuronal Cells on Electrospun Nanofibrous Substrates for Nerve Tissue Engineering. Biomaterials 2009, 30, 4996–5003. 16.Kaur, G.; Valarmathi, M. T.; Potts, J. D.; Wang, Q. The Promotion of Osteoblastic Differentiation of Rat Bone Marrow Stromal Cells by a Polyvalent Plant Mosaic Virus. Biomaterials 2008, 29, 4074–4081. 17.Popat, K. C.; Chatvanichkul, K. I.; Barnes, G. L.; Latempa, T. J.; Grimes, C. A.; Desai, T. A. Osteogenic Differentiation of Marrow Stromal Cells Cultured on Nanoporous Alumina Surfaces. J. Biomed. Mater. Res. Part A 2006, 80A, 955–964. 18.Wang D, Christensen K, Chawla K, et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Bone Miner Res, 1999, 14: 893— 903. 19.Stein G S, Lian J B. Molecular mechanisms mediating proliferation/ differentiation interrelationships during progressive development of the osteoblast phenotype. Endocr Rev, 1993, 14: 424— 442. 20.Collin P, Nefussi J R, Wetterwald A, et al. Expression of collagen, osteocalcin, and bone alkaline phosphatase in a mineralizing rat osteoblastic cell culture. Calcif Tissue Int, 1992, 50: 175— 183. 21.Obrant K J, Ivaska K K, Gerdhem P, et al. Biochemical markers of bone turnover are influenced by recently sustained fracture. Bone, 2005, 36: 786— 792. 22.Veitch S W, Findlay S C, Hamer A J, et al. Changes in bone mass and bone turnover following tibial shaft fracture. Osteoporos Int, 2006, 17: 364— 372。

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1、10申请公布号CN102329772A43申请公布日20120125CN102329772ACN102329772A21申请号201110219693X22申请日20110802C12N5/077520100171申请人港龙生物科技有限公司地址中国香港特别行政区九龙新蒲岗大有街34号新科技广场1101室72发明人梁文瑛74专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102代理人禹小明54发明名称一种以纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的方法及金纳米粒子的用途及分化剂57摘要本发明涉及金纳米粒子在诱导间充质干细胞（MSC）体外定向分化方面的用途，利用纳米材料对间充质干细胞进行体外诱导分化。

2、，以不同粒径及浓度的金纳米粒子材料对间充质干细胞进行体外诱导定向分化为成骨细胞。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图1页CN102329782A1/1页21一种以纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的方法，其特征在于包括以下步骤（1）骨髓间充质干细胞的分离纯化；（2）扩充间充质干细胞，培养至8090融合时，更换含胎牛血清的DMEM培养液，加入甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松，同时加入纳米材料进行诱导。2根据权利要求1所述的的方法，其特征在于所述的诱导采用的胎牛血清的浓度不低于10。3根据权利要求1所述的的方法，其特征在于所述的诱导采用甘。

3、油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松的浓度分别为10MMOL/L，015MMOL/L及1108MOL/L。4根据权利要求1所述的的方法，其特征在于所述的诱导采用纳米材料为金纳米粒子。5根据权利要求4所述的的方法，其特征在于所述的诱导采用金纳米粒子粒经为20NM至40NM。6根据权利要求4所述的的方法，其特征在于所述的诱导采用金纳米粒子浓度为15104,30105或15105MOL/L。7根据权利要求1所述的的方法，其特征在于所述的诱导时间为7至21天。8一种金纳米粒子的用途，其特征在于金纳米粒子用于纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化中，具体包括以下步骤（1）骨髓间充质干细胞的分离纯化；（2）扩。

4、充间充质干细胞，培养至8090融合时，更换含胎牛血清的DMEM培养液，加入甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松，同时加入金纳米粒子进行诱导。9一种促细胞分化剂，其特征在于包括甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松和纳米材料。10根据权利要求9所述的分化剂，其特征在于甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松的浓度分别为10MMOL/L，015MMOL/L及1108MOL/L；纳米材料为金纳米粒子,浓度为15104,30105或15105MOL/L。权利要求书CN102329772ACN102329782A1/5页3一种以纳米材料体外诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的方法及金纳米粒子的用途及分化剂技术领域0001本发明涉及。

5、一种纳米材料的用途，具体的涉及金纳米粒子在诱导间充质干细胞（MSC）体外定向分化方面的用途，可用于干细胞治疗骨组织中成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡的促细胞分化剂。技术背景0002人体的骨量依赖成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡，此种平衡一旦打破会导致骨代谢性疾病,如骨质疏松，石骨症等。通过对骨祖细胞的刺激可调控骨细胞之间的动态平衡。0003成骨细胞源于骨髓基质细胞,能够合成和矿化骨胶原和细胞外基质。间充质干细胞是一种具有多潜能分化的细胞，它能够定向诱导为骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等多种細胞。通過对间充质干细胞的定向诱导分化为成骨细胞可为临床治疗骨组织疾病提供新的技术方法。0004近年来随着纳米。

6、技术的发展，越来越多的纳米材料应用到生物工程的领域，如诊断、药物输送、组织工程等方面。纳米材料通过刺激基质环境促进细胞增殖及分化可应用于临床于干细胞治疗。金纳米粒子AUNP纳米材料中的一种,具有独特的物理性质和生物相容性，在生物领域,如药物载体、癌症诊断和基因治疗等方面也展现了其多样性的特点。由于其独特的粒径,纳米粒子能够通过多种途径进入人体，可通过肺部而迅速转移到其他重要器官中,包括血液、肝、脾、肾、睾丸、胸腺、心、肺、脑及骨髓。发明内容0005本发明利用金纳米粒子的特性对骨髓间充质干细胞进行定向分化，为骨髓间充质干细胞应用于临床治疗骨组织疾病提供了技术方法。0006本发明的目的是提供一种金。

7、纳米粒子于生物医药领域的新用途，用于定向诱导分化骨髓间充质干细胞。0007本发明的另一目的是提供一种用于干细胞治疗骨组织中成骨细胞和破骨细胞之间动态平衡的促细胞分化剂。0008本发明的另一目的是提供一种骨髓间充质干细胞定向分化的方法。具体包括以下步骤（1）骨髓间充质干细胞的分离纯化；（2）扩充间充质干细胞，培养至8090融合时，更换含胎牛血清的DMEM培养液，加入甘油磷酸钠，抗坏血酸和地塞米松，同时加入纳米材料进行诱导。0009由于70的骨基质是由1050NM纳米晶体结构的羟基磷灰石组成的，本发明采用了20NM40NM的金纳米粒子材料对人骨髓间充质干细胞进行体外定向分化。0010本发明的另一目。

8、的是提供一种骨髓间充质干细胞定向分化的鉴定方法。说明书CN102329772ACN102329782A2/5页40011利用扫描电镜（SEM），对MSC细胞形态进行观察。MSC细胞在无金纳米粒子培养条件下呈梭形，纤维状细胞簇。经金纳米粒子作用后，MSC细胞表面开始沉淀基质，细胞呈多角形结构并形成网状引致结节。MSC细胞高密度网状结构说明MSC细胞处于成骨分化期间，证明了金纳米粒子能够提高MSC成骨分化的能力。相对于现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步。0012金纳米粒子AUNP是纳米材料中的一种,具有独特的物理性质和生物相容性，由于其独特的粒径,纳米粒子能够通过多种途径进入人体，可通过肺部。

9、而迅速转移到其他重要器官中,包括血液、肝、脾、肾、睾丸、胸腺、心、肺、脑及骨髓。对目的细胞进行分化诱导。附图说明0013图1为金纳米粒子诱导骨髓间充质干细胞的定向分化碱性磷酸酶活性的量效关系图。0014图2为金纳米粒子诱导骨髓间充质干细胞的定向分化矿化结节的量效关系图。具体实施方式0015下面用实施例对本发明作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。0016实施例1骨髓间充质干细胞的分离，纯化和扩增培养无菌条件下采集非血液系统疾病的人骨髓，用含10胎牛血清的DMEM培养液3倍稀释，400G离心5分钟，弃上清，加入含10胎牛血清，100U/。

10、ML青霉素及100G/ML链霉素的DMEM培养液置于37,5CO2的孵育箱内培养。培养3天后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每3天更换一次培养基。待细胞80汇合后,用025胰蛋白酶加002的乙二胺四乙酸EDTA消化传代。0017实施例2金纳米粒子（AUNP）的制备以化学方法制备金纳米粒子。即在100C下，通过改变还原剂（柠檬酸钠）和三价金的化合物（氯金酸或氯金酸钠）的比例来控制还原反应生成金纳米粒子以及控制粒径的大小，从而获得粒径在2040NM范围内，分散性较好的AUNP。通过动态光散射法验证AUNP的大小。实施例3金纳米粒子于骨髓间充质干细胞的定向分化具有多潜能分化的MSC向成骨方向的分化是。

11、骨生成的关键。碱性磷酸酶（ALP）的活性是MSC成骨分化的早期标志，而矿化结节的形成则是成骨分化的晚期标志。由实施1例获得的骨髓间充质干细胞，经实施例2获得的金纳米粒子作用后，碱性磷酸酶活性，及矿化结节的增加可作为定向分化为成骨细胞的指标。0018碱性磷酸酶ALP活性的测定（1）MSC细胞5106个/孔接种于48孔板中培养。待细胞贴壁后更换含有成骨诱导剂（10MMOL/L甘油磷酸钠,015MMOL/L抗坏血酸和108MOL/L地塞米松的培养基,同时,加入不同粒径（2040NM），不同浓度的金纳米粒子使其终浓度达到15104,30105或15105MOL/L。说明书CN102329772ACN1。

12、02329782A3/5页50019（2）培养7至14天后,培养板用冷的DHANKS洗两次,两次冻融裂解用细胞碱性磷酸酶测定试剂盒和蛋白含量测定试剂盒分别测定上层清液的碱性磷酸酶活性和蛋白量,所有的结果通过蛋白的含量归一化。0020（3）ALP的活性参见图1，金纳米粒子对骨髓间充质干细胞ALP的活性影响ALP活性是成骨分化的一个早期标志，一般会于MSC体外培养7天后开始表达。经不同粒径金纳米粒子作用的MSC，培养7、10和14天后，ALP活性检测结果显示，不同浓度、不同粒径的金纳米粒子均能促进MSC的成骨分化。特别是高浓度金纳米粒子作用下的MSC呈现出了高ALP活性，并于培养14天达至峰值，A。

13、LP活性明显高于培养7天和10天。而同浓度下，20NM的金纳米粒子又较40NM的金纳米粒子作用明显。同时于此浓度下的金纳米粒子并未对细胞产生急性毒性。此结果表明，MSC的成骨分化可以通过金纳米粒子的大小，剂量及作用时间调控。0021矿化结节染色及定量测定（1）MSC细胞5106个/孔接种于48孔板中,在37,5CO2孵育箱中培养过夜,加入矿化诱导剂10MMOL/L甘油磷酸钠和50G/ML抗坏血酸和终浓度为15104,30105,或10105MOL/L的不同粒径（2040NM）的金纳米粒子,培养9至21天。采用茜素红ARS对矿化结节染色，实验结果以矿化促进率100表示OD样品OD对照/OD对照1。

14、00。0022（2）矿化结节参见图2，金纳米粒子对骨髓间充质干细胞矿化结节的影响。0023矿化结节的形成是MSC成骨分化成熟的晚期标志，矿化结节一般于MSC培养23周后形成。经不同粒径金纳米粒子作用的MSC，培养9、15和21天后，矿化结节检测结果显示不同浓度、不同粒径的金纳米粒子均能促进MSC的矿化结节，其对MSC矿化结节的的促进率与阳性对照一致，21天达至峰值，高浓度金纳米粒子对MSC矿化结节的的促进率大于45。而同浓度下，20NM的金纳米粒子又较40NM的金纳米粒子作用明显。同时于此浓度下的金纳米粒子并未对细胞产生急性毒性。此结果表明，MSC的成骨分化可以通过金纳米粒子的大小，剂量及作用。

15、时间调控。0024MSC细胞形态（1）MSC细胞5106个/孔接种于48孔板中培养。待细胞贴壁后更换含有成骨诱导剂（10MMOL/L甘油磷酸钠,015MMOL/L抗坏血酸和1108地塞米松的培养基，同时，加入20NM，15104MOL/L，金纳米粒子。0025（2）培养7天后，将细胞固定，脱水，干燥后，镀碳后于扫描电镜（SEM）下观察经金纳米粒子作用前后MSC细胞的形态。0026（3）细胞的形态利用扫描电镜（SEM），对MSC细胞形态进行观察。MSC细胞在无金纳米粒子培养条件下呈梭形，纤维状细胞簇。经金纳米粒子作用后，MSC细胞表面开始沉淀基质，细胞呈多角形结构并形成网状引致结节。MSC细胞高。

16、密度网状结构说明MSC细胞处于成骨分化期间，证明了金纳米粒子能够提高MSC成骨分化的能力。0027上述发明不局限于上述实施例中的最优技术方案，在扩充间充质干细胞，培养至说明书CN102329772ACN102329782A4/5页68090融合的范围区间内以及胎牛血清的浓度高于10时，同样可以达到相同或相似的技术效果。任何基于本发明的中心思想，或基于权利要求书，或基于说明书的技术方案做作出的改进或改良或采用的等同的技术手段，均为本发明所要求保护的技术方案。0028本发明涉及的部分参考文献1PACIOTTIGF,MYERL,WEINREICHD,ETALCOLLOIDALGOLDANOVELNA。

17、NOPARTICLEVECTORFORTUMORDIRECTEDDRUGDELIVERYDRUGDELIVERY,2004,111691832YANGN,SUNWHGENEGUNANDOTHERNONVIRALAPPROACHESFORCANCERGENETHERAPYNATMED,1995,14814833DEJONGWH,HAGENSWI,KRYSTEKP,ETALPARTICLESIZEDEPENDENTORGANDISTRIBUTIONOFGOLDNANOPARTICLESAFTERINTRAVENOUSADMINISTRATIONBIOMATERIALS,2008,291912191。

18、94KAPLANFS,HAYESWC,KEAVENYTM,ETALINSIMONSR,EDORTHOPEDICBASICSCIENCEROSEMONTAMERICANACADEMYOFORTHOPAEDICSURGEONS,19941271855GRISLAINL,COUVREURP,LENAERTSV,ETALPHARMACOKINETICSANDDISTRIBUTIONOFABIODEGRADABLEDRUGCARRIERINTJPHARM,1983,153353456TSAICY,SHIAUAL,CHENSY,CHENYH,CHENGPC,CHANGMY,CHENDH,CHOUCH,WA。

19、NGCR,WUCLAMELIORATIONOFCOLLAGENINDUCEDARTHRITISINRATSBYNANOGOLDARTHRITISRHEUM2007FEB562544547JAEGERGT,LARSENS,SLIN,MOELTWOYEARSFOLLOWUPSTUDYOFTHEPAINRELIEVINGEFFECTOFGOLDBEADIMPLANTATIONINDOGSWITHHIPJOINTARTHRITISARTHRITISACTAVETSCAND2007MAR234998PISSUWAND,VALENZUELASM,CORTIEMBTHERAPEUTICPOSSIBILITI。

20、ESOFPLASMONICALLYHEATEDGOLDNANOPARTICLESTRENDSBIOTECHNOL2006FEB242627EPUB2005DEC279JACOBDGIBSON,BISHNUPKHANAL,ANDEUGENERZUBAREVPACLITAXELFUNCTIONALIZEDGOLDNANOPARTICLESJAMCHEMSOC2007,129,1165311661DOI101021/JA075181K10QIAN,XIMEI“INVIVOTUMORTARGETINGANDSPECTROSCOPICDETECTIONWITHSURFACEENHANCEDRAMANNA。

21、NOPARTICLETAGS“NATUREBIOTECHNOLOGY2008VOL26NO111CHOW,MKZUKOSKI,CFGOLDSOLFORMATIONMECHANISMSROLEOFCOLLOIDALSTABILITYJCOLLOIDINTERFACESCI1994,165,9710912POCKWINSE,SWILMING,LCONLON,DSTEIN,GSLIAN,JBEXPRESSIONOFCELLGROWTHANDBONESPECIFICGENESATSINGLECELLRESOLUTIONDURINGDEVELOPMENTOFBONETISSUELIKEORGANIZAT。

22、IONINPRIMARYOSTEOBLASTCULTURESJCELLBIOCHEM1992,49,31032313ABDALLAH,BMJENSEN,CHGUTIERREZ,GLESLIE,RGQJENSEN,说明书CN102329772ACN102329782A5/5页7TGKASSEM,MREGULATIONOFHUMANSKELETALSTEMCELLSDIFFERENTIATIONBYDLK1/PREF1JBONEMINERRES2004,19,84185214STEIN,GSLIAN,JBMOLECULARMECHANISMSMEDIATINGPROLIFERATION/DIFFE。

23、RENTIATIONINTERRELATIONSHIPSDURINGPROGRESSIVEDEVELOPMENTOFTHEOSTEOBLASTPHENOTYPEENDOCRREV1993,14,42444215PRABHAKARAN,MPVENUGOPAL,JRRAMAKRISHNA,SMESENCHYMALSTEMCELLDIFFERENTIATIONTONEURONALCELLSONELECTROSPUNNANOFIBROUSSUBSTRATESFORNERVETISSUEENGINEERINGBIOMATERIALS2009,30,4996500316KAUR,GVALARMATHI,M。

24、TPOTTS,JDWANG,QTHEPROMOTIONOFOSTEOBLASTICDIFFERENTIATIONOFRATBONEMARROWSTROMALCELLSBYAPOLYVALENTPLANTMOSAICVIRUSBIOMATERIALS2008,29,4074408117POPAT,KCCHATVANICHKUL,KIBARNES,GLLATEMPA,TJGRIMES,CADESAI,TAOSTEOGENICDIFFERENTIATIONOFMARROWSTROMALCELLSCULTUREDONNANOPOROUSALUMINASURFACESJBIOMEDMATERRESPAR。

25、TA2006,80A,95596418WANGD,CHRISTENSENK,CHAWLAK,ETALISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFMC3T3E1PREOSTEOBLASTSUBCLONESWITHDISTINCTINVITROANDINVIVODIFFERENTIATION/MINERALIZATIONPOTENTIALBONEMINERRES,1999,1489390319STEINGS,LIANJBMOLECULARMECHANISMSMEDIATINGPROLIFERATION/DIFFERENTIATIONINTERRELATIONSHIPSDURINGP。

26、ROGRESSIVEDEVELOPMENTOFTHEOSTEOBLASTPHENOTYPEENDOCRREV,1993,1442444220COLLINP,NEFUSSIJR,WETTERWALDA,ETALEXPRESSIONOFCOLLAGEN,OSTEOCALCIN,ANDBONEALKALINEPHOSPHATASEINAMINERALIZINGRATOSTEOBLASTICCELLCULTURECALCIFTISSUEINT,1992,5017518321OBRANTKJ,IVASKAKK,GERDHEMP,ETALBIOCHEMICALMARKERSOFBONETURNOVERAREINFLUENCEDBYRECENTLYSUSTAINEDFRACTUREBONE,2005,3678679222VEITCHSW,FINDLAYSC,HAMERAJ,ETALCHANGESINBONEMASSANDBONETURNOVERFOLLOWINGTIBIALSHAFTFRACTUREOSTEOPOROSINT,2006,17364372。说明书CN102329772ACN102329782A1/1页8图1图2说明书附图CN102329772A。

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