用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、 探针及其方法 技术领域 本发明涉及生物检测领域, 特别是涉及一种用于检测小鼠脱脚病病毒的引物、 探 针及其方法。
背景技术 自然感染实验动物的病毒很多, 根据对人类的危害性, 可将其分为三类 ; 一类为人 兽共患病病毒, 能够感染人与灵长类动物 ; 二类目前尚无迹象表明感染人, 但能在体外培养 的人、 猿和猴源性细胞中进行复制, 对人类有潜在危险性 ; 三类病毒在自然条件下仅感染动 物本身, 目前尚无迹象表明能够感染人, 因此对人类威胁不大。
现今, 小鼠作为单克隆抗体、 蛋白类药物等生物制品的一个主要来源, 具有潜在的 病毒污染。在 《中华人民共和国药典 (2010 年版 )》 三部中, 规定了鼠源性生物制品需质检 的 8 种鼠源病毒, 其中小鼠脱脚病病毒属于 II 类, 目前尚无迹象表明感染人, 但能在体外培 养的人、 猿和猴源性细胞中进行复制, 对人类有潜在危险性。 鼠源性病毒检测标准的制定对 客观评价生物制品质量, 确保人民健康必将起到积极的作用。
小鼠脱脚病病毒也叫鼠痘病毒 (poxvirus of mice, MPV), 能引起鼠痘。鼠痘多呈 爆发性流行, 致死率较高, 常造成小鼠全群淘汰, 危害极大。临床表现以四肢、 尾和头部肿 胀、 溃烂、 坏死甚至脚趾脱落为特征, 故鼠痘病毒又称脱脚病病毒 (ectromelis virus, 以下 将此病毒简称为 EV)。 该病在世界各地的实验室鼠群中广泛流行, 在我国鼠群中呈散发性流 行。
药典规定的鼠源病毒检测方法有 : 细胞试验、 动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。 这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染, 检测手段复杂费时, 周期长, 且对操 作的实验室有一定要求, 不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。
而 目 前 发 展 十 分 成 熟 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 (Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR) 检测灵敏度高, 简单方 便, 且对实验室要求也很低。 Real Time PCR 于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推 出, 是在 PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程, 使每一 个循环变得 “可见” , 最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA(orcDNA) 的起始浓度进行定 量分析的方法。该方法自产生以来, 不断发展完善, 特别是随着 Taqman 荧光探针的广泛应 用, 到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman 荧光探针的 PCR 检测是指进行 PCR 扩增时, 在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针, 该探针为一寡核苷酸, 两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时, 报告基因所发射的 荧光信号被淬灭基因吸收, 扩增时随着 Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针, 其 -3’ 外切核酸酶活性将探针酶切降解, 报告荧光基团与淬灭荧光基团分离, 从而荧光检测 5’ 系统可以监测到荧光信号, 模板每复制一次, 就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释 放。由于被释放的荧光基团数目和 PCR 产物数量是一对一关系, 所以信号累积与 PCR 产物 完全同步。 整个反应结束后, 便可得到一条扩增曲线, 由已知浓度标准样品的扩增曲线可以
得到一条标准曲线, 根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。
实时荧光定量 PCR 技术不仅实现了对 DNA/RNA 模板的定量, 而且具有灵敏度和特 异性高、 能实现多重反应、 自动化程度高、 无污染、 实时和准确等特点, 该已被广泛用于免疫 分析、 细菌、 病毒检测等多个领域。迄今为止, 实时荧光定量 PCR 技术检测小鼠脱脚病病毒 方面还未见有报道, 无疑有着很广阔的发展空间。 发明内容 为了解决现有小鼠脱脚病病毒检测方法的不足, 本发明提供了一种实时荧光定量 PCR 检测小鼠脱脚病病毒的引物、 探针及其方法, 该方法简单方便、 灵敏度高且检测时间短。
本发明的一个目的是提供一对用于检测小鼠脱脚病病毒的引物。
本发明提供的引物, 是由具有序列表中的 SEQ ID NO : 1 的上游引物与具有序列表 中的 SEQ ID NO : 2 的下游引物组成的一对寡核苷酸。
序列表中的 SEQ ID NO : 1 由 31 个碱基组成 ; 序列表中的 SEQ IDNO : 2 由 22 个碱 基组成。
本发明人设计了多对 PCR 引物, 经过长期大量的实验众多引物对中筛选出了由上 述上游引物和下游引物组成的引物对。其扩增片断大小为 119bp。该引物对小鼠脱脚病病 毒具有高度的保守性, 且与小鼠基因组不具有显著的同源性, 使用该引物进行 PCR 扩增, 可 实现准确定性、 定量检测。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测小鼠脱脚病病毒的探针, 所述探针具有 序列表中的 SEQ ID NO : 3 的核苷酸序列, 所述探针 5’ 端连接有荧光报告基团, 3’ 端连接有 荧光淬灭基团。
所述探针中荧光报告基团可选自 FAM、 JOE、 HEX 中的任意一种, 优选为 FAM ; 所述荧 光淬灭基团选自 TAMRA 或 Eclipse, 优选为 TAMRA。
所述序列表中的 SEQ ID NO : 3 由 29 个碱基组成。
本发明的再一个目的是提供一种检测小鼠脱脚病病毒的方法, 所述方法以样品 DNA 为模板, 使用上述提及引物及探针进行的实时荧光定量 PCR 检测方法。
优选地, 所述实时荧光定量 PCR 的反应体系还包括脱脚病病毒核酸 PCR 扩增试剂、 阳性定量标准品、 阴性质控品、 空白对照。
优选地, 所述实时荧光定量 PCR 的退火温度为 62℃。
优选地, 所述实时荧光定量 PCR 的反应条件为 : 50 ℃, 2min ; 95 ℃, 10min ; 95 ℃, 15s, 62℃, 1min, 共 40 个循环。
优选地, 所述方法还包括标准曲线的建立, 方法为 : 用含序列表中 SEQ ID NO : 4所 示的碱基同源序列的 pMA-T 重组质粒作为阳性定量标准品, 将其十倍稀释成不同浓度的阳 性定量标准品, 以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量 PCR 检测, 得到检测生 小鼠脱脚病病毒残留的标准曲线。
本发明的又一个目的是提供一种检测小鼠脱脚病病毒的试剂盒, 所述试剂盒含上 述提及的引物及探针。
优选地, 所述试剂盒的反应体系还包括脱脚病病毒核酸 PCR 扩增试剂、 阳性定量 标准品、 阴性质控品、 空白对照。
优选地, 所述 PCR 扩增试剂为 2×Taqman PCR Mix。
优选地, 所述阳性定量标准品为含序列表中 SEQ ID NO : 4 所示的碱基同源序列的 pMA-T 重组质粒。
本发明的还一个目的是提供上述提及的引物或探针在检测鼠源生物制品中脱脚 病病毒残留时的应用。
与现有检测方法相比, 本发明提供的荧光定量 PCR 方法检测小鼠脱脚病病毒具有 以下优点 :
1、 简单快速 : 现有的药典小鼠脱脚病病毒检测方法为 : 细胞试验、 动物抗体产生 实验和鸡胚感染实验, 从生物学效应角度检测生物制品中小鼠脱脚病病毒的潜在感染, 需 时长 (1-4 周时间 ), 而本发明从核酸角度对脱脚病病毒进行检测, 只需要 6 小时左右即可出 结果, 且对操作实验室环境要求不高, 规避了以前抽检产品可能产生的漏洞, 可在企业实现 批批检测, 进一步提高了生物制品质控质量。
2、 灵敏度高 : 现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠脱脚病病毒 的潜在感染, 其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理, 残留鼠源病毒的活病 毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小, 而本发明从病毒核酸角度进行检测, 相对前述药典 规定方法而言, 提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光定量 PCR 检测生物制品中 小鼠脱脚病病毒时, 可以准确定量, 目标 DNA 在 102-107 浓度范围内, 都有很好的线性关系, 灵敏度高可达到 100 拷贝 /μl。
3、 重复性、 准确性和特异性 : 通过对 ECTV-Mos 的保守基因 EVM170 的同源性分析, 本发明中的引物和探针根据其同源性序列设计, 且与小鼠基因组无同源性, 检测特异性强, 重复性好 ;
4、 回收率高 : 行业内通用标准要求检测方法的同收率要达到 50%以上, 本发明实 时荧光定量 PCR 方法回收率均达到了 80%以上, 是一种理想的可替代现有药典规定的检测 方法。 附图说明
图 1 为阳性定量标准品质粒的结构示意图 ; 图 2 为实时荧光定量 PCR 定量曲线 ; 图 3 为实时荧光定量 PCR 标准曲线。具体实施方式
以下所举实施例只用于解释本发明, 并非用于限定本发明的保护范围。
下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外, 均为市售的常见原料, 试剂的配 制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作, 详见 《分子克隆》 第三版。
实施例 1 小鼠脱脚病病毒专用引物和探针的设计
根据文献 (David J.Esteban et al., 2005), 对 ECTV-Mos 的基因组进行分析, 并结 合文献 (Gloria Ribas et al., 2003), 选择 ECTV-Mos 的保守基因 EVM170( 即 crmD 基因 ) 进行 ECTV 同源性分析。将该基因序列与 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 数据库进行序列比对, 及 与小鼠基因组数据库进行序列比对, 确定同源序列如下 : 即 SEQ ID NO : 4 所示核苷酸序列。针对找出的保守的同源序列区域设计实时荧光定量 PCR 检测专用引物和探针序 列, 扩增出的目的片段大小为 119 碱基。其中优选的引物、 探针序列为 :
上游引物 : 5’ -TGACTCATTCCTGTAATACCACTTCTAATAC-3’ , 即 SEQID NO : 1 所示核苷 酸序列 ;
下游引物 : 5’ -ACTGCTACATTTGCCTCGACAA-3’ , 即 SEQ ID NO : 2 所示核苷酸序列 ;
所述探针 : 5’ -TCCATTCCTAATCATAGTCCCGCGTGTCT-3’ , 即 SEQID NO : 3 所示核苷酸 序列 ;
所述探针的 5’ 端用荧光报告基团 FAM 标记, 3’ 端用荧光淬灭基团 TAMRA 标记。
用设计的引物、 探针进行同源性比对后发现其只对脱脚病病毒具有高度保守型, 与小鼠基因组 /EST、 及其他近缘病毒不同源, 其特异性较高。
实施例 2 阳性定量标准品的制备
合成 SEQ ID NO : 4 所示核苷酸序列, 并将其插入 pMA-T 载体上制备而成 ( 由 Invitrogen 公司合成 ), 命名为 pMA-T-EV, 图谱如图 1 所示。pMA-T-EV 质粒全长共 2854b, 6 分子量 1.88×10 Da, 计算可得, 1μg 质粒= 3.2×1011copies。
将含 pMA-T-EV 质粒的甘油菌 (Invitrogen 公司提供 ) 在 LB 培养基 ( 含 100ng/ ml Amp) 中 37℃过夜震荡培养后, 用质粒小提试剂盒 (QIAgen 公司提供 ) 提取 pMA-T-EV 质 粒, 紫外吸光法定量并计算拷贝数, 稀释至 108copies/μl 作为阳性定量标准品, 分装保存 于 -80℃备用。
实施例 3 实时荧光定量 PCR 扩增方法的建立
1、 实时荧光定量 PCR 模板制备——总 DNA 提取 :
根据使用说明, 分别用 Trizol/Trizol LS 试剂盒 (Invitrogen 公司提供 ) 提取样 品 DNA, 具体方法如下 :
1) 向样品 ( 如为组织需研磨匀浆 ) 中加入适量 TRIzol//Trizol LS, 混匀, 室温静 置 5min ;
2) 加入氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 溶液 200ul, 用 vortex 剧烈混匀 10s。室温放置 5min ;
3)4℃ 15000prm 离心 15min。尽量吸尽上清, 弃上清 ;
4) 中间层和有机层加入 0.5mlDNA 回收液, 混匀, 室温静置 10min ;
5)4℃ 15000prm 离心 15min ;
6) 转移上清, 加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1), 震荡混匀 ;
7) 转移上清至新管, 加入 0.8 倍体积异丙醇, 室温静置 5min ;
8)4℃ 15000prm 离心 15min, 弃上清, 加入预冷的 75%乙醇 1ml 洗 DNA 沉淀 ;
9)4℃ 15000prm 离心 10min ;
10) 用移液枪将上清尽量去除干净, 真空干燥 5 ~ 10min ;
11) 用 100ulTE 溶解沉淀。
2、 实时荧光定量 PCR 反应体系
本发明人以阳性定量标准品 pMA-T-EV 为模板, 对探针、 引物的不同组合进行摸 索, 最终确定了探针和引物的最佳组合 : 20μl 反应体系中 10μM 探针 0.4μl、 10μM 上下 游引物各 0.6μl。具体地, 进行样品测定时, 以总 DNA 为模板, 进行实时荧光定量 PCR, 其中反应体系 反应体系 (20μl) :为:
3、 实时荧光定量 PCR 反应条件以上述反应体系进行实时荧光定量 PCR, 对反应程序中的退火温度进行摸索, 确定 最佳退火温度为 62℃。
具体反应条件为 :
50℃, 2min ; 95℃, 10min ; 95℃, 15s, 62℃, 1min, 共 40 个循环。每个循环结束后采 集数据, 反应结束后根据扩增曲线判定结果。
实施例 4 方法学验证
1、 标准曲线的建立及实时荧光定量 PCR 的灵敏度
以 pMA-T-EV 稀释至 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107copies/μl 为模板, 按照实施例 3 中的反应体系和反应条件进行实时荧光定量 PCR 反应, 随着 PCR 体系的每一个循环结束后 测定吸光值, 就得到了以循环数为横坐标, 吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的 对数值为横坐标, Ct 为纵坐标的标准曲线。其中, Ct 值的含义是 : 每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数。
本发明实时荧光定量 PCR 的检测低限 : 在 40 个循环内出现可信 Ct 值的稀释低限, 当每差 10 倍模板量, Ct 值相差 3.3 的 Ct 值被认为是可信的 Ct 值, 由图 2 所示的定量曲线 可得出, 该实时荧光定量 PCR 的灵敏度可达到 100copies/μl。
研究表明, 每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 起始拷 贝数越多, Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的阳性定量标准品作出标准曲线, 其中横坐标 代表起始拷贝数的对数, 纵坐标代 Ct 值。因此, 只要获得未知样品的 Ct 值, 即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。
标准曲线如图 3 所示, 标准曲线 R2 = 0.995, 线性相关性良好。
2、 实时荧光定量 PCR 的重复性、 准确性和特异性
将阳性定量标准品 pMA-T-EV 分别稀释至浓度为 106、 104、 102copies/μl 作为为高 中低值质控, 以无病小鼠 DNA 为阴性对照 ( 阴性质控品 ), 以 ddH2O 为空白对照, 进行实时荧 光定量 PCR, 测量结果如下表 1 :表1
由上述结果可知,1) 空白对照成立, 实验结果有效 ; 无病小鼠 DNA 检测结果为阴性 ;
阳性定量标准品检测结果均为阳性, 故说明本检测方法具有很强的特异性 ;
2)3 次实验标准偏差在 15%以内, 说明本发明重复性好, 精密度符合要求 ;
3) 准确度符合要求。
3、 回收率实验
取 4 份小鼠肝脏组织 ( 编号 1-4) 和 4 份市售苏肽生 ( 编号 4-8, 溶解后的注射 8 6 4 液 ), 将阳性定量标准品 pMA-T-EV 稀释至浓度 10 、 10 、 10 copies/μl, 按下表 2 配比配制 供试样品 ( 模拟阳性样品 )。
表 2 供试样品配制
按实施例 3 中的提取方法提取 DNA, 作为 PCR 反应的模板, 然后按实施例 3 的反应 体系和条件进行实时荧光定量 PCR 反应, 其中空白对照以 ddH2O 为模板, 三次重复结果如表 3 所示, 计算该方法的回收率。
表3
实施例 5 小鼠脱脚病病毒的实时荧光检测试剂盒
将上述用于对小鼠脱脚病病毒进行实时荧光定量 PCR 检测的上下游引物探针混 合液 500μl, Taqman Gene Expression Master MiX 10ml, 阳性定量标准品 (1×107copies/ μl)50μl 及稀释液 10ml, 阴性对照品 25μl, 无菌 ddH2O 10ml 共同包装, 得到小鼠脱脚病 病毒的实时荧光检测试剂盒。
该试剂盒使用方法 :
以按实施例 3-1 中提取的样品总 DNA 作为模板, 阳性定量标准品 1×107copies/ μl 作为阳性对照模板, 同时使用阴性对照、 ddH2O 空白对照, 按照实施例 3-2 的反应体系和 实施例 3-3 的反应条件进行实时荧光定量 PCR, 同时参照实施例 4-1 的方法将阳性定量标准 品稀释为不同浓度进行实时荧光定量 PCR 制作标准曲线。
结果分析, 当阳性对照、 阴性对照、 空白对照都正常时, 只要获得未知样品的 Ct 值, 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例, 并不用以限制本发明, 凡在本发明的精神和 原则之内, 所作的任何修改、 等同替换、 改进等, 均应包含在本发明的保护范围之内。
背景技术 自然感染实验动物的病毒很多, 根据对人类的危害性, 可将其分为三类 ; 一类为人 兽共患病病毒, 能够感染人与灵长类动物 ; 二类目前尚无迹象表明感染人, 但能在体外培养 的人、 猿和猴源性细胞中进行复制, 对人类有潜在危险性 ; 三类病毒在自然条件下仅感染动 物本身, 目前尚无迹象表明能够感染人, 因此对人类威胁不大。
现今, 小鼠作为单克隆抗体、 蛋白类药物等生物制品的一个主要来源, 具有潜在的 病毒污染。在 《中华人民共和国药典 (2010 年版 )》 三部中, 规定了鼠源性生物制品需质检 的 8 种鼠源病毒, 其中小鼠脱脚病病毒属于 II 类, 目前尚无迹象表明感染人, 但能在体外培 养的人、 猿和猴源性细胞中进行复制, 对人类有潜在危险性。 鼠源性病毒检测标准的制定对 客观评价生物制品质量, 确保人民健康必将起到积极的作用。
小鼠脱脚病病毒也叫鼠痘病毒 (poxvirus of mice, MPV), 能引起鼠痘。鼠痘多呈 爆发性流行, 致死率较高, 常造成小鼠全群淘汰, 危害极大。临床表现以四肢、 尾和头部肿 胀、 溃烂、 坏死甚至脚趾脱落为特征, 故鼠痘病毒又称脱脚病病毒 (ectromelis virus, 以下 将此病毒简称为 EV)。 该病在世界各地的实验室鼠群中广泛流行, 在我国鼠群中呈散发性流 行。
药典规定的鼠源病毒检测方法有 : 细胞试验、 动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。 这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染, 检测手段复杂费时, 周期长, 且对操 作的实验室有一定要求, 不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。
而 目 前 发 展 十 分 成 熟 的 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 (Real-time Fluorence Quantitative Polymerase Chain Reaction 简称 Real Time PCR) 检测灵敏度高, 简单方 便, 且对实验室要求也很低。 Real Time PCR 于 1996 年由美国 Applied biosystems 公司推 出, 是在 PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程, 使每一 个循环变得 “可见” , 最后通过 Ct 值和标准曲线对样品中的 DNA(orcDNA) 的起始浓度进行定 量分析的方法。该方法自产生以来, 不断发展完善, 特别是随着 Taqman 荧光探针的广泛应 用, 到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman 荧光探针的 PCR 检测是指进行 PCR 扩增时, 在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针, 该探针为一寡核苷酸, 两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时, 报告基因所发射的 荧光信号被淬灭基因吸收, 扩增时随着 Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针, 其 -3’ 外切核酸酶活性将探针酶切降解, 报告荧光基团与淬灭荧光基团分离, 从而荧光检测 5’ 系统可以监测到荧光信号, 模板每复制一次, 就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释 放。由于被释放的荧光基团数目和 PCR 产物数量是一对一关系, 所以信号累积与 PCR 产物 完全同步。 整个反应结束后, 便可得到一条扩增曲线, 由已知浓度标准样品的扩增曲线可以
得到一条标准曲线, 根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。
实时荧光定量 PCR 技术不仅实现了对 DNA/RNA 模板的定量, 而且具有灵敏度和特 异性高、 能实现多重反应、 自动化程度高、 无污染、 实时和准确等特点, 该已被广泛用于免疫 分析、 细菌、 病毒检测等多个领域。迄今为止, 实时荧光定量 PCR 技术检测小鼠脱脚病病毒 方面还未见有报道, 无疑有着很广阔的发展空间。 发明内容 为了解决现有小鼠脱脚病病毒检测方法的不足, 本发明提供了一种实时荧光定量 PCR 检测小鼠脱脚病病毒的引物、 探针及其方法, 该方法简单方便、 灵敏度高且检测时间短。
本发明的一个目的是提供一对用于检测小鼠脱脚病病毒的引物。
本发明提供的引物, 是由具有序列表中的 SEQ ID NO : 1 的上游引物与具有序列表 中的 SEQ ID NO : 2 的下游引物组成的一对寡核苷酸。
序列表中的 SEQ ID NO : 1 由 31 个碱基组成 ; 序列表中的 SEQ IDNO : 2 由 22 个碱 基组成。
本发明人设计了多对 PCR 引物, 经过长期大量的实验众多引物对中筛选出了由上 述上游引物和下游引物组成的引物对。其扩增片断大小为 119bp。该引物对小鼠脱脚病病 毒具有高度的保守性, 且与小鼠基因组不具有显著的同源性, 使用该引物进行 PCR 扩增, 可 实现准确定性、 定量检测。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测小鼠脱脚病病毒的探针, 所述探针具有 序列表中的 SEQ ID NO : 3 的核苷酸序列, 所述探针 5’ 端连接有荧光报告基团, 3’ 端连接有 荧光淬灭基团。
所述探针中荧光报告基团可选自 FAM、 JOE、 HEX 中的任意一种, 优选为 FAM ; 所述荧 光淬灭基团选自 TAMRA 或 Eclipse, 优选为 TAMRA。
所述序列表中的 SEQ ID NO : 3 由 29 个碱基组成。
本发明的再一个目的是提供一种检测小鼠脱脚病病毒的方法, 所述方法以样品 DNA 为模板, 使用上述提及引物及探针进行的实时荧光定量 PCR 检测方法。
优选地, 所述实时荧光定量 PCR 的反应体系还包括脱脚病病毒核酸 PCR 扩增试剂、 阳性定量标准品、 阴性质控品、 空白对照。
优选地, 所述实时荧光定量 PCR 的退火温度为 62℃。
优选地, 所述实时荧光定量 PCR 的反应条件为 : 50 ℃, 2min ; 95 ℃, 10min ; 95 ℃, 15s, 62℃, 1min, 共 40 个循环。
优选地, 所述方法还包括标准曲线的建立, 方法为 : 用含序列表中 SEQ ID NO : 4所 示的碱基同源序列的 pMA-T 重组质粒作为阳性定量标准品, 将其十倍稀释成不同浓度的阳 性定量标准品, 以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光定量 PCR 检测, 得到检测生 小鼠脱脚病病毒残留的标准曲线。
本发明的又一个目的是提供一种检测小鼠脱脚病病毒的试剂盒, 所述试剂盒含上 述提及的引物及探针。
优选地, 所述试剂盒的反应体系还包括脱脚病病毒核酸 PCR 扩增试剂、 阳性定量 标准品、 阴性质控品、 空白对照。
优选地, 所述 PCR 扩增试剂为 2×Taqman PCR Mix。
优选地, 所述阳性定量标准品为含序列表中 SEQ ID NO : 4 所示的碱基同源序列的 pMA-T 重组质粒。
本发明的还一个目的是提供上述提及的引物或探针在检测鼠源生物制品中脱脚 病病毒残留时的应用。
与现有检测方法相比, 本发明提供的荧光定量 PCR 方法检测小鼠脱脚病病毒具有 以下优点 :
1、 简单快速 : 现有的药典小鼠脱脚病病毒检测方法为 : 细胞试验、 动物抗体产生 实验和鸡胚感染实验, 从生物学效应角度检测生物制品中小鼠脱脚病病毒的潜在感染, 需 时长 (1-4 周时间 ), 而本发明从核酸角度对脱脚病病毒进行检测, 只需要 6 小时左右即可出 结果, 且对操作实验室环境要求不高, 规避了以前抽检产品可能产生的漏洞, 可在企业实现 批批检测, 进一步提高了生物制品质控质量。
2、 灵敏度高 : 现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠脱脚病病毒 的潜在感染, 其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理, 残留鼠源病毒的活病 毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小, 而本发明从病毒核酸角度进行检测, 相对前述药典 规定方法而言, 提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光定量 PCR 检测生物制品中 小鼠脱脚病病毒时, 可以准确定量, 目标 DNA 在 102-107 浓度范围内, 都有很好的线性关系, 灵敏度高可达到 100 拷贝 /μl。
3、 重复性、 准确性和特异性 : 通过对 ECTV-Mos 的保守基因 EVM170 的同源性分析, 本发明中的引物和探针根据其同源性序列设计, 且与小鼠基因组无同源性, 检测特异性强, 重复性好 ;
4、 回收率高 : 行业内通用标准要求检测方法的同收率要达到 50%以上, 本发明实 时荧光定量 PCR 方法回收率均达到了 80%以上, 是一种理想的可替代现有药典规定的检测 方法。 附图说明
图 1 为阳性定量标准品质粒的结构示意图 ; 图 2 为实时荧光定量 PCR 定量曲线 ; 图 3 为实时荧光定量 PCR 标准曲线。具体实施方式
以下所举实施例只用于解释本发明, 并非用于限定本发明的保护范围。
下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外, 均为市售的常见原料, 试剂的配 制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作, 详见 《分子克隆》 第三版。
实施例 1 小鼠脱脚病病毒专用引物和探针的设计
根据文献 (David J.Esteban et al., 2005), 对 ECTV-Mos 的基因组进行分析, 并结 合文献 (Gloria Ribas et al., 2003), 选择 ECTV-Mos 的保守基因 EVM170( 即 crmD 基因 ) 进行 ECTV 同源性分析。将该基因序列与 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 数据库进行序列比对, 及 与小鼠基因组数据库进行序列比对, 确定同源序列如下 : 即 SEQ ID NO : 4 所示核苷酸序列。针对找出的保守的同源序列区域设计实时荧光定量 PCR 检测专用引物和探针序 列, 扩增出的目的片段大小为 119 碱基。其中优选的引物、 探针序列为 :
上游引物 : 5’ -TGACTCATTCCTGTAATACCACTTCTAATAC-3’ , 即 SEQID NO : 1 所示核苷 酸序列 ;
下游引物 : 5’ -ACTGCTACATTTGCCTCGACAA-3’ , 即 SEQ ID NO : 2 所示核苷酸序列 ;
所述探针 : 5’ -TCCATTCCTAATCATAGTCCCGCGTGTCT-3’ , 即 SEQID NO : 3 所示核苷酸 序列 ;
所述探针的 5’ 端用荧光报告基团 FAM 标记, 3’ 端用荧光淬灭基团 TAMRA 标记。
用设计的引物、 探针进行同源性比对后发现其只对脱脚病病毒具有高度保守型, 与小鼠基因组 /EST、 及其他近缘病毒不同源, 其特异性较高。
实施例 2 阳性定量标准品的制备
合成 SEQ ID NO : 4 所示核苷酸序列, 并将其插入 pMA-T 载体上制备而成 ( 由 Invitrogen 公司合成 ), 命名为 pMA-T-EV, 图谱如图 1 所示。pMA-T-EV 质粒全长共 2854b, 6 分子量 1.88×10 Da, 计算可得, 1μg 质粒= 3.2×1011copies。
将含 pMA-T-EV 质粒的甘油菌 (Invitrogen 公司提供 ) 在 LB 培养基 ( 含 100ng/ ml Amp) 中 37℃过夜震荡培养后, 用质粒小提试剂盒 (QIAgen 公司提供 ) 提取 pMA-T-EV 质 粒, 紫外吸光法定量并计算拷贝数, 稀释至 108copies/μl 作为阳性定量标准品, 分装保存 于 -80℃备用。
实施例 3 实时荧光定量 PCR 扩增方法的建立
1、 实时荧光定量 PCR 模板制备——总 DNA 提取 :
根据使用说明, 分别用 Trizol/Trizol LS 试剂盒 (Invitrogen 公司提供 ) 提取样 品 DNA, 具体方法如下 :
1) 向样品 ( 如为组织需研磨匀浆 ) 中加入适量 TRIzol//Trizol LS, 混匀, 室温静 置 5min ;
2) 加入氯仿∶异戊醇 (24 ∶ 1) 溶液 200ul, 用 vortex 剧烈混匀 10s。室温放置 5min ;
3)4℃ 15000prm 离心 15min。尽量吸尽上清, 弃上清 ;
4) 中间层和有机层加入 0.5mlDNA 回收液, 混匀, 室温静置 10min ;
5)4℃ 15000prm 离心 15min ;
6) 转移上清, 加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1), 震荡混匀 ;
7) 转移上清至新管, 加入 0.8 倍体积异丙醇, 室温静置 5min ;
8)4℃ 15000prm 离心 15min, 弃上清, 加入预冷的 75%乙醇 1ml 洗 DNA 沉淀 ;
9)4℃ 15000prm 离心 10min ;
10) 用移液枪将上清尽量去除干净, 真空干燥 5 ~ 10min ;
11) 用 100ulTE 溶解沉淀。
2、 实时荧光定量 PCR 反应体系
本发明人以阳性定量标准品 pMA-T-EV 为模板, 对探针、 引物的不同组合进行摸 索, 最终确定了探针和引物的最佳组合 : 20μl 反应体系中 10μM 探针 0.4μl、 10μM 上下 游引物各 0.6μl。具体地, 进行样品测定时, 以总 DNA 为模板, 进行实时荧光定量 PCR, 其中反应体系 反应体系 (20μl) :为:
3、 实时荧光定量 PCR 反应条件以上述反应体系进行实时荧光定量 PCR, 对反应程序中的退火温度进行摸索, 确定 最佳退火温度为 62℃。
具体反应条件为 :
50℃, 2min ; 95℃, 10min ; 95℃, 15s, 62℃, 1min, 共 40 个循环。每个循环结束后采 集数据, 反应结束后根据扩增曲线判定结果。
实施例 4 方法学验证
1、 标准曲线的建立及实时荧光定量 PCR 的灵敏度
以 pMA-T-EV 稀释至 101、 102、 103、 104、 105、 106、 107copies/μl 为模板, 按照实施例 3 中的反应体系和反应条件进行实时荧光定量 PCR 反应, 随着 PCR 体系的每一个循环结束后 测定吸光值, 就得到了以循环数为横坐标, 吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的 对数值为横坐标, Ct 为纵坐标的标准曲线。其中, Ct 值的含义是 : 每个反应管内的荧光信 号到达设定的域值时所经历的循环数。
本发明实时荧光定量 PCR 的检测低限 : 在 40 个循环内出现可信 Ct 值的稀释低限, 当每差 10 倍模板量, Ct 值相差 3.3 的 Ct 值被认为是可信的 Ct 值, 由图 2 所示的定量曲线 可得出, 该实时荧光定量 PCR 的灵敏度可达到 100copies/μl。
研究表明, 每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 起始拷 贝数越多, Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的阳性定量标准品作出标准曲线, 其中横坐标 代表起始拷贝数的对数, 纵坐标代 Ct 值。因此, 只要获得未知样品的 Ct 值, 即可从标准曲 线上计算出该样品的起始拷贝数。
标准曲线如图 3 所示, 标准曲线 R2 = 0.995, 线性相关性良好。
2、 实时荧光定量 PCR 的重复性、 准确性和特异性
将阳性定量标准品 pMA-T-EV 分别稀释至浓度为 106、 104、 102copies/μl 作为为高 中低值质控, 以无病小鼠 DNA 为阴性对照 ( 阴性质控品 ), 以 ddH2O 为空白对照, 进行实时荧 光定量 PCR, 测量结果如下表 1 :表1
由上述结果可知,1) 空白对照成立, 实验结果有效 ; 无病小鼠 DNA 检测结果为阴性 ;
阳性定量标准品检测结果均为阳性, 故说明本检测方法具有很强的特异性 ;
2)3 次实验标准偏差在 15%以内, 说明本发明重复性好, 精密度符合要求 ;
3) 准确度符合要求。
3、 回收率实验
取 4 份小鼠肝脏组织 ( 编号 1-4) 和 4 份市售苏肽生 ( 编号 4-8, 溶解后的注射 8 6 4 液 ), 将阳性定量标准品 pMA-T-EV 稀释至浓度 10 、 10 、 10 copies/μl, 按下表 2 配比配制 供试样品 ( 模拟阳性样品 )。
表 2 供试样品配制
按实施例 3 中的提取方法提取 DNA, 作为 PCR 反应的模板, 然后按实施例 3 的反应 体系和条件进行实时荧光定量 PCR 反应, 其中空白对照以 ddH2O 为模板, 三次重复结果如表 3 所示, 计算该方法的回收率。
表3
实施例 5 小鼠脱脚病病毒的实时荧光检测试剂盒
将上述用于对小鼠脱脚病病毒进行实时荧光定量 PCR 检测的上下游引物探针混 合液 500μl, Taqman Gene Expression Master MiX 10ml, 阳性定量标准品 (1×107copies/ μl)50μl 及稀释液 10ml, 阴性对照品 25μl, 无菌 ddH2O 10ml 共同包装, 得到小鼠脱脚病 病毒的实时荧光检测试剂盒。
该试剂盒使用方法 :
以按实施例 3-1 中提取的样品总 DNA 作为模板, 阳性定量标准品 1×107copies/ μl 作为阳性对照模板, 同时使用阴性对照、 ddH2O 空白对照, 按照实施例 3-2 的反应体系和 实施例 3-3 的反应条件进行实时荧光定量 PCR, 同时参照实施例 4-1 的方法将阳性定量标准 品稀释为不同浓度进行实时荧光定量 PCR 制作标准曲线。
结果分析, 当阳性对照、 阴性对照、 空白对照都正常时, 只要获得未知样品的 Ct 值, 即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
以上所述仅为本发明的较佳实施例, 并不用以限制本发明, 凡在本发明的精神和 原则之内, 所作的任何修改、 等同替换、 改进等, 均应包含在本发明的保护范围之内。
9102329889 A CN 102329899
序列表1/2 页
10102329889 A CN 102329899序列表2/2 页