《斜纹夜蛾基因工程病毒3号及其构建方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《斜纹夜蛾基因工程病毒3号及其构建方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN102329783A43申请公布日20120125CN102329783ACN102329783A21申请号201110216417822申请日20110730CCTCCNOV20111620110520C12N7/01200601C12N15/63200601C12R1/9320060171申请人苏州大学地址215123江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号72发明人朱江浦冠勤郭大磊王文兵汤欣欣孙兴鲁秦启联74专利代理机构苏州创元专利商标事务所有限公司32103代理人陶海锋54发明名称斜纹夜蛾基因工程病毒3号及其构建方法57摘要本发明公开了一种斜纹夜蛾基因工程病毒3号及其构。
2、建方法，是一种利用基因工程方法对野生型病毒SPLTMNPV进行缺失和重组的斜纹夜蛾基因工程病毒。其基因组中缺失了EGT基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失EGT基因的位点处，插入由野生型病毒即早期基因1IE1启动子控制的东亚钳蝎毒BMKITA1基因和由野生型病毒多角体蛋白基因PH启动子控制的标记基因增强型绿色荧光蛋白EGFP基因。本发明比野生型病毒具有更快的杀虫速度、更少的剂量效应和更好的田间应用效果等优点。与现有技术相比，本发明提供的斜纹夜蛾基因工程病毒有更少的剂量效应和低剂量105个多角体/条幼虫时较低的LT50。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局。
3、12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图2页CN102329793A1/1页21一种斜纹夜蛾基因工程病毒，其特征是对野生型病毒SPLTMNPV进行缺失和重组得到的斜纹夜蛾基因工程病毒3号，其保藏信息为保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏编号CCTCCNOV201116；分类命名斜纹夜蛾基因工程病毒3号SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1；在其基因组中缺失了EGT基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失EGT基因的位点处，插入由野生型病毒即早期基因IE1启动子控制的东亚钳蝎毒BMKITA1基因和由野生型病毒多角体蛋白基因PH启动子控制的标记基因即增强型绿色荧光。
4、蛋白EGFP基因。2一种构建如权利要求1所述的斜纹夜蛾基因工程病毒3号（SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1）的方法，其特征在于包括以下步骤（1）构建重组质粒PSKEGTPPHEGFP以SPLTMNPVDNA为模板，分别扩增出同源重组臂EGT上游非编码端序列EGTUP和EGT3端的1055BP序列以及下游非编码端序列EGTDOWN；扩增产物回收纯化后分别经KPNI/XHOI，XBAI/SACI双酶切后依次克隆到载体PBLUESCRIPTSK上，获得中间质粒PSKEGTUPEGTDOWN；在上述两个片段之间，利用分子克隆技术插入SPLTMNPV多角体蛋白基因启动子启动PPH。
5、控制的增强型绿色荧光蛋白基因EGFP，获得重组质粒PSKEGTPPHEGFP；（2）构建重组转移载体PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1在BMKITA1基因前引入ACMNPVBV膜融合蛋白GP64的同系物，SPLTMNPVF蛋白的信号肽SIGNALP序列，以SPLTMNPVDNA为模板，扩增出SIGNALP序列，并克隆到PBACPAK8上得到PBACPAK8SIGNALP；将ACMNPV的即早期基因IE1启动子克隆到PBACPAK8SIGNALP中，得到中间质粒PBACPAK8PIE1SIGNALP；以PMD18BMKITA1为模板，PCR扩增出BMKITA1片段并克隆到PBACP。
6、AK8PIE1SIGNALP中，得到PBACPAK8PIE1SIGNALPBMKITA1；以SMAI和XBAI双酶切，切下PIE1SIGNALPBMKITA1片段并插入到PSKEGTPPHEGFP中EGFP基因和EGT3非编码端之间，得到重组转移载体PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1；（3）共转染、纯化，得到基因工程病毒SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1将PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1和SPLTMNPV基因组DNA共转染斜纹夜蛾SPLI细胞，通过基因等位交换，获缺失EGT基因的，以绿色荧光蛋白为标记的，病毒感染早期能表达BMKITA1的重。
7、组病毒SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1；经多轮荧光斑法纯化，得到纯的重组斜纹夜蛾基因工程病毒3号SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1。权利要求书CN102329783ACN102329793A1/5页3斜纹夜蛾基因工程病毒3号及其构建方法技术领域0001本发明涉及一种能够防治斜纹夜蛾等农林害虫的斜纹夜蛾基因工程病毒，属微生物技术领域。背景技术0002斜纹夜蛾是农作物的主要害虫之一，我国各省区均有分布。该虫食性极广，已知可危害的寄主植物达99科290多种。近年来随着农业耕作制度的改变和城市化进程的快速发展，蔬菜、花卉、绿化草坪等旱地作物的种植面积越。
8、来越多，斜纹夜蛾的为害也日益猖獗。当前生产上采用的化学防治往往达不到预期效果，而且容易造成环境污染、农药残留和人畜中毒等。0003随着国民经济的不断发展和人民生活水平的日益提高，人们对于各种农产品的质量要求越来越高，特别是产品的安全性问题已受到广泛的关注和重视。目前，在各种农作物病虫害的防治工作中，过度依赖化学农药的情况仍然十分严重，由此带来了害虫抗性、再猖獗和环境污染等问题，直接影响到人类的食品安全和生存环境。因此，大力发展高效、广谱、与环境相容性好的无公害生物农药是农业可持续发展的需要。0004斜纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒SPODOPTERALITURAMULTICAPSIDNUCLEO。
9、POLYHEDROVIRUS，以下简称野生型病毒或SPLTMNPV已用于斜纹夜蛾的防治。但由于它存在杀虫速度慢的缺陷，影响了其推广应用。为了改变野生型昆虫杆状病毒杀虫速度慢的缺陷，上世纪90年代以来，国内外已有多种重组昆虫杆状病毒问世，如文献报道了美国的重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒RACMNPVSTEWARTLMDETAL1991NATURE,3528588、中国发明专利（CN1109105C）公开的重组棉铃虫核型多角体病毒RHASNPV等。但迄今为止，国内外尚未见插入昆虫神经毒素基因的斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒构建成功。发明内容0005本发明的目的是提供一种能有效提高野生病毒杀虫速度和。
10、效果的斜纹夜蛾核型多角体基因工程病毒及其构建方法。0006本发明的目的是按下述方案实现的一种斜纹夜蛾基因工程病毒，对野生型病毒SPLTMNPV进行缺失和重组得到，其保藏信息为保藏单位中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址中国武汉武汉大学；保藏日期2011年5月20日；保藏编号CCTCCNOV201116；分类命名斜纹夜蛾基因工程病毒3号SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1；在其基因组中缺失了EGT基因即蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因，在缺失EGT基因的位点处，插入由野生型病毒即早期基因（IE1）启动子控制的东亚钳蝎毒BMKITA1基因和由野生型病毒多角体蛋白基因PH启。
11、动子控制的标记基因即增强型绿色荧光蛋白EGFP基因。0007提供一种构建上述基因工程病毒的方法，包括以下步骤说明书CN102329783ACN102329793A2/5页4（1）构建重组质粒PSKEGTPPHEGFP以具有毒力的野生病毒SPODOPTERALITURANUCLEOPOLYHEDROVIRUS,SPLTMNPV,GENBANK登录号NC011616SPLTMNPVDNA为模板，分别扩增出同源重组臂EGT上游非编码端序列EGTUP和EGT3端的1055BP序列以及下游非编码端序列EGTDOWN；扩增产物回收纯化后分别经KPNI/XHOI，XBAI/SACI双酶切后依次克隆到载体PB。
12、LUESCRIPTSK上，获得中间质粒PSKEGTUPEGTDOWN；在上述两个片段之间，利用分子克隆技术插入SPLTMNPV多角体蛋白基因启动子启动PPH控制的增强型绿色荧光蛋白基因EGFP，获得重组质粒PSKEGTPPHEGFP；（2）构建重组转移载体PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1在BMKITA1基因前引入ACMNPVBV膜融合蛋白GP64的同系物，SPLTMNPVF蛋白的信号肽SIGNALP序列，以SPLTMNPVDNA为模板，扩增出SIGNALP序列，并克隆到PBACPAK8上得到PBACPAK8SIGNALP；将ACMNPV的即早期基因IE1启动子克隆到PBACPA。
13、K8SIGNALP中，得到中间质粒PBACPAK8PIE1SIGNALP；以PMD18BMKITA1为模板，PCR扩增出BMKITA1片段并克隆到PBACPAK8PIE1SIGNALP中，得到PBACPAK8PIE1SIGNALPBMKITA1；以SMAI和XBAI双酶切，切下PIE1SIGNALPBMKITA1片段并插入到PSKEGTPPHEGFP中EGFP基因和EGT3非编码端之间，得到重组转移载体PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1；（3）共转染、纯化，得到基因工程病毒SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1将PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1。
14、和SPLTMNPV基因组DNA共转染斜纹夜蛾SPLI细胞，通过基因等位交换，获缺失EGT基因的，以绿色荧光蛋白为标记的，病毒感染早期能表达BMKITA1的重组病毒SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1；经多轮荧光斑法纯化，得到纯的重组斜纹夜蛾基因工程病毒3号SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1CCTCCNOV201116。0008本发明通过基因工程方法，构建了重组斜纹夜蛾核型多角体病毒斜纹夜蛾基因工程病毒3号，该病毒由中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏号为V201116。与现有的野生病毒相比，本发明提供的工程病毒3号具有更快的杀虫速度、更少的剂。
15、量效应和更好的田间应用效果等优点。生物学活性测定结果表明，工程病毒3号对3龄斜纹夜蛾的半致死剂量LD50分别为野生病毒的646、工程病毒2号的301。在使用剂量为105个多角体/条幼虫的情况下，工程病毒3号对3龄斜纹夜蛾的半致死时间LT50比野生病毒缩短192085天、比工程病毒2号缩短了176076天。上述数据，充分反映了工程病毒3号具有早期表达东亚钳蝎毒BMKITA1的特点。田间试验结果表明，工程病毒3号比野生病毒的杀虫效果明显提高。附图说明0009图1是本发明提供的斜纹夜蛾基因工程病毒3号的结构示意图；图2是本发明提供的斜纹夜蛾基因工程病毒3号的构建过程示意图。说明书CN10232978。
16、3ACN102329793A3/5页5具体实施方式0010下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。0011实施例一参见附图1，它是本发明提供的一种斜纹夜蛾基因工程病毒，即斜纹夜蛾基因工程病毒3号的结构示意图；图中，EGT蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因；PPH多角体蛋白基因启动子；PIE1即早期基因启动子；SIGNALPSPLTMNPVF蛋白信号肽序列；BMKITA1东亚钳蝎毒基因；EGFP增强型绿色荧光蛋白基因。该重组病毒的标记基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，在工程病毒3号的纯化和增殖过程中均可通过绿色荧光蛋白产生的绿色荧光进行监测和鉴定。0012参见附图2，它是本实施例提供的斜纹夜。
17、蛾基因工程病毒3号的构建过程示意图，图中，EGT为蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因；PPH为多角体蛋白基因启动子；PIE1为即早期基因1启动子；SIGNALP为SPLTMNPVF蛋白信号肽序列；BMKITA1为东亚钳蝎毒基因；EGFP为增强型绿色荧光蛋白基因；EGT5为含EGT基因5端的上游序列；EGT3为含EGT基因3端的部分序列及其上游序列；PBLUESCRIPTSK为通用载体；PBACPAK8为通用载体；PBACPAK8PIE1SIGNALP为含PIE1和SIGNALP的中间载体；PBACPAK8PIE1SIGNALPBMKITA1为含PIE1、SIGNALP和BMKITA1的中间载。
18、体；PSKEGTPPHEGFP为含缺失EGT基因并插入由多角体蛋白基因启动EGFP基因的重组转移载体；PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1为含缺失EGT基因并插入由即早期基因IE1启动子启动的BMKITA1基因和由多角体蛋白基因启动子启动的EGFP基因的重组转移载体；SPLTMNPV为野生型病毒；SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1为缺失EGT基因并插入由即早期基因IE1启动子启动的BMKITA1基因和由多角体蛋白基因启动子启动的EGFP基因的斜纹夜蛾核型多角体病毒基因工程株，即斜纹夜蛾基因工程病毒3号。0013由图2可以看出，本发明提供的工程病毒3号其构建方。
19、法包括以下步骤1、构建重组质粒PSKEGTPPHEGFP以具有毒力的野生病毒SPODOPTERALITURANUCLEOPOLYHEDROVIRUS,SPLTMNPV,GENBANK登录号NC011616SPLTMNPVDNA为模板，分别扩增出同源重组臂EGT上游非编码端序列EGTUP和EGT3端的1055BP序列以及下游非编码端EGTDOWN。扩增产物回收纯化后分别经KPNI/XHOI，XBAI/SACI双酶切后依次克隆到载体PBLUESCRIPTIISK上。获得中间质粒PSKEGTUPEGTDOWN。0014在这两个片段之间，利用分子克隆技术插入SPLTMNPV多角体蛋白基因启动子启动（P。
20、PH）控制的增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP），获得重组质粒PSKEGTPPHEGFP。00152、在PSKEGTPPHEGFP的基础上构建重组转移载体PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1，构建过程具体如下1在BMKITA1基因前引入了ACMNPVBV膜融合蛋白GP64的同系物，SPLTMNPVFFUSION蛋白的信号肽（SIGNALP）序列，便于东亚钳蝎毒的分泌表达。以SPLTMNPVDNA为模板，扩增出SIGNALP序列，并克隆到PBACPAK8上得到PBACPAK8SIGNALP，然说明书CN102329783ACN102329793A4/5页6后将ACMNPV的即早期基因（。
21、IE1）启动子克隆到PBACPAK8SIGNALP中，得到中间质粒PBACPAK8PIE1SIGNALP。00162以PMD18BMKITA1为模板，PCR扩增出BMKITA1片段并克隆到PBACPAK8PIE1SIGNALP中，得到PBACPAK8PIE1SIGNALPBMKITA1。00173最后以SMAI和XBAI双酶切，切下PIE1SIGNALPBMKITA1片段并插入到PSKEGTPPHEGFP中EGFP基因和EGT3非编码端之间，得到重组转移载体PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1。00183、共转染、纯化，得到基因工程病毒SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1B。
22、MKITA1将PSKEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1和SPLTMNPV基因组DNA共转染斜纹夜蛾（SPLI）细胞，通过基因等位交换，获缺失EGT基因的，以绿色荧光蛋白为标记的，病毒感染早期能表达BMKITA1的重组病毒SPLTMNPVEGTPPHEGFPPIE1BMKITA1。通过多轮荧光斑法纯化，得到纯的重组病毒。0019本发明提供的工程病毒即斜纹夜蛾基因工程病毒3号，所提供的病毒培养物为昆虫病毒多角体，只能采用活体增殖。增殖方法以1106多角体/ML左右的浓度感染3龄斜纹夜蛾幼虫，然后置2728培养57天，收集病死虫。检测存活亦要求生物测定，即检测病毒感染斜纹夜蛾的活性。0020。
23、本发明提供的斜纹夜蛾基因工程病毒3号的鉴定方法如下1、利用限制性核酸内切酶初步鉴定该病毒的正确性；2、设计合适引物，利用聚合酶链反应PCR的方法进一步确定该病毒中EGT基因的大部分编码序列已被删除，外源基因BMKITA1和EGFP已正确插入。00213、设计合适引物，利用RTPCR方法可确认BMKITA1基因已转录。00224、分析该病毒的蜕皮激素尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶的活性，确定EGT基因已失活。00235、室内生物活性测定以及田间药效试验确定病毒的效果。0024本工程病毒可以通过虫体培养方法大批量增殖，配置成可湿性粉剂或悬乳剂等剂型病毒杀虫剂，用于农作物、蔬菜、花卉和草坪等植物上斜纹夜蛾。
24、的防治。该杀虫剂保留了野生斜纹夜蛾病毒杀虫剂不伤害天敌，对环境安全以及害虫不易产生抗药性等优点。0025表1是斜纹夜蛾基因工程病毒3号的生物学活性测定结果（使用剂量单位为个多角体/条幼虫）表1由表1生物学活性测定结果表明，工程病毒3号对3龄斜纹夜蛾的半致死剂量LD50分别为野生病毒的646、工程病毒2号的301。在使用剂量为105个多角体/条幼虫的说明书CN102329783ACN102329793A5/5页7情况下，工程病毒3号对3龄斜纹夜蛾的半致死时间LT50比野生病毒缩短192085天、比工程病毒2号缩短了176076天。表1数据充分反映了工程病毒3号具有早期表达东亚钳蝎毒BMKITA1的特点。0026表2是斜纹夜蛾基因工程病毒3号的大田生物测定结果（使用浓度为107个多角体/ML）。0027表2由表2的田间试验结果表明，工程病毒3号比野生病毒的杀虫效果明显提高。说明书CN102329783ACN102329793A1/2页8图1说明书附图CN102329783ACN102329793A2/2页9图2说明书附图CN102329783A。