一种桔霉素人工抗原的制备方法 技术领域 本发明属于免疫学技术领域， 涉及一种桔霉素与蛋白质载体大分子偶联制备人工 抗原的方法。
背景技术 桔霉素 (citrinin， 简称 CIT) 是一种真菌的次级代谢产物， 自然界中多种青霉和 曲霉都可以产生。 它的污染常发生在玉米、 小麦等食品及饲料中， 能直接或者间接进入食品 链， 威胁人或动物的健康和生命安全。 CIT 作用的靶器官是肾脏， 毒性较明显， 能引起实验动 物的肾脏肿大、 尿量增多、 肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状， 还可以致畸、 导致肿瘤、 诱发突变， 小鼠口服半数致死量 LD50 为 110mg/kg。
目前 CIT 的检测方法主要有比色法、 薄层层析法 (thin layer chromatography， 简称 TLC)、 高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography， 简称 HPLC) 和酶 联免疫吸附法 (enzyme-liked immunosorbent assay， 简称 ELISA)。前两种方法灵敏度达 不到限量检测的要求， 而高效液相色谱法的前处理比较复杂、 检测费用高、 费时费力。 ELISA 法的灵敏度高、 特异性好、 前处理简单、 检测成本低， 是目前使用最多的免疫学检测方法， 且 抗原和抗体是免疫分析技术的核心试剂和技术源头。由于 CIT 是小分子半抗原， 只具有反 应原性， 不具有免疫原性， 因此对其进行改造， 合成完全抗原是获得抗桔霉素抗体并且建立 免疫学检测的关键步骤， 但是目前几乎所有关于 CIT 的免疫学检测都是采用 Mannich 法合 成 CIT 的完全抗原， 但是此法制备 CIT 完全抗原存在偶联比低、 毒素利用率不高等特点。
发明内容
( 一 ) 要解决的技术问题
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足而提供一种 CIT- 载体蛋白偶联 物的合成方法。
( 二 ) 技术方案
为达到上述目的， 本发明采用的技术方案是 ：
将 CIT 的 羟 基 封 阻，使 其 羧 基 暴 露，经 N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 (N-Hydroxysuccinimide， 简 称 NHS) 和 N， N’ - 二 环 己 基 碳 酰 亚 胺 (N， N′ -dicyclohexylcarbodiimide， 简称 DCC) 的活化， 使之能与载体蛋白的氨基进行偶联。 附图说明
图 1CIT 结构 图 2CIT 与载体蛋白的偶联机理具体实施方式
实施例 18- 甲氧基 - 桔霉素 - 牛血清白蛋白 (8-MeO-CIT-BSA) 人工抗原的制备1.8- 甲氧基 - 桔霉素 (8-MeO-CIT) 的制备
将 1mg CIT 溶于 2.5mL 无水丙酮中， 在 N2 保护下加入等摩尔的 K2CO3 负载试剂和 (CH3)2SO4， 58℃避光回流反应 6h ； 将反应液溶液旋转蒸发， 溶于少量甲醇， 用二维薄层层析， 以甲苯、 乙酸乙酯、 甲酸 (7 ∶ 3 ∶ 1， v/v/v) 和氯仿、 甲醇、 正己烷 (32 ∶ 1 ∶ 17， v/v/v) 为 展开剂， 分离目标封阻产物 8-MeO-CIT。
2.8-MeO-CIT-BSA 人工抗原的制备
(1) 取 0.5mg 8-MeO-CIT 与等摩尔 NHS 和 DCC 溶于 200μL 无水四氢呋喃， 室温震 荡反应 2h。所得反应液 4000r/min 离心 15min， 以无水四氢呋喃洗涤固形物 2 ～ 3 次， 合并 上清， 待四氢呋喃挥发， 残留物溶于 100μL 二甲基甲酰胺。
(2) 取 5mg 牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin， BSA) 溶于 400μL 0.13M 的 NaHCO3。
(3) 将 (1) 所得缓慢滴入 (2)， 室温振荡反应 12h。反应体系溶液中即含偶联物 8- 甲氧基 - 桔霉素 - 牛血清白蛋白 (8-MeO-CIT-BSA)。
(4) 将 (3) 所得溶液置于 0.05mol/L pH 7.4 的 PBS 中透析 2d， 每间隔 4h 更换 1 次透析液， 然后再用去离子水透析 1d， 将透析袋中的溶液分装， 经冷冻干燥， 即得到桔霉素 人工抗原 8-MeO-CIT-BSA。 实施例 28- 甲氧基 - 桔霉素 - 卵清蛋白 (8-MeO-CIT-OVA) 人工抗原的制备
1.8-MeO-CIT 的制备 ：
将 1mg CIT 溶于 2.5mL 无水丙酮中， 在 N2 保护下加入等摩尔的 K2CO3 负载试剂和 (CH3)2SO4， 58℃避光回流反应 6h ； 将反应液溶液旋转蒸发， 溶于少量甲醇， 用二维薄层层析， 以甲苯、 乙酸乙酯、 甲酸 (7 ∶ 3 ∶ 1， v/v/v) 和氯仿、 甲醇、 正己烷 (32 ∶ 1 ∶ 17， v/v/v) 为 展开剂， 分离目标封阻产物 8-MeO-CIT。
2.8-MeO-CIT-OVA 人工抗原的制备 ：
(1) 取 0.5mg 8-MeO-CIT 与等摩尔 NHS 和 DCC 溶于 200μl 无水四氢呋喃， 室温震 荡反应 2h。所得反应液 4000r/min 离心 15min， 以无水四氢呋喃洗涤固形物 2 ～ 3 次， 合并 上清， 待四氢呋喃挥发， 残留物溶于 100μl 二甲基甲酰胺。
(2) 取 10mg 卵清蛋白 (ovalbumin， OVA) 置于 400μl 0.13M 的 NaHCO3， 尽量将其 溶解， 于 8000r/min 高速离心 10min， 取上清。
(3) 将 (1) 所得缓慢滴入 (2) 中所得上清， 室温振荡反应 12h。反应体系溶液中即 含人工抗原 8-MeO-CIT-OVA。
(4) 将 (3) 所得溶液置于 0.05mol/L PH 7.4 的 PBS 中透析 2d， 每间隔 4h 更换 1 次透析液， 然后再用去离子水透析 1d， 将透析袋中的溶液分装， 经冷冻干燥， 即得到桔霉素 人工抗原 8-MeO-CIT-OVA。
CIT- 载体蛋白偶联物的鉴定 ：
采用紫外分光光度计对载体蛋白、 CIT 标品及偶联物进行扫描， 根据其特征吸收峰 来确定偶联是否成功。
结果显示， CIT- 载体蛋白偶联物在可见光区有明显吸收峰出现， 与 CIT 的最大吸 收峰 (319nm) 相比有红移现象。根据可见分光光度法， 按以下公式， 可以计算出 CIT 与载体 蛋白的偶联比。
4102329389 A CN 102329399
278mn说/εCIT明书3/4 页公式 ： [Aconjugate319nm319nm]/[(Aconjugate278nm-Aconjugate319nm×εCIT278nm/εCIT319nm)/εprotein]Aconjugate 319nm ： 偶联物在 319nm 的吸光度 ；
Aconjugate 278nm ： 偶联物在 278nm 的吸光度 ；
εCIT 319nm ： CIT 在 319nm 处的摩尔消光系数 ；
εCIT 278nm ： CIT 在 278nm 处的摩尔消光系数 ；
εprotein 319nm ： 载体蛋白在 319nm 处的摩尔消光系数 ；
εprotein 278nm ： 载体蛋白在 278nm 处的摩尔消光系数。
经过计算， CIT 与载体蛋白的偶联比在 6 ∶ 1 左右， 证明成功制备了 CIT 完全抗原。
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