一种酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法.pdf

本发明涉及一种酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法，属于食品生物技术领域。本发明利用产β-甘露聚糖酶的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5保藏号CCTCC NO：M208258，进行发酵制备β-甘露聚糖酶，再利用所制备的β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备甘露寡糖，酶解条件50～55℃，50～70转/分钟搅拌，酶解20-30小时。可方便低廉地实现甘露寡糖的工业化生产，满足市场对甘露寡糖的需求。

1.  产β-甘露聚糖酶的菌株，该菌株是芽孢杆菌Bacillussp.MSJ-5，保藏号CCTCC NO：M208258，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

2.  一种酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法，步骤如下：
(1)菌株斜面培养
产β-甘露聚糖酶的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5，保藏号CCTCC NO：M208258，菌株斜面培养基：角豆胶1.0～1.2份，(NH₄)₂SO₄ 0.4～0.6份，K₂HPO₄·3H₂O 0.8～1.0份，琼脂1.2～1.5份，水100份，均为重量份；
(2)液体种子培养
液体种子培养基：酵母粉2.0～2.5份、麸皮1.0～1.2份、K₂HPO₄·3H₂O 0.8～1.0份、水100份，均为重量份，下同；灭菌，冷却，接种步骤(1)制得的芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的斜面菌种的菌悬液5～10份，28～30℃，摇瓶转速100～120转/分钟，培养20～24小时，得芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的液体种子，待用；
(3)β-甘露聚糖酶液的发酵制备
将步骤(2)制得的芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的液体种子按重量份5～8份加入到产酶培养基中进行发酵，发酵条件是30～32℃、27～34小时；
产酶培养基是：魔芋粉2.0～2.5份、酵母粉1.3～1.5份、豆粕1.0～1.2份、K₂HPO₄·3H₂O0.4～0.5份，pH 7.0～7.2；发酵制得的β-甘露聚糖酶液中β-甘露聚糖酶酶活为651±37U/ml；
(4)β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备甘露寡糖
用去离子水配制魔芋粉液使魔芋粉含量为10～15mg/ml，将步骤(3)制得的β-甘露聚糖酶液按β-甘露聚糖酶10～15U/mg魔芋粉加入魔芋粉液中，pH7.0，50～70转/分钟搅拌，50～55℃，酶解20-30小时；酶解完毕，加温至100℃，保温5～10min使酶灭活，冷却后，10000rpm、室温离心5～10min，上清即为甘露寡糖液。

一种酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法
技术领域
本发明涉及一种酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
低聚寡糖(Oligosaccharide)是指由2-10个单糖通过糖苷键连接而形成的直链或支链的低度聚合物。根据功能，低聚寡糖可以分为普通寡糖和功能性寡糖。普通寡糖可以被动物体消化吸收，为机体提供能量和营养的同时也对肠道菌群生长有一定的促进作用，常见的有蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽三糖、海藻糖等。功能性寡糖是指动物消化道内的消化酶类对其不发生作用，不能被机体消化、吸收，但却为双歧杆菌等肠道有益菌增殖所需的寡糖，包括甘露寡糖、木寡糖、壳寡糖、果寡糖、乳果糖、半乳寡糖、异麦芽糖、葡萄寡糖和木寡糖等，目前功能性寡糖已成为人们研究的热点。由于功能性寡糖不能被机体消化吸收，也被称为不可消化性寡糖(Non-digestible oligosaccharides，NDOs)。近年来，寡糖不仅是一类功能食品，更是作为一类新的生理活性物质，在营养与保健、疾病诊断与防治、畜牧养殖、植物生长调节及抗病害等方面都有着极大的应用潜力。功能性寡糖的开发在国际上已经发展成为一个涉及医学、化学、工程等学科，应用于食品、医药、饲料、农业各领域的重要产业。
功能性寡糖的生理功能主要包括以下几个方面：(1)调整肠道菌群、(2)降低肠道pH、(3)营养产物、(4)可以增加排泄物的干重、(5)减轻便秘症状、(6)抑制痢疾、(7)保护肠胃系统、呼吸系统和泌尿生殖系统免受疾病传染、(8)增强各类矿物元素的吸收、(9)对糖代谢和脂代谢的有益影响、(10)降低癌症威胁。正是由于上述生理功能，功能性寡糖被认为是功能食品，被称为是“一种适时出现的、符合人类健康要求的、以对人体的积极作用为目标的、有生理功能的食品成分”。此外，功能性寡糖表现出优于膳食纤维的特质，因为它们只需要很低的日剂量，并且只要按照推荐剂量摄取就不会引起腹泻、痢疾等症状。它们甜度轻微，没有不好的质地和味道，并且完全溶于水，具有良好的物理稳定性，可以很好的与食品和饮品加工相联合。
魔芋(葡萄糖甘露聚糖)是在亚洲地区广泛分布的可食用性植物胶。特别是在我国，魔芋被作为半纤维素类食品已经有很长的历史。但是到目前为止，这种丰富而廉价的半纤维素资源除了部分作为低价值的食品添加剂之外都没有得到充分的开发和利用。利用β-甘露聚糖酶水解含甘露聚糖植物胶，可生成具有不同单糖分子组成的、性质优良的功能性寡糖——甘露寡糖。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种新筛选的产β-甘露聚糖酶的菌株，利用该菌株，发酵制备β-甘露聚糖酶，并提供利用该β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法。
发明概述
本发明利用产β-甘露聚糖酶的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5进行发酵制备β-甘露聚糖酶，再利用所制备的β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备甘露寡糖，可方便低廉地实现甘露寡糖的工业化生产，满足市场对甘露寡糖的需求。
发明详述
本发明的技术方案如下：
一、产β-甘露聚糖酶的菌株
本发明的产β-甘露聚糖酶的菌株为芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5，筛自四川魔芋地土样，保藏号CCTCC NO：M208258，保藏单位是中国典型培养物保藏中心。
二、酶解魔芋粉制备甘露寡糖
一种酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法，步骤如下：
(1)菌株斜面培养
产β-甘露聚糖酶的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5，保藏号CCTCC NO：M208258，菌株斜面培养基：角豆胶1.0～1.2份，(NH₄)₂SO₄0.4～0.6份，K₂HPO₄·3H₂O0.8～1.0份，琼脂1.2～1.5份，水100份，以上均为重量份。
(2)液体种子培养
液体种子培养基：酵母粉2.0～2.5份、麸皮1.0～1.2份、K₂HPO₄·3H₂O0.8～1.0份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，冷却，接种步骤(1)制得的芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的斜面菌种的菌悬液5～10份，28～30℃，摇瓶转速100～120转/分钟，培养20～24小时，得芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的液体种子，待用。
(3)β-甘露聚糖酶液的发酵制备
将步骤(2)制得的芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的液体种子按重量份5～8份加入到产酶培养基中进行发酵，发酵条件是30～32℃、27～34小时。
所述的产酶培养基是：魔芋粉2.0～2.5份、酵母粉1.3～1.5份、豆粕1.0～1.2份、K₂HPO₄·3H₂O0.4～0.5份，pH7.0～7.2。发酵制得的β-甘露聚糖酶液中β-甘露聚糖酶酶活为651±37U/ml。
上述发酵酶液对甘露聚糖具有较高的酶活性、对可溶性淀粉仅有很低的酶解活性、对纤维素和木聚糖没有水解活性，说明该发酵酶液中主要以甘露聚糖酶为主。该甘露聚糖酶对β-1，4-甘露聚糖(魔芋粉、角豆胶)有活性，而对α-1，6-甘露聚糖(酵母甘露聚糖)没有活性，因此，芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5发酵生产的甘露聚糖酶为β-甘露聚糖酶。以角豆胶为底物，最适pH5.5，pH6～9，50℃下保温1小时，仍然能够保持70％以上的酶活。以角豆胶为底物，该酶对角豆胶的最适酶活温度为50～60℃，35～65℃，保温1小时，仍然能够保持50％以上的酶活性。
(4)β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备甘露寡糖
用去离子水配制魔芋粉液使魔芋粉含量为10～15mg/ml，将步骤(3)制得的β-甘露聚糖酶液按β-甘露聚糖酶5～10U/mg魔芋粉加入魔芋粉液中，pH7.0，50～70转/分钟搅拌，50～55℃，酶解20-30小时。酶解完毕，加温至100℃，保温5～10min使酶灭活，冷却后，10000rpm、室温离心5～10min，上清即为甘露寡糖液。
以上制备方法中未详加限定的，均按本领域现有技术即可。
三、酶解产物的分析
将上述制备的酶解产物甘露寡糖液用孔径为0.22μm的硝酸纤维素膜过滤，采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)测定酶解液中的单糖和寡糖的量，分析柱采用Aminex HPX-42C(Bio-rad，300mm×7.8mm)，检测器为RID-10A型示差折光检测器，以双蒸水(ddH₂O)为流动相，流速为0.4ml/min，柱温为75℃。以购自Sigma公司的甘露2-6糖作为标准品，检测寡糖产物的聚合度(如图1、图2)。酶解分析结果表明，β-甘露聚糖酶在高效酶解魔芋粉的过程中产生聚合度为2-6的寡糖，其中三糖是主要产物。最佳的酶解条件：底物浓度，10mg/ml，酶浓度10U/mg魔芋粉。
本发明的方法的优良效果如下：
1、本发明提供的产β-甘露聚糖酶的菌株——芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5(保藏号CCTCCNO：M208258)具有较高的产酶活力，富含甘露聚糖的魔芋粉可诱导该菌株分泌β-甘露聚糖酶。利用廉价的魔芋粉等为原料，发酵制得的β-甘露聚糖酶液中β-甘露聚糖酶酶活为651±37U/ml。
2、本发明利用芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5发酵制得的β-甘露聚糖酶，可高效酶解魔芋粉，并且在高效酶解魔芋粉的过程中产生产生的寡糖的聚合度为2-6的寡糖，其中三糖是主要产物，而单糖甘露糖很少。
3、魔芋(葡萄糖甘露聚糖)是在亚洲地区广泛分布的可食用性植物胶。在我国，魔芋这种丰富而廉价的半纤维素资源除了部分作为低价值的食品添加剂之外都没有得到充分的开发和利用，本发明为魔芋资源提供了一条高效生产高值化的甘露寡糖的途径，满足市场对甘露寡糖的需求。
附图说明
图1是β-甘露聚糖酶酶解不同浓度的魔芋粉的高效液相色谱法(HPLC)分析测定结果。用ddH₂O分别配制1、5、10mg/ml的魔芋粉，添加5U/mg的β-甘露聚糖酶，按照本发明方法步骤(4)中的条件酶解。横坐标是时间，单位：分钟；纵坐标是折光度，单位：伏特。图中曲线由上往下依次是魔芋粉含量10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml的酶解物、标准品混合溶液HPLC洗脱曲线。其中的M1-M6依次是一糖峰、二糖峰、三糖峰、四糖峰、五糖峰、六糖峰。结果表明，10mg/ml的魔芋粉是较好的底物浓度。
图2是β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉的高效液相色谱法(HPLC)分析测定结果。用ddH₂O配置10mg/ml的魔芋粉，添加10U/mg的β-甘露聚糖酶，按照本发明方法步骤(4)中的条件酶解，分别于20min、1h、2h、12h、24h和48h时取样，HPLC测定产物的量。横坐标是时间，单位：分钟；纵坐标是折光度，单位：伏特。图中曲线是不同酶解时间的魔芋粉酶解产物和标准品甘露寡糖混合溶液的HPLC洗脱曲线。其中的M1-M6依次是一糖峰、二糖峰、三糖峰、四糖峰、五糖峰、六糖峰。β-甘露聚糖酶在高效酶解魔芋粉的过程中产生聚合度为2-6的寡糖，其中三糖是主要产物，从三糖峰的保留时间可以推断，该三糖以葡萄甘露三糖为主，伴有少量的甘露三糖。同时产物中还包含一定量的甘露二糖和很少量的甘露糖。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不先于此。实施例中所用的菌株为芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5，保藏号CCTCC NO：M208258；所用的魔芋粉购自重庆里茂农产品开发有限公司。
实施例：酶解魔芋粉制备甘露寡糖的方法，步骤如下：
(1)菌株斜面培养
产β-甘露聚糖酶的菌株芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5，保藏号CCTCC NO：M208258，菌株斜面培养基：角豆胶1.1份，(NH₄)₂SO₄0.5份，K₂HPO₄·3H₂O，0.9份，琼脂1.3份，水100份，均为重量份。划线接种5％wt。斜面菌种按现有技术配置为菌悬液，待用。
(2)液体种子培养
液体种子培养基：酵母粉2.2份、麸皮1.2份、K₂HPO₄·3H₂O，0.9份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，冷却，接种芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的斜面菌种的菌悬液7份，28～30℃，摇瓶转速100～120转/分钟，培养22小时，作为液体种子待用。
(3)β-甘露聚糖酶的发酵
将步骤(2)制得的芽孢杆菌Bacillus sp.MSJ-5的液体种子按重量份5份加入到产酶培养基中进行发酵，发酵条件是30～32℃、27～34小时。产酶培养基是：魔芋粉2.2份、酵母粉1.4份、豆粕1.1份、K₂HPO₄·3H₂O 0.45份，pH 7.0～7.2。在此发酵条件下制得的β-甘露聚糖酶酶活为651±37U/ml。
β-甘露聚糖酶酶活测定方法：吸取0.9ml5g/L(W/V)角豆胶溶液(pH6.0，20mmol/L磷酸缓冲液)，于50℃保温5min，加入0.1ml适当稀释的酶液，及1ml20mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，50℃水浴反应10min后，DNS法测酶解液中还原糖的含量。酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟释放1μmol甘露糖所需酶量为一个酶活单位(U)。
(4)酶解魔芋粉制备甘露寡糖
用去离子水配制魔芋粉液使魔芋粉含量为10mg/ml，将步骤(3)制得的β-甘露聚糖酶液按β-甘露聚糖酶12U/mg魔芋粉加入魔芋粉液中，pH7.0，50～70转/分钟搅拌，53±1℃，酶解24小时。酶解完毕，加温至100℃，保温8min使酶灭活，冷却后，10000rpm、室温离心8min，上清即为甘露寡糖液。