一种汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系.pdf

本发明公开了一种从汉族人肾透明细胞癌脊柱转移灶中，建立有转移表型的汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，CCTCC-C200909。本发明利用肾透明细胞癌患者脊柱转移灶作为建系瘤源，采用体外培养方式建立了一株具有高转移潜能的人肾透明细胞癌细胞系。试验表明本发明细胞系具有典型的肿瘤细胞系特征，且可致使NOD-SCID鼠发生稳定转移。可作为建立筛选制备检测与防治汉族人肾细胞癌药物的细胞模型的应用。

1、  一种汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，CCTCCNO.C200909。

2、  根据权利要求1所述汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系
HiMet-ccRCC，CCTCC NO.C200909，其特征在于所述细胞系呈上皮样细胞形态，多边不规则型；贴壁生长，接触性生长抑制丧失；超二倍体核型，染色体范围60-80条之间；细胞群体倍增时间为19.2h，克隆形成率41％；HE染色表明该细胞系核质比例失调，核异形、双核，且经免疫组化分析显示CA9、CD133均呈强阳性。

3、  根据权利要求1所述汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，CCTCC NO.C200909，其特征在于所述细胞系是通过下列方法得到的，该方法包括下列步骤：
(1)原代培养
1)转移灶为取自上海长征医院肾透明细胞癌患者脊柱转移灶的切除标本，无菌条件下将该转移灶取出放入盛有7-10mlD-Hanks液的玻璃平皿中，剔除坏死组织、脂肪组织、血管；
2)浸泡组织块于10-15ml的1640培养基中浸泡30-40min；
3)将转移灶剪成1-3mm³的小块，将浸泡液及组织块7-8ml一起转移至离心管中，反复摇晃清洗2-3min，1500rpm，离心10min；
4)弃上清，重新加入浸泡液7-8ml重新悬浮组织块，反复摇晃清洗5min，1500rpm，离心10min；
5)弃上清，用1640完全培养基3-4ml(含20％胎牛血清)悬浮组织块，将悬液以1ml/瓶移入细胞培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％ CO2，95％湿度的CO₂培养箱中孵育；
6)24h后仔细吸去瓶内的培养液，再加入1-1.5ml的1640完全培养基；
7)接种完毕后，将培养瓶置于37℃，5％ CO₂，95％湿度的CO₂培养箱中培养24h；
8)7-14天即可见到组织块周围生长出细胞，将培养基加至5-7ml；
(2)传代
1)在超净工作台内，取处于指数生长期的细胞，于无菌条件下吸除培养瓶内的培养液；
2)用D-hanks液4-5ml清洗培养瓶2次后，加入0.25％胰蛋白酶1ml，置37℃，5％ CO2，95％湿度的CO₂培养箱中4-5min；
3)当在倒置显微镜下观察大部分细胞细胞质回缩，细胞间隙增大，甚至看到有个别细胞漂浮起来时，加入1640完全培养基4ml，吸管反复轻轻吹打贴壁的细胞，形成细胞悬液；
4)计数板计数，调整细胞悬液浓度至10⁵/ml，将该5-6ml细胞悬液接种于新的培养瓶中；
(3)冻存
1)取处于指数生长期的细胞，吸除上述培养瓶内的培养液；
2)用D-hanks液4-5ml清洗培养瓶2次后，加入0.25％胰蛋白酶1ml，置37℃，5％ CO2，95％湿度的CO₂培养箱中4-5min；
3)当在倒置显微镜下观察大部分细胞细胞质回缩，细胞间隙增大，甚至看到有个别细胞漂浮起来时，加入1640完全培养基4ml，吸管反复轻轻吹打贴壁的细胞，形成细胞悬液；
4)将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心10min，弃上清液；
5)细胞沉淀中加入冻存液1.5ml，计数并调整至5×10⁶细胞/ml，移入冻存管，将冻存管口密封；
6)冷存管先置于4℃ 10min，移入-20℃ 30min，然后于-80℃放置过夜，最后移入液氮；
(4)复苏
1)准备400-500ml的37℃-42℃的温水，从液氮中取出冻存管，并迅速置于温水中不断搅动；
2)在超净工作台中打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，1000rpm离心10min，弃去上清液；
3)细胞沉淀中加入10ml 1640完全培养基，吹打均匀制成细胞悬液，细胞浓度5×10⁵/ml，转移至两个培养瓶中，置37℃，5％ CO₂，95％湿度的CO₂培养箱中培养。

4、  根据权利要求3的方法，其特征在于所述D-Hanks液为氯化钠8.0g、氯化钾0.4g、Na₂HPO₄ 12H₂O 0.08g、KH₂PO₄0.06g、NaHCO₃ 0.35g、1％酚红2ml、超纯水溶解并定容至1000ml。

5、  根据权利要求3的方法，其特征在于所述1640培养基为RPMI 1640粉10.4g，丙酮酸钠0.11g，2-巯基乙醇0.01mol/L，NaHCO₃ 2g，超纯水溶解并定容至1000ml。

6、  根据权利要求3的方法，其特征在于所述1640完全培养基为含1640培养基及20％ v/v胎牛血清。

7、  根据权利要求3的方法，其特征在于所述0.25％胰蛋白酶为含胰蛋白酶及D-Hanks液，以1：400v/v的比例配制。

8、  根据权利要求3的方法，其特征在于所述冻存液：由1640完全培养基、小牛血清及二甲基亚砜以7:2:1的比例配制。

9、  一种如权利要求1所述汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，CCTCC NO.C200909，作为建立筛选制备检测与防治汉族人肾细胞癌药物细胞模型的应用。

一种汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系
技术领域
本发明涉及微生物，具体涉及从一种汉族人肾透明细胞癌脊柱转移灶中，建立有转移表型的汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，CCTCC—C200909。
背景技术
肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统常见肿瘤，近几年RCC发病率在全球呈显著上升的趋势。肾细胞癌临床症状不典型，，易发生远处转移，近30％的RCC患者初诊时即发现转移，其平均生存期为6-12个月，2年生存率为10％-20％。其中肾透明细胞癌最为常见，占70％-80％。RCC对放疗、化疗、内分泌治疗等多种肿瘤治疗手段均不敏感，目前相对稳定的治疗方法为手术治疗，但术后转移率极高，1年转移发生率为59％，2年为83％，3年为93％。在肾透明细胞癌中，转移常见部位为肺、骨。为进一步研究汉族人肾透明细胞癌发生和转移机制，为临床预测、诊断及治疗提供研究对象，需建立有效且稳定的具有转移特性的肾透明细胞癌细胞系。自Ishihara报道了世界上第一个“人肾细胞癌细胞系”，至今已有许多实验室建立了不同病理类型的肾癌细胞系，包括来自原发及转移部位，它们在研究肾癌的发生发展及转移中发挥了重要的作用。然而，目前为止建立的肾癌细胞系，尚无来自汉族人转移灶可稳定转移的肾透明细胞癌细胞系，无法对原发癌细胞系和具有稳定转移倾向细胞系的生物学特性进行对比研究，也无法在汉族人肾癌研究中排除因人种遗传背景和生活条件导致的差异。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于应用体外细胞培养技术从汉族人脊柱转移灶中建立高转移倾向的肾透明细胞癌细胞系，并建立一种汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系，命名为HiMet-ccRCC。
本发明的汉族人转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，已于2009年2月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国 武汉 武汉大学 430072)。
保藏编号：CCTCC—C200909
本发明利用肾透明细胞癌患者脊柱转移灶作为建系瘤源，采用体外培养方式建立了一株具有高转移潜能的人肾透明细胞癌细胞系。
本发明的汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系是通过下列方法得到的，该方法包括下列步骤：
(1)原代培养
1)转移灶为取自上海长征医院肾透明细胞癌患者脊柱转移灶的切除标本，无菌条件下将该转移灶取出放入盛有7-10mlD-Hanks液的玻璃平皿中，剔除坏死组织、脂肪组织、血管；
2)浸泡组织块于10-15ml的1640培养基中浸泡30-40min；
3)将转移灶剪成1-3mm³的小块，将浸泡液及组织块7-8ml一起转移至离心管中，反复摇晃清洗2-3min，1500rpm，离心10min；
4)弃上清，重新加入浸泡液7-8ml重新悬浮组织块，反复摇晃清洗5min，1500rpm，离心10min；
5)弃上清，用1640完全培养基3-4ml(含20％胎牛血清)悬浮组织块，将悬液以1ml/瓶移入细胞培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％ CO2，95％湿度的CO₂培养箱中孵育；
6)24h后仔细吸去瓶内的培养液，再加入1-1.5ml的1640完全培养基；7)接种完毕后，将培养瓶置于37℃，5％ CO₂，95％湿度的CO₂培养箱中培养24h；
8)7-14天即可见到组织块周围生长出细胞，将培养基加至5-7ml。
(2)传代
1)在超净工作台内，取处于指数生长期的细胞，于无菌条件下吸除培养瓶内的培养液；
2)用D-hanks液4-5ml清洗培养瓶2次后，加入0.25％胰蛋白酶1ml，置37℃，5％ CO2，95％湿度的CO₂培养箱中4-5min；
3)当在倒置显微镜下观察大部分细胞细胞质回缩，细胞间隙增大，甚至看到有个别细胞漂浮起来时，加入1640完全培养基4ml，吸管反复轻轻吹打贴壁的细胞，形成细胞悬液；
4)计数板计数，调整细胞悬液浓度至10⁵/ml，将该5-6ml细胞悬液接种于新的培养瓶中；
(3)冻存
1)取处于指数生长期的细胞，吸除上述培养瓶内的培养液；
2)用D-hanks液4-5ml清洗培养瓶2次后，加入0.25％胰蛋白酶1ml，置37℃，5％ CO2，95％湿度的CO₂培养箱中4-5min；
3)当在倒置显微镜下观察大部分细胞细胞质回缩，细胞间隙增大，甚至看到有个别细胞漂浮起来时，加入1640完全培养基4ml，吸管反复轻轻吹打贴壁的细胞，形成细胞悬液；
4)将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心10min，弃上清液；
5)细胞沉淀中加入冻存液1.5ml，计数并调整至5×10⁶细胞/ml，移入冻存管，将冻存管口密封；
6)冷存管先置于4℃10min，移入-20℃30min，然后于-80℃放置过夜，最后移入液氮；
(4)复苏
1)准备400-500ml的37℃-42℃的温水，从液氮中取出冻存管，并迅速置于温水中不断搅动；
2)在超净工作台中打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中，1000rpm离心10min，弃去上清液；
3)细胞沉淀中加入10ml 1640完全培养基，吹打均匀制成细胞悬液，细胞浓度5×10⁵/ml，转移至两个培养瓶中，置37℃，5％ CO₂，95％湿度的CO₂培养箱中培养。复苏后的细胞生长状态与原培养细胞一致。
上述方法中所述试剂的成分如下：
D-Hanks液：氯化钠8.0g，氯化钾0.4g，Na₂HPO₄ 12H₂O 0.08g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃ 0.35g，1％酚红2ml，超纯水溶解并定容至1000ml
1640培养基：RPMI 1640粉10.4g，丙酮酸钠0.11g，2-巯基乙醇0.01mol/L，NaHCO₃ 2g，超纯水溶解并定容至1000ml。
1640完全培养基：含1640培养基及20％(v/v)胎牛血清。
0.25％胰蛋白酶：含胰蛋白酶及D-Hanks液，以1：400(v/v)的比例配制。
冻存液：由1640完全培养基、小牛血清及二甲基亚砜以7:2:1的比例配制。
本发明汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，CCTCCNO.C200909，经实验检测，其一般生物学特性表明，该细胞系呈上皮样细胞形态，多边不规则型，核质比例倒置，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，超二倍体核型，染色体范围60-80条之间，符合恶性肿瘤的遗传学特性。细胞群体倍增时间为19.2h，克隆形成率41％。苏木精-伊红(HE)染色表明该细胞系核质比例失调，核异形、双核，且经免疫组化分析显示CA9、CD133均呈强阳性。经不断传代及动物实验发现具有低转移倾向。冻存后复苏率达80％以上，复苏后的细胞生长状态与原培养细胞一致。
本发明的又一目的是提供一种汉族人低转移性肾透明细胞癌细胞系HiMet-ccRCC，CCTCC NO.C200909，作为建立筛选制备检测与防治汉族人肾细胞癌药物的细胞模型的应用。
通过在NOD-SCID鼠皮下注射细胞(2×10⁶个细胞)，并将皮下成瘤原位移植的方法，进行了6轮鼠间传代，成瘤时间由皮下接种时90天减少到7天，每轮原位成瘤率均为100％，且随传代次数的增加肺转移发生率逐渐增至100％。
表1 NOD-SCID鼠体内第1至6轮组织种植成瘤率比较

*其余两只死亡时肿瘤达500mm³，疑为恶液质致死
结论：以上结果表明，本发明细胞系具有典型的肿瘤细胞系特征，且可致使NOD-SCID鼠发生稳定转移。
本发明建立的汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系，为深入研究汉族人肾透明细胞癌的病因学，肿瘤转移机制的研究及抗转移的药物筛选提供试验模型。
附图说明
图1贴壁生长的肾透明细胞癌细胞(100×)。细胞为典型的上皮样细胞，形状不规则，贴壁生长，接触性抑制丧失，细胞核膜、核仁轮廓明显，核仁清晰，胞质少，核糖体颗粒丰富，大部分细胞双核或多核
图2HE染色可见HiMet-ccRCC细胞核质比例失调，核异形、双核
图3肾透明细胞癌细胞2×106细胞/0.2ml剂量接种NOD-SCID鼠皮下40天后，形成肿瘤体积为2×1.3×1.2×1cm
图4第6轮，NOD-SCID鼠肾包膜接种8天后肺部自发转移率100％，肺部见多个转移灶
具体实施方式
实施例1 HiMet-ccRCC细胞的获得
1)转移灶为取自上海长征医院肾透明细胞癌患者脊柱转移灶的切除标本，无菌条件下将该转移灶取出放入盛有10mlD-Hanks液的玻璃平皿中，以浸没大半组织为准，剔除坏死组织、脂肪组织、血管等；
2)浸泡组织块于15ml1640培养基中浸泡30min；
3)将转移灶用眼科剪剪成1mm³的小块，将浸泡液及组织块一起转移至离心管中，配平离心管，反复摇晃清洗2min。1500rpm，离心10min；
4)弃上清，重新加入浸泡液7ml重新悬浮组织块，反复摇晃清洗5min，1500rpm，离心10min；
5)弃上清，用1ml1640完全培养基(含20％胎牛血清)悬浮组织块，将悬液以1ml/瓶移入细胞培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5％ CO2，95％湿度的CO2培养箱中孵育；
6)24h后仔细吸去瓶内的培养液，再加入1ml的1640完全培养基；
7)接种完毕后，将培养瓶置于37℃，5％ CO2，95％湿度的CO2培养箱中培养24h。
8)7天后可见组织块周围生长出细胞，此时可将1640完全培养基加至5ml。
实施例2
汉族人高转移性肾透明细胞癌细胞系动物实验：
1)取细胞悬液(2×10⁶细胞/0.2ml)分别注射3只5周龄NOD-SCID鼠(第二军医大学肿瘤研究所提供)背部皮下。90天后处死NOD-SCID鼠，进行第1轮种植，取皮下瘤切成直径1mm的组织小块接种于肾包膜下，40天后原位形成直径1cm的肿瘤。
2)取上述原位瘤材复种于NOD-SCID鼠肾包膜下，进行第2轮种植，39天后NOD-SCID鼠衰竭，取出肺转移灶复种于肾包膜下。
3)27天后，取出上述肺转移灶复种于肾包膜下进行第3轮。重复上述过程直至第6轮。
以上结果表明，本发明细胞系具有典型的肿瘤细胞系特征，且可致使NOD-SCID鼠发生稳定转移。为深入研究中国人正常肾细胞与肿瘤细胞在生物学、免疫、代谢及遗传学方面的差异以及肾癌临床研究提供稳定的材料来源。