一种葛仙米多糖的提取方法 技术领域
本发明涉及生物技术和应用藻类学领域，更具体涉及一种利用葛仙米提取多糖的方法。
背景技术
目前，对葛仙米的开发只停留在培养作为食品的用途上，用葛仙米提取多糖并加以利用几乎未曾涉足。其多糖具有形成稳定凝胶的能力；能稳定悬浮液和乳状液，增加溶液的粘度，形成纤维、胶层、液晶；具有生物絮凝剂的功效。因此它们可以用于食品工业、制药工业、化妆品工业、纺织工业和石油工业等。而目前利用的藻多糖大都从大型海藻和螺旋藻中提取得到，这些藻的培养成本高。
提取藻多糖现有的方法大都是利用氯仿和正丁醇提取，而氯仿对人体是有害的，如果在提取过程中氯仿没有被充分利用，而直接排入河流和湖泊，将污染环境。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葛仙米多糖的提取方法，此方法易行、操作方便、设备简单、安全可靠、产量高、产品质量好，适宜于工业化生产。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：
I、培养液的配制：
由于几种化学试剂混合时可能会产生沉淀，因此，配制培养基时，最好按以下顺序加入：按每升水加入硝酸钠0.8-2.5g、磷酸氢二钾0.02-0.05g、硫酸镁0.06-0.09g、氯化钙0.02-0.05g、柠檬酸0.004-0.008g、柠檬酸铁铵0.004-0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.001-0.003g、碳酸钠0.01-0.04g，微量元素溶液A50.5-2ml，加入的同时最好搅匀；
II、葛仙米的培养：
葛仙米的培养情况，是其多糖产率高低的一个很重要的决定条件。因此，葛仙米的整个生长过程，最好按照以下条件进行培养。
(1)一级培养：由试管原种接入三角瓶(150-200ml)，静止培养或通气培养，通气培养，调节气流大小在2-3L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在70-80μE.m-2.s-1，温度控制在25-32℃，当培养到5-10天后，转入到二级培养。
(2)二级培养：将一级培养所得的培养物接入到培养瓶(500-1000ml)，通气培养，调节气流大小在3-5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在80-90μE.m-2.s-1，温度控制在25-32℃，当培养到5-10天后，转入到三级培养。
(3)三级培养：将二级培养所得的培养物接入到培养瓶(5000-20000ml)，通气培养，调节气流大小在4-6L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在80-100μE.m-2.s-1，温度控制在25-32℃，当培养到5-10天后，为继续培养的接种种源，进行培养。
(4)继续培养：采用三级培养后的藻种，接入光生物反应器或跑道式循环培养池，按每升培养液1-2g葛仙米湿重的比例接入到光生物反应器或跑道式循环培养池，进行大量培养，采用日光灯进行光照，光强控制在80-110μE.m-2.s-1，温度控制在25-32℃，接入光生物反应器时，采用空气充气泵通气，调节气流大小在4-9L.min-1，在充气泵与光生物反应器之间加入棉花球，以便过滤气流中地细菌和细小颗粒等杂质，接入跑道式培养池时，采用叶轮或潜水泵搅动培养基。
III葛仙米的收获：
将上述继续培养10-20天后的葛仙米经过孔径为0.3-0.7cm的不锈钢筛子过筛，能够通过这种不锈钢筛子的葛仙米经过处理后，继续培养；不能够通过这种不锈钢筛子的葛仙米用作葛仙米多糖提取的材料。
IV葛仙米多糖的提取：
将新鲜葛仙米研磨，加入8-12倍重量的蒸馏水，充分搅匀，于高压灭菌锅中1-1.4磅压力下抽提20-30min，12000-15000g离心5-10min，收集上清液，向上清液中加入8-10倍体积的预先冷冻到0-4℃的无水乙醇，静置10-20min，将会出现大量的白色絮状沉淀物析出，此即为葛仙米多糖，12000-15000g离心5-10min收集多糖。
V纯化、收获与干燥：
纯化：将上述所得粗多糖溶于4-6倍蒸馏水(w/v)中，用10-15倍(w/v)0-4℃冷的无水乙醇洗涤；
收获：将上述溶液在离心机中12000-15000g离心5-10min，收集沉淀物；
干燥：将收集到的多糖沉淀物在-60--110℃下冷冻干燥即得到多糖产品。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和卓著的效果：方法易行、操作方便、设备简单、产量高、产品质量好、安全可靠，适用于工业化规模生产。
具体实施方式
提取葛仙米多糖的具体实施步骤如下：
A、培养液的配制：
按每升水加入硝酸钠1.5g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸镁0.075g、氯化钙0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.001g、碳酸钠0.02g，微量元素溶液A51ml；
B、葛仙米的培养：
葛仙米的培养情况，是其多糖产率高低的一个很重要的决定条件。因此，葛仙米的整个生长过程，最好按照以下条件进行培养。
1.一级培养：由试管原种接入三角瓶(150-200ml)，静止培养或通气培养，如果通气培养，则调节气流大小在3L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在80μE.m-2.s-1，温度控制在30℃，当培养到7-10天后，转入到二级培养。
2.二级培养：将一级培养所得的培养物接入到培养瓶(500-1000ml)，通气培养，调节气流大小在4L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在90μE.m-2.s-1，温度控制在30℃，当培养到7-10天后，转入到三级培养。
3.三级培养：将二级培养所得的培养物接入到培养瓶(5000-20000ml)，通气培养，调节气流大小在5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在100μE.m-2.s-1，温度控制在30℃，当培养到7-10天后，为继续培养的接种种源，进行培养。
4.继续培养：采用三级培养后的藻种，接入光生物反应器或跑道式循环培养池，按每升培养液1-2g葛仙米湿重的比例接入到光生物反应器或跑道式循环培养池，进行大量培养。采用日光灯进行光照，光强控制在110μE.m-2.s-1，温度控制在30℃，接入光生物反应器时，采用空气充气泵通气，调节气流大小在8L.min-1，在充气泵与光生物反应器之间加入棉花球，以便过滤气流中的细菌和细小颗粒等杂质，接入跑道式培养池时，采用叶轮或潜水泵搅动培养基。
C、葛仙米的收获：
将上述继续培养15-20天后的葛仙米经过孔径为0.5cm的不锈钢筛子过筛，直径小于0.5cm的葛仙米经过处理后，继续培养，大于0.5cm的葛仙米用作葛仙米多糖提取的材料。
D、葛仙米多糖的提取：
将新鲜葛仙米研磨，加入10倍重量的蒸馏水，充分搅匀，于高压灭菌锅中1.2磅压力下抽提20min，12000-15000g离心5-10min，收集上清液，向上清液中加入8倍体积的预先冷冻到0℃的无水乙醇，静置10-20min，将会出现大量的白色絮状沉淀物析出，此即为葛仙米多糖，12000-15000g离心5-10min收集多糖。
E、纯化、收获与干燥：
纯化：将上述所得粗多糖溶于5倍蒸馏水(w/v)中，用10倍(w/v)0℃冷的无水乙醇洗涤；
收获：将上述溶液在离心机中12000g离心5-10min，收集沉淀物；
干燥：将收集到的多糖沉淀物在-100℃下冷冻干燥即得到葛仙米多糖产品。