O-取代羧甲基壳聚糖在外科手术防粘连材料的应用 【技术领域】
本发明涉及羧甲基壳聚糖在外科手术防止粘连材料的应用。本发明还涉及羧甲基壳聚糖的纯化方法。
背景技术
心胸、腹腔、脊椎、肌腱修复、口腔等手术后的愈合过程中，由于切口周围纤维组织的增生和渗透，不可避免地会发生粘连，给病人留下疼痛、肠梗阻等后遗症。解决粘连既简单又可靠的办法是采用所谓的“物理屏障”，即把惰性材料置于组织的切口部位，对纤维组织的生长起阻隔作用。长期以来，国外国内多采用明胶海绵、自体脂肪、硅橡胶膜、透明质酸等作为隔离材料，防止粘连的发生，但它们都因各自的局限而影响使用效果。明胶海绵会使成纤维细胞顺其蔓延或妨碍脂肪成活而使瘢痕粘连更为广泛；自体脂肪会发生液化坏死而诱发瘢痕生成，同时供区会出现血肿感染和皮肤下陷等现象；硅橡胶膜确能减少瘢痕和粘连的生成，但它不能被机体吸收，植入后作为异物长期残留体内，会对身体造成机械刺激；透明质酸钠涂复容易，但是价格高昂，且晚期防粘连效果亦有限。可降解材料是最近提出地新概念，它在手术后植入起隔离作用，在切口愈合后能降解吸收，不会长期存在体内，是术后防粘连材料的发展方向。
甲壳素学名β-(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，属线形多糖类的天然高分子。甲壳素在自然界资源丰富，广泛存在于虾蟹等海生动物的甲壳中，壳聚糖是甲壳素经脱乙酰后的产物。由于壳聚糖来源丰富、制备简单、价格便宜，它在纺织、造纸、食品、化妆品、污水处理等工业方面得到广泛用途。90年代以来，甲壳素和壳聚糖作为一种新的生物材料在医学界越来越受重视，壳聚糖已在缓释控制释药物载体、可吸收手术缝线、人工皮肤等方面有广泛的应用前景。
壳聚糖作为术后防粘连材料是一个崭新的研究方向，国外也仅在最近才见报道。壳聚糖无毒，无刺激性，无免疫抗原性，是生物相容性很好的植入材料；壳聚糖在体内受酶的作用，降解生成无毒的小分子，容易被生物体吸收；壳聚糖还具有选择性抵制人成纤维细胞生长的独特生物活性，这些都是新一代可降解的术后防粘连材料所必需具有的性质。壳聚糖的不足是难溶于水，只能制成薄膜，对于外形复杂的器官和组织，固定较为困难。经羧甲基壳修饰的壳聚糖在水中溶解性大为改善的，可以喷涂到伤口表面，使用更为方便。1996年加拿大Dalhousie大学Kennedy等曾把N，O-竣甲基壳聚糖用作术后防粘连材料，他们在小鼠的腹腔模型中应用羧甲基壳聚糖处理伤口。实验结果表明，粘连面积的大小、强度和数量都得到了有效的减少。Costain接着报道，手术过程中不同时段使用羧甲基壳聚糖防粘连有不同的效果，手术的最后即关闭腹腔前使用最为有效。
近年来国内开展防粘连材料的研究报道有增多的趋势，如中山医科大学的陈裕光等采用可降解的聚氨基酸膜预防家兔术后椎管粘连(1995年)；大连医科大学的吕德成等使用壳聚糖膜预防鸡趾屈肌腱粘连(1996年)；大连医科大学的孙康等比较了聚合纤维素、明胶海绵等5种材料预防大鼠术后硬膜外粘连的效果(1996年)；合肥第一人民医院梅宝珊等用人胎羊膜预防鸡术后肌腱粘连(1997年)；第一军医大学金大地等用聚丙交酯膜预防新西兰兔椎管术后瘢痕粘连(1997年)；上海第二医科大学侯筱魁和樊天佑等用透明质酸钠预防家兔术后硬膜外粘连(1998年)；山东医科大学宫泰良等在临床中采用自体中厚皮(1998年)。二军大长征医院侯春林等采用几丁糖预防肌腱粘连(1999年)。青岛大学毕莹等采用透明质酸钠膜预防腹膜与大肠浆膜的粘连(2002年)。他们的研究表明：这些材料都有一定的防粘连效果，但也存在着各种局限性。
开发一种新的防止术后粘连的材料，减轻病人的痛苦，减少外科手术后遗症，提高手术质量是急需解决的一个重要课题。
【发明内容】
本发明的目的在于开发一种新的防止术后粘连的材料，减轻病人的痛苦，减少外科手术后遗症，提高手术质量。
本发明的目的还在于提供一种上述材料的纯化方法。
本发明为O-取代羧甲基壳聚糖在外科手术防粘连材料中的应用，所述O-取代羧甲基壳聚糖具有以下单元结构式：
本发明对O-取代羧甲基壳聚糖、N-取代羧甲基壳聚糖、N，O-取代羧甲基壳聚糖分别进行以下对比试验，对其各性质进行分析：
1、碱量滴定、胶体滴定、红外光谱、核磁共振、元素分析、粘度等项分析，确定了羧甲基壳聚糖的分子量、脱乙酰度、羧甲基取代度和取代位置等结构参数，见图1、图2所示，及表1：
表1 试样 脱乙 酰度粘均分子 量×105 总取代度 O位取代度 N位取代度电位滴定胶体滴定电位滴定胶体滴定电位滴定胶体滴定 Chitosan 0.87 5.67 O-CMC 0.87 3.15 0.75 0.79 0.75 0.79 - - N-CMC 0.87 5.89 0.56 0.41 - - 0.56 0.41 N，O-CMC-1 0.87 5.12 0.56 0.38 0.19 0.1 0.37 0.28 N，O-CMC-2 0.68 2.89 0.75 0.64 0.35 0.26 0.4 0.39 N，O-CMC-3 0.68 3.62 0.84 0.75 0.34 0.31 0.5 0.44 N，O-CMC-4 0.79 3.96 0.93 0.86 0.61 0.32 0.61 0.54 N，O-CMC-5 0.87 3.31 1.18 1.09 0.46 0.33 0.72 0.76
质量指标如下：
外观：白色或浅黄色片状固体，易溶于水，水溶液中性
分子量在5～50万，
壳聚糖的脱乙酰度约为70～80％，
羧甲基壳聚糖的取代度大于65～80％，
Pb含量为0.00001～0.000065％，
As含量＜0.00001％。
2、材料生物降解性的分析：
溶菌酶的体外试验结果表明，所有羧甲基壳聚糖都具有生物降解性，
其生物降解速度、生物降解性受化学结构和分子量影响。
3、材料的生相溶性实验：
参照ISO10993-1：1992医疗器械生物学评价标准和要求，对不同取代CMC进行了细胞毒性试验、急性全身毒性试验、皮内刺激试验、过敏和热源试验。
a)细胞毒性试验：
O-CMC和N-CMC对体外培养的L929细胞形态不构成损害，对细胞的生长和增殖均无明显抑制作用，细胞增殖指数百分率与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。而N，O-CMC随着取代度的不同而具有不同程度的细胞毒性。
b)急性全身毒性试验：
O-CMC、N-CMC、透明质酸及羧甲基取代度较高(＞70％)的CMC实验组的小鼠活动进食及大小便正常，精神状态良好，无惊厥、瘫痪、呼吸抑制等毒性反应。体质量均有不同程度的增加。取代度较低(约50％)的CMC和壳聚糖实验组的小鼠运动减少，精神不佳、体重均有轻微下降，属轻至中度中毒。不排除残留的氯乙酸及所吸附的杂质的影响。经透析后两者的急性全身毒性降低，其急性全身毒性有待于进一步确定。
c)皮内刺激试验：
家兔试验所有样品侧和对照侧1、24、48小时记分均为0，均无红斑或水肿现象，表明受试物的刺激强度为无刺激性。
d)眼结膜刺激试验：
所有受试样品对家兔眼睛的影响无论是一次还是多次眼刺激试验，其结膜、虹膜、角膜和对照眼各测试时间点眼刺激反应记分均为0，表明受试物多次给药对眼无刺激性。
e)热原试验：
每只家兔注射O-CMC后，体温升高均未超过0.6℃，且3只家兔体温升高的总和低于1.4℃，说明O-CMC热原检查合格。
f)过敏性试验：
按《药理学实验》进行，实验组注射液的过敏性试验经诱导注射和激发2个阶段，各组与阴性对照组中，豚鼠无竖毛、喷嚏、干呕、咳嗽、呼吸困难、啰音、抽搐、虚脱或死亡等过敏反应，受试材料在本试验条件下对豚鼠未表现出致敏反应，反应记分均为0分。表明受试材料在本试验条件下对豚鼠未表现出致敏反应；而阳性对照组(10％卵白蛋白)均在激发阶段死亡。
以上结果表明，O-CMC和N-CMC无细胞毒性。取代度较低的CMC和壳聚糖的急性全身毒性可能与残留的氯乙酸有关。O-CMC、N-CMC及取代度较高的CMC无急性全身毒性，对家兔局部皮肤及眼无刺激性，对健康豚鼠全身无过敏反应。家兔耳缘静脉注射O-CMC无热原反应。证实O-CMC具有良好的生物相容性。
4、材料对机体细胞作用的评价：
如图3、图4、图5、图6、图7所示，结果表明，羧甲基壳聚糖对成纤维细胞和表皮细胞生长都有程度不同的抑制作用，其抑制作用受化学结构和材料浓度的影响。表2为不同浓度CMC和透明质酸钠(HA)对成纤维细胞增殖的影响。
表2药物浓度 抑制率(％) mg/mL N-CMC O-CMC N，O-CMC-1 N，O-CMC-2 N，O-CMC-3 N，O-CMC-4 HA 8 25.3 41.1 73.9 97.3 89.1 19.9 17.5 4 16.9 34.7 75.0 95.6 88.0 22.8 21.3
说明书 2 14.1 37.1 63.7 95.6 53.0 11.7 16.4 1 6.1 40.2 43.7 10.4 10.4 2.9 6.0 0(对照组) 0 0 0 0 0 0 0
HA和各种取代CMC对成纤维细胞的增殖都有抑制作用，但CMC在较低的浓度(1mg/mL)即可以抑制成纤维细胞的增殖。HA和CMC抑制成纤维细胞生长的特性，能减少创伤局部胶原纤维的形成，达到预防术后组织粘连、减少瘢痕的目的，而与HA相比，CMC有更强的抑制成纤维细胞增殖的作用。
表3为不同浓度CMC和HA对表皮细胞增殖的作用，各种取代度的N，O-CMC对表皮细胞增殖的抑制最强；N-CMC和HA对表皮细胞增殖的抑制较弱；高浓度下O-CMC对表皮细胞增殖只有较弱的抑制，而低浓度下O-CMC对表皮细胞增殖还有少许的促进作用。对表皮细胞增殖的抑制作用太强会影响伤口的愈合速度，这方面O-CMC应优于N，O-CMC。
表3 药物浓度 抑制率(％) mg/mL N-CMC O-CMC N，O-CMC-1 N，O-CMC-2 N，O-CMC-3 N，O-CMC-4 HA 8 38.9 35.0 77.8 69.0 86.4 75.2 41.5 4 13.8 19.5 73.2 68.0 81.0 39.0 16.3 2 1.7 -11.3 65.8 64.8 67.4 4.1 17.3 1 0.5 -5.9 32.3 51.2 57.3 6.2 10.7 0(对照组) 0 0 0 0 0 0 0
O-取代羧甲基壳聚糖(O-CMC)，制备简单可行，具有生物降解性，容易溶于中性水溶液(pH＝7.0)，能以溶液方式在体内施用，直接涂复到伤口表面，对于外形复杂的器官和组织的使用特别方便，这是它比壳聚糖更优异之处。与N-CMC和NO-CMC相比，O-CMC具有更好的生物相容性(即毒性最低)，对成纤维细胞的生长有合适的抑制性，对表皮细胞的生长有弱的作用。动物实验证明，O-CMC在所有取代结构的羧甲基壳聚糖中，其术后防止粘连效果是最好的。
【附图说明】
图1是壳聚糖和不同取代羧甲基壳聚糖红外光谱图。
图2是N，O-壳聚糖核磁共振谱图。
图3是实施例2空白组对成纤维细胞生长影响的光镜照片。
图4是实施例2透明质酸组对成纤维细胞生长影响的光镜照片。
图5是实施例2中N-CMC组对成纤维细胞生长影响的光镜照片。
图6是实施例2中N，O-CMC组对成纤维细胞生长影响的光镜照片。
图7是实施例2中O-CMC组对成纤维细胞生长影响的光镜照片。
图8是实施例3中O-CMC组7天后腹壁的照片。
图9实施例3中Chitosan组7天后腹壁的照片。
图10实施例3中空白组7天后腹壁的照片。
【具体实施方式】
实施例1
羧甲基壳聚糖的合成制备：
a)O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)
甲壳素5克，加入适量50％NaOH溶液和少量十二烷基苯磺酸钠，-18℃中碱化1～2天，滤去NaOH，加入氯乙酸22克，异丙醇80mL和少量NaBH4，室温搅拌3小时，60℃恒温3小时。过滤，沉淀用80％乙醇洗涤，再用95％乙醇冲洗，除去未反应的氯乙酸，干燥后得O-羧甲基甲壳素。于上述O-羧甲基甲壳素中，加入60％NaOH溶液90mL，80℃下反应0.5小时，120℃再反应1.5～2小时。倾去上清液，粘状物中加入适量水，溶解，过滤，乙酸调至中性，用95％酒精沉淀，过滤。无水乙醇及丙酮洗涤2～3次，干燥，得白色纤维状固体O-CMC。
b)N-羧甲基壳聚糖(N-CMC)
1克壳聚糖，加蒸馏水150mL，乙醛酸0.5克(壳聚糖∶乙醛酸的摩尔比为1∶1.2)，室温反应1.5小时，此时的pH值约为3.6。用10％NaOH调至pH值4～5，分次滴加10％NaBH4溶液5mL，再反应2小时。用稀盐酸调至中性，95％乙醇充分沉淀，过滤，无水乙醇及丙酮冲洗，干燥后得白色粉末N-CMC。
c)N，O-羧甲基壳聚糖(N，O-CMC)
壳聚糖粉末(脱乙酰度为87.29％)加入一定浓度的NaOH溶液，常温下碱化2小时。分次加入氯乙酸/异丙醇溶液，70℃反应6～8小时。冷却，倾出上清液，在粘状物中加入适量水，搅拌溶解，10％盐酸调至中性。滤去不溶物，滤液中加入适量95％乙醇沉淀，过滤，无水乙醇冲洗，烘干，得白色固体N，O-CMC。
实施例2
O-CMC的纯化按下步骤进行：
①粗O-CMC中加入适量蒸馏水，溶解，过滤，滤液用乙酸调至中性，用95％酒精沉淀，过滤，无水乙醇及丙酮洗涤2～3次，目的在于去除未反应的碱和氯乙酸，干燥得到白色纤维状固体。
②将上述粗提物加入适量的水重新溶解解，按粗提物∶活性炭＝1∶3的比例加入30目的活性炭，目的是除去热原及色素。4小时后用8μ的滤膜过滤，去除活性炭及少部分未反应的甲壳素。
③将上述②之滤液用分子量截留值为10000MWCO的透析膜对蒸镏水进行透析，冷冻干燥后得到白色固体。
④在无菌条件下，将上述步骤③之O-羧甲基壳聚糖重新溶解于蒸馏水中配成2％溶液，用0.45μ的滤膜过滤，可得植入用的O-CMC溶液。
实施例3
对大鼠回肠手术应用N-CMC、N，O-CMC-2、O-CMC、HA及空白对照组进行比较试验。
表4为文献Belluco的标准评分(Belluco C etal，J Surgica Reseach，2001，100：217-221)。
表4 粘连特征 记分 粘连面积百分比 0 ＜25％ ＜50％ ＜75％ ＜100％ 0 1 2 3 4 粘连种类 无粘连 薄膜，透明，无血管 不透明，或半透明，无血管 不透明，存在毛细血管 不透明，存在大的血管 0 1 2 3 4 粘连的韧性 无粘连 粘连本身易分离 粘连可牵引分离 粘连需利器分离 0 1 2 3
动物模型：SD大鼠，中下腹开腹，距切口1cm左侧腹壁造成缺损，面积1×2cm，后提出盲肠，对系膜侧肠壁擦伤，面积1×2cm，在伤口处施用试验材料2mL，将擦伤的盲肠面与腹壁缺损面相向放置，关腹。7天后处死动物，检查粘连的面积、粘连组织内血管的生长程度和粘连组织的韧性。根据表4评分标准，得分越高表示粘连越严重。粘连最严重的可得最大总分11分，若无粘连时，最小总分为0分。
表5为各种取代结构的CMC与HA的防粘连效果。
表5CMC的防粘连效果评价
材料 N-CMC N，O-CMC-2 N，O-CMC-5 O-CMC HA 空白
动物个数 n＝10 n＝10 n＝10 n＝10 n＝10 n＝10
评分 6.6±2.5 5.9±2.3 - 4.9±1.6 6.4±3.1 10.0±1.2
P＜0.001，差异有显著意义
N，O-CMC-2组在试验期间死亡4只，原因是毒性过大，无统计结果，该组首先被淘汰。记分结果表明，O-CMC组总分最低，N，O-CMC组、N-CMC组的总分依次增加，HA组与N-CMC组的总分相近，说明几种材料中O-CMC的防粘连效果最好。
表6为O-CMC、Chitosan、生理盐水及空白的防粘连效果：
表6O-CMC的防粘连效果评价
材料 O-CMC Chitosan 生理盐水 空白
动物个数 n＝21 n＝17 n＝10 n＝30
评分 4.62±2.9 5.76±2.3 8.7±2.2 9.6±1.8
P＜0.001，差异有显著意义
记分结果表明，O-CMC组得分最低，Chitosan组得分稍高，生理盐水组更高一些，空白组的得分最高，进一步说明O-CMC的防粘连效果比Chitosan好。
图8、图9和图10分别表明O-CMC组，Chitosan组和空白组在试验7天后腹壁的粘连情况，O-CMC组的粘连很少，Chitosan组的粘连较多，空白组的粘连十分严重，可见O-CMC的防粘连的效果最好。