一种透明质酸的生物发酵提取方法 技术领域 本发明涉及生物发酵技术领域 ( 基因、 细胞、 发酵工程 )， 更具体涉及一种透明质 酸的生物发酵提取方法。
背景技术 透明质酸广泛存在于动物的各种组织中， 其重要功能是保持细胞水分， 提高创口 愈合再生能力， 减少疤痕， 增强免疫力等作用。可用于非甾体消炎药， 关节炎治疗， 眼科、 心 外科手术的辅助药品。在治疗烫伤、 烧伤、 冻伤、 人造皮肤方面有独到作用。目前生产透明 质酸是自鸡、 羊等动物组织中提取， 原料限制高， 生产成本高， 生物发酵提取透明质酸不受 原料限制， 且安全可靠。
透明质酸可以广泛用于食品、 保健品、 化妆品、 药品等领域， 另外由透明质酸配制 的生化试剂， 在生物学界被广泛推广应用。
透明质酸在上世纪三十年代欧美国家已有研究， 并在七十年代开始自动物组织中 提取， 而国内在九十年代才开始研究并用传统提取法小批量生产。传统法大量采用丙酮等 有机溶剂， 环境污染大且存在安全隐患， 而生物发酵法， 安全可靠无污染。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种透明质酸的生物发酵提取方法， 方法易行， 操作 简便， 生产周期短、 成本低、 不产生任何有毒有害物质， 安全， 高效节能， 生产过程中不产生 污染。
为了实现上述的目的， 本发明采用以下技术措施 ：
一种透明质酸生物发酵提取方法， 其步骤如下 ：
1、 以链球菌为原菌株， 以紫外线和亚硝基胍为诱变剂， 对原菌株进行诱变， 再通过 对诱变株分离、 初筛、 复筛和性能检测， 得到生产性能好的生产菌株 ；
2、 将菌株接种于琼脂培养基上， 培养斜面菌种 ；
3、 取斜面菌种， 接于 1000ml 的三角烧瓶中， 三角烧瓶中按水和原料的比例加入水 500ml 葡萄糖 0.5％、 牛肉膏 0.5％、 蛋白胨 1％、 磷酸二氢钾 0.2％、 硫酸镁 0.1％配制培养 液， 37℃培养 13-17h， 经检查无杂菌污染， 生长良好， 备用 ；
4、 种子罐培养液 ( 原料同上③ )120℃灭菌 30min， 再冷却 37℃， 将三角烧瓶菌种按 种子罐培养液 5％的比例接入， 37℃培养 13-17h， 经检查长势好， 无污染， 备用 ；
5、 发酵罐培养液 ( 原料同上③ )120℃再依次灭菌、 冷却 37℃， 将种子罐菌种按发 酵罐培养液 10％的比例接入， 维持通气量 550L/min， 37℃培养 41-48h ；
6、 发酵液升温至 80℃恒温灭活 10min ；
7、 然后按发酵液重量的 0.3％加入活性炭， 吸附 1h， 过滤脱碳和除去菌体 ；
8、 过滤液搅拌下加入 1％的 CPB 水溶液 ( 常用液体试剂配比 )， 静置收集沉淀， 除 去上清液 ；9、 沉淀加入发酵液等体积的 0.4mol/L 的氯化钠溶液， 搅拌解离 6h ；
10、 解离液通过离子交换脱色 ；
11、 脱色液经膜分离浓缩和纯化 ；
12、 浓缩液加入三倍体积的 95( 产品常规浓度 )％乙醇， 析出沉淀 ；
13、 沉淀经干燥得透明质酸成品。
所述的链球菌为 ： 兽疫链球菌、 马链球菌、 类马链球菌 ( 中科院微生物储藏所或市 场上购置 )。
本发明与现有技术相比， 具有以下优点和效果 ：
1、 采用本发明生产方法， 有效地解决了传统工艺带来的环境污染和安全隐患。
2、 采用本发明脱离了对原材料生产的严重依赖， 不因原材料缺少而带来的生产不 稳定。
3、 采用本发明的膜分离技术， 对液态物料进行分离、 浓缩和纯化， 均在常温下操 作、 无相态变化、 高效节能， 并且生产过程中不产生污染。
4、 本发明采用离子交换进行脱色， 既避免了有害物质在产品中的残留， 又能保证 产品的天然洁白度。 5、 本发明生产周期短、 成本低、 不产生任何有毒有害物质， 安全， 无毒副作用， 可广 泛用于化妆品、 食品、 药品等领域。
本发明经多次试验得到如下数据 ：
项目 化妆品级 食品级 医药级
外观白 色粉末 白色粉末 白色粉末 6 6
分子量 1.6×10 1.6×10 1.6×106
蛋白质 ≤ 0.1％ ≤ 0.1％ ≤ 0.05％
干燥失重 ＜ 10％ ＜ 10％ ＜ 10％
炽烧残渣 ＜ 20％ ＜ 20％ ＜ 20％
PH(0.1％水溶液 ) 6.0-7.5 6.0-7.5 6.0-7.5
重金属 ( 以铅计 ) ＜ 20ppm ＜ 20ppm ＜ 20ppm
砷 ＜ 2ppm ＜ 2ppm ＜ 2ppm
细菌总数 ＜ 100cfu/g ＜ 100cfu/g ＜ 100cfu/g
细菌内毒素 ------＜ 1EU/mg
其他微生物指标 符合国家标准 符合国家标准 符合国家标准
产品收率 8 克 /L 7 克 /L 6 克 /L
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明方法做进一步的详细说明。
实施例 1 ：
一种透明质酸的生物发酵提取方法， 其步骤是 ：
A、 以兽疫链球菌为原始菌株， 分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍 对菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、 初筛、 复筛和性能检测， 得到生产性能好的生产菌 株；B、 将菌株接种于斜面琼脂培养基上， 40℃恒温培养 48h， 得到斜面菌种 ；
C、 1000ml 三 角 烧 瓶 中 按 水 和 原 料 的 比 例 加 入 水 500ml 葡 萄 糖 0.5 ％、 牛肉膏 0.5％、 蛋白胨 1％、 磷酸二氢钾 0.2％、 硫酸镁 0.1％配制培养液， 120℃灭菌 30min， 降温至 37℃， 将斜面菌种接入三角烧瓶， 37℃恒温培养 15h ；
D、 按 1 ∶ 10 比例接入种子罐， 扩培液体菌种 ( 种子罐培养液原料、 处理同 C)， 种子 罐培养液再按以上条件发酵 12-16h， 再按 1 ∶ 10 的比例接入发酵罐 ( 发酵罐发酵液原料、 处理同 C)， 发酵罐通气发酵 45h， 发酵完成， 经检查生长良好， 无污染得到发酵液 ；
E、 发酵液升温至 80℃恒温灭活 10min， 然后按发酵液重量的 0.3％加入活性炭， 吸 附 1h， 过滤脱碳和除去菌体 ；
F、 过滤液搅拌下加入 1％的 CPB 水溶液， 静置收集沉淀， 除去上清液 ；
G、 沉淀加入发酵液等体积的 0.4mol/L 的氯化钠溶液， 搅拌解离 6h ；
H、 解离液通过离子交换脱色 ； 脱色液经膜分离浓缩和纯化 ；
I、 浓缩液加入三倍体积的 95％乙醇， 析出沉淀 ； 沉淀经干燥得透明质酸成品， 一 般收率为 8 克 /L。
实施例 2 ：
A、 以类马链球菌为原始菌株， 分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍 对菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、 初筛、 复筛和性能检测， 得到生产性能好的生产菌 株；
B、 将菌株接种于斜面琼脂培养基上， 40℃恒温培养 36h， 得到斜面菌种 ；
C、 1000ml 三 角 烧 瓶 中 按 水 和 原 料 的 比 例 加 入 水 500ml 葡 萄 糖 0.5 ％、 牛肉膏 0.5％、 蛋白胨 1％、 磷酸氢二钾 0.2％、 硫酸镁 0.1％配制培养液， 120℃灭菌 30min， 降温至 37℃， 将斜面菌种接入三角烧瓶， 37℃恒温培养 16h ；
D、 按 1 ∶ 10 比例接入种子罐， 扩培液体菌种 ( 种子罐培养液原料、 处理同 C 步骤 )， 种子罐培养液再按以上条件发酵 16h， 再按 1 ∶ 10 的比例接入发酵罐 ( 发酵罐发酵液原料、 处理同 C 步骤 )， 发酵罐通气发酵 45h， 发酵完成 ；
E、 发酵液升温至 80℃恒温灭菌 10min， 然后按发酵液重量的 0.3％加入活性炭， 吸 附 1h， 过滤脱碳和除去菌体 ；
F、 过滤液搅拌下加入 1％的 CPB 水溶液， 静置收集沉淀， 除去上清液， 沉淀加入发 酵液等体积的 0.4mol/L 的氯化钠溶液， 搅拌解离 6h ；
G、 解离液通过离子交换脱色 ； 脱色液经膜分离浓缩和纯化 ；
H、 浓缩液加入三倍体积的 95％乙醇， 析出沉淀 ；
I、 沉淀经干燥得透明质酸成品， 平均每升发酵液得成品 7 克。
实施例 3 ：
A、 以马链球菌为原始菌株， 分别采用物理诱变剂紫外线和化学诱变剂亚硝基胍对 菌株进行诱变。再通过对诱变株分离、 初筛、 复筛和性能检测， 得到生产性能好的生产菌 株；
B、 将菌株接种于斜面琼脂培养基上， 40℃恒温培养 36h， 得到斜面菌种 ；
C、 1000ml 三 角 烧 瓶 中 按 水 和 原 料 的 比 例 加 入 水 500ml 葡 萄 糖 0.5 ％、 牛肉膏 0.5％、 蛋白胨 1％、 磷酸二氢钾 0.2％、 磷酸氢二钾 0.2％、 硫酸镁 1％配制培养液， 120℃灭菌 30min， 降温至 37℃， 将斜面菌种接入三角烧瓶， 37℃恒温培养 15h ；
D、 按 1 ∶ 10 比例接入种子罐， 扩培液体菌种 ( 种子罐培养液原料、 处理同 C 步骤 )， 种子罐培养液再按以上条件发酵 15h， 再按 1 ∶ 10 的比例接入发酵罐 ( 发酵罐发酵液原料、 处理同 C 步骤 )， 发酵罐通气发酵 45h， 发酵完成 ；
E、 发酵液升温至 80℃恒温灭菌 10min， 然后按发酵液重量的 0.3％加入活性炭， 吸 附 1h， 过滤脱碳和除去菌体 ；
F、 过滤液搅拌下加入 1％的 CPB 水溶液， 静置收集沉淀， 除去上清液， 沉淀加入发 酵液等体积的 0.4mol/L 的氯化钠溶液， 搅拌解离 6h ；
G、 解离液通过离子交换脱色 ； 脱色液经膜分离浓缩和纯化 ；
H、 浓缩液加入三倍体积的 95％乙醇， 析出沉淀 ；
I、 沉淀经干燥得透明质酸成品， 平均每升发酵液得 6 克成品。6