可作为Α葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法.pdf

本发明公开了一种可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法。该制备方法是首先采用乙醇对桦褐孔菌加热回流而获得乙醇浸膏，然后将乙醇浸膏充分分散于蒸馏水中，并用石油醚进行萃取，以除去浸膏中对α-葡萄糖苷酶无抑制活性的低极性组分，再用乙酸乙酯对萃余物进行萃取，从而获得对α-葡萄糖苷酶具有很强抑制活性的提取物，得率为2～4％。试验证明，利用本发明提供的制备方法所获得的桦褐孔菌提取物对α-葡萄糖苷酶具有很强的抑制活性，400μg剂量时抑制率达到80.5％，IC50为103.9μg/mL，因此可用于降糖药物的开发。另外，本制备方法还具有工艺简单、操作方便等优点。

1、  一种可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括按顺序进行的下列步骤：
(1)将桦褐孔菌粉碎后过30目筛，然后以80％浓度的乙醇作为提取溶剂加热回流提取3～5次，每次1～2小时，合并提取液，离心或抽滤分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得乙醇浸膏；
(2)将上述乙醇浸膏分散于蒸馏水中，然后用石油醚振荡萃取3～6次，每次2～4小时，将萃取液和水相萃余物分离；
(3)将上述水相萃余物用乙酸乙酯振荡萃取3～6次，每次2～4小时，然后将萃取液合并浓缩并干燥，即可获得对α-葡萄糖苷酶具有很强抑制活性的桦褐孔菌提取物。

2、  根据权利要求1所述的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中乙醇与桦褐孔菌的用量比为8～12mL：1g，回流提取温度为60～80℃。

3、  根据权利要求1所述的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中乙醇浸膏与蒸馏水的用量比为1g:20～50mL。

4、  根据权利要求1所述的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中石油醚的用量为乙醇浸膏重量的10～30倍。

5、  根据权利要求1所述的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中乙酸乙酯的用量为乙醇浸膏重量的10～30倍。

可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法
技术领域
本发明涉及一种可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法，属于中草药活性成分制备及化学化工技术领域。
背景技术
糖尿病是一种多病因的代谢疾病，其特点是慢性高血糖，并且伴随着因胰岛素分泌及作用缺陷而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。目前发达国家糖尿病的患病率在6-10％以上，我国患者人数在4000万以上，患病率约为2～4％，成为继心血管和肿瘤之后的第三位“健康杀手”，特别是随着全球人口的老龄化，该病的发病率呈持续上升趋势。糖尿病可导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭、神经病变、肢体损坏以致截肢、昏迷等多种并发症，造成多器官、多系统的广泛损伤，具有较高的致残率，从而严重地影响患者的生活质量。根据病因不同，糖尿病分为称为I型的胰岛素依赖型和称为II型的非胰岛素依赖型。其中I型糖尿病主要依赖胰岛素来治疗，II型糖尿病不能单纯依靠补充胰岛素，还需要口服降糖药，常用的降糖药主要包括胰岛素促泌剂、胰岛素增敏剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂三类。
α-葡萄糖苷酶包括位于小肠腔的α-淀粉酶、小肠刷状缘的麦芽糖酶、α-糊精酶和蔗糖酶等。正常人进食后，食物中的碳水化合物如淀粉先经α-淀粉酶作用生成麦芽糖、麦芽三糖、α-糊精等，随后和蔗糖一起通过蔗糖酶等α-糖苷酶水解作用生成葡萄糖、半乳糖和果糖，经肠壁细胞吸收而被机体利用。糖尿病患者因代谢障碍而导致血糖浓度发生异常改变。预防和治疗这类疾病的有效方法之一是限制或延缓多糖在消化道内分解，为此就必须降低α-葡萄糖苷酶活性。α-葡萄糖苷酶抑制剂通过可逆地占据仅一葡萄糖苷酶与糖的络合位点，抑制仅一葡萄糖苷酶催化多糖降解为单糖，从而延缓肠道碳水化合物的吸收。与其他口服降糖药及胰岛素治疗相比，α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物最显著的特征是能有效阻止糖尿病患者的餐后血糖升高，使患者血糖平稳且缓慢地维持在一定水平，改善血糖稳定指数；由于抑制了α-葡萄糖苷酶对肠道碳水化合物的分解速度，避免了餐后可能发生的血糖过高。另外，α-葡萄糖苷酶抑制剂往往具有调节脂肪生成、抗AIDS病毒感染等作用。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂成为安全高效的抗糖尿病药物而成为了研究热点。
桦褐孔菌是一种药用真菌，主要分布在北纬45°-50°的寒冷地区，含有以多糖、三萜类、甾体类和多酚类化合物为主的多种成分，具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、抗炎、止痛、抗血小板凝集、抗病毒、增强机体免疫力等多种药理活性。从16世纪开始，俄罗斯、波兰、芬兰等国的居民就已经开始食用，并且用于防治胃肠道、糖尿病、癌症等多种疾病。但到目前为止尚未发现有关从桦褐孔菌中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法见诸报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种提取物对α-葡萄糖苷酶具有很强的抑制活性，并且工艺简单、操作方便的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法。
为了达到上述目的，本发明提供的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法包括按顺序进行的下列步骤：
(1)将桦褐孔菌粉碎后过30目筛，然后以80％浓度的乙醇作为提取溶剂加热回流提取3～5次，每次1～2小时，合并提取液，离心或抽滤分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得乙醇浸膏；
(2)将上述乙醇浸膏分散于蒸馏水中，然后用石油醚振荡萃取3～6次，每次2～4小时，将萃取液和水相萃余物分离；
(3)将上述水相萃余物用乙酸乙酯振荡萃取3～6次，每次2～4小时，然后将萃取液合并浓缩并干燥，即可获得对α-葡萄糖苷酶具有很强抑制活性的桦褐孔菌提取物。
所述的步骤(1)中乙醇与桦褐孔菌的用量比为8～12mL：1g，回流提取温度为60～80℃。
所述的步骤(2)中乙醇浸膏与蒸馏水的用量比为1g:20～50mL。
所述的步骤(2)中石油醚的用量为乙醇浸膏重量的10～30倍。
所述的步骤(3)中乙酸乙酯的用量为乙醇浸膏重量的10～30倍。
本发明提供的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法是首先采用乙醇对桦褐孔菌加热回流而获得乙醇浸膏，然后将乙醇浸膏充分分散于蒸馏水中，并用石油醚进行萃取，以除去浸膏中对α-葡萄糖苷酶无抑制活性的低极性组分，再用乙酸乙酯对萃余物进行萃取，从而获得对α-葡萄糖苷酶具有很强抑制活性的提取物，得率为2～4％。试验证明，利用本发明提供的制备方法所获得的桦褐孔菌提取物对α-葡萄糖苷酶具有很强的抑制活性，400μg剂量时抑制率达到80.5％，IC₅₀为103.9μg/mL，因此可用于降糖药物的开发。另外，本制备方法还具有工艺简单、操作方便等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明提供的可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的桦褐孔菌提取物制备方法进行详细说明。
实施例1：
(1)将100g桦褐孔菌粉碎后过30目筛，然后以1000mL80％浓度的乙醇作为提取溶剂，在70℃的温度下加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液，离心分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得16.2g乙醇浸膏；
(2)将上述乙醇浸膏分散于324mL蒸馏水中，然后用162mL石油醚振荡萃取3次每次2小时，将萃取液和水相萃余物分离；
(3)将上述水相萃余物用162mL乙酸乙酯振荡萃取3次，每次2小时，然后将萃取液合并浓缩并干燥，即可获得2.1g对α-葡萄糖苷酶具有很强抑制活性的棕褐色粉状桦褐孔菌提取物。
实施例2：
(1)将100g桦褐孔菌粉碎后过30目筛，然后以1200mL80％浓度的乙醇作为提取溶剂，在75℃的温度下加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，抽滤，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得18.1g乙醇浸膏；
(2)将上述乙醇浸膏分散于543mL蒸馏水中，然后用362mL石油醚振荡萃取4次，每次2小时，将萃取液和水相萃余物分离；
(3)将上述水相萃余物用362mL乙酸乙酯振荡萃取4次，每次2小时，然后将萃取液合并浓缩并干燥，即可获得3.3g对α-葡萄糖苷酶具有很强抑制活性的棕褐色粉状桦褐孔菌提取物。
实施例3：
(1)将100g桦褐孔菌粉碎后过30目筛，然后以1200mL80％浓度的乙醇作为提取溶剂，在75℃的温度下加热回流提取5次，每次2小时，合并提取液，抽滤，分离上清液，并将上清液浓缩干燥后获得22.3g乙醇浸膏；
(2)将上述乙醇浸膏分散于1115mL蒸馏水中，然后用669mL石油醚振荡萃取4次，每次4小时，将萃取液和水相萃余物分离；
(3)将上述水相萃余物用669mL乙酸乙酯振荡萃取4次，每次4小时，然后将萃取液合并浓缩并干燥，即可获得4.0g对α-葡萄糖苷酶具有很强抑制活性的棕褐色粉状桦褐孔菌提取物。
为了验证利用本发明提供的制备方法所获得的桦褐孔菌提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，本发明人对从上述实施例中获得的桦褐孔菌提取物进行了体外α-葡萄糖苷酶抑制试验，试验方法及结果如下：
在2.0mL反应体系中分别加入不同浓度的桦褐孔菌提取物溶液0.1mL、40mmol/L的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苯0.1mL、0.1mol/L pH为6.8的磷酸盐缓冲液1.7mL以及0.125U/mL的α-葡萄糖苷酶0.1mL；以不加桦褐孔菌提取物溶液的反应体系为原始酶活体系，不加α-葡萄糖苷酶和4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苯的体系作为提取物空白。将上述反应体系在37℃的温度下保温30min，然后加入0.1mol/L的碳酸钠溶液4mL终止反应，于波长400nm处测定在酶的作用下释放出的对硝基酚的吸光度。
其中酶活力单位定义为：37℃、pH6.8条件下，反应体系中对硝基酚在400nm处每分钟吸光值变化0.001规定为一个酶活力单位。
一个抑制剂活力单位定义：37℃、pH6.8条件下，相同时间内降低1个酶活力单位的吸光值。
抑制百分率＝[1-(提取物吸光值-提取物空白吸光值)/酶活吸光值]×100％
测试结果如表1所示：
表1 桦褐孔菌提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性