半枝莲中黄酮类抗肿瘤活性成分的提取方法.pdf

本发明涉及植物有效成分的提取和分离技术领域，具体地说是运用大孔吸附树脂方法提取半枝莲中所含木樨草素和芹菜素的方法。本发明将半枝莲干燥、粉碎，用乙醇水溶液提取回收乙醇，稀释过滤得澄清水溶液，为吸附上柱液；将自行合成的吸附树脂MDG装入吸附柱中，将上柱液通过树脂柱吸附，然后以乙醇水溶液解吸，将解吸液减压蒸馏回收乙醇、浓缩、真空干燥，得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。本发明通过“吸附-解吸”一步工艺，得到高纯度的木犀草素和芹菜素提取物，工艺简单，环境友好、不使用有毒溶剂、生产成本低廉、树脂可重复使用，适于大规模工业化生产。

1.  一种高选择性大孔吸附树脂的制备方法，包括下列步骤：
在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成质量百分含量为1~5％的水溶液，加热至30℃；将丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、二乙烯苯、长链烷烃、偶氮二异丁氰混合成油相，各物质在油相中的质量百分含量为20~30％、5~15％、5~10％、5~20％、50~60％、1~2％，水相和油相质量比为3:1，按照常规悬浮聚合的方法，先缓慢升温至60~70℃反应4小时，然后继续升温至90℃反应6小时；最后经过滤、洗涤处理后得到高选择性大孔吸附树脂，编号为MDG。

2.  按照权利要求1所述的高选择性大孔吸附树脂MDG，其特征在于，该树脂为白色、球形，粒径为0.3~1.0mm，比表面积为120~600m²/g的干树脂，含水率为50~70％，平均孔径为20~50nm，孔隙率为50~70％。

3.  一种半枝莲中黄酮类抗肿瘤活性成分的提取方法，包括下列步骤：
a)半枝莲全草干燥、粉碎，在60~75℃时用体积百分数为70~90％的乙醇水溶液提取2小时，重复提取2~3次，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至溶液与原料半枝莲体积质量比ml/g为5/1~10/1，；过滤得澄清水溶液，为吸附上柱液；
b)将权利要求1所述方法制备的高选择性大孔吸附树脂MDG装入吸附柱中，吸附柱的径长比为1/5~1/20；
c)室温下，将上柱液以1.0~2.0BV/小时的流速通过b)所述树脂柱吸附，其中木犀草素和芹菜素被吸附在树脂柱上，每次上柱吸附时，树脂的处理量为0.3~0.8g半枝莲/ml湿树脂；
d)吸附完成后，用水将树脂清洗干净，然后以体积百分数为50~70％的乙醇水溶液解吸，解吸速度为0.5~1BV/小时，收集解吸液；
e)将上述解吸液减压蒸馏回收乙醇、浓缩、真空干燥，得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物；经高效液相色谱检测，其中木犀草素质量百分含量为30~35％，芹菜素含量为60~65％。

半枝莲中黄酮类抗肿瘤活性成分的提取方法
技术领域
本发明涉及植物有效成分的提取和分离技术领域，具体说是运用大孔吸附树脂方法提取半枝莲中所含木樨草素和芹菜素的方法。
背景技术
半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)为唇形科黄芩属植物，别名狭叶韩信草、并头草、牙刷草等，以干燥全草入药。其名最早见于《外科正宗》，味辛、苦，性寒，归肺、肝、肾经，具有清热解毒、散瘀止血、利尿消肿的功效，用于疔疮肿毒、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、跌扑肿痛及水肿、黄疸等。日本学者在通过体外实验对800种中药作抗肿瘤活性筛选时发现有88种中药对肿瘤细胞增殖的抑制率在90％以上，其中半枝莲对JTc-26肿瘤细胞体外抑制率达100％，其对正常细胞的抑制率则仅为50％。半枝莲的主要生理活性物质为黄酮类化合物，现代药理学研究表明，半枝莲黄酮类化合物对A549、HL-60、HONE1、KB、HT29、U937型肿瘤细胞有明显的抑制作用。
半枝莲全草含多种黄酮，文献报道其黄酮的主要包括野黄芩苷、野黄芩素、木犀草素和芹菜素等，其中以木犀草素和芹菜素抗肿瘤活性最为明显，有广泛的应用前景，而其他的黄酮类物质的抗肿瘤作用未见报道。木犀草素和芹菜素的结构式如下：

木犀草素                  芹菜素
木犀草素是抗肿瘤的启动因子。研究证实其对多种实体瘤、腹水癌和白血病细胞有显著抑制作用。木犀草素还能增敏多种致凋亡因子，具有多靶点抗肿瘤的潜力(张芳芳，沈汉明，朱心强，木犀草素抗肿瘤作用的研究进展，浙江大学学报(医学版)，2006，35(5)：573-578)。芹菜素的抗肿瘤作用主要表现在抗肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、干扰肿瘤细胞的信号传导途径、抗氧化等方面(苑林宏，芹菜素抗肿瘤作用的研究进展，中国公共卫生，2004，20(2)：241-242)。二者均是非常有前途的潜在抗肿瘤药物。
目前，半枝莲黄酮的提取主要集中在总黄酮的提取为主，常见的提取方法有溶剂提取法和微波提取法([1]邸多隆，刘丽春，刘晔玮等，半枝莲提取工艺的研究，中成药，2003，25(7)：530-532；[2]薛梅，王自军，周静，半枝莲中总黄酮和多糖的微波提取与含量测定，时珍国医国药，2005，16(10)：965-966)，这两种提取方法只能得到粗提物。涂其顺等应用吸附树脂法精制半枝莲总黄酮，得到了纯度较高的提取物(涂其顺，蔡光明，黄媛等，大孔树脂分离纯化半枝莲总黄酮的研究，中南药学，2008，6(2)：171-174)。在前述大孔树脂法提取总黄酮的报道中使用的树脂为全苯乙烯结构或含少量极性基团的吸附树脂，疏水作用很强，而黄酮类物质具有大部分相同的疏水性结构，因此这些树脂对黄酮具有相同的吸附能力，无法将木犀草素和芹菜素从半枝莲总黄酮中提取出来。为此，我们合成了一种大孔吸附树脂MDG，从半枝莲全草中提取得到高纯度的木犀草素和芹菜素，工艺简单，易于实现大规模工业化生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种以高选择性大孔吸附树脂作为主要提取介质的半枝莲黄酮类抗肿瘤成分的树脂法提取方法。
本发明所用的高选择性大孔吸附树脂的制备方法，包括下列步骤：
在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成1~5％的水溶液，加热至30℃；将丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、二乙烯苯、长链烷烃、偶氮二异丁氰混合成油相，各物质在油相中的质量百分含量为20~30％、5~15％、5％、10％、50％、1~2％，水相和油相质量比为3：1，按照常规悬浮聚合的方法，先缓慢升温至60~70℃反应4小时，然后继续升温至90℃反应6小时；最后经过滤、洗涤处理后得到吸附树脂，编号为MDG。
MDG树脂为白色、球形，粒径为0.3~1.0mm，比表面积为120~600m²/g的干树脂，含水率为50~70％，平均孔径为20~50nm，孔隙率为50~70％。
本发明的半枝莲中黄酮类抗肿瘤活性成分的提取方法，包括下列步骤：
a)半枝莲全草干燥、粉碎，在60~75℃时用体积百分数为70~90％的乙醇水溶液提取2小时，重复提取2~3次，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释，溶液体积与原料半枝莲质量比为5/1~10/1，溶液体积以毫升计、原料半枝莲质量以克计；过滤得澄清水溶液，为吸附上柱液；
b)将大孔吸附树脂装入吸附柱中，吸附柱的径长比为1/5~1/20；
c)室温下，将上柱液以1.0~2.0BV/小时的流速通过MDG树脂柱吸附，其中木犀草素和芹菜素被吸附在MDG树脂柱上，每次上柱吸附时，树脂的处理量为0.3~0.8g半枝莲/ml湿树脂；
d)吸附完成后，用水将树脂清洗干净，然后以体积百分数为50~70％的乙醇水溶液解吸，解吸速度为0.5~1BV/小时，收集解吸液；
e)将上述解吸液减压蒸馏回收乙醇、浓缩、真空干燥，得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物；经高效液相色谱检测，其中木犀草素质量百分含量为30~35％，芹菜素含量为60~65％。
本发明的优点和积极效果：本发明根据半枝莲中木犀草素和芹菜素的结构特征，合成了一种高选择性的大孔吸附树脂MDG，仅通过“吸附-解吸”一步简单工艺，即可得到高纯度的木犀草素和芹菜素提取物，工艺简单，环境友好、不使用有毒溶剂、生产成本低廉、树脂可重复使用，适于大规模工业化生产。制得的木犀草素和芹菜素质量稳定，其中木犀草素的质量百分含量约为30~35％，芹菜素的质量百分含量约为60~65％，。本发明的工业化应用可为半枝莲的抗肿瘤活性研究以及药物开发提供大量高纯度的试验样品。
具体实施方式
实施例1：
通过以下步骤制备高选择性大孔吸附树脂MDG：
在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成质量百分数为1％的水溶液450g，于1000ml三口瓶中水浴加热至30℃；以45g丙烯酸甲酯、7.5g甲基丙烯酸甲酯、7.5g苯乙烯和15g二乙烯苯的混合物为总反应单体、以50g甲苯和25g液蜡混合做为致孔剂、以3g偶氮二异丁腈为引发剂，混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠尺寸在0.3-1.0mm之间，经悬浮聚合，以1℃/min的升温速度缓慢升温至70℃反应4小时，再继续升温至90℃反应6小时，停止反应，经过滤、洗涤处理后，得到MDG树脂。
实施例2：
在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成质量百分数为3％的水溶液450g，于1000ml三口瓶中水浴加热至30℃；以30g丙烯酸甲酯、10g甲基丙烯酸甲酯、10g苯乙烯和10g二乙烯苯的混合物为总反应单体、以60g甲苯和30g液蜡混合做为致孔剂、以1.5g偶氮二异丁腈为引发剂，混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠尺寸在0.3-1.0mm之间，经悬浮聚合，以1℃/min的升温速度缓慢升温至70℃反应4小时，，再继续升温至90℃反应6小时，停止反应，经过滤、洗涤处理后，得到MDG树脂。
实施例3：
通过MDG树脂从半枝莲全草中制备高纯度黄酮类抗肿瘤成分的提取工艺
将10g半枝莲干燥全草粉碎，70ml 70％的乙醇水溶液60℃加热回流提取2小时，共2次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至50ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径15mm，柱长250mm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为1.0BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用50％乙醇水溶液解吸，解吸速度为0.5BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为31.1％，芹菜素的总含量为质量百分含量为61.8％。
实施例4：
将10g半枝莲干燥全草粉碎，100ml 90％的乙醇水溶液75℃加热回流提取2小时，共3次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至100ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径15mm，柱长250mm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为2.0BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用70％乙醇水溶液解吸，解吸速度为1.0BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为32.4％，芹菜素的总含量为质量百分含量为63.8％。
实施例5：
将20g半枝莲干燥全草粉碎，150ml 70％的乙醇水溶液60℃加热回流提取2小时，共2次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至100ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径15mm，柱长250mm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用50％乙醇水溶液解吸，解吸速度为0.5BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为30.9％，芹菜素的总含量为质量百分含量为62.7％。
实施例6：
将20g半枝莲干燥全草粉碎，200ml 70％的乙醇水溶液60℃加热回流提取2小时，共3次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至100ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径15mm，柱长250mm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为2.0BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用60％乙醇水溶液解吸，解吸速度为1.0BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为30.7％，芹菜素的总含量为质量百分含量为64.1％。
实施例7：
将20g半枝莲全草粉碎，200ml 90％的乙醇水溶液75℃加热回流提取2小时，共3次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至200ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径15mm，柱长250mm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为2.0BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用70％乙醇水溶液解吸，解吸速度为1BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为32.4％，芹菜素质量百分含量为64.8％。
实施例8：
将200g半枝莲干燥全草粉碎，1500ml 70％的乙醇水溶液60℃加热回流提取2小时，共2次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至1000ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径5cm，柱长60cm，装有500ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用60％乙醇水溶液解吸，解吸速度为0.5BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为33.1％，芹菜素的总含量为质量百分含量为63.2％。
实施例9：
将400g半枝莲干燥全草粉碎，700ml 90％的乙醇水溶液60℃加热回流提取2小时，共3次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至2000ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径5cm，柱长60cm，装有500ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用70％乙醇水溶液解吸，解吸速度为1.0BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素和芹菜素的含量为94.7％(质量百分数，木犀草素31.4％，芹菜素63.3％)。
实施例10：
将20g半枝莲全草粉碎，200ml 90％的乙醇水溶液70℃加热回流提取2小时，共2次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至200ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径15mm，柱长250mm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为1.0BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用70％乙醇水溶液解吸，解吸速度为1BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为32.3％，芹菜素的总含量为质量百分含量为63.2％。
实施例11：
将400g半枝莲干燥全草粉碎，700ml 90％的乙醇水溶液60℃加热回流提取2小时，共3次，过滤后合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水稀释至2000ml，过滤得澄清溶液，将其通入MDG树脂柱(柱内径5cm，柱长60cm，装有500ml湿树脂)，吸附速度为1.5BV/h，吸附完成后，用去离子水清洗树脂柱，用70％乙醇水溶液解吸，解吸速度为1.0BV/h，将解吸液经减压蒸馏、真空干燥得到半枝莲黄酮类抗肿瘤活性成分的提取物。经高效液相色谱检测，其中木犀草素的质量百分含量为30.8％，芹菜素的总含量为质量百分含量为64.1％。