抗变异链球菌多肽及其应用与制备方法.pdf

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及抗变异链球菌多肽及其应用与制备方法，其特征在于：应用基因克隆技术，构建麦芽糖结合蛋白(MBP)、大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。本发明还公开了编码重组多肽的核苷酸序列，以及所述核苷酸序列的重组质粒。本发明的抗菌多肽是针对致龋的变异链球菌直接在靶细胞的细胞膜上形成离子通道而达到杀菌的目的。

1、  抗变异链球菌多肽，其特征在于：应用基因克隆技术，构建麦芽糖结合蛋白(MBP)、大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。

2、  根据权利要求1所述的抗变异链球菌多肽，其特征在于：所述的抗变异链球菌多肽的基因含有SE QI DNO.1的核苷酸序列：
GACGCAATTAATTTCACAACAGAGTTCCTGAAATCAGTTTCAGAAAAATATGGTGCAAAAGCTGAGCAGTTAGCCAGAGAGATGGCCGGGCAGGCTAAAGGGAAGAAAATACGTAATGTTGAAGAGGCATTAAAAACGTATGAAAAGTACCGGGCTGACATTAACAAAAAAATTAATGCAAAAGATCGTGCAGCGATTGCCGCAGCCCTTGAGTCTGTGAAGCTGTCTGATATATCGTCTAATCTGAACAGATTCAGTCGGGGACTGGGATATGCAGGAAAATTTACAAGTCTTGCTGACTGGATCACTGAGTTTGGTAAGGCTGTCCGGACAGAGAACTGGCGTCCTCTTTTTGTTAAAACAGAAACCATCATAGCAGGCAATGCCGCAACGGCTCTTGTGGCACTGGTCTTCAGTATTCTTACCGGAAGCGCTTTAGGCATTATCGGGTATGGTTTACTGATGGCTGTCACCGGTGCGCTGATTGATGAATCGCTTGTGGAAAAAGCGAATAAGTTCTGGGGTATTGGATCCACCTTTTTTCGTCTGTTTAACCGT

3、  根据权利要求1所述的抗变异链球菌多肽，其特征在于：所述的大肠杆菌素Ia通道结构域含有SEQ ID NO.2的核苷酸序列：
GACGCAATTAATTTCACAACAGAGTTCCTGAAATCAGTTTCAGAAAAATATGGTGCAAAAGCTGAGCAGTTAGCCAGAGAGATGGCCGGGCAGGCTAAAGGGAAGAAAATACGTAATGTTGAAGAGGCATTAAAAACGTATGAAAAGTACCGGGCTGACATTAACAAAAAAATTAATGCAAAAGATCGTGCAGCGATTGCCGCAGCCCTTGAGTCTGTGAAGCTGTCTGATATATCGTCTAATCTGAACAGATTCAGTCGGGGACTGGGATATGCAGGAAAATTTACAAGTCTTGCTGACTGGATCACTGAGTTTGGTAAGGCTGTCCGGACAGAGAACTGGCGTCCTCTTTTTGTTAAAACAGAAACCATCATAGCAGGCAATGCCGCAACGGCTCTTGTGGCACTGGTCTTCAGTATTCTTACCGGAAGCGCTTTAGGCATTATCGGGTATGGTTTACTGATGGCTGTCACCGGTGCGCTGATTGATGAATCGCTTGTGGAAAAAGCGAATAAGTTCTGGGGTATT

4、  根据权利要求1所述的抗变异链球菌多肽，其特征在于：所述的变异链球菌感受刺激多肽CSP的基因含有SEQ ID NO.3的核苷酸序列：
ACCTTTTTTCGTCTGTTTAACCGT。

5、  根据权利要求1所述的重组抗变异链球菌多肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将编码可形成离子通道的大肠杆菌素Ia通道结构域的基因与编码变异链球菌感受刺激多肽CSP的基因可操作地连接获得编码重组抗变异链球菌多肽的基因：
2)将获得的基因导入带有麦芽糖结合蛋白基因的pMAL-c2x中；
3)将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达；
4)亲和层析分离麦芽糖结合蛋白—抗变异链球菌多肽的融合蛋白，经蛋白酶裂解后获得本发明的抗变异链球菌多肽；
5)应用琼脂扩散法检测该多肽证明其具有抗变异链球菌的能力。

6、  根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于：所述的麦芽糖结合蛋白—抗变异链球菌多肽的融合蛋白含有SEQ ID NO.4的氨基酸序列：MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFDAINFTTEFLKSVSEKYGAKAEQLAREMAGQAKGKKIRNVEEALKTYEKYRADINKKINAKDRAAIAAALESVKLSDISSNLNRFSRGLGYAGKFTSLADWITEFGKAVRTENWRPLFVKTETIIAGNAATALVALVFSILTGSALGIIGYGLLMAVTGALIDESLVEKANKFWGIGSTFFRLFNR

7、  根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于：所述的大肠杆菌素Ia通道结构域含有SEQ ID NO.5的氨基酸序列：
DAINFTTEFLKSVSEKYGAKAEQLAREMAGQAKGKKIRNVEEALKTYEKYRADINKKINAKDRAAIAAALESVKLSDISSNLNRFSRGLGYAGKFTSLADWITEFGKAVRTENWRPLFVKTETIIAGNAATALVALVFSILTGSALGIIGYGLLMAVTGALIDESLVEKANKFWGI。

8、  根据权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于：所述的变异链球菌感受刺激多肽CSP含有SE QI DNO.6的氨基酸序列：
TFFRLFNR。

9、  根据权利要求1所述的重组抗变异链球菌多肽，其特征在于：所述的抗变异链球菌多肽用于在口腔龋病中的治疗，在靶细菌细胞膜水平上作为抗致龋菌药物治疗工具。

抗变异链球菌多肽及其应用与制备方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因突变、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channeldomain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
龋病(dental caries)是在口腔内外环境中多种因素影响下，牙齿硬组织发生的一种慢性进行性破坏的细菌感染性疾病，该病被世界卫生组织列为世界性非传染性的三大疾病之一。1946年，McClure和Hewitt证实青霉素可以抑制大鼠龋病的发生，主要机理是抑制细菌细胞壁合成、抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成途径来达到抗菌的目的。然而这些抗菌途径容易诱使细菌发生突变而产生抗菌素的耐药性。因此，国内外学者一直致力于开发新型的抗菌素，从分子生物学的角度出发干扰细菌密度感应信号系统，在细胞膜上直接形成离子通道而致细菌死亡。
牙菌斑生物膜(dental plaque bacterial biofilm)是由种类繁多的各式菌种构成的复杂生物膜群体。其中细菌是主体部分，绝大多数细菌是以生物膜(biofilm，BF)方式生长，而不是以浮游(planktonic)方式生长。随着对细菌生物膜的研究深入，发现细菌彼此之间传递信号是通过细菌密度感应信号系统(quorum sensing，QS)来实现的。变异链球菌是牙菌斑生物膜中的主要致龋菌，通过CSP介导的变异链球菌的QS系统，是由com基因家族——comABcomCDEcomX编码控制的。comCDE基因位于同一个操纵子中，编码产物分别为CSP前体、组氨酸蛋白激酶及反应调节蛋白，组成一个三组份信号传导系统。CSP前体在转运过程中被切断，后段成为活性分子，出胞外达到一定浓度时，与膜受体ComD结合，通过磷酸化激活ComE，作为启动子促使comAB、comCDE基因大量扩增。同时，ComE可激活具有o因子活性的comX蛋白，而comX蛋白一RNA聚合酶复合物可使启动子中含有cin盒序列的一系列基因开始表达，这些基因参与细菌转化中的各个环节，包括与外源DNA结合相关的SSB蛋白基因、与核酸降解相关的dpnA基因、与DNA的摄入相关的celAB基因、与DNA同源重组相关的cin系列蛋白等。可见CSP在变异链球菌的密度感应系统中起到了及其重要的作用。2006年，施文元等通过优化实验找到了变异链球菌感受刺激多肽CSP中由8个氨基酸组成的能与其自身生物膜结合的有效序列。
细菌素(Bacteriocin)是细菌在伴随着核糖体合成过程中产生的一类分泌到细胞外的小分子蛋白质或多肽代谢物。1925年，Gratia等发现大肠杆菌的V菌株产生的代谢物能抑制φ菌株的生长，随后Gratia和Fredericq对V菌株分泌物质进行分离研究，发现是一种物质在起作用，Fredrericq称这种物质为大肠杆菌素。1978年Finkelstein等发现了可形成离子通道的大肠菌素可以在人工脂质双分子膜上形成电压依赖性离子通道，从而在根本上揭示了这一类细菌毒素的抗菌机制。1996年Qiu和Finkelstein等揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上形成的离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构，为在分子水平上设计和制备新型的抗菌素奠定了理论基础。目前已被命名的大肠杆菌素有20多种，这些大肠杆菌素可分为两类，即孢子形成类的大肠杆菌素和核糖体类的大肠杆菌素，前者一般是由449—629个氨基酸组成，是在细胞质膜的表面形成通道而起到杀菌的作用：后者一般由178—777个氨基酸组成，是通过非特异性水解DNA或特异性水解rRNA来抑制细菌的生长。然而，大肠杆菌素具有广谱的抗菌作用，既抗致龋菌又抗非致龋菌，单纯应用于口腔会导致口腔生物膜中的正常菌群失调。且应用化学合成法合成抗变异链球菌多肽，其成本较高，限制了多肽大规模的制备，所以利用基因工程技术制备抗菌肽具有更重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Iachanneldomain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合蛋白的制备方法，利用致龋菌变异链球菌的感受刺激多肽CSP作为靶位，诱导大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Iachannel domain)穿过靶细胞膜，在靶细菌胞膜上形成离子通道，使靶细菌胞内内容物泄露而致靶细菌死亡，从而达到杀菌目的。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：应用基因克隆技术，构建麦芽糖结合蛋白(MBP)、大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。
所述的抗变异链球菌多肽的基因含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列：
GACGCAATTAATTTCACAACAGAGTTCCTGAAATCAGTTTCAGAAAAATATGGTG
CAAAAGCTGAGCAGTTAGCCAGAGAGATGGCCGGGCAGGCTAAAGGGAAGAAA
ATACGTAATGTTGAAGAGGCATTAAAAACGTATGAAAAGTACCGGGCTGACATTA
ACAAAAAAATTAATGCAAAAGATCGTGCAGCGATTGCCGCAGCCCTTGAGTCTGT
GAAGCTGTCTGATATATCGTCTAATCTGAACAGATTCAGTCGGGGACTGGGATATG
CAGGAAAATTTACAAGTCTTGCTGACTGGATCACTGAGTTTGGTAAGGCTGTCCG
GACAGAGAACTGGCGTCCTCTTTTTGTTAAAACAGAAACCATCATAGCAGGCAAT
GCCGCAACGGCTCTTGTGGCACTGGTCTTCAGTATTCTTACCGGAAGCGCTTTAG
GCATTATCGGGTATGGTTTACTGATGGCTGTCACCGGTGCGCTGATTGATGAATCG
CTTGTGGAAAAAGCGAATAAGTTCTGGGGTATTGGATCCACCTTTTTTCGTCTGTT
TAACCGT
所述的大肠杆菌素Ia通道结构域含有SEQ ID NO.2的核苷酸序列：
GACGCAATTAATTTCACAACAGAGTTCCTGAAATCAGTTTCAGAAAAATATGGTG
CAAAAGCTGAGCAGTTAGCCAGAGAGATGGCCGGGCAGGCTAAAGGGAAGAAA
ATACGTAATGTTGAAGAGGCATTAAAAACGTATGAAAAGTACCGGGCTGACATTA
ACAAAAAAATTAATGCAAAAGATCGTGCAGCGATTGCCGCAGCCCTTGAGTCTGT
GAAGCTGTCTGATATATCGTCTAATCTGAACAGATTCAGTCGGGGACTGGGATATG
CAGGAAAATTTACAAGTCTTGCTGACTGGATCACTGAGTTTGGTAAGGCTGTCCG
GACAGAGAACTGGCGTCCTCTTTTTGTTAAAACAGAAACCATCATAGCAGGCAAT
GCCGCAACGGCTCTTGTGGCACTGGTCTTCAGTATTCTTACCGGAAGCGCTTTAG
GCATTATCGGGTATGGTTTACTGATGGCTGTCACCGGTGCGCTGATTGATGAATCG
CTTGTGGAAAAAGCGAATAAGTTCTGGGGTATT
所述的变异链球菌感受刺激多肽CSP的基因含有SEQ ID NO.3的核苷酸序列：
ACCTTTTTTCGTCTGTTTAACCGT
所述的重组抗变异链球菌多肽的制备方法，是选用麦芽糖结合蛋白(MBP)，应用基因重组的方法将其与抗变异链球菌多肽(Colicin Ia channel domain—CSP)氨基端融合，并在大肠杆菌中获得高效表达，包括如下步骤：
1)将编码可形成离子通道的大肠杆菌素Ia通道结构域的基因与编码变异链球菌感受刺激多肽CSP的基因可操作地连接获得编码重组抗变异链球菌多肽的基因：
2)将获得的基因导入带有麦芽糖结合蛋白基因的pMAL-c2x中；
3)将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后诱导表达：
4)亲和层析分离麦芽糖结合蛋白—抗变异链球菌多肽的融合蛋白，蛋白酶裂解后获得本发明的抗变异链球菌多肽；
5)应用琼脂扩散法检测该多肽证明其具有抗变异链球菌的能力。
所述的麦芽糖结合蛋白—抗变异链球菌多肽的融合蛋白含有SEQ ID NO.4的氨基酸                  序               列               ：
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQS
GLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSAL
MFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGE
TAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNK
DKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSS
SNNNNNNNNNNLGIEGRISEFDAINFTTEFLKSVSEKYGAKAEQLAREMAGQAKGKKIRNVEEALKTYEKYRAD
INKKINAKDRAAIAAALESVKLSDISSNLNRFSRGLGYAGKFTSLADWITEFGKAVRTENWRPLFVKTETIIAG
NAATALVALVFSILTGSALGIIGYGLLMAVTGALIDESLVEKANKFWGIGSTFFRLFNR
所述的大肠杆菌素Ia通道结构域含有SEQ ID NO.5的氨基酸序列：
DAINFTTEFLKSVSEKYGAKAEQLAREMAGQAKGKKIRNVEEALKTYEKYRADINKKINAKDRAAIAAALESVKLSDISSNLNRF
SRGLGYAGKFTSLADWITEFGKAVRTENWRPLFVKTETIIAGNAATALVALVFSILTGSALGIIGYGLLMAVTGALIDESLVEKA
NKFWGI
所述的变异链球菌分泌感受刺激多肽CSP含有SEQ ID NO.6的氨基酸序列：
TFFRLFNR
所述的抗变异链球菌多肽用于在口腔龋病中的治疗，在靶细菌胞膜水平上作为抗致龋药物治疗工具。
本发明在成功构建和表达融合基因的基础上，应用麦芽糖结合蛋白将其纯化，建立了成本低廉的纯化工艺。
本研究将变异链球菌分泌感受刺激多肽CSP信号分子的基因与大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)基因重组，从而获得编码重组抗变异链球菌多肽的基因。在构建的重组抗菌多肽中，可与靶细菌胞膜受体结合的感受刺激多肽作为诱导物诱导大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)穿过细菌外膜与膜间隙到达靶细胞膜附近，然后大肠杆菌素通道结构域中的水性孔道结构域在靶细菌胞膜上形成离子通道，使靶细菌胞内内溶物泄露而致靶细菌死亡，从而达到杀菌目的。
附图说明
下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。
图1是含有大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP重组质粒pMAL-c2x-Colicin Ia channel domain-CSP的结构示意图。
图2是本发明中插入大小片段正确的Colicin Ia channel domain-CSP融合基因原核表达载体的酶切鉴定图。其中M：DNA Marker：1：插入大小片段正确的ColicinIa channel domain-CSP融合基因。
图3是本发明中MBP-Colicin Ia channel domain-CSP融合蛋白诱导表达电泳图。其中M：低分子量蛋白标准；1：未诱导的菌体；2：空载体诱导；3：融合蛋白诱导。
图4是本发明中MBP-Colicin Ia channel domain-CSP融合蛋白纯化电泳图。其中M：低分子量蛋白标准；1：亲和层析纯化所得MBP-Colicin Ia channel domain-CSP融合蛋白。
图5是本发明中MBP-Colicin Ia channel domain-CSP融合蛋白裂解后纯化所得的抗变异链球菌多肽。M：低分子量蛋白标准；1：抗变异链球菌多肽。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
制备如上所述的大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合蛋白的方法，按以下步骤制备：
1)Colicin Ia channel domain-CSP融合基因克隆
将装载了大肠杆菌素Ia(Colicin Ia)的宿主菌(由四川大学华西医院移植免疫实验室丘小庆教授馈赠)扩增后提质粒；首先设计一对引物将5’端和3’端的酶切位点分别突变为EcoRI和BamHI；
引物1(32nt)：5’-CGGAATTCGACGCAATTAATTTCACAACAGAG-3’
引物2(31nt)：5’-GCGGATCCAATACCCCAGAACTTATTCGCTT-3’
对大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)进行PCR扩增：
PCR扩增反应管的组成为：
200ng/ml DNA                      1μl
20μM P1                          1μl
20μM P2                          1μl
2.5Mm dNTPs                      4μl
10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺Plus)       5μl
0.5U/μl Ex Taq酶                  0.5μl
H₂O                              37.5μl
总计                             50μl
PCR反应的管的配制均在冰浴中进行，配制过程中按上述组分加水、模板、引物、Taq酶及其它反应组分，95℃，反应5min：94℃，30s变性反应；52℃，60s退火反应；72℃，45s扩增反应，进行30次循环，于72℃延伸10min。
PCR产物胶回收后用EcoRI和BamHI双酶切2h，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，命名为Colicin Ia channel domain(大肠杆菌素Ia通道结构域的基因序列)：
按照大肠杆菌惯用密码子，依据变异链球菌感受刺激多肽CSP的氨基酸序列，设计并合成了编码变异链球菌感受刺激多肽CSP的核酸片段，这两个片段退火后可形成含8个氨基酸的CSP片段以及5’和3’的粘性末端(BamH 1和Sal 1的酶切位点)
片段1(33nt)：5’-GATCCACCTTTTTTCGTCTGTTTAACCGTTGAG-3’
片段2(33nt)：5’-TCGACTCAACGGTTAAACAGACGAAAAAAGGTG-3’
将合成的两个片段于煮沸变性10min，然后缓慢退火，再与Colicin Ia channeldomain及用Sal 1和EcoRI处理过的pMAL-c2x的质粒连接，连接产物转化入大肠杆菌DH5α细胞，调取阳性克隆，于LB培养液中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定，获得插入片段大小正确的Colicin Ia channel domain-CSP融合基因原核表达载体(图2)，进行DNA序列分析(抗变异链球菌多肽的基因序列)，测序正确者命名为pMAL-c2x-Colicin Ia channel domain-CSP，其中含有大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合蛋白的基因。
2)重组蛋白的诱导表达
将测序正确的质粒pMAL-c2x-Colicin Ia channel domain-CSP(见图1)转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，随机挑选单克隆菌，于LB中37℃活化振摇培养过夜，次日晨以1：100比例接种LB培养基，其中含Amp 100μg/ml，37℃继续培养至OD600nm＝0.4-0.6时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养4小时，3000rpm离心15min收集菌体，行SDS-PAGE，对SDS-PAGE结果进行用薄层扫描以测定目的蛋白的表达量(图3)。
上述的工程菌大肠杆菌BL21(DE3)细胞，基因型为F’ompT hsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)，其中含有表达大肠杆菌素Ia通道结构域(Colicin Ia channel domain)与变异链球菌感受刺激多肽CSP融合蛋白基因的原核表达载体pMAL-c2x-Colicin Iachannel domain-CSP。
3)重组蛋白的纯化
将冻存的菌体于室温融化后，加入10ml过柱缓冲液，20mM Tris-HCl pH7.4，200mM NaCl，1mM EDTA，悬浮菌体。在冰水浴上进行超声波破碎细胞(脉冲为15秒或更短)，然后离心(4℃，12000rpm/min 30min)收集上清液。将收集的上清用直连淀粉亲和树脂纯化，洗脱液为20mM Tris-HCl pH7.4，200mM NaCl，1mM EDTA，10mM麦芽糖，连续洗脱4个柱床体积，收集洗脱液，进行活性测定和SDS-PAGE检测(图4)。
4)融合蛋白裂解与目的蛋白纯化
融合蛋白在裂解液，20mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl，2mM CaCl₂，经FactorXa裂解为麦芽糖结合蛋白和抗变异链球菌多肽。裂解蛋白液过SP阳离子层析柱，收集分离峰并SDS-PAGE鉴定(图5)。
5)重组蛋白体外生物学活性检测
细菌选取变异链球菌(Streptococcus mutans)ATCC 25175；血链球菌(Streptococcus sanguis)ATCC 10556；远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)ACTT6715(购自四川大学华西口腔医院中心实验室)
BHI培养基：成分：牛心浸出液：250ml；牛脑浸出液：200ml；示胨：10g；酵母粉：5g；葡萄糖：2g；盐酸半胱氨酸：0.5g；氯化血红素(5mg/ml)：1ml；维生素k1(10mg/ml)：0.1ml；氯化钠：5g；NaHPO_4·12H₂O：2.5g；加水至：1000ml；调PH＝7.4，121℃灭菌20min，取出后4℃保存备用。
BHIB培养基：成分：牛心浸出液：250ml；牛脑浸出液：200ml；示胨：10g；酵母粉：5g；葡萄糖：2g；盐酸半胱氨酸：0.5g；氯化血红素(5mg/ml)：1ml；维生素k1(10mg/ml)：0.1ml；氯化钠：5g；NaHPO_4·12H₂O：2.5g；加水至：1000ml；再加入2％琼脂粉和5—8％脱纤维棉羊血：调PH＝7.4，121℃灭菌20min，取出后4℃保存备用。
纸片制作：用新化定性滤纸，厚度1mm，用打孔器将滤纸打成直径为6mm的圆纸片，121℃ 30min，高压灭菌后待用。实验时，取滤纸片，加实验试剂。
琼脂扩散法：取牛心脑血液琼脂培养基三个，分别用无菌棉签蘸取上述三种细菌的菌液，涂布于培养基上，反复涂均匀，约10min后用无菌镊子把含有药品的纸片贴到培养基上，轻压使其与琼脂适当接触。均放入37℃厌氧培养箱中培养24—48h，可见变异链球菌培养基的抑菌圈明显，而其它两种培养基中无明显的抑菌圈。由此可见，抗变异链球菌多肽可于在口腔龋病中的治疗，在靶细菌细胞膜水平上可作为抗致龋菌药物的治疗工具。
本发明经实验结果证明，其有益效果如下：
1)利用PCR的方法成功改造了Colicin Ia channel domain 5’端和3’端的酶切位点，并将人工合成的编码CSP的寡核苷酸片段与Colicin Ia channel domain的3’端连接，构建了Colicin Ia channel domain-CSP融合基因的原核表达载体pMAL-c2x-Colicin Ia channel domain-CSP，DNA序列测定证实完全正确。
2)经IPTG诱导后，MBP-Colicin Ia channel domain-CSP蛋白在大肠杆菌中获得高效表达。
3)纯化了MBP-Colicin Ia channel domain-CSP的融合蛋白，SDS—PAGE凝胶电泳检测纯度大于95％。
4)体外活性实验显示Colicin Ia channel domain-CSP融合蛋白具有抑制变异链球菌的能力。
需要说明的是，以上实施例中未作详细叙述部分属于本行业或相关行业的公知技术，采用的设备是行业惯例设备。本发明提供的附图2是在紫外灯下采集的DNA电泳图，附图3、图4、图5是用薄层扫描仪下采集的蛋白电泳图片、为医学研究最清晰的图片。
                          SEQUENCE LISTING
NO.1 抗变异链球菌多肽的基因序列
GACGCAATTAATTTCACAACAGAGTTCCTGAAATCAGTTTCAGAAAAATATGGTG
CAAAAGCTGAGCAGTTAGCCAGAGAGATGGCCGGGCAGGCTAAAGGGAAGAAA
ATACGTAATGTTGAAGAGGCATTAAAAACGTATGAAAAGTACCGGGCTGACATTA
ACAAAAAAATTAATGCAAAAGATCGTGCAGCGATTGCCGCAGCCCTTGAGTCTGT
GAAGCTGTCTGATATATCGTCTAATCTGAACAGATTCAGTCGGGGACTGGGATATG
CAGGAAAATTTACAAGTCTTGCTGACTGGATCACTGAGTTTGGTAAGGCTGTCCG
GACAGAGAACTGGCGTCCTCTTTTTGTTAAAACAGAAACCATCATAGCAGGCAAT
GCCGCAACGGCTCTTGTGGCACTGGTCTTCAGTATTCTTACCGGAAGCGCTTTAG
GCATTATCGGGTATGGTTTACTGATGGCTGTCACCGGTGCGCTGATTGATGAATCG
CTTGTGGAAAAAGCGAATAAGTTCTGGGGTATTGGATCCACCTTTTTTCGTCTGTT
TAACCGT
NO.2 大肠杆菌素Ia通道结构域的基因序列
GACGCAATTAATTTCACAACAGAGTTCCTGAAATCAGTTTCAGAAAAATATGGTG
CAAAAGCTGAGCAGTTAGCCAGAGAGATGGCCGGGCAGGCTAAAGGGAAGAAA
ATACGTAATGTTGAAGAGGCATTAAAAACGTATGAAAAGTACCGGGCTGACATTA
ACAAAAAAATTAATGCAAAAGATCGTGCAGCGATGCCGCAGCCCTTGAGTCTGT
GAAGCTGTCTGATATATCGTCTAATCTGAACAGATTCAGTCGGGGACTGGGATATG
CAGGAAAATTTACAAGTCTTGCTGACTGGATCACTGAGTTTGGTAAGGCTGTCCG
GACAGAGAACTGGCGTCCTCTTTTTGTTAAAACAGAAACCATCATAGCAGGCAAT
GCCGCAACGGCTCTTGTGGCACTGGTCTTCAGTATTCTTACCGGAAGCGCTTTAG
GCATTATCGGGTATGGTTTACTGATGGCTGTCACCGGTGCGCTGATTGATGAATCG
CTTGTGGAAAAAGCGAATAAGTTCTGGGGTATT
NO.3 变异链球菌信号传导多肽CSP的核酸序列
ACCTTTTTTTCGTCTGTTTAACCGT
NO.4 麦芽糖结合蛋白—抗变异链球菌多肽融合蛋白的氨基酸序列
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQS
GLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSAL
MFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGE
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NO.5　大肠杆菌素Ia通道结构域的氨基酸序列
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NO.6　变异链球菌信号传导多肽CSP的氨基酸序列
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