用于治疗癌症和其它病症的雷帕霉素的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)衍生物
技术领域
本发明涉及新颖的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物、其制备方法以及其用途。另一方面，本发明提供所述36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物在治疗癌症和/或B细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫病症、发炎疾病、血管疾病和纤维化疾病，刺激神经元再生或治疗真菌感染中的用途。
背景技术
雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))(图1)是由吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)NRRL 5491(舍盖尔(Sehgal)等人，1975；维兹娜(Vézina)等人，1975；美国专利第3,929,992号；美国专利第3,993,749号)产生的具有与哌啶酸内酯键联的1，2，3-三羰基部分(派瓦(Paiva)等人，1991)的亲脂性大环内酯。出于本发明的目的，根据麦卡尔平(McAlpine)等人(1991)的编号规定来描述雷帕霉素，优先于芬德利(Findlay)等人(1980)或化学文摘(第11卷累积索引(11thCumulative Index)，1982-1986p60719CS)的编号规定。
因为雷帕霉素展现广谱活性，所以所述化合物具有重要的药理学价值。雷帕霉素展示主要针对假丝酵母属(Candida)物种以及针对丝状真菌的中等抗真菌活性(贝克(Baker)等人，1978；舍盖尔(Sehgal)等人，1975；维兹娜(Vézina)等人，1975；美国专利第3,929,992号；美国专利第3,993,749号)。雷帕霉素在多种细胞类型中通过靶向信号转导途径，例如通过抑制使细胞周期G1期进展为S期的信号转导途径来抑制细胞增殖(郭(Kuo)等人，1992)。在T细胞中，雷帕霉素抑制IL-2受体的信号转导和随后的T细胞自体增殖，从而产生免疫抑制。雷帕霉素的抑制效应不限于T细胞，因为雷帕霉素抑制许多哺乳动物细胞类型的增殖(布阮(Brunn)等人，1996)。因此，雷帕霉素是在预防器官同种异体移植排斥和治疗自体免疫疾病中具有确定或预测的治疗应用的有效免疫抑制剂(卡汉(Kahan)等人，1991)。40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素(SDZ RAD，RAD 001，Certican，依维莫司(everolimus))是展示免疫抑制药理学效应的雷帕霉素的半合成类似物且同时处于作为抗癌剂的研究中(瑟曲尼·里(Sedrani，R.)等人，1998；基尔希纳(Kirchner)等人，2000；美国专利第5,665,772号，鲍雷(Boulay)等人，2004)。在欧洲，2003年获得批准将这一药物用作免疫抑制剂。雷帕霉素酯衍生物CCI-779(惠氏(Wyeth-Ayerst))活体外抑制细胞生长且活体内抑制肿瘤生长(余(Yu)等人，2001)。CCI-779作为潜在抗癌剂目前正处于第III阶段临床试验中。雷帕霉素在治疗慢性斑块型银屑病中的价值(科尔比(Kirby)和格里菲斯(Griffiths)，2001)，诸如刺激PC12细胞中的神经突外生长的效应的潜在用途(里昂(Lyons)等人，1994)，阻断机械性损伤后血管和平滑肌细胞对细胞激素的增殖性反应(格雷戈里(Gregory)等人，1993)和其在预防同种异体移植物纤维化中的作用(沃勒(Waller)和尼克尔森(Nicholson)，2001)是热门研究领域(卡汉(Kahan)和坎玛都(Camardo)，2001)。最近报导揭露，雷帕霉素与处于长期免疫抑制疗法中的器官同种异体移植患者的较低的癌症发病率(与处于其它免疫抑制方案中的患者相比)相关，且所述癌症发病率的降低是由血管生成的抑制作用所致(古巴(Guba)等人，2002)。已报导免疫亲和素配体的神经营养活性与其免疫抑制活性无关(斯坦因(Steiner)等人，1997)且如专利申请案WO01/03692中所概述，通过破坏成熟类固醇受体复合物来促进神经生长刺激。已报导诸如高脂血症和血小板减少症的副作用以及潜在致畸效应(亨特盖斯(Hentges)等人，2001；卡汉(Kahan)和坎玛都(Camardo)，2001)。
雷帕霉素的聚酮主链是通过总计七个丙酸酯单元和七个乙酸酯单元与莽草酸酯(shikimate)衍生的环己烷羧酸启动子单元(starter unit)经由包含I型聚酮合成酶(rapPKS，派瓦(Paiva)等人，1991)的极大多官能蛋白进行的头-尾缩合来合成。L-赖氨酸衍生的氨基酸(哌啶酸)经由酰胺键缩合到聚酮主链的最后一个乙酸酯上(派瓦(Paiva)等人，1993)且接着内酯化形成大环。
三个雷帕霉素PKS基因、NRPS编码基因和侧接后期基因序列和相应多肽中的每一个的核苷酸序列都是由阿帕里可(Aparicio)等人，1996和施维克(Schwecke)等人，1995来鉴别且以登录号X86780寄存在NCBI中，且这一序列的修正最近已公布在WO04/007709中。
雷帕霉素生物合成簇的第一无酶产物已被指定为前雷帕霉素(pre-rapamycin)(WO04/007709，格雷戈里(Gregory)等人，2004)。制造完全经加工的雷帕霉素需要由雷帕霉素后期基因RapJ、RapN、RapO、RapM、RapQ和RapI所编码的酶进一步加工聚酮/NRPS核心。
认为迄今所表征的雷帕霉素的药理学作用是由与称为FKBP的胞浆受体的相互作用所介导。真核T-细胞中的主要细胞内雷帕霉素受体是FKBP12(迪莱拉(DiLella)和克雷格(Craig)，1991)且所得复合物与靶蛋白特异性相互作用以抑制细胞的信号转导级联。
雷帕霉素-FKBP12复合物的靶在酵母中已被鉴别为雷帕霉素靶(target of rapamycin，TOR)(阿拉康(Alarcon)等人，1999)且哺乳动物蛋白是称为FKBP-雷帕霉素相关蛋白(FRAP)或哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin，mTOR)(布朗(Brown)等人，1994)。
已描述mTOR信号转导与位于神经元中的蛋白合成之间的联系；其对参与翻译控制的蛋白的磷酸化状态的影响；在转录和翻译水平下翻译机构的组分的丰富程度；氨基酸通透酶活性的控制和许多参与代谢途径的酶的转录的协调作用(雷奥特(Raught)等人，2001)。雷帕霉素敏感信号转导途径似乎在胚胎脑发育、学习和记忆形成中也发挥重要作用(唐(Tang)等人，2002)。对酵母中TOR蛋白的研究也揭露其在调节营养物敏感信号转导途径中的作用(哈德威奇(Hardwick)等人，1999)。类似地，已鉴别mTOR为蛋白激酶B(akt)作用的直接靶且在胰岛素信号转导中起关键作用(舍菲德(Shepherd)等人，1998；纳维(Navé)等人，1999)。哺乳动物TOR也涉及肌动蛋白细胞骨架的极化和翻译启始的调控(阿拉康(Alarcon)等人，1999)。诸如mTOR的磷脂酰肌醇3-激酶在诸如细胞周期进展、粘附、细胞存活和血管生成的肿瘤发病机理的数个方面起作用(罗曼斯(Roymans)和斯莱格斯(Siegers)，2001)。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物的药物动力学研究已证明，需要开发在溶液中可能更稳定、更具代谢发作抗性和/或具有改进的细胞膜渗透性和减少的流出且因此可展现改进的口服生物可用性的新颖雷帕霉素化合物。
已报导使用分子的化学可用位点所合成的多种雷帕霉素类似物。以下化合物的说明适于图1中所述的雷帕霉素分子的编号系统。分子的衍生或置换的化学可用位点包括C40和C28羟基(例如美国专利第5,665,772号；美国专利第5,362,718号)、C39和C16甲氧基(例如，WO 96/41807；美国专利第5,728,710号)、C32、C26和C9酮基(例如美国专利第5,378,836号；美国专利第5,138,051号；美国专利第5,665,772号)。C17、C19和/或C21处靶向三烯的氢化导致保留抗真菌活性，但免疫抑制存在相对损失(例如，美国专利第5,391,730号；美国专利第5,023,262号)。分子稳定性(例如，在C32、C40和/或C28处形成肟，美国专利第5,563,145号；美国专利第5,446,048号)、代谢发作抗性(例如，美国专利第5,912,253号)、生物可用性(例如，美国专利第5,221,670号；美国专利第5,955,457号；WO 98/04279)和前药制造(例如，美国专利第6,015,815号；美国专利第5,432,183号)的显著改进已通过衍生来实现。
发明内容
然而，仍需要更多雷帕霉素衍生物。所述雷帕霉素衍生物应在多种病状的治疗中具有重要效用。本发明提供多种新颖的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物。所述化合物适用于医学领域，尤其适用于治疗癌症和/或B细胞恶性肿瘤，诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫病症、发炎疾病、血管疾病和纤维化疾病，刺激神经元再生或治疗真菌感染。
本发明提供雷帕霉素的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)衍生物、这些化合物的制备方法、其中间体以及这些化合物在医学领域中的使用方法。
在最广义方面，本发明提供雷帕霉素的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)衍生物，其特征在于40-羟基位置衍生为羧酸酯、醚、亚膦酸酯、缩醛或糖基。
当36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生为羧酸酯、醚或缩醛时，衍生化基团优选含有不超过12个碳原子(尤其7个或7个以下碳原子，尤其5个或5个以下碳原子)。其优选含有至少一个选自-CF2PO(OH)2、-PO(OH)2、-COOH、-OH和-NH2，尤其选自-COOH和-OH，更尤其为-OH的官能团(尤其至少两个官能团)。
当36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生为由糖基衍生的缩醛时，各糖基优选由优选含有不超过12个碳原子(尤其7个或7个以下、尤其6个或6个以下碳原子)的糖或糖苷形成。实例包括单糖和双糖，尤其形成5和6元环的单糖。其优选含有至少一个选自-COOH、-OH和-NH2，尤其选自-NH2和-OH，更尤其为-OH的官能团(尤其至少两个官能团)。
当36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生为亚膦酸酯时，优选地，烷基优选含有不超过4个碳原子，实例为由次膦酸(phosphinic acid)形成的酯。
下文给出衍生化部分的特定实例。
在一更特定方面，本发明提供根据下式(I)的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物或其医药学上可接受的盐：
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其中：
X表示键或CH2；
R1表示酮基或(H，H)；
R2表示OH或OMe；
R3表示H、OH或OMe；
R4和R5各自独立地表示H或OH；
R6表示-R7、-C(O)R7、-POR19R20或Y-R15；
R7表示-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14；
R8和R9各自独立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，仟何所述基团都可视情况经-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或R8和R9各自独立地表示H、三氟甲基或F；
R10、R11、R12、R13和R14各自独立地表示C1-C4烷基、C2-C4烯基或C2-C4炔基，任何所述基团都可视情况经-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-OH、-COOH或-NH2取代；或R10、R11、R12、R13和R14可独立地选自H、-(CR8R9)qNH2、-(CR8R9)qOH、CF3、F、COOH；或R10和R11或R12和R13或R13和R14可与其所连接的碳一起形成C3-C6环烷基或含有一个或多个选自N、O和S的杂原子且视情况经至多5个-(CR8R9)qOH、-(CR8R9)qNH2或COOH基团取代的3到6元杂烷基环；
Y＝键、-C(O)-O-、-(CH2)2-O-C(O)-O-；
R15表示![]()
或![]()
R16各自独立地为H或OH；
R17独立地选自H、OH和NH2；
R18独立地选自H、-CH3、-CH2OH和-COOH；
然而，不超过2个选自R16、R17和R18的基团表示H或CH3；
R19和R20各自独立地表示H或C1-C4烷基；
m、p和q各自独立地表示0-4之间的整数；
然而，R7部分含有不超过12个碳原子且含有至少一个选自-PO(OH)2、-CF2PO(OH)2、-COOH、OH或NH2的官能团；或其医药学上可接受的盐。
以上结构展示代表性互变异构体，且本发明包括式(I)化合物的所有互变异构体，例如在说明烯醇化合物时，包括酮化合物，且反之亦然。
除非另有说明特定立体异构体(例如，通过在结构式中的相关立构中心处的粗体或虚线键，通过描绘结构式中的双键具有E或Z构型，或通过使用立体化学命名法)，否则呈纯化合物以及其混合物形式的所有立体异构体都包括在本发明范畴内。除非另有说明，否则本发明涵盖所有个别对映异构体、非对映异构体、几何异构体和其组合和混合物。多晶型结晶形式和溶剂化物和水合物也涵盖在本发明范畴内。
另一方面，本发明提供诸如式(I)化合物的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物或其医药学上可接受的盐，其用作为药剂。
定义
冠词“一”在本文中用于指一个或超过一个(即，至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，“一类似物”意思是一个类似物或超过一个类似物。
如本文中所使用，术语“类似物”是指在结构上类似于另一化合物但组成上略有不同(如一个原子经另一原子置换，或存在或不存在特定官能团)的化合物。
详言之，术语“36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素类似物”是指由WO 2004/007709的方法产生且如式(1I)所示的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素化合物。这些化合物也称为“母体化合物”且这些术语在本申请案中可互换使用。在本申请案中，术语“36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素类似物”包括提及36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素本身。
如本文中所使用，术语“衍生物”是指由母体化合物通过半合成有机化学所修饰的化合物。
详言之，术语“36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物”是指通过半合成改变母体化合物所产生的根据上式(I)的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物或其医药学上可接受的盐。这些化合物也称为“本发明化合物”或“雷帕霉素的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)衍生物”且这些术语在本申请案中可互换使用。
如本文中所使用，术语“自体免疫病症”涉及其中针对自体抗原引发适应性免疫反应的病状，其通常以组织的慢性发炎性损伤为特征。本发明范畴内所包括(但不限于)的自体免疫病症为：全身性红斑狼疮(systemic lupus erythrematosis，SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、重症肌无力(myasthenia gravis)、胰岛素依赖性糖尿病和多发性硬化。
如本文中所使用，术语“发炎疾病”包括其中发炎性系统反应过度从而引起组织损伤和/或不必要的副作用的病状。反应过度可针对非自体抗原、自体抗原或可自发发生。发炎疾病包括过敏(也称为过敏性反应)。发炎疾病的实例包括(但不限于)：银屑病、皮炎、湿疹、皮脂溢(seborrhoea)、发炎性肠病(包括但不限于溃疡性结肠炎和克罗恩氏病(Crohn′s disease))、肺发炎(包括哮喘、慢性阻塞性肺病、肺气肿、急性呼吸窘迫综合征和支气管炎)、类风湿性关节炎和眼睛葡萄膜炎。
如本文中所使用，术语“癌症”是指皮肤或身体器官中细胞的恶性或良性生长，所述器官例如(但不限于)乳房、前列腺、肺、肾、胰腺、胃或肠。癌症倾向于渗透到相邻组织中且扩散(转移)到远处器官，例如扩散到骨、肝、肺或脑中。如本文中所使用，术语癌症包括转移性肿瘤细胞类型，诸如(但不限于)黑色素瘤、淋巴瘤、白血病、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和肥大细胞瘤；与组织癌瘤类型，诸如(但不限于)结肠直肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胶质母细胞瘤、原发性肝癌和卵巢癌。
如本文中所使用，术语“B细胞恶性肿瘤”包括一组病症，其包括慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukaemia，CLL)、多发性骨髓瘤和非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)。其为血液和造血器官(blood forming organ)的赘生性疾病。其引起骨髓和免疫系统功能异常，从而使宿主变得极易感染和出血。
如本文中所使用，术语“血管疾病”包括(不限于)：过度增生性血管病症(例如，再狭窄和血管堵塞)、移植血管动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病和周围血管疾病(例如，冠状动脉疾病、动脉硬化、动脉粥样硬化、非动脉粥样化动脉硬化或血管壁损坏)。
如本文中所使用，术语“神经元再生”是指刺激神经元细胞生长且包括神经元细胞的神经突外生长和功能恢复。神经元再生可具有明显治疗益处的疾病和病症包括(但不限于)阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington′s chorea)、肌肉萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、三叉神经痛(trigeminal neuralgia)、舌咽神经痛(glossopharyngeal neuralgia)、贝尔麻痹(Bell′spalsy)、肌肉萎缩症(muscular dystrophy)、中风、进行性肌肉萎缩、进行性延髓遗传性肌肉萎缩、颈椎病、格林-巴利综合征(Gullain-Barre syndrome)、痴呆、周围神经病和由物理损伤(例如脊髓损伤或外伤、坐骨神经或面神经病变或损伤)或疾病状态(例如，糖尿病)引起的周围神经损坏。
如本文中所使用，术语“纤维化疾病”是指与过度产生细胞外基质相关的疾病且包括(但不限于)肉状瘤病、瘢痕疙瘩、肾小球肾炎、末期肾病、肝纤维化(包括但不限于肝硬化、酒精肝病和脂肪性肝炎)、慢性移植肾病、手术粘附、血管病变、心脏纤维化、肺纤维化(包括但不限于特发性肺纤维化和隐源性纤维化肺泡炎)、黄斑退化、视网膜和玻璃体视网膜病和化学疗法或放射诱发的纤维化。
如本文中所使用，术语“移植物抗宿主疾病”是指在异基因干细胞/骨髓移植后所观察到的并发症。其在来自供体的抗感染细胞认为患者的身体不同或为外来身体时发生。然后，这些抗感染细胞攻击患者身体内的组织，就如同其攻击感染。当移植物抗宿主疾病在移植后的第一个100天内发生时，将所述疾病分类为急性的，且如果其在移植后超过100天发生，那么将其分类为慢性的。通常涉及的组织包括肝、胃肠道和皮肤。在干细胞/骨髓移植后，约10-40％的患者发生慢性移植物抗宿主疾病。
如本文中所使用，术语“生物可用性”是指药物或其它物质在投与后在生物活性位点处被吸收或变得可用的程度或比率。这一性质取决于若干因素，包括化合物的溶解性、在肠管中的吸收速率、蛋白结合和代谢的程度等。本文中描述多种应为所属领域的技术人员所熟悉的生物可用性测试(也参见曲盼尼尔(Trepanier)等人，1998，戛兰特-海德纳(Gallant-Haidner)等人，2000)。
如本申请案中所使用，术语“水溶性”是指在水性介质(例如，pH值为7.4的磷酸盐缓冲生理食盐水(phosphate buffered saline，PBS))中的溶解性。
诸如式(I)化合物的本发明化合物的医药学上可接受的盐包括由医药学上可接受的无机或有机酸或碱形成的常规盐以及季铵酸加成盐。合适的酸式盐的更特定实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、高氯酸盐、富马酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、乙醇酸盐、甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、棕榈酸盐、丙二酸盐、羟基马来酸盐、苯乙酸盐、谷氨酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、富马酸盐、甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯磺酸盐、羟基萘甲酸盐、氢碘酸盐、苹果酸盐、硬脂酸盐(steroic)、丹宁酸盐等。诸如草酸的其它酸虽然本身不为医药学上所接受，但可适用于制备适用作获得本发明化合物和其医药学上可接受的盐的中间体的盐。合适的碱性盐的更特定实例包括钠盐、锂盐、钾盐、镁盐、铝盐、钙盐、锌盐、N，N′-二苯甲基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、胆碱盐、二乙醇胺盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐和普鲁卡因盐。下文提及根据本发明的化合物包括式(I)化合物与其医药学上可接受的盐。
烷基、烯基和炔基可为直链或支链。
C1-C4烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。
C2-C4烯基的实例包括乙烯基和2-丙烯基。
C2-4炔基的实例包括乙炔基。
C3-C6环烷基是指可视情况具有支链的包括3-6个碳原子的环烷基环。实例包括环丙基、环丁基、甲基-环丁基、环戊基和环己基。
含有一个或多个选自N、O和S的杂原子的3到6元杂烷基环包括含有一或两个杂原子，尤其一个杂原子的环。实例包括呋喃、吡喃、环氧内烷、环氧乙烷(oxirane)、哌啶、吡咯烷、吖丁啶、氮丙啶、环硫乙烷、硫代乙烷(thiethane)、噻吩、硫代吡喃和吗啉。
3到6元杂烷基环的例示性可选取代基包括-OH、-CH2OH、NH2、CH2NH2和COOH。3到6元杂烷基环通常可未经取代或经1或2个(例如1个)取代基取代。
本发明提供如上所述的36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物(本发明化合物)、这些化合物的制备方法、其中间体以及这些化合物在医学领域中的使用方法。
R7优选含有7个或7个以下碳原子，尤其5个或5个以下碳原子。
R7优选含有至少一个选自-PO(OH)2、-OH、-COOH和-NH2，更优选选自-OH、-COOH或-NH2，尤其选自-COOH和OH，最尤其为OH的官能团。R7优选含有2个或2个以上取代基，例如2个-OH基团。
X合适地表示CH2。
p合适地表示0或1。
m合适地表示0或1。
q合适地表示0、1或2。
R11合适地表示H。R12合适地表示H。
R13合适地表示H或OH。
当p表示1时，R11合适地表示Me、H或CH2OH。
当m和p都表示0时，合适地，R12和R13都表示H，R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1，且R8和R9都表示H。
当p表示1且m表示0时，合适地，R10和R11都表示H，R12表示H，R13表示H、OH或NH2，R14表示-(CR8R9)q-OH，其中q＝0或1，且R8和R9都表示H。
当R6表示-POR15R16时，合适地，R15和R16都表示CH3或都表示CH2CH3。
R6合适地表示通过与羟基乙酸、3-羟基-2，2-二甲基丙酸、2，3-二羟基丙酸、3-羟基-2-羟基甲基丙酸或2，2-双(羟基甲基)丙酸形成酯而衍生的残基。
在一组例示性化合物中，R6表示C(O)R7。
R7优选为通过大环醇与选自由羟基乙酸、3-羟基-2，2-二甲基丙酸、2，3-二羟基丙酸、3-羟基-2-羟基甲基丙酸和2，2-双(羟基甲基)丙酸组成的清单的酸、尤其2，2-双(羟基甲基)丙酸的缩合所形成的部分。
当R15表示：
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时，
这一部分的实例包括通过与以下物质形成缩醛所形成的部分：(i)葡萄糖(即，R18表示CH2OH且R16和R17各自表示OH)，例如D-葡萄糖；(ii)葡糖胺(即，R18表示CH2OH，R16各自表示OH，且R17表示NH2)，例如D-葡糖胺；(iii)葡糖醛酸(即，R18表示COOH，且R16和R17各自表示OH)，例如D-葡糖醛酸；以及(iv)阿拉伯糖(即，R18表示H，且R16和R17各自表示OH)，例如D-阿拉伯糖。
当R15表示：
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时，
这一部分的实例包括通过与果糖(即，R16各自表示OH)(例如D-果糖的残基)形成缩醛所形成的部分。
当R15表示：
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时，
这一部分的实例包括通过与葡糖醛酸(即，R16各自表示OH)(例如D-葡糖醛酸的残基)形成酯所形成的部分。
本发明化合物通常通过式(II)的母体化合物的半合成衍生化来制备。
因此，制备根据式(I)的本发明化合物或其医药学上可接受的盐的方法包含：
(a)使式(II)的母体化合物：
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或其经保护衍生物与式(III)化合物：
HO-R6 (III)
或R6的活化衍生物反应；
(b)使式(I)化合物或其盐转化为另一式(I)化合物或另一其医药学上可接受的盐；或
(c)使经保护式(I)化合物去保护。
如以上所使用，术语“活化衍生物”是指(例如但不限于)：在酯的情况下，羧酸、酰基卤、混合酸酐、对称酸酐或羧酸酯；在醚的情况下，烷基卤、甲磺酸烷基酯、三氟甲磺酸烷基酯、甲苯磺酸烷基酯或其它合适地活化的烷基衍生物；在磷酸酯和膦酸酯的情况下，氯磷酸酯、氰基磷酸二烷基酯、二烷基氨基磷酸二烷基酯或氯亚磷酸酯；或在由糖基衍生的缩醛的情况下，使用糖基供体，例如糖基卤、硫苷、1-O-酰基糖苷、原酸酯(ortho ester)、1-O或1-S碳酸酯、三氯亚氨酸酯(trichloroimidate)、4-戊烯基糖苷、糖基磷酸酯、1-O-磺酰或1-O-硅烷化糖苷。
在过程(a)中，式(II)的母体化合物可如WO 2004/007709中所述来制备。
除本文中所提供的特定方法和参考文献外，所属领域的技术人员也可查阅关于合成方法的标准教程参考，包括(但不限于)伏格尔实用有机化学教程(Vogel′s textbook ofpractical organic chemistry)(弗尼斯(Furniss)等人，1989)和玛曲先进有机化学(March′sadvanced organic chemistry)(史密斯(Smith)和玛曲(March)，2001)。
另外，可通过所属领域的技术人员可利用的许多标准羟基保护策略中的一种来保护所存在的羟基。羟基可通过形成醚而受到保护，所述醚包括(但不限于)经取代烷基醚、经取代苄醚和硅醚(silyl ether)。包括(但不限于)三甲基硅醚、三乙基硅醚、叔丁基二甲基硅醚和叔丁基二苯基硅醚的硅醚优选通过在合适的碱存在下使硅烷的活化形式(包括但不限于氯硅烷或三氟甲磺酸硅烷酯)与母体化合物反应而形成。然后，可通过酸水解或氟化物辅助裂解来去除保护基。1，2-二醇可基于丙酮衍生物的缩合而被保护为丙酮化物。其可通过酸催化去除。
式(II)的母体化合物可用作半合成(即，过程(a))的模板。C-40处的侧接羟基可通过例如酰基化、烷基化、糖基化或磷酸化经由所属领域的技术人员已知的若干合成转化而官能化。
在过程(a)中，当R6表示式-C(O)R7或Y-R15部分时，
其中R15表示![]()
且Y＝键，羟基酯的形成或O-酰基化可通过使式(II)化合物的羟基与相应羧酸(优选活化形式)反应来介导，所述羧酸例如式(IIIAi)或(IIIAii)化合物：
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或通过与式(IIIB)化合物反应来介导：
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其中W为活化羧酸以进行亲核进攻的基团。可通过形成例如(但不限于)酰基卤(例如，W＝C1)、混合酸酐(即，W＝OC(O)R′)、对称酸酐(W＝OC(O)R7)或羧酸酯(即，W＝OR′)来活化羧酸。
式(IIIAi)、(IIIAii)或(IIIB)化合物可由其可购得的羧酸使用所属领域的技术人员已知的标准方法来制备，且在一特定方面，根据式(IIIAi)的化合物(其中R7为-(CR8R9)m(CR10R11)pCR12R13R14)可使用如美国专利第5,362,718号、美国专利第5,665,772号或欧洲专利第EP-0 663 916号中所述的方法来制备。
优选在碱存在下使母体化合物在有机介质中与酰基氯或混合酸酐反应。可使用的碱包括(但不限于)吡啶、4，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、2，6-二甲基吡啶、2，6-二-叔丁基吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、其它三烷基胺、1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)或1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)。
在过程(a)中，当R6表示式-C(O)R7或Y-R15部分时，
其中R15表示![]()
且Y＝-C(O)O-或-(CH2)2-OC(O)O-，这些羟基酯的形成需要使式(II)化合物的羟基与将形成活化碳酸酯的试剂反应，所述试剂诸如式(IV)化合物：
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其中T＝键或-O(CH2)2-，且R21为烷基或芳基，优选芳基，尤其对硝基苯基。
然后，可使式(IV)化合物与式(III)化合物反应以生成R6经由碳酸酯基连接子与40-羟基连接的化合物(WO 2004/101583)。
同样地，母体化合物可通过使母体化合物与所选择的经合适活化的烷基衍生物反应形成本发明化合物(其为母体化合物的40-O-烷基衍生物)而在C-40处经不同羟基醚衍生化。活化烷基是指已经许多方法中的一种活化的烷基，所述方法包括(但不限于)形成烷基卤(RCl、RI、RBr)、甲磺酸烷基酯(ROS(O)2CH3)、三氟甲磺酸烷基酯(ROS(O)2CF3)、甲苯磺酸烷基酯(ROS(O)2PhMe)。然后，应在合适的碱存在下使活化烷基与母体化合物在有机介质中反应。所属领域的技术人员可采用标准方法来优化反应条件以避免在其它反应性位置发生烷基化。
同样地，可使母体化合物磷酸化，且在使磷酸酯去保护后可得到本发明化合物(其为母体化合物的40-O-磷酸基衍生物)或另一本发明化合物(其为母体化合物的40-O-二烷基磷酸基衍生物)和通过所属领域的技术人员已知的方法制得的这些衍生物的盐。磷酸酯可直接形成或经由O-亚磷酸酯(即，(R′O)2POR)间接形成，其中将三价亚磷酸酯(优选在过酸的作用下，所述过酸诸如但不限于mCPBA)氧化成五价磷酸酯。直接磷酸化方法包括(但不限于)使母体化合物与经保护的氯磷酸酯(例如(BnO)2P(O)Cl、(烷基O)2P(O)Cl)优选在DMAP存在下在有机介质中反应，或使母体化合物与磷酰氯(POCl3)在诸如三乙胺的碱存在下反应，接着酸水解所得的O-二氯磷酸酯(即，ROP(O)Cl2)或与氰基磷酸二烷基酯偶合(WO 01/81355)。氯磷酸二烷基酯或氯磷酸二芳基酯可在碱存在下通过使亚磷酸二烷基酯或亚磷酸二芳基酯(即(RO)2P(O)H)与四氯化碳反应而当场生成。形成O-亚磷酸酯(用于氧化成O-磷酸酯)的方法包括(但不限于)在碱(优选四唑)存在下使母体化合物与二烷基氨基磷酸二烷基酯(优选二异丙基氨基磷酸二烷基酯)偶合，或在碱存在下使用氯亚磷酸酯偶合(埃文斯(Evans)等人，1992)。保护基的选择很重要，磷酸乙酯和磷酸甲酯在酸性或碱性条件下不易水解。保护基优选包括(但不限于)苄酯(经由碘化钠/三甲基氯硅烷促进的水解来裂解，(WO01/81355))或2-氰基乙基酯(经由弱碱催化的裂解来裂解)。类似地，本发明化合物(其为母体化合物的40-O-二烷基膦酸基衍生物)可通过使母体化合物与经合适活化(如上所述)的二烷基膦酸酯或二烷基亚磷酸酯反应而生成。
在过程(a)中，当R15表示式![]()
或![]()
的部分时，糖苷键的形成或O-糖基化可通过使羟基与相应的糖基供体(优选活化形式)(参见丰岛(Toshima)和龙田(Tatsuta)(1993))反应来介导，所述糖基供体例如式(IIIC)化合物：
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或式(IIID)化合物：
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使用‘糖基供体’可使母体化合物在有机介质中优选在活化剂(诸如路易斯酸(Lewisacid)或重金属盐，参见丰岛(Toshima)和龙田(Tatsuta)，1993)存在下糖基化，所述‘糖基供体’包括(但不限于)糖基卤(Z＝F、Cl、Br)、硫苷(Z＝SMe、Set、SPh、SPy、SCN)、1-O-酰基糖苷(Z＝OC(O)R)、原酸酯(Z＝式(IIIC/IIID)的OC(Me)(R)(O-C2))、1-O或1-S碳酸酯(Z＝OC(S)SMe，Z＝OC(O)咪唑，Z＝OC(S)咪唑，Z＝SC(S)OEt)、三氯亚氨酸酯(Z＝OC(＝NH)CCl3)、4-戊烯基糖苷(Z＝OCH2CH2CH2CH＝CH2)、磷酸酯(例如，Z＝OP(O)(OPh)2)、1-O-磺酰(Z＝甲苯磺酰基)或1-O-硅烷化糖苷(Z＝OTMS或OTBS)。所使用的特定糖基供体和反应条件将决定形成α糖苷还是β糖苷。如先前关于酰基化所述，可保护或掩蔽母体化合物中所存在的任何羟基以致使用1当量糖基供体将产生40-O-酰基化。因为应将糖基供体上的剩余羟基保护为例如O-乙酸酯、O-苯甲酸酯、1，2-丙酮化物，所以将有必要进行进一步去保护。此外，可使用诸如烯糖的2-脱氧糖基供体(也需要还原步骤)来制备母体化合物的2′-脱氧-糖苷，且可使用诸如2，6-脱水-2-硫糖的2，6-二脱氧糖基供体来制备母体化合物的2′，6′-二脱氧-糖苷。
在过程(b)中，盐的形成和交换可通过所属领域的技术人员已知的常规方法来进行。式(I)化合物的互变可通过已知方法进行，例如羟基和酮基可如本文其它地方所述通过氧化/还原互变。R6表示-PO(OH)2的式(I)化合物可通过磷酸化R6表示OH的相应式(I)化合物来制备。合适条件提供在本文的其它地方。
在过程(a)和(c)中，保护基的实例和其去除方法可见于特·沃·格林(TW Greene)的“有机合成中的保护基”(＂Protective Groups in Organic Synthesis＂)(约翰威立父子出版社，1991)。合适的羟基保护基包括可通过水解去除的烷基(例如，甲基)、缩醛(例如，丙酮化物)和酰基(例如，乙酰基或苯甲酰基)，和可通过催化水解去除的芳基烷基(例如，苯甲基)，或可通过酸性水解或氟离子辅助裂解去除的硅醚。
除过程(a)外，R6表示R7的根据式(I)的本发明化合物也可通过脂肪酶催化的酯基转移来合成。例如(但不限于)，可在古(Gu)等人(2005)所述且如本文实例中进一步所述的反应条件下在脂肪酶PS-C“天野(Amano)”II存在下使式(II)的母体化合物与式(V)的乙烯酯反应。这一方法不限于使用乙烯酯，且酯基转移可由其它脂肪酶或酯酶催化。
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本发明的其它化合物可由本身已知的方法或类似于上述方法的方法来制备。
新颖的本发明化合物适合直接和作为模板用于进一步半合成或生物转化以产生适用作免疫抑制剂、抗真菌剂、抗癌剂、消炎剂、神经再生剂(neuroregenerative agent)或用于治疗移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫病症、血管疾病和/或纤维化疾病的药剂的化合物。用于雷帕霉素和其类似物的半合成衍生化的方法在所属领域中为熟知的且包括(但不限于)以下专利中所述的修改：例如美国专利第5,665,772号、美国专利第5,362,718号、WO 96/41807、美国专利第5,728,710号、美国专利第5,378,836号、美国专利第5,138,051号、美国专利第5,665,772号、美国专利第5,391,730号、美国专利第5,023,262号、美国专利第5,563,145号、美国专利第5,446,048号、美国专利第5,912,253号、美国专利第5,221,670号、美国专利第5,955,457号、WO 98/04279、美国专利第6,015,815号和美国专利第5,432,183号。
可使中间体的以上结构(例如式(II)化合物)经受互变异构化，且当说明代表性互变异构体时，应理解打算提及所有互变异构体，例如当说明烯醇化合物时，也打算提及酮化合物，且反之亦然。
另一方面，本发明提供本发明化合物在医学领域中的用途。另一方面，本发明提供本发明化合物在制备用于诱导或维持免疫抑制，刺激神经元再生或治疗癌症、B细胞恶性肿瘤、真菌感染、移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫病症、发炎疾病、血管疾病和纤维化疾病的药物或用于调控创伤愈合的药剂中的用途。
所属领域的技术人员应能够通过常规实验来确定这些化合物抑制真菌生长的能力(例如贝克·赫(Baker，H.)等人，1978；酵母的肉汤稀释抗真菌敏感性测试的NCCLS参考方法：获批的标准M27-A(NCCLS Reference method for broth dilution antifungalsusceptibility testing for yeasts：Approved standard M27-A)，17(9)，1997)。另外，所属领域的技术人员也应能够通过常规实验来确定这些化合物抑制肿瘤细胞生长的能力(参见杜德金(Dudkin，L.)等人，2001；余(Yu)等人，2001)。另一方面，本发明化合物适用于诱导免疫抑制，用于确定化合物在这些领域中的功效的测定为所属领域的技术人员所熟知，例如(但不限于)：免疫抑制剂活性—华纳·力·曼(Warner，L.M.)等人，1992，卡汉(Kahan)等人(1991)和卡汉(Kahan)和坎玛都(Camardo)(2001)；同种异体移植物—费什本因·特·曼(Fishbein，T.M.)等人，2002，基尔希纳(Kirchner)等人，2000；自体免疫/发炎/哮喘—卡尔森·里·皮(Carlson，R.P.)等人，1993，鲍威尔·尼(Powell，N.)等人，2001；I型糖尿病—雷比诺维奇·阿(Rabinovitch，A.)等人，2002；银屑病—莱塔莫·司(Reitamo，S.)等人，2001；类风湿性关节炎—福伊·阿(Foey，A.)等人，2002；纤维化—朱·杰(Zhu，J.)等人，1999，杰尼·司(Jain，S.)等人，2001，格雷戈里(Gregory)等人，1993。
本发明化合物诱导免疫抑制的能力可在用于这一目的的标准测试中得到证明。另一方面，本发明化合物适于与抗纤维化、神经再生和抗血管生成机理相关，所属领域的技术人员应能够通过常规实验来确定这些化合物防止血管生成的能力(例如古巴·曼(GubaM.)等人，2002)。所属领域的技术人员应能够通过常规实验来确定这些化合物治疗血管过度增生疾病(例如，在药物洗脱支架中)的效用(例如莫里斯·曼·希(Morice，M.C.)等人，2002)。另外，所属领域的技术人员也应能够通过常规实验来确定这些化合物的神经再生能力(例如麦克卡汀·特·曼(Myckatyn，T.M.)等人，2002，史德乐(Steiner)等人，1997)。
本发明也提供一种医药组合物，其包含本发明化合物以及医药学上可接受的载剂。
所属领域的技术人员应能够使用所属领域的技术人员已知的活体内和活体外方法来确定本发明化合物的药物动力学和生物可用性，所述方法包括(但不限于)下文和实例中所述的方法，所属领域的技术人员熟知替代性测定，包括(但不限于)下文和戛兰特-海德纳(Gallant-Haidner)等人，2000和曲盼尼尔(Trepanier)等人，1998以及其中的参考文献中所述的测定。化合物的生物可用性由若干因素(例如水溶性、肠管中的吸收速率、蛋白结合和代谢的程度)决定，所述因素各自可由如下文所述的活体外测试来确定，所属领域的技术人员应了解这些因素中的一个或多个因素的改进将使得化合物的生物可用性得到改进。或者，化合物的生物可用性可使用如下文更详细描述的活体内方法来测量。
Caco-2渗透测定
可使用于24孔康宁科思达群斯威尔(Corning Costar Transwell)格式中的汇合Caco-2细胞(李·阿·皮(Li，A.P.)1992；格拉斯·吉·曼(Grass，G.M.)等人，1992；沃尔皮·德·阿(Volpe，D.A.)等人，2001)，例如，由活体外技术公司(In Vitro Technologies Inc.，IVT Inc.，巴尔的摩(Baltimore)，马里兰州(Maryland)，美国(USA))所提供。顶室含有0.15mLpH值为7.4的汉克氏平衡缓冲溶液(Hank′s balanced buffer solution，HBBS)、1％ DMSO、0.1mM荧光黄。底室含有0.6mLpH值为7.4的HBBS、1％ DMSO。然后，将对照物和测试物在37℃下在加湿培育箱中培育且在130rpm下震荡1h。荧光黄仅经由细胞旁路(紧密接头之间)路径渗透，荧光黄的高表观渗透率(Papp)指示测定期间存在细胞损坏且排除所有这种孔。使用普萘洛尔(propranolol)(被动渗透良好而无已知的转运体效应)和醋丁洛尔(acebutalol)(被动渗透不良，由于P-糖蛋白的活性流出而减弱)作为参考化合物。可通过向顶室或底室施加化合物(0.01mM)而以单向和双向格式测试化合物。由HPLC-MS来分析顶室或底室中的化合物。结果以表观渗透率Papp(nm/s)和通量比(A到B比B到A)表示。
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受体体积：0.6mL(A>B)和0.15mL(B>A)。
单层面积：0.33cm2。
Δ时间：60min。
通量比的正值指示细胞顶部表面的活性流出。
人类肝微粒体(Human Liver Microsomal，HLM)稳定性测定
肝匀浆提供化合物对I期(氧化)酶的固有易损性的量度，所述酶包括CYP450(例如CYP2C8、CYP2D6、CYP1A、CYP3A4、CYP2E1)、酯酶、酰胺酶和黄素单氧化酶(flavinmonooxygenase，FMO)。
测试化合物的半衰期(T1/2)可在暴露于人类肝微粒体后通过由LC-MS监测其随时间的消失来确定。将0.001mM化合物在37℃下在具有蛋白为0.25mg/mL的人类肝微粒体亚细胞组分和饱和含量的作为辅因子的NADPH的0.1M Tris-HC1(pH7.4)中培育40min。以定时间隔向测试样品中添加乙腈以使蛋白沉淀且使代谢停止。离心样品并由HPLC-MS分析母体化合物。
活体内生物可用性测定
也可使用活体内测定来测量化合物的生物可用性(参见例如克劳(Crowe)等人，1999)。通常，腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)和经口(p.o.)向测试动物(例如，小鼠或大鼠)投与化合物，且以规则间隔采集血液样品来检查药物的血浆浓度随时间如何变化。血浆浓度随时间的时程可用于使用标准模式以百分率形式计算化合物的绝对生物可用性。典型方案的实例描述如下。
静脉内给小鼠服用3mg/kg本发明化合物或母体化合物或经口给小鼠服用10mg/kg本发明化合物或母体化合物。以5分钟、15分钟、1小时、4小时和24小时间隔采集血液样品，且经由HPLC确定样品中本发明化合物或母体化合物的浓度。然后可使用血浆浓度时程来推导关键参数，诸如血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC，其与到达体循环的未变化的药物的总量成正比)、最大(峰值)血浆药物浓度、出现最大血浆药物浓度的时间(峰值时间)，用于精确确定生物可用性的其它因素包括：化合物的最终半衰期、总体清除率、分布的稳态体积和F％。然后由非隔室或隔室法分析这些参数以给出生物可用性的计算百分率，关于这类方法的一个实例参见戛兰特-海德纳(Gallant-Haidner)等人，2000和曲盼尼尔(Trepanier)等人，1998和其中的参考文献，和其中的参考文献。
本发明的前述化合物或其调配物可由任何常规方法投与，例如(但不限于)其可肠外、经口、局部(包括经颊、舌下或经皮)、经由医学装置(例如支架)、吸入或经由注射(皮下或肌肉内)投与。治疗可由单个剂量或一段时间内的多个剂量组成。
虽然有可能单独投与本发明的化合物，但优选使其与一种或多种可接受的载剂一起呈医药调配物形式。载剂须为“可接受的”，意即可与本发明化合物相容且不对其接受者有害。合适载剂的实例更详细地描述于下文中。
本发明化合物可单独投与或与其它治疗剂组合投与，共投与两种(或两种以上)药剂需要明显比各自使用的剂量低的剂量，从而减小可见的副作用。
在一个实施例中，将本发明化合物与用于诱导或维持免疫抑制，治疗移植排斥、移植物抗宿主疾病、自体免疫病症或发炎疾病的另一治疗剂共投与，优选药剂包括(但不限于)免疫调节剂，例如硫唑嘌呤、皮质类固醇、环磷酰胺、环孢菌素A、FK506、霉酚酸吗啉乙酯、OKT-3和ATG。
在替代实施例中，将本发明化合物与用于治疗癌症或B细胞恶性肿瘤的另一治疗剂共投与，优选药剂包括(但不限于)甲氨喋呤、醛氢叶酸、阿霉素、泼尼松、博莱霉素、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、太平洋紫杉醇、多西紫杉醇、长春新碱、长春碱、长春瑞宾、多柔比星、他莫昔芬、托瑞米芬、乙酸甲地孕酮、阿那曲唑、戈舍瑞林、抗HER2单克隆抗体(例如赫赛汀(HerceptinTM))、卡培他滨、盐酸雷洛西芬、EGFR抑制剂(例如爱诺沙(IressaTM)、它赛瓦(TarcevaTM)、艾比特思(ErbituxTM)))、VEGF抑制剂(例如阿伐斯汀(AvastinTM))、蛋白酶体抑制剂(例如万珂(VelcadeTM))、格列卫(![]()
)或hsp90抑制剂(例如17-AAG)。另外，本发明化合物也可与其它疗法组合投与，所述疗法包括(但不限于)放射疗法或手术。
在一个实施例中，将本发明化合物与用于治疗血管疾病的另一治疗剂共投与，优选药剂包括(但不限于)ACE抑制剂、血管收缩素II受体拮抗剂、纤维酸衍生物、HMG-CoA还原酶抑制剂、β肾上腺素阻断剂、钙通道阻断剂、抗氧化剂、抗凝剂和血小板抑制剂(例如玻立维(PlavixTM))。
在一个实施例中，将本发明化合物与用于刺激神经元再生的另一治疗剂共投与，优选药剂包括(但不限于)神经营养因子，例如神经生长因子、神经胶质源性生长因子、脑源性生长因子、睫状神经营养因子和神经营养素-3。
在一个实施例中，将本发明化合物与用于治疗真菌感染的另一治疗剂共投与；优选药剂包括(但不限于)两性霉素B、氟胞嘧啶、棘白菌素(例如卡泊芬净(caspofungin)、阿尼芬净(anidulafungin)或米卡芬净(micafungin))、灰黄霉素、咪唑或三唑抗真菌剂(例如克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)、酮康唑(ketoconazole)、益康唑(econazole)、布康唑(butoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、特康唑(terconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、氟康唑(fluconazole)或伏立康唑(voriconazole))。
如对技术人员来说将显而易见，共投与包括作为同一治疗方案的一部分向患者传递两种或两种以上治疗剂的任何方式。虽然所述两种或两种以上药剂可在单个调配物中同时投与，但这并非必需的。药剂可在不同调配物中和在不同时间投与。
调配物可方便地以单位剂型存在且可由药剂学领域熟知的任何方法来制备。所述方法包括使活性成分(本发明化合物)与构成一种或多种配合成分的载剂缔合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载剂或细粉状固体载剂或两者均匀且精细缔合且接着在必要时使产物成形来制备调配物。
本发明化合物通常将经口或经由任何肠外途径以呈医药学上可接受的剂型的医药调配物(包含视情况呈无毒有机或无机酸或碱加成盐形式的活性成分)形式投与。视欲治疗的病症和患者以及投药途径而定，可以不同剂量投与组合物。
举例来说，对于速释、缓释或控释应用来说，本发明化合物可以可含有调味剂或着色剂的片剂、胶囊、胚珠、酏剂、溶液或悬浮液形式经口、经颊或舌下投与。
适于经口投与的本发明化合物的溶液或悬浮液也可含有赋形剂，例如N，N-二甲基乙酰胺；分散剂，例如聚山梨酸酯80；表面活性剂；和增溶剂，例如聚乙二醇、Phosal 50PG(其由磷脂酰胆碱、大豆脂肪酸、乙醇、单/二酸甘油酯、丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯组成)。
所述片剂可含有赋形剂，诸如微晶纤维素、乳糖(例如单水合乳糖或无水乳糖)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸；崩解剂，诸如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；和造粒粘合剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)、羟基丙基纤维素(HPC)、聚乙二醇(macrogol)8000、蔗糖、明胶和阿拉伯胶(acacia)。另外，也可包括润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。
类似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。就此来说，优选赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂，可将本发明化合物与多种甜味剂或调味剂、色素或染料、乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂(诸如水、乙醇、丙二醇和甘油)和其组合进行组合。
片剂可通过视情况与一种或多种配合成分一起压制或模制来制造。压制片剂可通过在合适机器中压制视情况与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟基丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式的活性成分(诸如粉剂或颗粒剂)来制备。模制片剂可通过在合适机器中模制经惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物的混合物来制造。所述片剂可视情况包衣或刻痕且可使用例如不同比例的羟基丙基甲基纤维素来进行调配以提供其中的活性成分的缓释或控释，从而提供想要的释放曲线。
适于经口投与的根据本发明的调配物可以如下形式呈现：离散单元，诸如胶囊、扁囊剂或片剂，各含有预定量的活性成分；粉剂或颗粒剂；于水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油型液体乳液或油包水型液体乳液。活性成分也可以丸剂、冲剂(electuary)或糊剂形式呈现。
适于局部投与口中的调配物包括下列各物：含片，包含通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶的调味基质中的活性成分；药片，包含诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中的活性成分；和漱口药，包含合适液体载剂中的活性成分。
应理解，除尤其以上所提及的成分外，本发明的调配物考虑到所讨论的调配物的类型还可包括所属领域中的其它常规药剂，例如适于经口投与的调配物可包括调味剂。
适合局部投与的医药组合物可调配为软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶剂、浸渗性敷料、喷雾剂、气雾剂或油类、经皮装置、爽身粉等。这些含有活性剂的组合物可经由常规方法制备。因此，其也可包含相容性常规载剂和添加剂，诸如防腐剂、辅助药物渗透的溶剂、乳膏或软膏中的润肤剂和用于洗剂的乙醇或油醇。所述载剂可以组合物的约1％到约98％存在。其更通常将构成组合物的多达约80％。仅为说明，乳膏或软膏是通过混合足量亲水物质和足以产生具有想要稠度的乳膏或软膏的量的水(含有约5-10重量％化合物)来制备。
适于经皮投与的医药组合物可以打算与接受者的表皮保持一段较长时间的亲密接触的离散贴片形式呈现。举例来说，可通过电离子透入自贴片传递活性剂。
关于对外部组织(例如口和皮肤)的施用，优选以局部软膏或乳膏形式施用组合物。当在软膏中调配时，活性剂可与石蜡或水可混溶软膏基质一起使用。
或者，可将活性剂与水包油型乳膏基质或油包水型基质一起调配到乳膏中。
关于肠外投药，利用活性成分和无菌媒剂来制备流体单位剂型，所述无菌媒剂例如(但不限于)水、醇、多元醇、甘油和植物油，水为优选的。视所使用的媒剂和浓度而定，活性成分可悬浮或溶解于媒剂中。在制备溶液时，可将活性成分溶解于注射用水中并进行无菌过滤，接着填充到合适小瓶或安瓿中并密封。
有利地，可将诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂的药剂溶解于媒剂中。为增强稳定性，可在填充于小瓶中之后冷冻组合物且在真空下去除水。然后，将干燥冻干粉剂密封于小瓶中，且可随附提供一小瓶注射用水以在使用之前复原液体。
肠外悬浮液是以大体上与溶液相同的方式制备，其中例外为将活性成分悬浮而不是溶解于媒剂中，且杀菌不能通过过滤来实现。活性成分可在悬浮于无菌媒剂中之前通过暴露于氧化乙烯中来杀菌。有利地，组合物中包括表面活性剂或润湿剂以有利于均匀分布活性成分。
本发明化合物也可使用所属领域中已知的医学装置来投与。举例来说，在一个实施例中，本发明的医药组合物可用无针皮下注射装置投与，诸如美国专利第5,399,163号；美国专利第5,383,851号；美国专利第5,312,335号；美国专利第5,064,413号；美国专利第4,941,880号；美国专利第4,790,824号或美国专利第4,596,556号中所揭示的装置。适用于本发明的熟知植入物和模块的实例包括：美国专利第4,487,603号，其揭示一种以受控速率分配药物的可植入式微输注泵；美国专利第4,486,194号，其揭示一种通过皮肤投与药物的治疗装置；美国专利第4,447,233号，其揭示一种以精确输注速率传递药物的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，其揭示一种用于连续药物传递的可变流速可植入式输注设备；美国专利第4,439,196号，其揭示一种具有多室隔室的渗透性药物传递系统；以及美国专利第4,475,196号，其揭示一种渗透性药物传递系统。在特定实施例中，可使用药物洗脱支架来投与36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素衍生物，例如对应于WO 01/87263和相关公开案中所述的支架或培因(Perin)(培因(Perin)，EC，2005)所述的支架。所属领域的技术人员已知许多其它所述植入物、传递系统和模块。
本发明化合物的待投与剂量将根据特定化合物、所涉及的疾病、个体和疾病的性质和严重程度和个体的身体条件以及所选择的投药途径而变化。适当的剂量可由所属领域的技术人员容易地确定。
视投药方法而定，组合物可含有0.1重量％、优选5-60重量％、更优选10-30重量％的本发明化合物。
所属领域的技术人员应认识到，本发明化合物的最佳量和个别剂量的间隔应由所治疗病状的性质和程度、投药形式、途径和位点以及所治疗的特定个体的年龄和状况来确定且医师将最终确定待使用的适当剂量。这一剂量可适当频繁地重复。如果显现副作用，那么可根据正常临床实践改变或减小剂量的量和/或频率。
附图说明
图1展示雷帕霉素的结构。
具体实施方式
实例
一般方法和材料
材料
所有试剂都获自商业来源，且除非另有说明，否则不经进一步纯化即使用。
培养
在28℃下，将吸水链霉菌(S.hygroscopicus)MG2-10[JMNOQLhis]维持在培养基1琼脂板(参见下文)上。在培养基1上生长后制备孢子储备液，将其保存在蒸馏水中的20％w/v甘油：10％w/v乳糖中并存储在-80℃下。通过将0.1mL冷冻储备液接种到250mL烧瓶中的50mL培养基2(参见下文)中来制备营养培养物。将培养物在28℃下以300rpm培育36到48小时。
制备方法：
将营养培养物以2.5-5％v/v接种到培养基3中。在26℃下，以300rpm进行6-7天培养。
馈给程序：
在接种后24-48小时，进行馈给/添加所选择的羧酸，且除非另有说明，否则以1-2mM馈给。
培养基1：
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然后，通过在121℃下高压消毒20min对培养基杀菌。
培养基2：RapV7种子培养基
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然后，通过在121℃下高压消毒20min对培养基杀菌。
杀菌后，向每7mL培养基中添加0.16mL 40％葡萄糖。
培养基3：MD6培养基(发酵培养基)
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杀菌之前，向1L培养基中添加0.4mL西格玛(Sigma)α-淀粉酶(BAN 250)。
在121℃下，对培养基杀菌20min。
杀菌后，向每7mL中添加0.35mL无菌40％果糖和0.10mL L-赖氨酸(140mg/mL在水中，无菌过滤)。
培养基4：RapV7a种子培养基
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然后，通过在121℃下高压消毒20min对培养基杀菌。
培养基5：MD6/5-1培养基(发酵培养基)
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在121℃下，对培养基杀菌30min。
杀菌后，每升添加15g果糖。
48h后，添加0.5g/L的L-赖氨酸。
分析方法
方法A
注射体积：0.005-0.1mL(按取决于灵敏度的需要)。在阿格兰特(Agilent)＂Spherisorb＂＂Rapid Resolution＂柱SB C8，3微米，30mm×2.1mm上进行HPLC，其中运行以下流动相：
流动相A：纯水中的0.01％甲酸。
流动相B：乙腈中的0.01％甲酸。
流动速率：1毫升/分钟。
使用线性梯度：0min时5％B到2.5min时95％B，保持在95％B下直到4min时，重新回到5％B直到下一循环。根据254nm下的UV吸光度进行检测，和/或通过质谱电喷雾离子化(正或负)使用Micromasss Quattro-Micro仪器进行检测。
方法B
注射体积：0.02mL。在3微米BDS C18 Hypersil(赛默海派多斯顿有限公司(ThermoHypersil-Keystone Ltd))柱150×4.6mm上进行HPLC，维持在50℃下，其中运行以下流动相：
流动相A：乙腈(100mL)、三氟乙酸(1mL)、1M乙酸铵(10mL)，用去离子水补足1L。
流动相B：去离子水(100mL)、三氟乙酸(1mL)、1M乙酸铵(10mL)，用乙腈补足1L。
流动速率：1毫升/分钟。
经10分钟使用55％B-95％B的线性梯度，接着在95％B下2分钟，0.5分钟到55％B且继续在55％B下2.5分钟。根据280nm下的UV吸光度进行化合物检测。
方法C
HPLC系统包括阿格兰特(Agilent)HP 1100且在3微米BDS C18 Hypersil(赛默海派多斯顿有限公司(ThermoHypersil-Keystone Ltd))柱150×4.6mm上进行，维持在40℃下，其中运行以下流动相：
流动相A：去离子水。
流动相B：乙腈。
流动速率：1毫升/分钟。
所述系统与布鲁克道尔顿(Bruker Daltonics)Esquire3000电喷雾质谱仪耦合。在500到1000道尔顿的扫描范围内使用正/负转换。
经10分钟使用55％B-95％B的线性梯度，接着在95％B下2分钟，0.5分钟到55％B且继续在55％B下2.5分钟。
合成方法
除非另有说明，否则所有反应都使用可购得的无水溶剂在无水条件下进行。在与装配有电喷雾源的布鲁克道尔顿(Bruker Daltonics)Esquire 3000+质谱仪耦合的阿格兰特(Agilent)1100 HPLC上，通过LC-UV-MS监测反应。经由Phenomenex Hyperclone柱BDS C18 3u(150×4.6mm)以1mL/min实现分离，其中线性梯度为：水:乙腈(v:v)30:70到100％乙腈，10min；接着为5min的等强度时期，100％乙腈。
抗癌活性的活体外生物测定
化合物在单层增生测定中在一组12种人类肿瘤细胞系中的抗癌活性的活体外评估可在致癌测试设备(Oncotest Testing Facility)，实验性肿瘤学学会(Institute forExperimental Oncology)，致癌测试股份有限公司(Oncotest GmbH)，弗莱堡(Freiburg)上进行。12种所选择的细胞系的特征概述于表1中。
表1：测试细胞系
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如罗斯(Roth)等人，1999所述，由人类肿瘤异种移植物建立致癌测试细胞系。供体异种移植物的来源由费比格(Fiebig)等人，1999描述。其它细胞系是获自NCI(H460、SF-268、OVCAR-3、DU145、MDA-MB-231、MDA-MB-468)或购自DSMZ，不伦瑞克(Braunschweig)，德国(Germany)(LNCAP)。
除非另有说明，否则所有细胞系都是在37℃下在加湿气氛(95％空气，5％ CO2)中在含有RPMI 1640培养基、10％胎牛血清和0.1mg/mL庆大霉素(gentamicin)的‘已混合’培养基(PAA，可尔比(![]()
)，德国(Germany))中生长。
单层测定-方案的简要说明
可使用修改的碘化丙啶测定来评定测试化合物对12种人类肿瘤细胞系的生长的影响(丹格勒(Dengler)等人，(1995))。
简单来说，通过胰蛋白酶消化从指数生长期培养物收集细胞，计数并以视细胞系而定的细胞密度(5-10,000个活细胞/孔)将其涂铺于96孔平底微量滴定板上。24h后，回收以使细胞重新开始指数生长，向各孔中添加0.01mL培养基(每个板6个对照孔)或含有测试化合物的培养基。一式三份涂铺各浓度。以两种浓度(0.001μM和0.01μM)施加化合物。在连续暴露4天后，用0.2mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)水溶液(7mg/L)来替换含或不含测试化合物的细胞培养基。为测量活细胞的比例，通过冷冻各板使细胞渗透。在解冻各板后，使用Cytofluor 4000微板读取器(激发530nm，发射620nm)测量荧光，从而给出与活细胞总数的直接关系。
以经处理组/对照组×100(％T/C)表示生长抑制。关于活性化合物，可通过绘制化合物浓度对细胞活力的曲线来估算IC50值和IC70值。
实例1：36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素的发酵和分离
根据WO 04/007709中所述的方法来制备36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素。简单来说，用携带有雷帕霉素基因rapJ、rapM、rapN、rapO、rapQ和rapL的适当表达载体转化吸水链霉菌MG2-10的培养物以产生菌株吸水链霉菌MG2-10[rapJMNOQLhis]。使用WO 04/007709中所述的方法使吸水链霉菌MG2-10[rapJMNOQLhis]的培养物生长并馈入环庚烷甲酸。培养物萃取物的LCMS和LCMSn分析展示所制备的雷帕霉素类似物的m/z比率比雷帕霉素的m/z比率小16个原子质量单位且与C-36处经3-羟基环庚基部分置换的3-甲氧基-4-羟基环己基部分相一致。
实例2：通过36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素的脂肪酶催化的酯化来合成36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)-40-O-[2，2-双(羟基甲基)丙酰基]雷帕霉素
在氩气氛下，将36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素(10mg，0.011mmol)、2，2，5-三甲基[1.3-二噁烷]-5-甲酸乙烯酯(100mg，0.5mmol)、脂肪酶PS-C“天野(Amano)”II(100mg)和0.5nm分子筛(50mg)在无水叔丁基甲基醚(2mL)中的混合物加热到43℃。72h后，LC/MS监测展示起始物质完全转化。添加THF(10mL)且经硅藻土垫过滤混合物。用THF(2×10mL)洗涤酶且在减压下浓缩组合的有机萃取物。将残余物溶解于THF(7.5mL)中，且添加H2SO4(2.5mL，0.5N)。使溶液在室温下静置5h，且接着通过添加NaHCO3(10mL，5％)和水(10mL)来中止反应。用EtOAc(3×10mL)萃取水性混合物，且经MgSO4干燥组合的有机萃取物。去除溶剂产生呈半固体状的产物。由LCMS分析这一物质且展示其含有预期产物作为主要组分。
MS(ESI)m/z 1036.6[M+Na]+。如所预期，钠加成物碎裂产生m/z为863.5、742.4、614.3、574.3和441.4的离子。
实例3：36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素
3.1：三氟甲磺酸2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧基乙酯
将2-(叔丁基二甲基硅烷基)-乙二醇(125mg，0.71mmol)和2，6-二甲基吡啶(0.08mL，0.69mmol)在6mL二氯甲烷中的溶液冷却到-78℃。经5min的时期添加三氟甲烷磺酸酐(0.11mL，0.65mmol)，且在-78℃下再继续搅拌15min以完成三氟甲磺酸酯的形成。当场将三氟甲磺酸酯用于如下文3.2中所述的反应中。
3.2：40-O-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)]乙基36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素
在室温下，用三氟甲磺酸2-(叔丁基二甲基硅烷基)氧基乙酯处理36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素和2，6-二-叔丁基吡啶。然后用轻微的氮气流将所述溶液浓缩到其原始体积的1/3，且在室温下将所得悬浮液再搅拌72h。在这段时期后，添加饱和碳酸氢钠溶液和水，且将混合物搅拌约30min。分离有机层，且用乙酸乙酯萃取水相两次。经硫酸钠干燥组合的有机萃取物且在减压下浓缩以产生无色油状物。使用己烷到己烷/丙酮(v:v 1:1)的梯度，通过二氧化硅柱色谱法进行纯化产生呈无色固体状的产物。
3.3：36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)-40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素
在室温下，用硫酸(0.5N)处理40-O-[2-(叔丁基二甲基硅烷基)]乙基-36-去(3-甲氧基-4-羟基环己基)-36-(3-羟基环庚基)雷帕霉素在丙酮中的溶液。使溶液在室温下静置约3h，且接着通过添加饱和碳酸氢钠溶液和水使其中止。然后，用乙酸乙酯萃取水性混合物3次，且经硫酸钠干燥组合的有机萃取物。在减压下浓缩产生无色固体，其可进一步经HPLC(水/乙腈v:v 20/80)纯化。
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