GNRHPE突变体融合蛋白及其用途.pdf

本发明属于医药生物领域，发明名称为GnRH-PE突变体融合蛋白及其用途。具体而言，本发明涉及新的GnRH-PE突变体融合蛋白，及其用于制备治疗银屑病的药物的用途。利用豚鼠银屑病样动物模型，本发明人发现，采用所述GnRH-PE突变体融合蛋白，能够有效治疗银屑病，包括寻常型银屑病、脓疱型银屑病、关节病型银屑病与红皮病型银屑病。

1、  GnRH-PE突变体融合蛋白用于制备治疗银屑病的药物的用途，其中所述GnRH-PE突变体融合蛋白选自：
1)GnRH突变体的C-末端与PE突变体的N-末端通过接头序列以肽键相连形成的融合蛋白LLP，即GnRH突变体-接头序列-PE突变体；和
2)PE突变体的C-末端与GnRH突变体的N-末端通过接头序列以肽键相连形成的突变体融合蛋白PLL，即PE突变体-接头序列-GnRH突变体；
3)具有1)或2)中所述突变体融合蛋白氨基酸序列中一个或几个氨基酸的插入、缺失和/或替换的变体，前提是所述变体基本上保持1)或2)中所述突变体融合蛋白的生物学活性；以及
4)与1)或2)中所述突变体融合蛋白氨基酸序列具有大于或等于90％序列同一性的变体，前提是所述变体基本上保持1)或2)中所述突变体融合蛋白的生物学活性；
其中
所述GnRH突变体是指其氨基末端第一位氨基酸替换成谷氨酸(Glu)的人促黄体生成激素释放因子突变体；
所述接头序列由0-20个氨基酸所组成，如需要，可不使用所述接头序列，或选择使用由3个氨基酸残基、5个氨基酸残基、10个氨基酸残基、15个氨基酸残基，甚至20个氨基酸残基组成的接头序列；
所述PE突变体选自：
a)假单胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-252位氨基酸后形成的缺失突变体PE40；
b)将假单胞菌外毒素A(PE)的第253-364位，第381-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE38；
c)将假单胞菌外毒素A(PE)的第280-364位，第381-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE35；
d)将假单胞菌外毒素A(PE)的第280-613位氨基酸序列的片段蛋白PE37；和
e)将假单胞菌外毒素A(PE)的第253-358位，第366-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE39。

2、  权利要求1所述的用途，其中所述接头序列选自：
-His-Met-Ala-Glu-Glu-(SEQ ID NO：3)；
-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-(SEQ ID NO：4)；和
-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ IDNO：5)。

3、  权利要求1所述的用途，其中所述融合蛋白LLP中，所述PE突变体的C-末端还可以含有2-5个选自-XYEL或-REDLK的重复片段，即：
GnRH突变体-接头序列-PE突变体-(XYEL)n，或
GnRH突变体-接头序列-PE突变体-(REDLK)n，
其中n为2-5的整数；
所述片段-XYEL中，X代表赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，Y代表天冬氨酸(Asp)，谷氨酰胺(Gln)或谷氨酸(Glu)，E代表谷氨酸(Glu)，L代表亮氨酸(Leu)；所述片段-REDLK为采用单字母表示的氨基酸序列片段，其中，R代表精氨酸(Arg)，E代表谷氨酸(Glu)，D代表天冬氨酸(Asp)，L代表亮氨酸(Leu)，K代表赖氨酸(Lys)。

4、  权利要求1所述的用途，其中所述融合蛋白PLL中，所述GnRH突变体的C-末端还可以含有2-5个选自-XYEL或-REDLK的重复片段，即
PE突变体-接头序列-GnRH突变体-(XYEL)n或
PE突变体-接头序列-GnRH突变体-(REDLK)n，
其中n为2-5的整数；
所述片段-XYEL和-REDLK的定义如权利要求2中所述。

5、  权利要求1所述的用途，其中所述GnRH突变体进一步的在其氨基末端第6位甘氨酸(Gly)任选的突变为丙氨酸(Ala)、色氨酸(Trp)或亮氨酸(Leu)。

6、  权利要求1所述的用途，其中所述PE突变体进一步的在其C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys突变为-XYEL。

7、  权利要求1所述的用途，其中所述GnRH-PE突变体融合蛋白选自GnRH-PE40、⁶Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL和GnRH-PE38。

8、  权利要求1所述的用途，其中所述银屑病选自寻常型银屑病、脓疱型银屑病、关节病型银屑病和红皮病型银屑病。

9、  GnRH-PE突变体融合蛋白，其选自：
1)GnRH-PE39KDEL(SEQ ID NO：18)；
2)具有1)中所述突变体融合蛋白氨基酸序列中一个或几个氨基酸的插入、缺失和/或替换的变体，前提是所述变体基本上保持1)中所述突变体融合蛋白的生物学活性；以及
3)与1)中所述突变体融合蛋白氨基酸序列具有大于或等于90％序列同一性的变体，前提是所述变体基本上保持1)中所述突变体融合蛋白的生物学活性。

GnRH-PE突变体融合蛋白及其用途
发明领域
本发明涉及GnRH-PE突变体融合蛋白，以及所述突变体融合蛋白用于制备治疗银屑病的药物的用途。
背景技术
银屑病俗称牛皮癣，是一种常见的具有特征性皮损的慢性易于复发的皮肤病。表面银白色鳞屑、薄膜、点状出血是该病的三大临床特征。该病的病因及发病机理尚不完全明确。近年来大多认为遗传、代谢障碍，感染、免疫功能障碍等可能为发病的重要因素，季节变化、潮湿、精神创伤或手术等也可能诱发该病。银屑病组织病理学的改变主要表现为角质形成细胞过度增殖、炎症细胞聚集和真皮乳头部血管扩张三大特征。其中，角质形成细胞过度增殖常常伴有异常的角化过程，同时出现角蛋白表达的改变。
根据临床表现，银屑病通常可分为四型，即寻常型银屑病(psoriasis vulgaris)、脓疱型银屑病(Psoriasis pustulosa)、关节病型银屑病(psoriasis arthropathica)与红皮病型银屑病(erythrodermic psoriasis)。
目前对银屑病尚无特效疗法。现有各种疗法只能达到近期疗效，不能防止复发，主要包括：
1)心理疗法：主要包括解除思想顾虑，消除精神创伤，避免各种诱发因素；
2)外用药物疗法：常用的外用药物有角质促成剂和皮质类固醇霜剂；
3)全身疗法：对于外用药物疗效欠佳可考虑应用全身疗法，包括采用免疫抑制剂、维甲酸、抗生素(青霉素及新型青霉素)、皮质类固醇等；和
4)物理疗法：包括浴疗、光疗及光化学疗法。
利用豚鼠银屑病样动物模型，本发明人出人意料的发现，采用GnRH-PE突变体融合蛋白，能够有效治疗银屑病，包括寻常型银屑病、脓疱型银屑病、关节病型银屑病与红皮病型银屑病。
发明内容
本发明涉及GnRH-PE突变体融合蛋白，以及所述突变体融合蛋白用于制备治疗银屑病的药物的用途。
GnRH-PE融合蛋白由人促黄体生成激素释放因子(GnRH)和假单胞菌外毒素A(PE)组成，是已知用于治疗肿瘤的生物靶向性药物。其中GnRH为由10个氨基酸组成的小肽，其序列用三字母表示为：pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly，其中第一位氨基酸残基为焦谷氨酸，氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。假单胞菌外毒素A(PE)已知是一个由613个氨基酸组成的蛋白质分子(GENEBANK，gi：151215)，其具体氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
具体的，在所述融合蛋白中，GnRH作为靶向性药物的导向部分，PE作为靶向性药物的毒素部分。
为了提高所述融合蛋白杀伤癌变T细胞的活性，基于所述GnRH-PE融合蛋白，已经分别针对上述导向部分的GnRH和毒素部分的PE开发并制备了一系列融合蛋白的突变体(参见中国发明专利“一种能特异杀死肿瘤细胞的基因工程重组蛋白”，专利号ZL03137587.1)。
GnRH-PE突变体融合蛋白的组成及种类
在本发明中，所述GnRH-PE突变体融合蛋白由GnRH突变体与PE突变体组成，其中所述突变体融合蛋白选自：
1)GnRH突变体的C-末端与PE突变体的N-末端通过接头序列以肽键相连形成的突变体融合蛋白LLP，即GnRH突变体-接头序列-PE突变体。任选的，在所述突变体融合蛋白LLP中，所述PE突变体的C-末端还可以含有2-5个选自-XYEL或-REDLK的重复片段，即：
GnRH突变体—接头序列-PE突变体-(XYEL)n，或
GnRH突变体-接头序列-PE突变体-(REDLK)n，其中n为2-5的整数；
2)PE突变体的C-末端与GnRH突变体的N-末端通过接头序列以肽键相连形成的突变体融合蛋白PLL，即PE突变体-接头序列-GnRH突变体。任选的，在所述突变体融合蛋白PLL中，所述GnRH突变体的C-末端还可以含有2-5个选自-XYEL或-REDLK的重复片段，即：
PE突变体-接头序列-GnRH突变体-(XYEL)n或
PE突变体-接头序列-GnRH突变体-(REDLK)n，其中n为2-5的整数；
3)具有1)或2)中所述突变体融合蛋白氨基酸序列中一个或几个氨基酸的插入、缺失和/或替换的变体或其功能性片段，前提是基本上保持1)或2)中所述突变体融合蛋白的生物学活性；以及
4)与1)或2)中所述突变体融合蛋白氨基酸序列具有大于等于90％序列同一性的变体或其功能性片段，前提是基本上保持1)或2)中所述突变体融合蛋白的生物学活性。
在本发明中，所述接头序列为一段由0-20个氨基酸残基所组成的序列。具体的，在所述GnRH突变体与PE突变体之间可以不使用接头序列，也可以根据需要选择使用由3个氨基酸残基、5个氨基酸残基、10个氨基酸残基、15个氨基酸残基，甚至20个氨基酸残基组成的接头序列。优选的，所述接头序列可以为如下所示(用三字母表示)的序列：
-His-Met-Ala-Glu-Glu-(SEQ ID NO：3)；
-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-(SEQ ID NO：4)；
-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQ IDNO：5)。
在本发明上下文中，所述片段-XYEL中，X代表赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，Y代表天冬氨酸(Asp)，谷氨酰胺(Gln)或谷氨酸(Glu)，E代表谷氨酸(Glu)，L代表亮氨酸(Leu)；所述片段-REDLK为采用单字母表示的氨基酸序列片段，其中，R代表精氨酸(Arg)，E代表谷氨酸(Glu)，D代表天冬氨酸(Asp)，L代表亮氨酸(Leu)，K代表赖氨酸(Lys)；
在本发明中，所述GnRH突变体是指其氨基末端第一位氨基酸替换成谷氨酸(Glu)，以及任选的，其氨基末端第6位由甘氨酸(Gly)突变为丙氨酸(Ala)或色氨酸(Trp)或亮氨酸(Leu)的突变体。
在本发明中，所述GnRH-PE突变体融合蛋白在保留或基本上保留其生物学活性的前提下可以被进一步修饰，包括在亲本蛋白质氨基酸序列的两个残基之间插入一个或多个另外的残基，以及从氨基酸序列中删除、替换一个或多个残基。
具体的，在本发明中，人促黄体生成激素释放因子(GnRH)氨基末端第一位氨基酸由焦谷氨酸替换成谷氨酸的所述GnRH突变体其氨基酸序列为：Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ IDNO：6)；当其氨基末端第6位由甘氨酸(Gly)分别由丙氨酸(Ala)或色氨酸(Trp)或亮氨酸(Leu)所替代后，其氨基酸序列分别为：
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ ID NO：7)
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ ID NO：8)
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Leu-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQ ID NO：9)
在本发明中，所述PE突变体包括：
1)假单胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-252位氨基酸后形成的缺失突变体PE40，参见序列表中SEQ ID NO：10；任选的，所述PE40的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替换为-XYEL；
2)将假单胞菌外毒素A(PE)的第253-364位，第381-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE38，参见序列表中SEQ ID NO：11；任选的，所述PE38的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替换为-XYEL；
3)将假单胞菌外毒素A(PE)的第280-364位，第381-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE35，参见序列表中SEQ ID NO：12；任选的，所述PE35的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替换为-XYEL；
4)假单胞菌外毒素A(PE)的第280-613位氨基酸序列的片段蛋白PE37，参见序列表中SEQ ID NO：13；任选的，所述PE37的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替换为-XYEL；
5)将假单胞菌外毒素A(PE)的第253-358位，第366-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE39，参见序列表中SEQ IDNO：14；任选的，所述PE39的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替换为-XYEL。
具体的，本发明中所述“变体”是指至少具有以下特征的多肽：(1)与GnRH-PE突变体融合蛋白的多肽序列具有约80％或以上的氨基酸序列同一性，优选至少约81％的氨基酸序列同一性，更优选至少约82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
“百分(％)氨基酸序列同一性”被定义为在排比两个序列时，候选序列中与所述GnRH-PE突变体融合蛋白之氨基酸序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。
为了测定％氨基酸同一性，将序列排比并在必要时为了获得最大％序列同一性而引入空位；保守置换不被认为是序列同一性的一部分。测定百分同一性的氨基酸序列排比方法是本领域技术人员公知的。通常使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，来排比肽序列。本领域技术人员能够确定用于排比的适当参数，包括在所比较的序列全长上获得最大排比所需的任何算法。
当排比氨基酸序列时，特定氨基酸序列A与特定氨基酸序列B(或者可以表述为与特定氨基酸序列B具有或者包含一定％氨基酸序列同一性的特定氨基酸序列A)的％氨基酸序列同一性可以如下计算：
％氨基酸序列同一性＝X/Y·100
其中X是通过A和B的序列排比程序或算法排比被评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，Y是B中的氨基酸残基总数。
如果氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度，则A与B的％氨基酸序列同一性将不等于B与A的％氨基酸序列同一性。
在本发明优选实施方案中，所述GnRH-PE突变体融合蛋白选自GnRH-PE40，参见序列表中SEQ ID NO：15；GnRH-PE40KDEL，参见序列表中SEQ ID NO：16；⁶Ala-GnRH-PE40KDEL，参见序列表中SEQ ID NO：17；GnRH-PE39KDEL，参见序列表中SEQ ID NO：18；和GnRH-PE38，参见序列表中SEQ ID NO：19。
所述GnRH-PE突变体融合蛋白的构建策略
本发明所述突变体融合蛋白可以用本领域公知的基因突变和重组方法容易地产生。具体的，所述突变体融合蛋白可以用本领域公知的方法如寡核苷酸-介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制备。可以对被克隆的DNA进行定点诱变、盒诱变、限制选择诱变或其他已知的技术，以产生GnRH-PE突变体融合蛋白之变体的DNA序列。
编码GnRH突变体的核酸序列可以与编码PE或其突变体的核酸序列在阅读框内融合。所述编码突变体融合蛋白的基因也可以通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪。也可以采用使用锚定引物的PCR扩增，该锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，然后可以退火，再扩增，产生嵌合基因序列。通过将如上述获得的编码突变体融合蛋白的基因在阅读框内亚克隆到用于目标蛋白表达的本领域已知的多种表达载体上，可以生产所述突变体融合蛋白。
具体的，为获得本发明所述GnRH-PE突变体融合蛋白，分别采取如下策略人促黄体生成激素释放因子(GnRH)和假单胞杆菌外毒素A(PE)进行改造。
(一)、对融合蛋白的GnRH部分之改造，包括：
1.将天然GnRH的N末端第一位的焦谷氨酸改为谷氨酸；
2.任选的，将根据步骤1获得的GnRH突变体的N末端第6位氨基酸分别替换为为Ala或Trp或Leu。
3.任选的，将步骤1或2中获得的GnRH突变体C末端连接上-(XYEL)n或-(REDLK)n，其中n为2-5的整数。
(二)、融合蛋白假单胞杆菌外毒素A部分之改造：
1.PE40及其突变体的构建
将假单胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-252位氨基酸得到缺失突变体称为PE40。根据需要，可进一步将所述PE40的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替换为-XYEL。
2.PE38及其突变体的构建
将假单胞菌外毒素A(PE)的第253-364位，第381-613位两段氨基酸序列按原顺序相连，得到蛋白PE38。根据需要，可以将所述PE38的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替换为-XYEL。
3.PE35及其突变体的构建
将假单胞菌外毒素A(PE)的第280-364位，第381-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE35。根据需要，可进一步将所述PE35的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替换为-XYEL。
4.PE37及其突变体的构建
将假单胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-279位氨基酸得到的缺失突变体，即假单胞菌外毒素A(PE)的第280-613位氨基酸序列片段称为蛋白PE37。根据需要，可以将所述PE37的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替换为-XYEL。
5.PE39及其突变体的构建
将假单胞菌外毒素A(PE)的第253-358位，第366-613位两段氨基酸序列按原顺序相连得到蛋白PE39。根据需要，所述PE39的C-末端的5个氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替换为-XYEL。
本发明另一方面，涉及所述GnRH-PE突变体融合蛋白用于治疗银屑病的用途。
本发明另一方面，涉及所述GnRH-PE突变体融合蛋白用于制备治疗银屑病的药物的用途。
在本发明中，所述“治疗”包括在给药后使得所述银屑病的症状缓解、有效、显效和逆转的情形。具体的，按照通用的Baker方法(BakerBS等人，Br J Dermatol，1992，126：105 110)制定组织学评分标准，即：典型的银屑病皮损评分在4.0～10.0之间，根据如下标准进行的判定：对于用药前评分大于7.0的患者，凡用药后评分小于5.0的，判定为银屑病症状缓解，凡用药后评分小于3.0的，判定为银屑病症状有效，凡用药后评分小于2.0的，判定为银屑病症状显效，凡用药后评分小于1.0的，判定为银屑病症状逆转。
相应的，本发明所述治疗有效量是指当根据受试者疾病或病症的性质和严重程度对特定受试者施用时具有所需疗效的量，例如将缓解、有效、显效和逆转所述银屑病的量
本发明中，通过采用以下两种动物模型判定所述GnRH-PE突变体融合蛋白治疗银屑病的效果。
模型一：
采用现有技术中用于评价银屑病治疗效果的常用动物模型——豚鼠银屑病样动物模型，评价本发明所述GnRH-PE突变体融合蛋白治疗银屑病的效果(参见“豚鼠银屑病样动物模型中角蛋白K14，16，17表达水平的变化”，樊平申，廖文俊，刘玉峰，第四军医大学学报(新)2001年12月第22卷第24期)。
模型二：
鳞片状皮肤(fsn/fsn)突变鼠模型。所述模型是美国Jackson实验室1985年新发现的一种自发常染色体隐性基因突变小鼠品系，这种小鼠刚出生时表现为低色素性贫血，不久全身或局部出现鳞状灰白色斑块。而且发现角化过度、棘层肥厚、角层下脓疱和真皮毛细血管扩张等病理特征在出生后2周出现，3～4周皮损融合扩散，其发生与大量淋巴细胞和少量的中性粒细胞、巨噬细胞在真皮的浸润有关，表现出与银屑病极为相似的组织病理学特征[China J Lepr Skin Dis.Jan2006，Vol.22，No.1；Pathogenic function of IL-1b in psoriasiformskin lesions of flaky skin(fsn/fsn)mice；Clin Exp Immunol 2001；123：505-510]。
实施例1 GnRH-PE突变体编码基因的制备
1、GnRH-PE40编码基因的获得
依据已知GnRH突变体和PE40突变体的氨基酸序列，选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成GnRH-PE40 DNA序列，得到GnRH-PE40核酸序列，为方便基因重组操作，同时在相应于所述多肽之N末端和C末端加上限制性酶切位点NdeI(CATATG)、EcoRI(GAATTC)，在3’端修饰上终止密码子。
按照本领域常用方法，参见如《分子克隆(第二版)：实验室指南》(1992，冷泉港实验室)，将如上述制备的GnRH-PE40 DNA序列以及筛选质粒pBSK(Stratagene公司，货号212205)用限制性内切酶NdeI、EcoRI处理，经计算各样品浓度后，按摩尔比1:1加入T4连接体系。经转化、筛选出得到包含上述GnRH-PE40核酸序列的重组质粒，命为pSK-GnRH-PE40，测序后备用。
2、GnRH-PE其他突变体编码基因的获得
按照本领域常用方法，参见如《分子克隆(第二版)：实验室指南》(1992，冷泉港实验室)，以GnRH-PE40基因为模板，采用PCR方法，通过常规DNA序列的缺失与突变方法，获得其它GnRH-PE突变体的编码基因。将所述编码基因片段以NdeI、EcoRI为位点顺序插入到测序载体pBSK(Stratagene公司，货号212205)中，测序后备用。
实施例2 GnRH-PE突变体融合蛋白的制备
本发明中，GnRH-PE突变体融合蛋白的制备可通过如下方法完成：将所述从实施例1中得到的测序载体上用NdeI、EcoRI双酶切取下目的基因片段，插入表达载体中，再把重组表达载体导入表达宿主菌中，经培养表达，疏水层析、螯合层析、离子交换层析得到目的蛋白。以下以GnRH-PE突变体融合蛋白GnRH-PE40为例进行说明。其它融合蛋白均可按照类似方法制得。
1、重组质粒PET20-GnRH-PE40的制备
分别用相应的限制性内切酶从实施例1制备的载体上切下所述融合蛋白基因，再将该融合蛋白基因片段与经Nde I和EcoR I双酶切质粒PET20(NOVAGEN)的回收大片段，18℃在T4连接酶体系中两段目的基因片段进行连接。经酶切和序列测定对所得重组子筛选鉴别，得到正确连接的重组质粒，命名为PET20-GnRH-PE40。
2.含有重组质粒PET20-GnRH-PE40的基因工程菌的制备
然后用CaCl₂法转化大肠杆菌RBL21(NOVAGEN公司)，涂布在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性菌落，鉴别含有上述重组质粒PET20-GnRH-PE40的转化子。
在LA液体培养基中培养所述转化子至OD600为0.6-0.8时，加入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％ SDS-PAGE电泳时出现一条43KD左右的蛋白带，表达量为35％。经PE的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。获得高效表达GnRH-PE40蛋白的基因工程菌，命名为PET20-GnRH-PE40/RBL21。
3.GnRH-PE40的表达及纯化
1)摇瓶表达：将如上述制备的含GnRH-PE40蛋白基因的基因工程菌PET20-GnRH-PE40/RBL21，在含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜培养(37℃，200rpm)，再按体积比1:30接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mMIPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含GnRH-PE40(43KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的35％。
2)大规模发酵表达：
a.培养基组成：
a)种子液培养基(LA)：
大豆蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、卡那霉素：50微克/毫升。
b)培养基(15升)：
磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10.05克、氯化铵：50克、大豆蛋白胨：90克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料(500克/升)：葡萄糖。
发酵及诱导表达：
i)种子培养：
从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LK中，36℃、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LK中，36℃、200转/分，培养过夜。
ii)发酵及诱导表达过程：
将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36℃、150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时，约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(四小时)。
3)纯化的步骤：
i)破菌：取出饼状冻存的200克菌体，用1600mL的破菌缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8，1mM EDTA)进行溶解完全，冰浴搅拌15分钟。离心10000rpm，20min，收集上清。
ii)补盐：
测量样品的体积，补加入硫酸铵使之达到终浓度为0.3M，补加氯化钠使之达到终浓度为1M。
iii)Phenyl Sepharose HP层析：
层析柱直径为50mm，高20cm，介质约200mL，280nm进行监测，用50mM Tris-HCl，0.3M NH3(SO4)2，1M NaCl，pH8对层析柱进行平衡，上一步的样品进行上样，然后再用上述溶液平衡至基线后，用50mMTris-HCl，0.5M NaCl，pH8进行洗脱，收集蛋白洗脱峰。以上流速均为20mL/min。
iv)Chelating Sepharose Fast Flow层析
缓冲液A：20mM PB，pH7.4，0.5M NaCl
缓冲液B：20mM PB，pH7.4，0.5M NaCl，50mM咪唑。
层析柱直径为35mm，高20cm，介质约100mL，280nm监测。
首先水洗，然后用1％硫酸铜溶液通过层析柱，待介质结合完全铜离子之后，水洗，缓冲液A平衡5个柱体积，然后上一步的样品直接上样，之后再平衡至基线，然后进行线形梯度洗脱，100％A到100％B，20个柱体积。收集目的蛋白洗脱峰。以上流速均为15mL/min。
v)Q Sepharose HP层析
缓冲液A：20mM PB，pH7.4。
缓冲液B：20mM PB，pH7.4，0.5M NaCl，。
层析柱直径为26mm，高20cm，介质约60毫升。
缓冲液A平衡，上样，然后再平衡，之后进行线形梯度洗脱，100％A到100％B，10个柱体积。收集目的蛋白洗脱峰。以上流速均为15mL/min。
通过以上步骤，200g菌体可以得到大约200mg目的蛋白纯品。
4).质量检测：
通过SDS-PAGE电泳和反相HPLC检测，得到的目的蛋白纯度大于95％。
实施例3 GnRH-PE其他突变体融合蛋白的制备
按照上述实施例2制备方法，分别构建并获得了高效表达GnRH-PE40KDEL、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL和GnRH-PE38蛋白的基因工程菌，命名为PET20-⁶Ala-GnRH-PE40KDEL/RBL21、PET20-GnRH-PE39KDEL/RBL21、PET20-GnRH-PE38/RBL21、PET20-GnRH-PE40KDEL/RBL21。
利用上述基因工程菌，得到纯度大于95％的目的蛋白：GnRH-PE40KDEL、⁶Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL和GnRH-PE38。
实施例4 GnRH-PE突变体融合蛋白GnRH-PE40对银屑病的治疗效果
1、材料
70只健康成年豚鼠(体质量300～400g，雌雄不限)，5％心得安乳剂由北京诺思兰德生物技术有限责任公司配制，试验样品GnRH-PE40按照实施例1所述方法制备。
2、方法
2.1、豚鼠银屑病样模型制备
实验动物随机分为模型组和模型对照组共两组，其中模型组60只实验动物，应用5％心得安乳剂均匀外涂双耳背皮肤，每日4次，连续涂4周(参见：“心得安涂药造成豚鼠耳部银屑病样病理变化”，中华皮肤杂志，1991，24(2)：9697；抗角蛋白自身抗体对豚鼠银屑病样模型的影响，中国皮肤性病学杂志2002年3月第16卷第2期：73-5)。模型对照组10只实验动物，用单纯乳剂涂抹双耳背皮肤，每日4次，连续涂4周。每周分别随机取模型组与模型对照组6只豚鼠耳廓标本，石蜡包埋，HE染色，观察组织学变化。
HE染色：将用10％甲醛溶液固定的标本脱水，透明浸蜡后包埋，制作石蜡切片，常规HE染色.在光镜下逐一观察组织学所见。参考Baker的方法制定组织学评分标准，即：典型的银屑病皮损评分在4.0～10.0之间，见表1。
表1 组织学评分方法

2.2、GnRH-PE突变体融合蛋白GnRH-PE40对豚鼠银屑病样模型动物的治疗
将模型组中的48只豚鼠随机分成4组，每组12只。分别施用以下4种不同浓度的融合蛋白：GnRH-PE40 30ug/kg、GnRH-PE40 60ug/kg、GnRH-PE40 120ug/kg、溶媒(5％甘露醇、20mM的磷酸缓冲液，pH值7-8)1ml/只。采用静脉注射方式给药，1次/天，连续15天。给药前0天、给药第15分别取耳廓皮肤标本储存待检。
3 结果
3.1 豚鼠银屑病样模型的制备过程中采集标本HE染色结果
正常模型对照组豚鼠皮肤可见菲薄的角质层，颗粒层约为1～3层，棘细胞层约3～5层，基底层为单层柱状细胞.真表皮交界较平，真皮内有散在少数单核细胞浸润。
模型组经心得安涂药3周后大部分标本均见到角质层角化过度、表皮层棘层肥厚、真皮层乳突内有炎细胞浸润，部分标本见到广泛或灶状角化不全，颗粒层变薄或消失，表皮突延伸呈棒状，乳突上伸呈杵状变，毛细血管扩张。
我们通过参考Baker评分方法，对每份标本逐一进行组织学评分分析.应用组织评分法(典型的银屑病皮损评分在4.0～10.0之间)评分得到，涂药前组标本组织学评分为0.47±0.18，涂药4周组标本组织学评分为7.23±0.71，正常模型对照组单纯乳剂涂抹前后组织学评分为：0.47±0.18，0.38±0.24。经统计学处理结果，涂药后组与涂药前组以及正常模型对照组相比较差异显著(P<0.01)，而对照组涂单纯乳剂前组与对照组涂单纯乳剂后组无差异，见表2。
表2 豚鼠银屑病模型和对照组样本的组织学评分
分组                 组织学评分涂     药前后比较P
模型组涂药前         0.47±0.18       -
对照组涂单纯乳剂前   0.42±0.05       -
模型组涂药后         7.23±0.71       <0.01
对照组涂单纯乳剂后   0.38±0.24       0.47
上述实验结果表明，利用豚鼠可以成功建立的银屑病模型，可用于治疗银屑病药物的效果评估。
3.2 采用不同浓度的GnRH-PE40对豚鼠银屑病模型治疗前后各组标本HE染色结果
采用不同浓度的GnRH-PE40对豚鼠银屑病模型中的模型组豚鼠静脉注射药物15天后，GnRH-PE40 60ug/kg组与120ug/kg处理组标本中，角质层角化不全现象基本消失，仅个别处有角化不全改变。表皮层棘细胞层变薄，多数出现1～2层颗粒层细胞，表皮突延伸及乳突上伸、毛细血管扩张等明显减轻，真皮层乳突内仅有少数炎细胞浸润。GnRH-PE4030ug/kg处理组与前述改变相似，但改变较轻，空白对照组组织学无明显改变。各组给药前后组织学评分见表3。
表3 不同浓度的GnRH-PE40给药前后组织学评分
组别                  处理时评分     处理15天后评分   P
GnRH-PE40 30ug/kg组   7.33±0.24     4.38±0.63       0.000781
GnRH-PE40 60ug/kg组   7.38±0.73     2.15±0.75       8.58E-06
GnRH-PE40 120ug/kg组  7.46±0.46     1.42±0.53       6.38E-10
空白对照组            7.42±0.39     6.88±0.37       0.267819
由上述结果可知，30ug/kg组、60ug/kg组和120ug/kg组GnRH-PE40均有改善银屑病症状的效果，随着给药浓度增加，改善银屑病症状的效果也明显增强。
实施例5、GnRH-PE突变体融合蛋白⁶Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38对银屑病的治疗效果
1、材料
80只健康成年豚鼠(体质量300～400g，雌雄不限)，5％心得安乳剂由北京诺思兰德生物技术有限责任公司配制，试验样品GnRH-PE突变体融合蛋白⁶Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38分别按照实施例1所述方法制备获得。
2、方法
2.1 豚鼠银屑病样模型制备
参照实施例3所述，将实验动物随机分为模型组和模型对照组共两组。按照实施例3描述的方式建立豚鼠银屑病样模型，通过组织学评分确认所述动物模型适于银屑病治疗效果的评估。
2.2、GnRH-PE突变体融合蛋白的施用方案
将模型组中的60只豚鼠随机分成5组，每组12只，分别施用以下5种GnRH-PE突变体融合蛋白：⁶Ala-GnRH-PE40KDEL60ug/kg、GnRH-PE40KDEL 60ug/kg、GnRH-PE39KDEL 60ug/kg、GnRH-PE38 60ug/kg、溶媒1ml/只。采用静脉注射方式给药，1次/天，连续15天。给药前、给药第15天时取耳廓皮肤标本储存待检。
3 结果
3.1 豚鼠银屑病模型采集标本的HE染色结果
正常模型对照组豚鼠皮肤可见菲薄的角质层，颗粒层约为1～3层，棘细胞层约3～5层，基底层为单层柱状细胞.真表皮交界较平，真皮内有散在少数单核细胞浸润。
模型组经心得安涂药3周后大部分标本均见到角质层角化过度、表皮层棘层肥厚、真皮层乳突内有炎细胞浸润，部分标本见到广泛或灶状角化不全，颗粒层变薄或消失，表皮突延伸呈棒状，乳突上伸呈杵状变，毛细血管扩张。
我们通过参考Baker评分方法，对每份标本逐一进行组织学评分分析。应用组织评分法(典型的银屑病皮损评分在4.0～10.0之间)评分得到，模型组涂药前标本组织学评分为0.35±0.28，涂药4周组标本组织学评分为7.81±0.62，正常模型对照组涂单纯乳剂前后组织学评分分别为：0.41±0.32、0.47±0.11，经统计学处理结果，涂药后组与涂药前组以及正常模型对照组相比较差异显著(P<0.01)，而对照组涂单纯乳剂前组与对照组涂单纯乳剂后组无差异，见表4。
表4 豚鼠银屑病模型和对照组样本的组织学评分
分组                组织学评分       涂药前后比较P
模型组涂药前        0.35±0.28       -
对照组涂单纯乳剂前  0.41±0.32       -
模型组涂药后        7.81±0.62       <0.01
对照组涂单纯乳剂后  0.47±0.11       0.46
上述实验结果表明，利用豚鼠可以成功建立的银屑病模型，可用于治疗银屑病药物的效果评估。
3.2 GnRH-PE突变体融合蛋白施用于豚鼠银屑病模型前后各组标本HE染色结果
按照此前2、2节中所述的施用方案，将GnRH-PE突变体融合蛋白施用于模型组豚鼠15天后，⁶Ala-GnRH-PE40KDEL 60ug/kg组、GnRH-PE40KDEL 60ug/kg组、GnRH-PE 39KDEL 60ug/kg组以及GnRH-PE38 60ug/kg组的标本中，角质层角化不全现象基本消失，仅个别处有角化不全改变。表皮层棘细胞层变薄，多数出现1～2层颗粒层细胞，表皮突延伸及乳突上伸、毛细血管扩张等明显减轻，真皮层乳突内仅有少数炎细胞浸润。空白对照组组织学无明显改变。各组给药前后组织学评分见表5。
表5 各组给药前后组织学评分
组别                     处理时评分    处理15天后评分   P
⁶Ala-GnRH-PE4OKDEL组     7.57±0.58    1.43±0.37       1.49297E-10
GnRH-PE40KDEL组          7.37±0.58    1.62±0.35       1.24225E-09
GnRH-PE39KDEL组          8.08±0.75    1.51±0.55       4.14948E-09
GnRH-PE38组              7.62±0.49    2.32±0.81       1.67254E-06
空白对照组               7.70±0.65    6.49±0.88       0.163981
由上述结果可知，GnRH-PE突变体融合蛋白⁶Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38均有明显改善银屑病症状的效果。
实施例5、GnRH-PE突变体融合蛋白GnRH-PE40、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38对鳞片状皮肤(fsn/fsn)突变鼠模型的治疗效果
1、材料
36只健康成年鳞片状皮肤(fsn/fsn)突变鼠(雌雄不限)，试验样品GnRH-PE40、⁶Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38由北京诺思兰德生物技术有限责任公司根据实施例生产提供。
2、样品对模型的治疗
将模型组中的36只豚鼠随机分成6组，每组6只。分别对应于以下6种处理方案：GnRH-PE40 60ug/kg、⁶Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL 60ug/kg、GnRH-PE39KDEL 60ug/kg、GnRH-PE38 60ug/kg、溶媒1ml/只。采用静脉注射方式给药，1次/天，连续15天。给药前0天、给药第15天分别取耳廓皮肤标本储存待检。石蜡包埋，HE染色，观察组织学变化。
HE染色：将用10％甲醛溶液固定的标本脱水，透明浸蜡后包埋，制作石蜡切片，常规HE染色.在光镜下逐一观察组织学所见。参考Baker的方法制定组织学评分标准。
3 模型治疗前后各组标本HE染色结果
模型组豚鼠静脉注射药物15天后，GnRH-PE40 60ug/kg组、⁶Ala-GnRH-PE40KDEL60ug/kg组、GnRH-PE40KDEL60ug/kg组、GnRH-PE39KDEL 60ug/kg组以及GnRH-PE38 60ug/kg组标本中几乎都出现下列现象：角化不全现象基本消失，仅个别处有角化不全改变。棘细胞层变薄，多数出现1～2层颗粒层细胞，表皮突延伸及乳突上伸、毛细血管扩张等明显减轻，乳突内仅有少数炎细胞浸润。空白对照组组织学无明显改善，角质层角化过度、表皮层棘层肥厚、真皮层乳突内有大量炎细胞浸润，颗粒层变薄或消失，表皮突延伸呈棒状，乳突上伸呈杵状变，毛细血管扩张。各组给药前后组织学评分见表6。
表6 各组给药前后组织学评分